（法医学专业论文）x染色体上str与snp标记的分型检测.pdf

”。一彳i 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所( 含万方数据电子出版社) 、 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 ，在年 月解密后适用本规定。 非涉密论如 论文作者签名： 导师签名： e t 期：垫a 止! 坚：丕 e l 期：厶狸s 箬，- ， x 染色体上s 像与 目的：利 x s n p 位点进行群体遗传学分析，为疑难类型的案件如祖母与孙女的亲缘关系鉴 定、同父异母姐妹关系的鉴定等提供鉴定思路和解决方法。 方法：采用m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒调查8 个x - s t r 基因座在中国汉族人 群的多态性，计算其遗传学参数并应用于实际案例。选择1 3 个均衡分布于x 染色 体上的s n p 位点，建立t a q m a n 探针检测方法，探讨该方法的灵敏度、准确性、 特异性和检材的适用性等，并调查1 3 个x - s n p 位点在中国汉族人群中的多态性、 遗传学参数和连锁情况等。另外，对x 染色体上两类遗传标记的联合应用价值进 行探讨。 结果：m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒中包含的8 个x s t r 基因座在中国汉族人 群中多态性良好，遗传学参数理想；在实际案例应用中以基因座d x s l 0 1 3 5 和 d x s l 0 1 0 1 的排除率最高，分别达到8 5 5 1 和7 5 3 6 。t a q m a n 探针技术可以对 1 3 个x s n p 位点准确分型，灵敏度高、特异性高、对检材的适用性宽泛。1 3 个 x s n p 位点符合h a r d y w e i n b e r g e 平衡，独立遗传，多态信息含量均在0 3 以上， 平均杂合度为0 4 8 9 4 。联合检测这两类遗传标记，在女性群体中的累积个体识别 能力( c d p f m 蚰c ) 达到0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 7 ，在男性群体中的累积个体识别能力 ( c d p m a i 。) 为0 9 9 9 9 9 9 9 9 8 6 9 9 ；在二联体中的联合非父排除率( c p e d u ) 为 o 9 9 9 9 9 7 1 7 7 ，在三联体中的联合非父排除率( c p e t a ) 为0 9 9 9 9 9 9 9 7 6 3 9 2 。 结论：m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒中包含的8 个高度多态性的x s t r 基因座 适用于中国汉族人群。t a q m a n 探针技术可以对x s n p 位点进行准确可靠的分型， 1 3 个多态性良好且独立遗传的x s n p 位点可以满足当前法医学应用要求。统计学 结果表明，两类遗传标记的联合检测可为疑难亲缘鉴定案件提供丰富的遗传学信 息，满足鉴定需求。 关键词：x 染色体；s t r ；s n p ；m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒；t a q m a n 作者：张素华 指导老师：李莉 t h e g e n o t y p i n go fs n p a n ds t ro nx - - c h r o m o s o m e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t h r o u g ht h eg e n e t i ca n a l y s i so fe i g h tx - s t r sa n dt h i r t e e nx - s n p s w i m s t rg e n o t y p i n gp l a t f o r ma n dt a q m a nt e c h n o l o g yr e s p e c t i v e l yt op r o v i d em e t h o d s f o r s p e c i a l c a s e ss u c ha st h ej u d g e m e n to fr e l a t i o n s h i p so fg r a n d m o t h e rt o g r a n d d a u g h t e ra n dh a l f - s i bs i s t e r sw i mt h es a m ef a t h e r m e t h o d s ：t h ep o l y m o r p h i s m so fe i g h tx - s t r si nc h i n e s eh a np o p u l a t i o nw e r e d e t e c t e db ym e n t y p e a r g u sx - 8k i t t h eg e n e t i cp a r a m e t e r so ft h e mw e r ec a l c u l a t e d a n da p p l i e di np r a c t i c a lc a s e s t h i r t e e nx - s n p sl o c a t e de q u i l i b r a t e l yo nxc h r o m o s o m e w e r ed e t e c t e db yt a q m a nt e c h n o l o g y t h es e m i t i v i t y , a c c u r a t i s s i m e ，s p e c i f i c i t ya n d a d a p t i v i t y o fs a m p l e so ft a q m a nt e c h n o l o g yw e r ee x p l o r e d , t o g e t h e rw i t l lt h e p o l y m o r p h i s m ，g e n e t i cp a r a m e t e r sa n dl i n k a g ei n f o r m a t i o no fx - s n p s i na d d i t i o n , t h e a p p l i c a t i o nv a l u eo f t h e s eg e n e t i cm a r k e r so nxc h r o m o s o m ew e r ei n v e s t i g a t e d r e s u l t s ：t h ee i g h tx s t r si n c l u d e di nm e n t y p e a r g u sx - 8k i tw e r e p o l y m o r p h i ci n c h i n e s eh a r t p o p u l a t i o n w i t hi d e a l g e n e t i cp a r a m e t e r s l o c io f d x s l 0 1 3 5a n dd x s l 0 1 0 1w i lh i g h e s te x c l u s i o nr a t er e a c h8 5 5 1 a n d7 5 3 6 ， r e s p e c t i v e l y t h e t h i r t e e nx - s n p sw h i c hh e r i t a g e di n d e p e n d e n t l ya n df o l l o w e d h a r d y - w e i n b e r g ee q u i l i b r i u mg e n o t y p e db yt a q m a nt e c h n o l o g ya c c u r a t e l y , w i t hh i g h s e n s i t i v i t y , s p e c i f i c i t ya n da d a p t i v i t y t h ep o l y m o r p h i ci n f o r m a t i o nc o n t e n t s ( p i c ) o f t h e ma r ea l la b o v eo 3a n dt h em e a nh e t e r o z y g o s i t yi s0 4 8 9 4 d e t e c t e dt h et w ok i n d s o fg e n e t i cm a r k e r st o g e t h e r , c u m u l a t i v ed i s c r i m i n a t i o np o w e r ( c d p ) i nf e m e l e sr e a c h 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 7 ，i nm a l e sr e a c h0 9 9 9 9 9 9 9 9 8 6 9 9 ；c u m u l a t i v ep r o b a b i l i t yo f e x c l u s i o n ( c p e ) i nd u o sr e a c h 0 9 9 9 9 9 717 7 ，i nt r i o sr e a c h0 9 9 9 9 9 9 9 7 6 3 9 2 c o n c l u s i o n ：t h ee i g h tx - s t r si n c l u d e di nm e n t y p e a r g u sx 一8k i tw e r es u i t a b l e f o rc h i n e s eh a r tp o p u l a t i o n t h eg e n o t y p i n go fx - s n p sb yt a q m a nt e c h n o l o g yw a s a c c u r a t ea n dr e l i a b l e t h i r t e e nx - s n p s 埘t l lm g hp o l y m o r p h i s ma n di n d e p e n d e n t l y h e r i t a g ec a l lm e e tt h ed e m a n d so ff o r e n s i ca p p l i c a t i o n s t a t i s t i ca n a l y s i ss h o wt h a t c o m b i n e dd e t e c t i o no ft h et w ok i n d so fm a r k e r sc a np r o v i d ec o n s i d e r a b l eg e n e t i c t h eg c n o t y p i n go fs n pa n ds t r0 1 1x c h r o m o s o m e i n f o r m a t i o nf o rs p e c i a lc a s c s k e yw o r d s ：x - c h r o m o s o m e ；s h o r t t a n d e m r e p e a t s ；s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ；m e n t y p e a r g u sx - 8k i t ：t a q m a n w r i t t e n b ys u h u az h a n g s u p e r v i s e db yl il y 引 言 第一部 l 2 3 4 4 1m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒在实际案例中应用情况l3 4 2 典型案例15 第二部分应用t a q m a n 技术检测1 3 个x s n p 位点1 9 1x s n p 位点的筛选19 1 1 位点的筛选原则1 9 1 2 位点的筛选方法1 9 1 3 位点的筛选结果2 2 2 引物和探针的设计原则3 0 3t a q m a n 技术检测1 3 个x - s n p 位点”3 2 3 1 实验材料3 2 3 2t a q m a n 实验方法与过程”3 3 3 2 1 基因组d n a 抽提3 3 3 2 2 样本d n a 的定量3 3 3 2 3 待检d n a 的制备3 4 3 2 4 分型过程3 4 3 3 统计学分析方法3 7 34 结果与讨论3 7 3 4 1d n a 样奉的定量结果3 7 3 4 2t a q m a n 技术分型结果3 8 3 4 3x - s n p 位点的分布频率及法医学参数4 l 3 4 41 3 个x s n p 位点的连锁情况分析4 4 3 4 4 实际案例应用情况4 8 4 t a q m a n 技术的验证4 8 4 1t a q m a n 技术的灵敏度检验4 8 4 2t a q m a n 技术的准确性检验4 9 4 2 1 内对照位点r s 6 6 3 9 3 9 8 的分型4 9 4 2 2x s n p 位点的测序检验”5 0 4 3 检材的适用性检验6 1 4 4t a q m a n 技术的特异性检验6 2 第三部分x s t r 和x s n p 联合应用的价值探讨6 3 1x - s t r 遗传标记的应用6 3 2x s n p 遗传标记的应用6 3 3x s t r 和x s n p 联合应用的价值6 4 3 1x - s t r 和x s n p 联合应用的意义”a ooooooo o e o * 6 4 3 2 典型案例- 全同胞姐妹关系的鉴定6 5 结 仑j 6 8 参考文献6 9 在校期间发表论文情况7 2 在校期间参与科研情况7 4 附录综述7 5 致 射9 0 x 染色体上s t r 与s n p 芦i 已 - 丁i苗 法医d n a 分型的发展有力地证明了这种技术惊人的潜力：目前，p c r - s t r 复合扩增荧光检测技术已经成为法医d n a 鉴定的重要技术手段，在刑事案件的侦 破、个体识别、身源认定以及亲权鉴定等司法实践中发挥着重要的作用。但目前 的常规s t r 复合扩增试剂盒主要局限在人类常染色体s t r 基因座，满足不了疑难 亲缘鉴定的需要。对于下述一些疑难类型的案件，国内外尚缺乏足够有效的鉴定 手段：需要明确祖母与女孩是否具有亲祖孙关系，但缺乏孩子祖父和父亲、母亲 的参照样本；需要明确两个姐妹( 不同母) 是否有着同一个生物学父亲，但缺乏 孩子父亲的参照样本。这类案件的鉴定需要借助x 染色体上的遗传学标记。人类 x 染色体因其特殊的遗传规律而倍受国际法医遗传学界重视。依据孟德尔遗传规 律，父亲只能将x 染色体遗传给女儿，母亲的x 染色体则可随机地遗传给儿子或 女儿，类似于常染色体遗传。因此，x 染色体上s t r 基因座( x s t r ) 在祖母孙 女关系、同父异母姐妹关系以及母子关系、父女关系等鉴定中均具有重要应用价 值。 到目前为止，x 染色体上已有4 0 多个s t r 基因座被报道用于法医学研究。基 于实际应用的需要，将x 染色体分为4 个连锁群，将基因座d x s 8 3 7 8 、d x s 7 1 3 2 、 h p r t b 和d x s 7 4 2 3 作为这四个连锁群的核心基因座，它们分别位于x p 2 2 2 、x q l 2 、 x q 2 6 和x q 2 8 。b i o t y p e 公司的商业化试剂盒m e n t y p e a r g u sx - u l 就是针对这4 个核心x s t r 基因座开发的，也是第一个关于x s t r 的商业化试剂盒。之后，在 其基础上研发了第二代商业化试剂盒：m e n t y p e a r g u sx 一8 ，它可以检测位于第一 连锁群的d x s l 0 1 3 5 和d x s 8 3 7 8 、第二连锁群的d x s 7 1 3 2 和d x s l 0 0 7 4 、第三连 锁群的h p r t b 和d x s l 0 1 0 1 以及第四连锁群的d x s l 0 1 3 4 和d x s 7 4 2 3 。这4 个连 锁群相互之间的距离少于0 5 c m ，重组率均小于0 5 t 1 1 。2 0 0 9 年底，b i o t y p e 公司 又推出了第三代关于x s t r 的商业化试剂盒m e n t y p e a r g u sx - 1 2 。 s z i b o r l 2 等研究发现，x - s t r 基因座进行减数分裂的平均突变率为2 0 9 x 1 0 d ， 与常染色体s t r 基因座的突变率相近，而s n p 位点的突变率仅为1 0 母，显示了更 高的遗传稳定性，这引起了众多学者的关注。此外，s n p 位点在人类基因组中含 引言x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 量丰富、分布广泛，二态分布的双等位基因组成模式更易于开展自动化研究。当 前关于s n p 的报道主要集中于常染色体s n p 3 、y 染色体s n p 4 1 和线粒体 ( m t d n a ) s n p t 5 1 。到目前为止，z a r r a b e i t i a 6 1 等报道了1 0 个x s n p 位点( r s l 2 2 9 0 7 8 、 r s l 5 4 4 5 4 5 、r s 4 4 4 2 2 7 0 、r s l 8 7 4 1 1 1 、r s 5 9 6 8 3 3 2 、r s l l 6 6 7 5 6 、r s l 2 8 4 9 6 3 4 、r s 5 9 3 2 5 9 5 、 r s 2 0 3 6 4 8 和r s 6 1 1 7 1 1 ) 在西班牙人群中的多态性；w a n 9 1 7 等报道了8 个x - s n p 位 点( r s 2 0 3 8 6 、r s 2 0 3 6 4 、r s 2 0 3 6 2 、r s 3 6 3 7 6 5 、r s 3 6 3 7 5 4 、r s 3 6 3 7 8 0 、r s 4 9 2 5 3 9 和r s 3 6 3 7 5 9 ) 在日本人群中的多态性。另外，基于遗传进化的角度，t o m a s s 等从h a p m a p 网站 中选取了x 染色体上2 5 个多态信息含量高、物理距离大于6 0 0 k b 的x s n p 位点， 对地中海地区1 1 个人群进行了遗传特征的研究。但真正将x s n p 应用于法医学实 践尚未见报道。 基于以上研究现状，本课题首先采用m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒检测8 个 x s t r 基因座在中国汉族人群中的多态性，计算其法医学参数，并探讨其实际应 用价值。另外，由于目前可应用于实际检案的x - s t r 基因座数目较少，且x s t r 突变率高，因而学者们将目光投向了x s n p 位点。本实验室己初步建立了s n p l e x 平台，它可以同时检测4 8 个x s h i p 位点，但由于该技术对样本的质和量要求高、 耗时长、部分位点出峰情况不理想等缺点，因而我们重新选择了1 3 个均衡分布于 x 染色体上的x s n p 位点，采用t a q m a n 探针技术进行分型检测。结合检测这两 类遗传标记，可为疑难亲缘鉴定案件如祖母与孙女的亲缘关系鉴定、同父异母姐 妹关系的鉴定等提供一定的遗传学信息，满足鉴定需求。 2 x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测第一部分 第一部分应用m e n t y p e a r g u sx 一8 试剂盒检测 x s t r 基因座 m e n t y p e a r g u s x 一8 试剂盒是b i o t y p e 公司推出的第二代商业化试剂盒，它可 以同时检测8 个x - s t r 基因座。本课题第一部分内容是应用m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒对1 9 8 名汉族无关个体进行群体遗传学数据的调查，同时将该试剂盒应用 于1 0 4 例二联体实际案例，探讨其应用价值。 l 实验材料 1 1 实验样本 无关个体血样：来源于华东地区1 9 8 名汉族健康自愿者，其中男性1 0 6 名， 女性9 2 名。 实际案例：1 0 4 例二联体案件，来源于日常检案，包括5 4 例父女二联体、2 9 例母子二联体和2 l 例母女二联体，均已用s i n o f i l e rk i t 分型后得到明确的鉴定结 论，其中排除案例6 9 例，认定案例3 5 例。 1 2 实验主要试剂 试剂名称生产厂家 c h e l e x1 0 0 ( 1 0 0 2 0 0 目) s i n o f i l e r 试剂盒 i d e n t i f i l e r 试剂盒 p o w e r p l e x 试剂盒 m e n t y p e a r g u sx - 8 试剂盒 甲酰胺 r o x p o p 4 美国b i o r a d 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国p r o m e g a 公司 德国b i o t y p e a g 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 美国a b 公司 3 第一部分 x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 1 3 实验主要仪器 仪器名称 生产厂家 微量移液器 e p p e n d o r f 5 417 r 离心机 e p p e n d o r f s l 0 离心机 恒温水浴锅 旋涡混合器 台式高速离心机 9 7 0 0 型扩增仪 3 1 3 0 型遗传分析仪 德国e p p e n d o r f 公司 德国e p p e n d o f f 公司 德国e p p e n d o r f 公司 上海一恒科学仪器有限公司 上海医科大学仪器厂 上海市离心机械研究 美国a b 公司 美国a b 公司 2 实验方法 2 1d n a 提取 采用c h e l e x 1 0 0 法【明提取基因组d n a 。具体步骤如下： 1 、在1 5 m l 离心管中加纯水i m l ，剪取血斑( 约9 1 t i i t l 2 大小) 置于管内纯水 中；室温放置3 0 m i n ，间歇振荡。 2 、1 4 0 0 0 r p m 离心6 m i r a 弃上清，保留载体。 3 、于管中加入5 0 0 9 l5 c h e l e x 1 0 0 ( 1 0 0 2 0 0 目) 悬浮液，混匀。 4 、5 6 保温3 0 m i n 。 5 、沸水浴8 m i n 。 6 、剧烈振荡5 1 0 s ，1 4 0 0 0 r r a i n 离心6 m i r a 取上清液用于p c r 扩增，4 c 保 存或冻存剩余d n a 。 2 2p c r 扩增 2 2 1 常染色体s t r 基因座扩增 采用s i n o f i l e r 试剂盒对1 5 个常染色体s t r 基因座同时扩增。p c r 体系为 1 2 5 9 l ，包括r e a c t i o nm i x5 9 l 、p r i m e rm i x2 5 9 l 、a m p l i t a qg o l dd n ap o l y m e r a s e ( 5 u t l ) 0 2 5 t t l 以及模板d n a5 9 l ( 0 5 n g - 10 n g ) 。p c r 条件为：9 5 c1l m i m9 4 c l m i n ，5 9 cl m i n ，7 2 * ( 2l m i n ，共2 8 个循环：6 0 。c6 0m i i l i l o l 。 2 2 2x 染色体s t r 基因座扩增 4 x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测第一部分 采用m e n t y p e a r g u sx 一8 试剂盒对8 个x - s t r 基因座进行复合扩增。试剂盒 推荐的p c r 体系为2 5 1 a l ，本课题在此基础上进行小体系优化，采用8 p l 体系进 行p c r 扩增，具体体系组成见表1 。p c r 条件为：9 4 ( 24 m i r a9 4 ( 23 0 s ，5 8 。c1 2 0 s ， 7 2 * c7 5 s ，共3 0 个循环；6 8 c6 0m i n t l l l 。 表1m e n t y p e a r g u sx 8 试剂盒p c r 扩增体系 p c r 组分 试剂盒推荐的p c r 体系( p l )课题采用的p c r 体系( p l ) n u c l e a s e - f r e ew a t e r1 4 12 z 7 r e a c t i o nm i x a 5 01 6 p r i e m rm i x2 5o 8 印d n ap o l y m e 勰0 4 0 1 3 ( h o ts t a r t , 2 5 u b l ) t e m p l a t ed n a 3 03 2 注：r e a c t i o nm i x a + 包括m + 、d n t p 和b s a 2 3p c r 产物分型检测 取l l x l p c r 扩增产物与1 0 i _ t l h i d i 甲酰胺r o x 混匀、离心，9 5 。c 变性3 m i n 。 通过3 1 3 0 - a v a n t 型遗传分析仪进行毛细管电泳，收集电泳信息；用基因分析软件 g e n e m a p p e ri dv 3 2 对各基因座的等位基因进行分析。 2 4 统计学分析方法 采用a r l e q u i n2 0 软件对8 个x - s t r 基因座在女性群体的等位基因分布进行 h a r d y - w e i n b e r g e 平衡检验。用c e r v u s 软件计算9 2 名女性个体在8 个x - s t r 基 因座的等位基因分布频率，用直接计数法统计1 0 6 名男性个体在4 个x s t r 连锁 群中单倍型分布频率。计算8 个x s t r 基因座在女性群体中的杂合度( h ) ，个人 识别能力( p d ) 、非父排除率( - - 联体p e d 峨与三联体p ) 和多态信息含量( p i c ) 等群体遗传学参数1 2 , 1 3 , 1 4 , 1 5 】：计算4 个x s t r 连锁群在男性群体中的h 、p d 、p e d 嘲、 p 鼬、p i c 等。具体公式见图1 ( 其中f 代表等位基因的频率，i 代表第i 个等位 基因，n 代表等位基因总数) 。采用f i s h e r 检验【1 6 】将各连锁群中的单倍型在中国人 群的分布频率与匈牙利【1 7 1 、德创1 引、日本和加纳【1 8 1 人群进行差异显著性分析。 第一部分 x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 p i c = 1 - z 2 - 2 z 2 斤 日= 者慷厂2 ) 厂七、2i 睥础= 1 2 l z 2l + z 4 p d l e = 1 - e z 2 雕k = 1 - z 2 + ，4 一( z 2 ) 2 砸o = 1 - 2 y j , 2 + z 3 图lx 染色体上基因座惟点的法医学参数计算公式 3 结果与讨论 3 18 个x s t r 基因座在女性群体中的等位基因分布情况 该试剂盒中检测的8 个x s t r 基因座两两连锁，以单倍型的形式遗传给后代。 女性群体单倍型的确定必须通过家系的调查【1 8 】，在本课题中由于试剂盒检测份数 以及家系样本收集等客观原因的限制，没有进行该方面的工作。通过对9 2 名汉族 无关女性个体的分型检测，8 个x s t r 基因座的基因型分布符合h a r d y w e i n b e r g e 平衡，结果见表1 ；8 个x s t r 基因座的等位基因分布频率见表2 ；各基因座的遗 传学参数见表3 。其中基因座d x s l 0 1 3 5 和d x s l 0 1 0 1 检见的等位基因数最多，分 别为2 1 个和1 6 个，多态信息含量也最高，分别为0 9 1 3 3 和0 8 7 6 2 。另外，在中 国人群中检测到一些新的等位基因：d x s l 0 0 7 4 ( 等位基因1 5 3 ) 、d x s l 0 1 0 1 ( 等 位基因3 6 ) ，这在匈牙利【1 7 1 、德副1 鲫、日本和加纳f 1 8 】人群中均未检见。 6 ! 銎鱼竺圭! 翌皇! 竺堡望箜坌型竺型 釜二塑坌 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i _ _ _ _ _ i _ _ _ _ _ _ - _ - - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ l - _ - - _ _ _ _ _ _ - 。一。 表18 个x s t r 基因座的h a r d y w e i n b e r g e 平衡检验结果( n = 9 2 ) x s t r 基因座卡方值 卡方检验p 值 d x $ 8 3 7 8 d x $ 7 4 2 3 3 4 4 6 3 5 6 2 7 8 1 3 8 0 1 0 d x $ 7 13 25 0 2 9 0 8 d x s l 0 1 3 42 1 2 5 4 9 d x s l 0 0 7 41 3 0 5 9 0 2 d x s l 0 1 0 1 1 6 5 2 9 3 6 0 0 6 3 4 0 7 8 3 3 0 8 4 5 5 0 8 7 8 0 0 9 2 4 3 0 8 1 4 6 0 2 3 9 7 d x s l 0 1 3 51 0 5 5 7 5 0 9 9 0 0 7 一n重一辞紧静奄匾硝逍扣留争肇祷赳本堪越 图硝皆。)(七n x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 第一部分 表38 个x s t r 基因座在如挂群体中的遗传学参数( n = 9 2 ) 3 24 个x s t r 连锁群中单倍型分布情况 男性个体只有一条x 染色体，遗传过程中表现为性连锁遗传，只遗传给女儿。 采用直接计数法统计1 0 6 名男性个体在4 个x - s t r 连锁群中单倍型分布频率，结 果见表4 。其中d x s l 0 1 3 5 一d x s 8 3 7 8 检见4 5 种单倍型、d x s 7 1 3 2 - d x s l 0 0 7 4 检见 2 9 种单倍型、h p r r b d x s l 0 1 0 1 检见3 7 种单倍型、d x s l 0 1 3 4 - d x s 7 4 2 3 检见2 6 种单倍型。 对4 个x s t r 连锁群进行群体遗传学数据的计算，结果见表5 。其中杂合度 ( h ) 为0 9 2 8 - - - 0 9 7 1 ：男性群体中个体识别能力( p d m a l 。) 为0 9 1 9 - - 0 9 6 2 ；二联 体案件中非父排除率( p e d u ) 为0 8 4 8 - - 0 9 2 6 ；三联体案件中非父排除率( p 鼬) 为0 9 1 4 - - 一0 9 6 1 。4 个连锁群在二联体中的联合非父排除率( c p e ) 为0 9 9 9 8 9 3 3 3 5 ， 在三联体中的c p e 为0 9 9 9 9 9 0 6 9 9 。多态信息含量为0 9 1 4 - 0 9 6 1 。4 个连锁群均 具有良好的多态性，适合法医学应用。 采用f i s h e r 检验对中国汉族人群4 个连锁群中各单倍型频率与匈牙利【1 7 】、德 副1 引、日本【1 8 1 和加纳【1 8 】人群进行差异显著性分析( 萨o 0 5 ) 。结果分别见表6 表9 。 可以发现，中国与德国人群的差异最为明显，分布差异具有统计学意义的单倍型 共有3 1 种；中国与日本人群的差异最小，分布差异具有统计学意义的单倍型仅有 4 种，在连锁群d x s l 0 1 0 1 h p r t b 未检见。这也充分说明了连锁群中单倍型的分 布具有地区分布差异，进行本地区本民族的群体遗传学调查具有重要的意义。 9 一心o_-u一讣聚婷冬剥枣舛如争枯琴埘七寸寸 第一部分 x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 d x s l 0 1 3 5 一 d x $ 8 3 7 8 d x $ 7 1 3 2 d x s l 0 0 7 4 h p r t b d x s l 0 1 0 1 d x s l 0 1 3 4 - d x $ 7 4 2 3 表54 个连锁群的法医学参数( n - - 1 0 6 ) 0 9 7 1 0 9 5 3 0 9 6 4 0 9 2 8 0 9 6 2 0 9 4 4 0 9 5 5 0 9 1 9 0 9 6 10 9 2 60 9 6 1 0 9 4 1 0 9 5 3 0 9 1 4 0 8 9 1 0 9 1 3 0 8 4 8 0 9 4 1 0 9 5 4 0 9 1 4 表6中国汉族与匈牙利人群差异具有统计学意义的单倍型( f i s h e r 检验，p 0 0 5 ) 表7中国汉族与德国人群差异具有统计学意义的单倍型( f i s h e r 检验，p 0 0 5 ) 1 2 x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 第一部分 d x $ 8 3 7 8 d x s l 0 1 3 5d x s l 0 0 7 4 d x s 7 1 3 2d x s l 0 1 0 1 - h p r t b d x s 7 4 2 3 d x s l 0 1 3 4 单倍型p 值单倍型p 值单倍型p 值 单倍型 p 值 1 1 2 1 1o 0 3 1 2 1 1 2 3 1 1 1 3 0 0 0 3 1 2 5 8 l b l 4 表8 中国汉族与日本人群差异具有统计学意义的单倍型( f i s h e r 检验，p n e w ，单击n e wd e t e c t o r ， 在n e w d e t e c t o r 对话框内，为s n p 位点的检测探针选择合适的报告基团和淬灭基团。 本课题所选择的1 3 个s n p 位点，等位基因1 均采用f a m 荧光素进行标记，等位基因2 均采用v i c 荧光素进行标记，采用的均是t a q m a n m g b 探针，故淬灭基团均为n f q 。 具体选项卡操作如下：在n a m e 字段中键入探针名称a l l e l e1 ，将报告基团设置为 f a m ，单击c o l o r 按钮，选择蓝色，淬灭基团选择n o n e ，然后单击o k ；单击c r e a t e a n o t h e r ，在n a m e 字段中键入a l l e l e2 ，将报告基团设置为v i c ，单击c o l o r 按钮，选 择绿色，淬灭基团选择n o n e ，然后单击o k 。 i i 创建指示器 单击n e wm a r k e r ，在n e wm a r k e r 对话框内，在n a m e 字段中键入相应的样本名， 选择在上述步骤中创建的探针a l l e l el 和a l l e l e2 ，单击o k 即可。 ( 2 ) 创建等位基因鉴别反应板文件 选择f i l e n e w ，从a s s a y 下拉列表中选择a l l e l i cd i s c r i m i n a t i o n ( 等位基因鉴 别) ；在p l a t e n a m e 字段中，键入a dp r e r e a d ( 读取等位基因鉴别扩增前荧光信号) ， 然后单击n e x t ；将指示器添加到反应板文件中，然后单击n e x t ；为每个孔指定指示 器和任务，然后单击f i n i s h 。在w e l li n s p e c t o r ( 反应孔设定) 窗口( 依次选择v i e w w e l li n s p e c t o r ) 中，输入样本名并指定任务。 ( 3 ) 读取扩增前荧光信号 选择i n s t r u m e n t 选项卡，将s a m p l ev o l u m e 更改为2 5 此。同时确保选取9 6 0 0 e m u l a t i o n 复选框。选择f i l e s a v e ，然后单击s a v e 以保留在创建反应板文件时指定 的文件名。将反应板装入仪器中。单击p r e r e a d ( 读取扩增前荧光信号) 按钮，当 机器正式开始运行时，可以显示剩余的反应时间。一般预读板过程将持续约1 分钟。 3 2 4 3 扩增d n a ( 1 ) 为扩增样本创建一个a q ( 绝对定量) 反应板文件 选择f i l e n e w ，从a s s a y 下拉列表中，选择a b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o n ( s t a n d a r d c u r v e ) ( 绝对定量，标准曲线) ；在p l a t e n a m e 字段中，键入a m p l i f i c a t i o n ( 扩增) ， 然后单击n e x t ；将探针添加到反应板文件中，然后单击n e x t ；为每个反应孔指定探 针和任务，然后单击f i n i s h 。 ( 2 ) 执行扩增程序 选择i n s t r u m e n t 选项卡；按住s h i f t 键并单击第一阶段框的底部附近以选取它， 3 5 第二部分x 染色体上s t r 与s n p 标记的分型检测 然后单击d e l e t e ，删除默认的第一阶段。单击第二阶段的第二个框，然后键入9 2 ， 将第二步的温度更改为9 2 ；将s a m p l ev o l u m e 更改为2 5 此。同时确保选取9 6 0 0 e m u l a t i o n 复选框。接受p c r 步骤的其余默认时间和温度设置。 保存文件后开始运行程序，_ 般预读板过程将持续约9 0 分钟。具体的p c r 程序 如表1 6 所示。 表1 6t a q m a n 技术中d n a 扩增程序 3 2 4 4 读取扩增后荧光信号 ( 1 ) 读取扩增后荧光信号 打开扩增前荧光信号读取反应板文件，选择i n s t r u m e n t 选项卡；确定选取9 6 0 0 e m u l a t i o n 复选框，而且将s a m p l ev o l u m e 设置为2 5 此；选择f i l e s a v ea s ，在反应 板文件名字段中键入a dp o s t r e a d ( 读取等位基因鉴别扩增