（病原生物学专业论文）hsv1包膜糖蛋白gg1的克隆表达.pdf

h s v 一1 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 中文摘要 目的 1 用毕赤酵母表达系统表达h s v - 1 型特异性抗原g g l ，为建立e l i s ah s v 一1 型特异性检测诊断试剂盒奠定基础； 2 探讨g g l 蛋白在原核表达系统中的表达及抗原性分析。 方法 1h s v - 1 包膜糖蛋白g g l 在毕赤酵母表达系统中的表达 1 1 获得目的基因、构建克隆载体p m d l 8 一t g g l 根据g e n b a n kg g l 基因全序列设计引物，以h s v 一1 之细胞增殖物提取的总 d n a 作为模板，p c r 扩增目的基因，连接于p m d l 8 - t 载体，转化t o p i o ，提取质 粒做e c o ri 、n o ti 双酶切鉴定并委托测序。 1 2 构建表达载体p p i c 9 k - g g l 将e c o ri 、n o ti 双酶切目的基因与经相同双酶切的p p i c 9 k 质粒连接，转 化t o p i o ，双酶切鉴定重组质粒。 1 3 电转化毕赤酵母( ；s 1 1 5 s a li 酶切线性化表达质粒p p i c 9 k g g l ，电转化毕赤酵母g s l1 5 。转化条 件为1 8k v 、5 m s ，连续电击两次。取转化物涂布佃平板，3 0 培养。 1 4 多拷贝转化子的筛选及诱导表达 挑取肋平板上单菌落约1 0 0 个，依次接种至含g 4 1 80 2 5 m g m l 、0 5 m g m l 、 l m g m l 、2 m g m l 的y p d 平板，3 0 。c 培养。挑取抗2 m g m lg 4 1 8 的菌落，l 甲 醇诱导表达，每2 4 h 取样一次，上清一2 0 。c 保存，待鉴定。 1 5 表达条件的优化 将工程菌换用不同的诱导体系、加不同量的诱导剂后诱导表达，每2 4 h 取 样一次，电泳观察蛋白量的变化。 1 6 表达产物的鉴定 用s d s - p a g e 电泳分析蛋白的表达情况，用间接e l i s a 法分析抗原的敏感性 和特异性。 2h s v - 1 包膜糖蛋白g g l 9 在原核表达系统中的表达 山东省医学科学院硕士学位论文 2 1 获得目的基因、构建克隆载体p m d l 8 - t g g l 9 根据文献选取g g l 基因序列亲水性强、抗原表位集中的片段，设计引物。 以p m d l8 一t _ g g l 为模板，p c r 方法扩增目的基因，连接于p f 1 ) 1 8 一t 载体，转化 t o p i o 感受态菌株，p c r 鉴定。 2 2h s v - 1g g l9 表达载体p b v 2 2 0 - g g l9 的构建 提取质粒p m d l 8 - t - g g l9 ，与表达载体同时以e c o ri 、b a m hi 双酶切，构 建表达载体p b v 2 2 0 一g g l 9 ，转化大肠杆菌d h 51 2 1 ，双酶切鉴定并委托测序。 2 3g g l9 蛋白的表达及表达产物的鉴定 4 2 * ( 2 诱导表达，s d s - p a g e 电泳检测表达情况，w e s t e r nb l o t 方法检测其抗 原性。 结果 1实现h s v - i 包膜糖蛋白g g l 在毕赤酵母表达系统中的表达 1 1 获得目的基因、构建了克隆载体p m d l 8 一t g g l p c r 方法获得薛l 基因全序列，构建了p m d l 8 一t g g l ，双酶切后电泳显示在 7 2 6 b p 、2 7 0 0 b p 左右获得2 条电泳带，大小与目的d n a 和载体片段长度相符。 测序结果显示目的基因序列与g e n b a n k 标准序列( h s v 一1 s t o c k e r 株g g l ) 9 9 同源。 1 2 构建了表达载体p p i c 9 k - g g i p p i c 9 k - - g g l 经e c o ri 和n o ti 双酶切，电泳显示在7 2 6 b p 、9 0 0 0 b p 左右 获得2 条电泳带，大小与目的d n a 和载体片段长度相符。 1 3 电转化毕赤酵母g s i l 5 s a li 酶切线性化p p i c 9 k - g g i ，电转化毕赤酵母g s l l 5 。取转化物涂布彻 平板，3 0 。c 培养3 d ，彻平板上长出多个单菌落。 1 4 筛选多拷贝转化子及诱导表达 m d 平板上长出的菌落经g 4 1 8 加压筛选，在抗2 m g m l g 4 1 8 转化子中筛选出 6 个多拷贝转化子用于诱导表达实验。 1 5 表达条件的优化 s d s - p a g e 电泳结果显示，将工程菌换用不同的诱导体系、加不同量的诱导 剂后，表达蛋白量并没有随诱导条件改变的增加。 2 h s v - 1 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 1 6 表达产物的鉴定 甲醇诱导培养9 6 h 后，将培养上清s d s p a g e 电泳，在5 9 k d a 出现电泳条 带，大小与预期目的蛋白一致；将重组蛋白g g l 作为抗原试剂做间接e l i s a 试 验结果发现，p n 为4 1 2 ( 0 7 0 0 1 7 ) ，是全病毒抗原( 0 4 i 0 1 6 = 2 5 6 ) 的1 6 1 倍，两者相比，重组抗原具有更好的抗原性。 2 实现h s v - i 包膜糖蛋白g g l 9 在原核表达系统中的表达 2 1 获得目的基因、构建了克隆载体p m d l 8 一t - g g l 9 p c r 获得目的基因，构建p m d l8 - t - g g l9 ，并转化到t o p i o 感受态菌株，获 得阳性克隆。 2 2 构建了h s 卜lg g l 9 表达载体p b v 2 2 0 - g g l 9 构建了表达载体p b v 2 2 0 - g g l 9 ，双酶切电泳显示在3 9 3 b p 、3 6 0 0 b p 左右获得 2 条电泳带，大小与目的d n a 和载体片段长度相符；测序结果显示p b v 2 2 0 - g g l 9 目的基因序列与g e n b a n k 标准序列( h s v 一1 s t o c k e r 株g g l ) 9 9 同源。 2 3g g l 9 蛋白的表达及表达产物的鉴定 4 2 诱导表达，s d s - p a g e 电泳显示在1 4 k d 出现目的条带，大小与预期一 致，w e s t e r nb l o t 方法检测其具有良好的抗原性。 结论 l 用毕赤酵母表达系统表达了目的蛋白g g l ，经初步分析表明，重组抗原 比全病毒抗原具有更好的抗原性，但表达量低。 2 用原核表达载体p b v 2 2 0 成功表达了截短目的蛋白g g l p ，w e s t e r nb l o t 方法检测其具有良好的抗原性，且表达量高。 主题词：单纯疱疹病毒，i 型：g g l ：毕赤酵母表达系统；原核表达系统 山东省医学科学院硕士学位论文 a b s t r a c t o b j e e t ： 1t oe x p r e s st h et y p e - s p e c i f i ca n t i g e ng g1o fh s v - 1i np i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o n s y s t e ma n dt oe s t a b l i s ha k i n do f t y p e s p e c i f i ce l i s a a s s a yk i tb a s eo ni t 2t oe x p r e s st h et y p e - s p e c i f i ca n t i g e ng g1o fh s v - 1i ne c o l ia n dt oa n a l y z ei t s a n t i g e n i c i t y m e t h o d ： 1e x p r e s s i o no ft h et y p e - s p e c i f i ca n t i g e ng g lo fh s v - 1i np i c h i ap a s t o r i s s y s t e m 1 1t oo b t a i nt h et a r g e tg e n ea n dc o n s t r u c tt h ep m d l 8 一t - g g l p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h eg g ls e q u e n c ei ng e n e b a n ka n dt h e t a r g e tg e n ew a sa m p l i f i e db yp c ru s i n gt h et o t a ld n a e x t r a c t e df r o mc u l t u r e dv i r u s a st e m p l a t e s t h ep r o d u c t so b t a i n e db yp c rw e r ef i g a t e dt ot h ep m d 18 一tv e c t o r , t h e nt r a n s f o r m e di n t ot h et o p 10c o m p e t e n tc e l la n da s s e s s e db ys e q u e n c i n g 1 2t oc o n s t r u c tt h ep p i c 9 k - g g l t h ef r a g m e n t sa n dp p i c 9 k d i g e s t e d w i t he c o ri ，n o t1w e r el i g a t e d ， t r a n s f o r m e di n t ot h et o p10c o m p e t e n tc e l la n da s s e s s e db yd i g e s t i n gw i t he c o ri ， n o ti 1 3t oe l e c t r o t r a n s f o r m a tt h ep i c h i ap a s t o r i sg s l l 5 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r el i n e a r i z a t e dw i t hs a li ，t h e ne l e c t r o t r a n s f o r m a t e d i n t op i c h i ap a s t o r i sc o m p e t e n tc e l l t h ee l e c t r o t r a n s f o r m a t i o nc o n d i t i o nw a s1 8k v , 5 m s t h ep r o d u c t sw e r es p r e a do nm d p l a t ea n dc u l t i v a t e da t3 0 。c 1 4t os c r e e nm u l t i c o p yc o n v e r t e r sa n di n d u c ee x p r e s s i o n t h em u l t i c o p yc o n v e r t e r sw e r es c r e e n e db yg 418a n di n d u c e dw i t hm e t h a n 0 1 t h ei n d u c e dp r o d u c t i o nw a sh a r v e s t e da to h , 2 4 h , 4 8 h , 7 2 h , a n d9 6 h 1 5t oo p t i m i z et h ec o n d i t i o no fe x p r e s s i o n i no r d o rt or a i s et h ep r o d u c t i o no ft a r g e tp r o t e i n , w ec h a n g e dt h ei n d u c t i o n c u l t u r em e d i u ma n dt h ed o s eo fi n d u c t o r t h ep r o d u c t i o no ft a r g e tp r o t e i nw a s o b s e r v e db ys d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i s 4 一h s v 一1 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 _ 一 1 6t oa s s e s st h ee x p r e s s e dp r o d u c t i o n t h e e x p r e s s i o no ft a r g e tp r o t e i nw r i t sa n a l y s i s e db ys d s p a g e t h es e n s i t i v i t y a n ds p e c i f i c i t yw e n a n a l y s i s e db yi n d i r e c te l i s a 2e x p r e s s i o no ft h et y p e s p e c i f i ca n t i g e ng g l po fh s v - 1i ne c o l i 1 1t oo b t a i nt h et a r g e tg e n ea n d c o n s t r u c tt h ep m d l 8 t - g g l p p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h eg g ls e q u e n c ei ng e n e b a n ka n dt h et a r g e t g e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yp c r t h ep r o d u c t so b t a i n e db yp c rw e r el i g a t e dt o t h ep m d1 8 一tv e c t o r , t h e nt r a n s f o r m e di n t ot h et o p 10c o m p e t e n tc e l la n da s s e s s e d b y p c r 1 2t oc o n s t r u c tt h ep b v 2 2 0 g g l p t h ef r a g m e n t sa n dp b v 2 2 0d i g e s t e dw i t he c o ri ，b a m h1w e r e l i g a t e d ， t r a n s f o r m e di n t ot h ed h 5 ac o m p e t e n tc e l la n da s s e s s e db yd i g e s t i n gw i t he c o r i ， b a m hia n ds e q u e n c i n g ， 1 3t h ee x p r e s s i o na n da s s e s s i o no fg g l p t h et a r g e tp r o t e i nw a si n d u c e da t4 2 c t h ee x p r e s s i o no f t a r g e tp r o t e i nw a s a n a l y s i s e db ys d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i s t h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yw e r e a n a l y s i s e db yw e s t e r nb l o t r e s u l t ： 1e x p r e s st h et y p e s p e c i f i ca n t i g e ng g lo fh s v - 1i np i c h i ap a s t o r i ss y s t e m s u c c e s s f u l l y 1 1o b t a i n e dt h et a r g e tg e n ea n dc o n s t r u c t e dt h e p m d l 8 t - g g l t h et a r g e tg e n ew a sa m p l i f i e db yp c ra n dc o n s t r u c t e dt h ep m d 18 t - g g l t h e p l a s m i d sw e r ee x t r a c t e da n dd i g e s t e dw i t he c o ri ，n o ti t h er e s u l to f a g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sd i s p l a y e dt w os t r a p sa t7 2 6 b p ，2 7 0 0 b pr e s p e c t i v e l y t h er e s u l to f s e q u e n c i n gr e v e a l e dt h et a r g e tg e n ei np m d 18 - t - g gw a s h o m o l o g o u sw i t hs t a n d a r d s e q e n c eo ng e n b a n ka t9 9 1 2c o n s t r u c t i o no ft h e p p i c 9 k - g g l t h e f r a g m e n t s a n dp p i c 9 k d i g e s t e dw i t he c o ri ，n o t1w e r e l i g a t e d ， t r a n s f o r m e di n t ot h et o p10 c o m p e t e n tc e l la n da s s e s s e db yd i g e s t i n gw i t he c o ri ， 5 山东省医学科学院硕士学位论文 n o ti t h er e s u l to fa g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd i s p l a y e dt w os t r a p sa t7 2 6 b p ， 9 0 0 0 b pr e s p e c t i v e l y t h es i z e so ff r a g m e n t sw e r ec o i n c i d e n tw i t ht h es i z eo ft a r g e t g e n ea n dp l a s m i df r a g m e n t 1 3e i e c t r o t r a n s f o r m a t i o no ft h ep i c h i a p a s t o r i sg s l l 5 t h er e c o m b i n a n tp l a s r n i d sw e r el i n e a r i z a t e dw i t hs a li ，t h e ne l e c t r o t r a n s f o r m a t e d i n t op i c h i ap a s t o r i sc o m p e t e n tc e l l t h ep r o d u c t sw e r es p r e a do nm d p l a t ea n d c u l t i v a t e da t3 0 c m a n yc o l o n ye r u p t e da f t e r3d a y s 1 4s c r e e n i n gm u l t i c o p yc o n v e r t e r sa n di n d u c e de x p r e s s i o n t h em u l t i c o p yc o n v e r t e r sw e r es c r e e n e db yg 418a n di n d u c e dw i t hm e t h a n 0 1 t h e i n d u c e dp r o d u c t i o nw a sh a r v e s t e da to h , 2 4 h , 4 8 h , 7 2 h , a n d9 6 h 1 5o p t i m i z i o no ft h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n t h er e s u l t so fs d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i sr e v e a l e dt h a tt h e p r o d u c t i o n so f t a r g e tp r o t e i na td i f f e r e n tc o l l d i t i o nw e r en o ti n c r e a s e 。 1 6a s s e s s i o no ft h ee x p r e s s e dp r o d u c t i o n t h er e s u l to fs d s - p a g ed i p l a yas t r a pa t5 9 k d a , w h i c hw a sc o i n c i d e n tw i t h t a r g e tp r o t e i n t h es e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yw e r ea n a l y s i s e db yi n d i r e c te l i s a t h er e s u l tr e v e a l e dp no fr e c o m b i n a n tp r o t e i nw a s4 12 ，w h i l ep no fv i r a la n t i g e n w a so n l y2 5 6 s ot h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a sp r e f e r a b l ya n t i g e n i c i t y 2e x p r e s s i o no ft h et y p e s p e c i f i ca n t i g e ng g l po fh s v - 1i ne c o l i 1 1o b t a i n e dt h et a r g e tg e n ea n dc o n s t r u c t e dt h ep m d l 8 i - g g l p t h et a r g e tg e n ef r a g m e n tw a sa m p l i f i e db yp c r , a n dt h ep r o d u c t sw e r el i g a t e dt o t h ep m d18 - tv e c t o r , t h e nt r a n s f o r m e di n t ot h et o p10c o m p e t e n tc e l la n dg a i n e d p o s i t i v ec l o n e s 1 2c o n s t r u c t e dt h ep b v 2 2 0 g g l p t h ef r a g m e m sa n dp b v 2 2 0d i g e s t e dw i t he c o ri ，b a m h1w e r el i g a t e d ， t r a n s f o r m e di n t ot h ed h 5 ac o m p e t e n tc e l la n da s s e s s e db yd i g e s t i n gw i t he c o ri ， b a m hia n ds e q u e n c i n g t h er e s u l to f a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sd 邱l a y e dt w os t r a p s a t3 9 3 b p ，3 6 0 0 b pr e s p e c t i v e l y t h es i z e so ff r a g m e n t sw e r ec o i n c i d e mw i t ht h es i z eo f t a r g e tg e n ea n dp l a s m i df r a g m e n t t h er e s u l to fs e q u e n c i n gr e v e a l e dt h et a r g e tg e n ei n p b v 2 2 0 一g g 1 pw a s h o m o l o g o u sw i t hs t a n d a r ds e q e n c eo ng e n b a n k a t9 9 6 h s v - 1 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 1 3t h e e x p r e s s i o na n da s s e s s i o no fg g l p t h et a r g e tp r o t e i nw a si n d u c e da t4 2 c t h er e s u ko fs d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i s d i s p l a y e das t r a pa t14 k d ，w h i c hw a sc o i n c i d e n tw i t ht a r g e tp r o t e i n w e s t e r nb l o t r e v e a l e dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a ss a t i s f a c t o r ya n t i g e n i c i t y c o n c l u s i o n ： 1t h et a r g e tp r o t e i n ( g g1 ) w a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi np i c h i ap a s t o r i s i n i t i a l a n a l y s i si n d i c a t e dt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a sp r e f e r a b l ya n t i g e n i c i t y b u tt h e p r o d u c t i o nw a sl o w 2t h et r u n c a t e dg g lw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l i t h er e s u l to fw e s t e r n b l o tr e v e a l e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nh a ss a t i s f a c t o r ya n t i g e n i c i t y a n di t s p r o d u c t i o nw a sh i g h k e y w o r d s ： h e r p e ss i m p l e xv i r u st y p e2 ( h s v - 2 ) ；g g l ；y e a s te x p r e s s i o ns y s t e m ；p r o t o k a r y e x p r e s s i o ns y s t e m 7 山东省医学科学院硕士学位论文 h s v ( h e r p e ss i m p l e xv i r u s ) a ( a bs o r b e n c e ) a m p ( a m p i c i l l i n ) b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) b p ( b a s ep a i r ) b u f f e r c p e ( c y t o p a t h ice f f e c t ) 主要符号表 d n t p ( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) d n a1 i g a s e e c o l i ( e s c h e r i c h i ac o l i ) e b ( e t l i o l i u nb r o m i d e ) 人单纯疱疹病毒 吸光度值 氨苄青霉素 牛血清白蛋白 碱基对 缓冲液 致细胞病变效应 脱氧核糖核苷三磷酸 d n a 连接酶 埃希氏大肠杆菌 溴化乙锭 e d t a ( e t h y l e n ed i a m i n e e t et r a a c e t i ca c i d )乙二胺四乙酸 e pt u b e ( e p p e n d o r ft u b e ) e t o h ( e t h a n 0 1 ) e l i s a ( e n z y m e li n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) n t ( n u c l e o t i d e ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) p a g e ( p 0 1 y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s is ) p b s ( p h o s p h a l eb u f f e r e ds a li n e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) r 2 5 0 s d s ( s o d iu md o d e c y ls u if a t e ) t b e t e m e d 8 e p 管 乙醇 酶联免疫吸附试验 核苷酸 开放性读码框 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲一生理盐水 聚合酶链反应 考马斯亮蓝 十二烷基磺酸钠 t r i s 硼酸 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 山东省医学科学院硕士学位论文 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研 究成果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论 文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不 包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属山东省医学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复 制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用 学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然 为山东省医学科学院。 论文作者签名：拯 导师签名：趁三 1 i - i s v l 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 研究生导师和课题指导小组介绍 1 导师：孟红，女，4 8 岁，研究员。从事医学病毒学研究2 0 多年， 主要从事病毒疫苗、疫苗佐剂和病毒诊断试剂的研制、抗病毒抗生 素的研制。9 0 年代以来，承担省级课题1 2 项，国家自然基金2 项， 山东省科技进步二等奖1 项，三等奖3 项，院级奖励7 项。 2 万言珍，女，1 9 7 9 9 出生，硕士，研究实习员，分子病毒学专业 3 李鹏，男，1 9 8 0 1 出生，硕士，研究实习员，微生物学专业 h s v 一1 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 刖吾 单纯疱疹病毒i 型( h s v - 1 ) 属疱疹病毒科、单纯疱疹病毒属，是人类最早发 现的疱疹病毒，也是人类病毒性疾病中最常见的病原体。正常人感染该病毒一 般不出现明显的临床症状，但在免疫功能低下人群，如a i d s 病人、恶性肿瘤 或接受器官移植的病人等，则可导致严重的临床症状，甚至威胁病人的生命。 另外，h s v 1 是t o r c h 系列病原中最为常见的病原体，孕妇由于内分泌的改 变和机体免疫力的下降，一方面使既往感染的病原体容易得到激活出现复发感 染，同时也容易原发感染。孕妇在孕早期无论是复发性感染或原发性感染，不 仅会损害母体，还可引起宫内感染导致流产、死胎及早产，并可引起胎儿畸形。 同时，h s v - i 可感染人类多种组织和细胞，发生在内脏和中枢神经系统的h s v - 1 感染通常病情严重，并且诊断困难，但及时给予抗病毒治疗能明显改善预后。 因此，早期快速诊断h s v - 1 活动性感染，以便及时进行治疗以及在孕期开展 h s v - 1 感染状态的检查，对活动性感染的孕妇进行定期监控，对优生优育工作 和促进国民健康都具有重要意义。 h s v - 1 与h s v - 2 同属单纯疱疹病毒属，为单纯疱疹病毒的两个血清型。迄 今已测定了两者基因组的全部序列，分析显示它们在核苷酸序列、框架结构、 编码的蛋白及功能上均存在较大的同源性，两者之间存在着广泛的抗原交叉。 然而由于h s v - 1 与h s v - 2 在致病特征、流行特点、预后以及社会意义上存在着 较大的差别，因此对两者做出正确的鉴别诊断具有重要的临床价值和社会意义。 研究表明由h s vu s 4 序列区编码的包膜糖蛋白g g 是h s v - 1 与h s v - 2 型 间差异最大的一个糖蛋白，也是抗h s v 体液免疫应答的主要靶位，其诱导产生 的的抗体可将h s v - 1 与h s v - 2 区分开来，可作为h s v 血清学检测最可靠的型 特异性抗原。因此，g g l 作为抗原检测h s v - 1 感染，能有效提高e l i s a 实验的 特异性，可作为h s v 型特异性血清学诊断的标准抗原。 本研究选取g g l 基因序列，首先选用毕赤酵母表达系统进行表达，初步分 析显示表达的目的蛋白比全病毒抗原具有更好的抗原性。但由于其表达量偏低， 优化表达条件后产量亦无明显提高，大规模生产成本过高，不适于用作检测试 剂盒的抗原。综合分析各种因素后，我们决定改用操作简便、表达效率较高的 原核大肠杆菌表达系统，先后选用了p e t - 3 0 a ( + ) 、p t r ch i s a 、p q e 3 0 a 、p g e x - 2 t 9 山东省医学科学院硕士学位论文 表达载体未获得目的蛋白，最终利用带有p r p l 启动子的p b v 2 2 0 载体获得成 功。本研究中我们通过引物加入6 h i s 标签，易于用n i - n t a s e p h a r o s e 螯和层 析柱纯化，有助于蛋白的大量提取和纯化，另外大肠杆菌的培养简单，也降低 了试剂应用的成本。本研究为h s v - 1 早期诊断试剂盒的研制奠定了基础。 材料 一实验材料 1 菌株载体： 1 ) t o p l 0 ：本室保存； 2 ) b l 2 1 ( d e 3 ) 、b l 2 1 ( p l y s s ) - 本室保存； 3 ) m 1 5 ：本室保存； 4 ) d h 5a ：本室保存； 5 ) 毕赤酵母g s l l 5 ：本室保存； 6 ) p m d 一1 8 t ：购白宝生物工程( 大连) 有限公司； 7 ) p e t - 3 0 a ( + ) 本室保存； 8 ) p t r ch i s a ：本室保存； 9 ) p q e 3 0 a - 本室保存； 1 0 ) p b v 2 2 0 ：由山东省医药生物技术研究中心王世立研究员惠赠； 1 1 ) p p i c 9 k - 本室保存； 1 2 ) p g e x 2 t ：本室保存。 2 细胞、毒株和引物 1 ) h s v - 1 病毒株：引自中国疾病预防控制中心病毒病所。 2 ) 人喉上皮细胞癌( h e p 2 ) 细胞：本室保存。 3 ) h s v - 1 d n a 模板的制备：h s v - i 在h e p 2 细胞上增殖，当c p e 达到9 0 时 终止培养，8 0 c 冻融三次，2 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，收集上清，通过异丙醇沉淀 法提取病毒全基因组d n a 。 4 ) 引物：g c n e r u n n e r 辅助设计引物，由北京博尚生物技术有限公司合成。 真核表达： a 015 - g t a g a a r t c c a c c a c c a c c a c c a c c a c a t g t c g 3 a 0 25 a c c a c c a c c a c a t g t c g c a g g g c g c c a t - 3 1 0 h s v - 1 包膜糖蛋白g g l 的克隆表达 a 0 35 - i ”i c g c g g c c g c c i a c c c g c g t i - 3 原核表达： g g l y s ： 5 一c 闺ra t gt c gc a g g g cg c ca t g 一3 g g l y a ：5 - g a at t c c c cg c gt t cg g a c g gc - 3 z g g l s ： 5 一cg g t g t at t a c a t a t gc c c a c ca a cg t c 3 z g g l a ： 5 - a gc g gc t cg a gt t ga g gc g tc - 3 y g g ls ： 5 一c g g t g t a t t a c a t a t g c c a a g t a l t t g 一3 1 y g g l a ： 5 一a gc g gc t cg a gc t tc g g g c ga c - 3 g g l y s 2 ： 5 - g g at c cg c ca = r gc g t g c cg t tg 3 g g l p a ： 5 - g a at t c c c cg c gt t cg g ac - 3 g g l y s 2 ： 5 - g g at c cg c ca t gc g t g c cg t tg 一3 g g l a 2 1 ： 5 一g a at t c c t ac c cg c gt t cg g ac - 3 。 p b v 二s ： 5 。g a at t c a t gg g tc g t c c ct c gc 3 p b v - a 1 ：5 a cc a c c a cc g ga a cc a ag g gt c 3 p b v 二a 2 ：5 g g at c c t t ac a cc a c c a c c a cc a cc a cc g ga a cc 3 3 质粒提取试验材料： 1 ) 质粒d n a 小量提取试剂盒：购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 2 ) 质粒纯化试剂盒：购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 4 d n a 酶切的实验材料： 核酸内切酶e c o ri 、n o ti 、n d ei 、x h oi 、b a m hi 、h i n d m 均为宝生物 工程( 大连) 有限公司产品。 f i d n a 回收试剂盒：购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。 6 d n a 连接体系：t 4d n al i g a s e 及相关的1 0 x t 4d n ab u f f e r 均为宝生物工程 ( 大连) 有限公司产品。 7 p c r 反应体系： 1 0 x p c rr e a c t i o nb u f f e r 、2 5 m m d n t p 、t a q d n a 聚合酶均为北京天根生化 科技有限公司产品乞 8 琼脂糖凝胶电泳实验材料： 1 ) 1 0 xt b e 电泳缓冲液： 山东省医学科学院硕士学位论文 t r i s5 4g ( 上海聚源生物科技有限公司) 硼酸2 7 5g ( b o r i ca c i d a m r e s c o 分装) 2 0 m lo 5 me d t a ( a r n r e s c o 分装) ( p h 8 o ) 加去离子水至5 0 0