（分析化学专业论文）荧光有机小分子试剂在磷酸根阴离子家族典型成员分析中的应用研究.pdf

特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者： 森舔 签字日期：方6 i f 年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 、 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：b 尔保密， 口保密期限至年 学位论文作者签名： 签字日期：d o j 年 月止) 。 备、讯 导师签名 加7 日 f 签字日期：c 如”年6 产 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩写符号对照表。v 第一章绪论l 1 1 阴离子识别与检测概述1 1 2 有机荧光小分子与阴离子的作用2 1 2 1 特异性识别阴离子的有机荧光小分子简介2 1 2 2 荧光有机小分子与阴离子之间的作用方式3 1 2 3 荧光有机小分子与阴离子作用的荧光信号产生机理4 1 3 荧光有机小分子与含磷酸根阴离子相互作用的研究进展6 1 3 1 基于荧光有机小分子与磷酸根阴离子之间氢键或静电作用研究7 1 3 2 基于金属离子调节有机荧光小分子与含磷阴离子作用的研究。9 1 3 3 基于荧光指示剂的方法检测识别含磷阴离子1 0 1 4 本文拟达到的目的和意义及主要研究内容。l l 第二章藏红t 与六偏磷酸钠的作用及其在食品分析中的应用。1 3 2 1 引言13 2 2 实验部分13 2 2 1 主要试剂和仪器1 3 2 2 2 实验方法与步骤1 4 2 3 实验结果与讨论1 4 2 3 1s h m p 与s t 作用的吸收光谱1 4 2 3 2s h m p 与s t 作用的荧光光谱l5 2 3 3 结合比1 6 2 3 4p h 值对与体系的影响1 7 2 3 5 工作曲线、线性范围及检测限：1 8 2 3 6 共存物质的干扰。1 8 2 3 7 样品分析及回收率的检测1 9 2 41 2 ；论2 ( ) 第三章基于荧光共振能量转移检测饮料中六偏磷酸钠。2l 3 1 引言2 l 3 2 实验部分2 1 3 2 1 主要试剂和仪器2 l 3 2 2 实验方法与步骤 3 3 实验结果与讨论 3 3 1 荧光共振能量转移光谱 3 3 2p h 值对体系的影响 3 3 3 反应时间对体系的影响 3 3 4 反应物浓度对体系的影响2 5 曩 3 3 5 选择性实验2 5 3 3 6 工作曲线、精密度和灵敏度2 5 3 3 7 实际样品的分析2 5 3 3 8 作用机理的研究与探讨2 7 ，_ 荧光有机小分子化合物由于具有很好的光学特性，在阴离子的分析中得 到广泛的应用。筛选或合成新的特异性识别检测阴离子的荧光有机小分子是 近年来超分子化学领域的发展方向和趋势。本文以含磷酸根阴离子为研究对 象，探讨了藏红t 分子与六偏磷酸根的相互作用，并根据藏红t 作用前后光 谱的变化建立了两种简单、快速检测六偏磷酸钠的新方法。此外，合成了缩 邻氨基苯酚化合物，研究了它与焦磷酸盐的作用。具体包括以下三个方面： ( 1 ) 研究了藏红t 与六偏磷酸钠分别在弱酸性的n a a c h a c 缓冲及弱碱 性的t r i s h c i 缓冲中的相互作用，结果发现，在两种介质中随着六偏磷酸钠 的加入，藏红t 在5 2 0 n m 的吸收峰强度均明显降低，同时在4 7 6 n m 处出现新 l 一_ ，一一 的吸收峰；实验还发现加入六偏磷酸钠后，藏红t 的在5 7 8 n m 处荧光强度会 降低，但是其荧光寿命没有发生变化，表明s h m p 静态猝灭s t 的荧光。据 此，在弱酸性条件下根据s h m p 存在时s t 吸光度的变化，建立了一种检测 食品添加剂六偏磷酸钠的新方法，线性范围为1 0 1 0 一m o l l 一1 1 1 0 一m o l l ， 检测限为3 4 1 0 m o l l 。该方法应用于饮料中六偏磷酸钠的检测，相对误差 小于4 6 ，回收率在9 5 0 1 0 4 o 之间。 ( 2 ) 在p h8 5 的t r i s h c l 缓冲溶液，藏红t ( s t ) 与钙黄绿素( c a l e e i n ) 能发生有效地荧光共振能量转移，而六偏磷酸钠( s h m ) 的加厶使缛藏红工荧 光猝灭，同时增大了s t 与c a l c e i n 之间的距离，导致了荧光共握能量转移效 率的降低。六偏磷酸钠的浓度在3 o 1 0 一m o l l 1 0 1 0 巧m o l l 范围内呈很好 的线性关系，对6 0 1 0 6m o l l 的连续平行测定1 1 次，其相对标准偏差( r s d ) 为3 1 ，应用于饮料中六偏磷酸钠的分析检测，结果令人满意。 ( 3 ) 合成荧光试剂缩水杨醛邻氨基苯酚，在p h5 0 的n a a c h a e 缓冲 溶液中，考察了该试剂与b r 、c i 。、c 1 0 3 。、h c 0 3 、n 0 3 、p i 、s 0 2 、c t p 、 西南大学硕士学位论文 g t p 、u t p 、h 2 p 0 4 。、p p i 等阴离子的相互作用，结果表明该试剂只对p p i 有 较好的选择性识别能力，p p i 的加入导致缩水杨醛邻氨基苯酚溶液荧光强度降 低，据此建立了一种检测p p i 的新方法。该方法可用于合成样中p p i 的检测， 回收率在9 5 以上。 关键词：藏红t 六偏磷酸钠焦磷酸钠缩水杨醛邻氨基苯酚钙黄绿素 a b s t r a c t 量曼曼曼皇曼曼量曼曼曼鲁皇曼曼曼量曼量曼暑皇鼍舅曼葛i = i i 皇皇曼舅皇曼舅葛鼍置晕量鲁_ t h e s t u d yo nt h ea n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s o f f l u o r e s c e n ts m a l lo r g a n i cm o l e c u l e sf o rt h e t y p i c a lm e m b e r s i np h o s p h a t ea n i o nf a m i l y m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t e ：m i n l e s u p e r v i s o r ：p r o f c h e n gz h ih u a n g a bs t r a c t b e c a u s eo ft h eg o o do p t i c a lp r o p e r t i e s ，t h ef l u o r e s c e n ta n ds m a l lo r g a n i c m o l e c u l e sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nt h ef i e l d so fa n i o n i ca n a l y s i s s p e c i f i c s c r e e n i n go rs y n t h e s i so f n e wf l u o r e s c e n ta n ds m a l lo r g a n i cm o l e c u l e sf o ra n i o n i c r e c o g n i t i o na n dd e t e c t i o ns u p p l ym u c hm o r eo p p o r t u n i t i e sa n dc h a l l e n g e si nt h i s e v o l u t i o nf o rs u p r a m o l e c u l a rc h e m i s t r yi nr e c e n ty e a r s i n t h i st h e s i s ，t h e t y p i c a lm e m b e r si np h o s p h a t ea n i o nf a m i l yi s t h em a i no b je c to ft h es t u d y w e h a v ed i s c u s s e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns ta n ds h m p , i na c c o r d a n c ew i t h c h a n g e s i n s p e c t r ao fs t , t w on e w l y ，r a p i d l ya n d s i m p l e l y m e t h o d sw a s e s t a b l i s h e df o rs h m p s d e t e c t i o n i n a d d i t i o n ， f l u o r e s c e n c e r e a g e n t s a l i c y l a l d e h y d e o a m i n o p h e n o lw a ss y n t h e s i z e d w i t ht h e a d d i t i o no fp p i ，t h e f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fs a l i c y l a l d e h y d e o a m i n o p h e n o lw a sd e c r e a s e d ad i r e c t f l u o r e s c e n c ea n a l y t i c a lm e t h o dw a sp r o p o s e dt od e t e r m i n et h ep p ib a s e do nt h e d e c r e a s eo ff l u o r e s c e n ti n t e n s i t yw i t ht h ei n c r e a s eo ft h ec o n c e n t r a t i o no fp p i t h em a i n l yp o i n t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) w eh a v er e s p e c t i v e l yr e s e a r c h e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns ta n ds h m p i nt h ea c i dh a c n a a cb u f f e ra n da l k a l i n et r i s h c lb u f f e r t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ea b s o r b e n c yo fs tw a sd e c r e a s e da t5 2 0 h ma f t e ra d d i n gt h es h m p , a n da n e wp e a ka p p e a r e da t4 7 6b i ni nv i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r a f u r t h e rf o u n dt h a tt h e i h 两南大学硕士学位论文 f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo fs tw a sd e c r e a s e da t5 7 8 n m b u tt h ef l u o r e s c e n tl i f e t i m e o ft h es ti sn o tc h a n g e d w h i c hs h o w e dt h ef l u o r e s c e n c eo fs ti ss t a t i c a l l y q u e n c h e db ys h m p b a s e do nt h ec h a n g eo fa b s o r b a n c e ，w eh a v ee s t a b l i s h e da n e wm e t h o dt od e t e c tt h es h m p u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g e w a s1 o x l o 6m o l l 1 1 1 0 5m o l lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f3 4 x 1 0 7 m o l l t h ea p p l i c a t i o no ft h ee s t a b l i s h e dm e t h o di nt h ed e t e r m i n a t i o no ft e ad r i n k s a m p l e sg a v ear e c o v e r yr a t eo f9 5 o - 1 0 4 0 ，w i t ha r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n o fl e s st h a n4 6 缩写符号对照表 缩写符号对照表 英文名称中文名称缩写符号 t s a f r a n i n et藏红t s t p c a l c e i n钙黄绿素 c a l p y r o p h o s p h a t e焦磷酸盐p p i p h o s p h a t e磷酸盐 p i a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e三磷酸腺苷 a t p g u a n o s i n e 3 - d i p h o s p h a t e 一5 - d i ( t r i ) p h o s p h a t e四( 五) 磷酸鸟苷p p ( p ) g p p s o d i u mh e x a m e t a p h o s p h a t e六偏磷酸钠s h m p f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r荧光共振能量转移 f r e t p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r光诱导电子转移p e t e x c i t e d - - s t a t ei n t r a m o l e c u l a rp r o t o nt r a n s f e r激发态质子转移e s i p t e l e c t r o na n de n e r g yt r a n s f e r电子能量转移 e e t i 子识别。 由于阴离子在生物学、医药科学、食品科学以及环境科学中起到很大作 用，设计和合成选择性识别与检测阴离子的受体越来越受到人们的关注【4 5 】。 对生物、医药、食品、及环境中的一些重要的阴离子进行识别与检测在疾病 诊治、食品检测及环境改造方面有着广泛的应用前景【6 d3 1 。例如，对于严紧 激素四磷酸鸟苷( p p g p p ) 或者五磷酸鸟苷( p p p g p p ) 的识别与检测能够判 断植物和细菌的生存状态 1 4 - 1 6 1 ；从河流中选择性的识别、检测和萃取磷酸盐 及硝酸盐阴离子能够及时判断、抑制河水富营养化作用及由此产生的缺氧和 鱼类死亡等 1 7 , 1 8 j 。 然而，阴离子的识别与阳离子识别有所不同，能用于识别检测阴离子的 体系较少。这是因为：阴离子具有多样的离子结构( 球形、平面型、四面体 型、直线型等) ；阴离子的半径都相对比阳离子要大，导致其电荷密度较小； 阴离子容易受溶剂化效应的影响，阴离子能与质子型溶剂生成氢键【l9 1 。因 此选择性识别检测阴离子就要求相应的受体分子必须具备与阴离子相匹配的 空间构型，同时与阴离子的作用要远远大于溶剂分子与阴离子之间的作用【2 0 1 。 由此可见，在阴离子的识别与检测中，筛选、设计及合成合适的受体分子最 为关键。 目前识别与检测阴离子的研究大多还是利用阴离子与其受体作用前后的 光、电、磁等信号变化【2 1 。2 3 】。其中1 h n m r 谱技术在研究阴离子识别与检测 中应用较早且最为经典，能直接揭示阴离子与其配体相互作用 2 4 , 2 5 】。但是， 由于1 h n m r 谱技术在检测阴离子方面需要较大浓度的受体浓度才能得到信 号，且阴离子与受体作用后1 h n m r 信号位置很难确定，因此它在方法上用 于检测阴离子具有一定的局限性。阴离子的光度分析法具有操作简单、灵敏 度高等特点，特别是目视比色法更为简单方便。但是该方法需要的特异性受 体较少，特别是可用于裸眼检测阴离子的例子更为鲜见【2 6 , 2 7 。荧光分析方法 两南大学硕士学位论文 量曼喜量曼量鼍曼曼量鼍曼舅舅i i _i i i ii _ _ 一一一一一一一1 1 1 i 量鲁量曼曼量皇量置一 由于其具有操作方便快捷、灵敏度高、选择性好，易与其他技术联合实现实 时在线分析和远程在线分析，且可见光区及红外光区的荧光发射与显微镜技 术结合还能实现荧光成像分析等优点，因此在阴离子的识别与检测中有较广 泛的应用和潜在的研究价值【2 8 , 2 9 。电分析识别检测阴离子的方法也有报道， 但该方法中所用电极的修饰一般较为繁琐 3 0 , 3 1 。 近年来，随着有机合成等技术的快速发展，荧光分析方法用来识别与检 测阴离子的研究越来越深入，它的应用也越来越广泛，涉及到生物医学，食 品及环境等各个领域。本文主要研究的是荧光有机小分子与含磷阴离子之间 的相互作用，并将其应用于食品添加剂六偏磷酸钠和生物分子焦磷酸钠的分 析检测。 1 2 有机荧光小分子与阴离子的作用 1 2 1 特异性识别阴离子的有机荧光小分子简介 自1 8 6 7 年，g o p p e l s r 6 d e r 3 2 】应用有机小分子桑色素a l 配合物的荧光测 定铝以来，有机小分子化合物在荧光分析中的应用已经有近1 5 0 年的历史。 由于荧光有机小分子具有荧光发射范围宽等优点，近年来其在荧光探针、荧 光标记、荧光成像等技术中的应用也越来越广。 作为阴离子的识别与检测试剂，有机荧光小分子( o r g a n i cf l u o r e s c e n t s m a l lm o l e c u l e s ，o f s m s ) 一般都由三部分单元组成，它们分别为荧光信号基 团、连接基团、识别基团【3 3 1 。 s i g n a l i n gb i n d i n g a n i o n s u b u n i ts u b u n i t s i g n a l i n g s u b u n i t 图1 1 有机荧光小分子用于识别阴离子的示意图【3 3 1 b i n d i n g s u b u n i t 荧光信号基团所发挥的作用是为阴离子的识别与检测提供可检测的荧光 信号，因此，其信号强度就决定了检测阴离子的灵敏度。荧光信号基团的种 g o n m a l v e s 【3 4 】以荧光信号基团的发射峰位置为主线，评述了最近几 的较多的荧光信号基团。根据杂环元素种类不同，可以分为含氮杂 、含氧杂环生色团、含硫杂环生色团、及萘环类生色团。根据化合 第一章绪论 m m ml_mi i im_ 物种类，又可分为花青类、s q u a r a i n e s 类、b o d i p y 类、罗丹明类、荧光素类 等化合物。 识别基团提供阴离子进行特异性结合的位点，从而保证高选择性识别检 测阴离子。目前，在阴离子的识别检测中应用最多的识别基团主要包括：酰 胺、脲及硫脲、胍盐和硫脲盐、五元杂环等。因此，在选择性识别与检测 不同阴离子时，需要根据具体阴离子的空间构型选择与之相适应的有机小分 子，如硫脲类识别基团与平面三角型阴离子( c h 3 c o o 。) 空间构型上相匹配， 表现出对c h 3 c o o 。的选择性识别，而对其他结构的阴离子选择性就很差p 5 。 连接基团也称间隔基团，其功能就是将生色基团与识别基团连接一起。 虽然它一般很少与阴离子化合物直接作用，且一般不会信号的产生。但是， 连接基团的长短也会影响有机试剂的空间结构，且有时还能给受体分子提供 一些与阴离子作用的非共价作用力( 氢键，静电等) 。因此，连接基团在有机 小分子与阴离子的作用中也起到非常大的作用。 总之，阴离子的识别检测与有机小分子的结构及其相关。荧光基团直接 影响到识别检测的灵敏度，识别基团关系到与阴离子相互作用的特异性。因 此，在筛选、设计及合成选择性好和灵敏度高的有机小分子受体时，必须考 虑到信号基团、识别基团和连接基团三者之间的相互影响。 1 2 2 荧光有机小分子与阴离子之间的作用方式 荧光有机小分子与阴离子间的作用主要是通过非共价键进行的，包括静 电作用、氢键作用及疏水力作用等。吴芳英等对阴离子的识别检测过程中经 常使用的几种分子间的相互作用力作了详细的介绍f 3 引。 静电作用在这几种作用力中作用最强，是基于荧光有机小分子与阴离子 之间带有不同电荷而形成的。这类荧光有机小分子大多含有氮原子。在一定 酸度下，荧光有机小分子质子化，带上正电荷，从而与带负电的阴离子相互 作用，生成离子缔合物或诱导荧光小分子聚集，导致有机小分子的荧光参数 发生变化。但由于静电力无方向性，若荧光小分子带有正电荷，则对 体系中的所有阴离子均可产生静电作用，降低了对底物阴离子识 别检测的选择性。 氢键也是荧光有机小分子与阴离子相互作用中常常考虑的另一种作用 力。由于氢键是具有方向性的分子间的作用力，因此在识别检测阴离子中运 用氢键的作用能大大的提高选择性。但是，运用氢键作为识别检测阴离子的 主要作用力时，必须克服阴离子与溶剂分子之间的氢键作用力。 3 两南大学硕士学位论文 量量量量量曼曼曼曼舅曼曼曼曼曼量皇量曼曼罾舅舅量量量量量曼曼曼曼曼曼舅量曼曼量皇曼量罾量曼曼量量量量量量喜量量量量虽置量曼鲁曼曼曼量曼量曼皇i i i 蔓量 除此之外，阴离子的识别检测还常常借助荧光有机分子一金属离子与阴 离子一金属离子的配位结合力的不同、疏水作用等。 1 2 3 荧光有机小分子与阴离子作用的荧光信号产生机理 第一章绪论 h o m o 轨道电子转移，同样在无辐射情况下从激发态转变为基态，观测到荧 光猝灭( 图i b ) 。 理想的p e t 过程有以下特征：在阴离子识别过程中，仅有荧光发射的 强度( 或量子产率) 和寿命发生变化；在离子识别过程中，激发态荧光团和 受体之间电子转移的自由能凹g p e t ) 发生变化：荧光团的吸收光谱没有变 化。 一钞 一芳孑 一+ 厂* 一卑” b ：h 一书 缈 i , u m 0 4 - 一一矽气 一* 弋一_ 图1 2p e t 荧光信号产生的机理【3 6 1 其中：图a 是外来分子为全满轨道；图b 是外来分子为空轨道。 ( 3 ) 电子能量转移( e e t ) 【3 6 】 当其他分子的空轨道或半充满轨道能级处于有机小分子荧光团的h o m o 和l u m o 之间，电子同时从荧光团的l u m o 轨道转移至外来的基团分子轨 道和从外来基团的分子轨道转移至荧光团h o m o 轨道。这样的双电子电子交 换过程使得荧光团重又回到基态，随之发生非辐射过程，导致荧光猝灭( 图2 ) 。 双电子同步转移要求这一外来基团与荧光团相距较近。因此，具有柔性的连 接基团的有机小分子更能使得这种类型的分子内能量转移过程发生。 一1 一一乡节 # u 廿飞一一j - h _ 酬幽呵 i - 1 - 哟啪廿 图1 3e e t 荧光信号产生的机理【3 6 1 ( 4 ) 单体一激基复合物形成【3 6 1 当一个处于激发态的荧光基团与另一个处于基态且具有相同结构的荧光 团之间发生相互作用是形成的复合物即为激基缔合物( e x c i m e r ) 。激基缔合 物( e x c i m e r ) 是两个同种分子或原子的聚集体，在激发态时两分子或原子作用 ， 第一章绪论 及多聚磷酸盐是重要的食品添加剂。因此检测这些磷酸根阴离子家族中的典 型成员在生命科学、环境科学、食品科学等领域中具有较大的意义。 1 3 1 基于荧光有机小分子与磷酸根阴离子之间氢键或静电作用研究 近年来，利用分子间的静电作用及氢键作用已成为识别检测阴离子的重 要手段之一。p r a m a n i k 3 9 】等合成了形似“三角支架”的喹啉类合物l ，能高效选 择性的检测识别无机磷酸阴离子。单独化合物1 存在时，其单体3 1 0 n t o 荧光 峰与激发态4 7 5 n m 荧光峰都能显现；键合含氢磷酸化合物如( h 3 p 0 4 ) 后通 过氢键及静电作用，导致其单体与激发态的荧光强度均降低；当与正磷酸根 ( p 0 4 3 ) 键合时只能通过静电作用，仅仅导致了激发态的荧光发射强度急剧 降低，而单体的荧光强度不变化，据此可以识别检测酸式磷酸根及正磷酸根 阴离子。 固。鲨霈 m o n o n k - r o f fm o i l o i m r o 、m o q o i u t i t ，、 e | j 啊竹0 f fe 坼嘛r 0 ne i x i m e r ( i f f - - - - - i h - - d h i 囊膏嘲- - g l e a m m e s s 围1 5 化合物1 1 3 9 】 忡耙妇 受体化合物2 【4 0 】是具有“拟四面体”钳式结构的多酰胺物质，能与磷酸阴 离子选择性的键合，同时主体芘基的单体荧光增强，激基缔合物荧光减弱，其 它阴离子( f 。，c i ，b r ，s c n 。，a c o 。，n 0 3 。，c 1 0 4 和h s 0 4 ) 对主体的荧光光谱 几乎没有影响。可以通过处于相近方向n 3 ，n 6 亚甲基相连的芘环( 或n 4 。，n 7 。) 经肛万堆积作用形成激基缔合物。与阴离子配位时，主体芘基被迫相互远离， 难形成激基缔合物，因而激基缔合物发射强度降低。该课题组还合成了另一 个带有双臂的荧光化合物3 【4 1 1 ，磷酸阴离子的加入能使化合物3 单体的荧光 显著增强。 7 西南大学硕十学位论文 k 3 4 s m a 圈1 6 化合物2 嗍图1 7 化合物3 t 4 1 j 含吡咯类荧光化合物4 1 4 2 1 ，能通过分子间的氢键作用分别选择性的识别 磷酸阴离子和焦磷酸阴离子，且形成l ：l 的化合物，而对其他阴离子的识别 作用较弱。加入阴离子时，荧光化合物4 发生聚集，导致其自身荧光急剧降 低：而化合物5 1 4 列由于含有多个带正电荷的伯氨基能选择性的与焦磷酸阴离 子作用，荧光小分子发生聚集，从而检测识别焦磷酸阴离子。利用同样的原 理z h a o 等合成化合物6 1 4 4 在a t p 存在下也能发生聚集，从而达到检测识别 a t p 的目的，文章中还进一步检测了碱性磷酸酯酶。 8 圈1 8 化合物4 1 2 j h 吖h h 哥卜强 卜 圈1 9 化合物5 邮j 图1 1 0 化合物6 m 气， 、o矿卯 第一章绪论 - l i _ i _ - _ l i _ i _ l l l l _ l _ i _ l _ _ _ l _ l l l i _ i i i i i l | l l _ _ l _ l l _ _ l l _ _ l _ _ l l _ _ _ _ i i l i r a i _ _ l i l i _ l i _ _ _ _ l _ _ _ _ _ i i i i i i i 一 综合文献发现，与磷酸根阴离子通过分子间静电或氢键作用的荧光有机 小分子其识别基团一般含有酰胺基【4 5 4 引、尿及硫脲基【4 9 - 5 2 1 、含氮杂环【5 3 - 5 5 1 等 特异性基团。有时这类荧光物质还可能是一些大环类物质【蜘5 9 1 或高分子化合 物【6 0 ，6 l 】。 1 3 2 基于金属离子调节有机荧光小分子与含磷阴离子作用的研究 金属离子由于具有较强的配位能力，能与阴离子产生很好的配位作用， 同时金属离子还可以作为拉电子基团与含石共轭体系的荧光分子相连，增强 荧光有机小分子与阴离子之间的结合力，因此金属离子往往在阴离子的识别 检测中被广泛应用。然而运用到磷酸根阴离子家族的检测时涉及到最多的金 属离子主要是c u 2 + 和z n 2 + ，其他金属离子如c d 2 + 等仅有少量报道。 c o s k u m 6 2 】等报道化合物7 的z n ( i i ) 配位化合物与磷酸阴离子具有较强的 作用。单独的化合物7 的z n ( i i ) 配位化合物由于荧光团激发态向z n ( i i ) 联吡啶 配位化合物的氧化电子转移( o x i d a t i v ep e t ) ，导致其荧光强度很弱。当加入磷 酸阴离子后，通过静电作用，z n 2 + 的部分电荷被中和，导致氧化电子转移被 部分抑制，荧光强度得到恢复。同样，道化合物8 的z n ( i i ) 配位化合物【6 3 j 也 能发生分子内电荷转移( p e t ) ，加入焦磷酸盐或三磷酸盐导致分子内电荷转 移禁阻，使其荧光强度增强。 图1 1 1 化合物7 1 6 2 l 圈1 1 2 化合物8 【6 3 1 9 西南大学硕士学位论文 c u ( i i ) 络合物应用于含磷阴离子的识别的报道也很多。x i a o m e ih u a n g m j 等报道合成了的化合物9 ，当向化合物9 的溶液中加入各种金属离子时，只有 c u 2 + 能较大程度的猝灭其荧光如果进一步。加c u 2 + 猝灭其荧光后，再向溶 液中加入各种阴离子化合物，结果只有p p i 能使9 的荧光得到恢复，从而建 立了一种检测p p i 的新方法。c u ( i i ) 的共价聚合物也经常用于含磷阴离子的识 别，x i a o y o n gz h a 0 1 6 5 】等报道共价聚合物l o 与c u 2 + 作用后其荧光强度也会有 很大大猝灭，但当加入p p i 后其荧光会恢复，从而达到构建一个o n o f f 的模 式荧光检测p p i 。最近，j u n f e n gz h a n g 酌】等进一步又合成了化合物1 1 ，并将 其固定在硅纳米粒子上，从而实现了对p p i 的固相检测，荧光化合物还能循 环使用。类似的z n ( i i ) 配位化合物的络合物【6 7 刁l 】和c u ( i i ) 配位化合物络合物 【7 2 】在焦磷酸根、磷酸根等磷酸根阴离子检测中均有应有应有含磷阴离子中均 有报道。 化合物9 删 f 啪 多 n a 0 2 c p p e c 0 2 化合物l o 【6 5 l化合物l l 嗣 豳1 1 3 2 ( ：1 0 4 在含磷阴离子的检测分析方面除了上述两种主要使用的金属离子外，其 他金属离子应用较少。目前，仅文献【7 3 】曾报道利用金属c d 2 + 作为媒介来检测 p p i 。 1 3 3 基于荧光指示剂的方法检测识别含磷阴离子 除上述两种常用的检测识别含磷阴离子的方法外，还有少数文献报道基 于荧光指示剂的方法检测识别含磷阴离子。d o n j o nl e e l 7 4 】等报道合成一种猝 灭型荧光受体1 2 ( q r ) 及含磷酸阴离子的荧光基质共价化合物f s ，在f s 溶 液中加入q r 后f - s 的荧光强度降低。由于p p i 与q r 的作用大于q - r 与 f s 之间的作用力，因此当加入p p i 后，f s 被置换出来，其荧光得到恢复。 k u a n h u n gc h e n 7 5 】等合成了含磷酸阴离子的香豆素型的指示剂1 3 ，基于其与 受体分子间的荧光共振能量转移作用f r e t ，加入p p i 后能置换出这种指示剂， 从而指示剂上香豆素的荧光得到恢复。 1 0 地e m o e科一 q 洲c _ 柚u l 棚h a 吖 圈1 1 5 化合物1 3 1 7 5 1 总的来说，目前文献中基于荧光小分子识别检测含磷阴离子的方法主要 就是上述三种形式。随着该领域不断发展和更多选择性识别配体的合成，必 将更多新的检测方法，在生命、环境等领域也将发挥巨大的作用。 1 4 本文拟达到的目的和意义及主要研究内容 无机磷酸阴离子主要包括正磷酸根离子，磷酸一氢、二氢根离子，焦磷 酸根离子，及其他们的各种衍生物。无机磷酸阴离子在及其衍生物在环境、 生物及食品中起到重要的作用。例如磷酸盐( p i ) 是水体富营养化的主要物质， 焦磷酸盐( p p i ) 是细胞中直接能源物质a t p 等水解的主要产物之一，六偏磷 酸盐及多聚磷酸盐是重要的食品添加剂。因此，无机磷酸阴离子及其衍生物 的检测识别就尤为重要。 本文旨在研究无机含磷阴离子与荧光有机小分子的作用，利用荧光小分 子作用前后荧光强度变化，从而建立简单、快速、灵敏的检测无机含磷阴离 子分析方法，主要包括以下几个方面： ( 1 ) 通过对现有的荧光染料进行筛选，结果发现六偏磷酸钠( s h m p ) 能与藏红t ( s t ) 发生特异性的作用。研究了s h m p 与s t 相互作用的条件 西南大学硕十学位论文 及其作用的机理，根据s t 作用前后荧光光谱和紫外吸收谱的变化的变化，建 立了一种检测s h m p 的新方法，并成功的应用于饮料中食品添加剂s h m p 的 检测。 ( 2 ) 藏红t 与钙黄绿素( c a l c e i n ) 能在弱碱性的条件下能发生有效地荧 光共振能量转移( f l 也t ) ，加入六偏磷酸钠后s t 作用使s t 荧光强度降低， 同时增大了s t 与c a l c e i n 之间的距离，导致了荧光共振能量转移效率的降低。 基于此建立了一种荧光比例法检测饮料中六偏磷酸盐的方法。 ( 3 ) 席夫碱类化合物由于具有较好的光学性质，已广泛的应用在阴离子 的识别检测中。研究以水杨醛和邻氨基苯酚为原材料，合成了缩邻氨基苯酚 化合物。将其溶于乙醇：水为1 ：9 的溶剂当中，加入焦磷酸钠( p p i ) ，结果发 现缩水杨醛邻氨基苯酚溶液的荧光强度明显降低，但其吸收光谱却没有明显 的变化。由此建立了一种基于分子内电荷转移的荧光分析法识别检测p p i 的 新方法。 六偏磷酸钠是一种常用食品添加剂，存在于饮料、肉制品等食品中。然 而，过量添加会破坏食品中的各种营养元素，且在人体内长时间积累会引发 如肿瘤病变、氟骨症、骨质硬化和骨质疏松等各种疾病，对人肝脏功能造成 伤害。因此，我国对各类食品中六偏磷酸钠的允许用量做了明确的规定【7 6 1 。 目前测定六偏磷酸钠的主要方法有离子色谱法【7 7 铷】、原子吸收光度法【8 1 ，8 2 1 、 沉淀法【8 3 】和分光光度法【8 4 】等。近年来，荧光染料聚集体研究多有报道【8 5 。8 9 】， 并进一步应用于d n a 9 0 硝】、蛋白质9 5 研1 及多糖类化合物【9 8 1 等生物大分子检 测分析。 本文研究了藏红t 溶液在六偏磷酸钠存在时发生聚集作用的吸收光谱和 荧光性质，并由此建立了一种快速测定六偏磷酸钠的新方法。方法操作简单、 灵敏度高、选择性好，成功应用于饮料中六偏磷酸钠的检测。 2 2 实验部分 2 2 1 主要试剂和仪器 u v - 3 0 1 0 型紫外可见分光光度计( 日本日立公司) ，用于扫描吸收光谱： f 2 5 0 0 型荧光光度计( 日本日立公司) ，用于测量荧光光谱；f l 。t c s p e 荧光 光度计( h o r i b aj o b i ny v o ni n e 法国) 用以测定荧光寿命；m v s 1 型旋涡混合 器( 海门市其林贝尔仪器制造公司) ，用于混匀溶液；p h i o n5 1 0 型酸度计， 用来调节溶液的酸度。 1 o 1 0 。3 m o l l 藏红t ( s t ) 储备液，用时再稀释成1 0 x 1 0 。4 m o l l 的使用 液；六偏磷酸钠( n a ( p 0 3 ) 6 ，s h m p ) ，配置成1 0 1 0 。4 m o l l 的使用液；n a a c h a e 缓冲：所有用水均为二次蒸馏水，试剂均为分析纯。 h 图2 1s t 分子的结构图 1 3 西南大学硕士学位论文 2 2 2 实验方法与步骤 在1 0m l 试管中，分别加入1 0m l 缓冲液，然后加入4 0m l1 0 1 0 4 m o l l 的s t 溶液。旋涡混匀后，再加入一定量的浓度为1 o 1 0 。4m o l l 的六 偏磷酸钠标准溶液或实际样品，用水稀释到刻度并混匀，分别测定荧光和吸 收光谱。 2 3 实验结果与讨论 2 3 1s h m p 与s t 作用的吸收光谱 如图2 1 所示，s t 溶液在5 2 0n l l l 处有一最大吸收峰，其摩尔吸收系数达 2 8 4 x 1 0 4l m 0 1 - 1 c m j ( 2 9 5 k ) 9 9 1 。当加入s h m p 时，s t 的特征吸收峰随着 s h m p 浓度增加而降低；当s h m p 浓度大于4 o 1 0 击m o l l 时，s t 的特征吸 收峰不仅降低，并且在4 7 6n l n 处出现新吸收峰。 有机小分子染料在水溶液中，往往存在单体、二聚体及寡聚体【1 0 0 1 。六偏 磷酸钠带有较多负电荷，能与阳离子染料通过静电作用结合，导致阳离子荧 光染料性质发生显著变化。w i a m e 等【1 0 1 】报道六偏磷酸钠与一些染料作用后形 成异质杂化体( m e t a c h r o m a s y ) ，异质杂化体是由于染料的聚集导致的，染料在 短波长处产生新的吸收峰。实验表明，在弱酸性n a a c h a c 缓冲介质中，s h m p 与s t 作用后既有s t 聚集体形成，也有异质杂化体产生。这是因为当s h m p 浓 度较低时，s h m p 诱导s t 自身聚集仅导致s t 吸光度降低及其最大吸收波长发 生较小位移；而4 7 6n m 处新的吸收峰与文献【9 3 1 报道的s t 聚集峰位置不相同， 所以应该归属于s h m p 与s t 相互结合后产生的异质杂化体的吸收峰( 图 2 2 a ) 。 1 4 w a v e l e n g t h n mw a v e l e n g t h n m 图2 2s t 与s i - e v l p 作用的吸收光谱图 c 汀，4 0 x10 一m o l l ；a ：i nn a a c h a cb u f f e r , b ：i nt r i s h c ib u f f e r 第二章藏红t 与六偏磷酸钠的作用及其在食品分析中的应用 置葛墨i l i i i 鼍璺曼皇皇曼曼量量曼量皇 在t r i s h c i 缓冲中具有类似的作用( 如图2 2 8 ) 。只是在t r i s h c i 缓冲中 明显出