（海洋生物学专业论文）壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究.pdf

壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 摘要 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素( c h i t i n ) 的脱乙酰的产物，是一种天然可生物 降解的阳离子多糖。有关壳聚糖及其聚合物抗菌性能的研究表明，壳聚糖不仅具 有天然抗菌性能，而且具有广谱抗菌性。近年来，关于甲壳质、壳聚糖及其衍生 物的抑菌机理的认识经有了长远的发展，但抑菌行为的确切机理还不清楚。同时， 由于壳聚糖的水溶性较差，研究大都围绕其水溶性衍生物，即溶液状态壳聚糖的 抑菌行为展开。本文基于一种固态的壳聚糖微球分散体系的制备及其理化性质的 研究，以一种新型介质通过界面作用来研究壳聚糖的抑菌性。 采用乳化交联法制备的不同类型的壳聚糖微球( c m s ) 样品球型完整，边缘 清晰，表面光滑，具有良好的热稳定性，能够在1 1 0r p m 的培养基中形成良好稳 定的固体分散体系。粒径分布表明，微球大小均一，。平均粒径为1 2 4 岬。红外 图谱分析表明了不同脱乙酰度( d d ) 样品之间结构的差异；特征吸收峰表明油 酰基团成功引入了壳聚糖分子。电位滴定法计算出了三种不同脱乙酰度样品的 d d 分别为9 7 3 、8 3 7 、6 2 6 ；红外光谱法计算得油酰壳聚糖微球( o c m s ) 的取代度分别为5 和1 0 。不同样品在不同p n 条件下的解离常数p k 也呈现 出了与结构相关的变化，这些变化会影响壳聚糖微球样品的抑菌行为。 壳聚糖微球分散体系对大肠杆菌ec o l i 和金黄葡萄球菌& t 3 u g e u s 的生长均 具有抑制作用，随着体系中的微球浓度的增加而增强，随体系p h 值得降低而增 强，但在中性条件下，同样表现出了抑菌活性。由于菌种不同，壳聚糖微球对两 种菌产生抑制的作用方式存在较大差异：对于a u r e u s 生长的抑制主要是通过 壳聚糖微球样品的质子化与疏水性的共同作用实现的，而疏水相互作用是主要作 用方式；对ec o l i 的抑菌效果主要取决于分子上的游离胺基的作用，疏水结构 同样起着重要作用，但并非主要作用。 镁离子对细菌膜稳定性影响的研究表明，壳聚糖的抑菌活性与细菌细胞壁上 结合的二价金属离子相关。在酸性环境中，微球质子化的表面能够与二价金属离 子竞争结合菌体表面的负电性基团；中性环境中，作用于g + 菌时，微球通过疏 水结构改变菌体壁肽聚糖构象，而后游离氨基螯合二价金属离子，导致肽聚糖层 解体；作用于g 。菌时，微球表面的游离胺基可直接螯合二价金属离子，导致细 菌外膜解体。微球与菌体通过表面结合导致细胞壁外层的破坏是壳聚糖产生抑菌 作用的第一步，使磷脂双分子层暴露出来。 对菌体膜蛋白的影响表明，无论是中性还是酸性环境中，微球都会导致菌体 细胞壁甚至细胞膜结构发生变化，改变壁蛋白及膜蛋白的空间构象；电镜照片显 示细菌与c m s 借助表面相互结合，通过界面抑制作用产生抑菌行为，为c m s 可 导致菌膜破裂，胞内物质释放提供直接证据；细胞膜透性实验，说明c m s 与菌 体相互作用后，增强了细胞膜的渗透性，从而降低了对菌体胞内物质的保护，并 且作用随c m s 表面疏水性的增强而增强；卵磷脂对c m s 抑菌作用影响的研究， 揭示了磷脂在c m s 与e c o l i 及a u r e u s 菌体细胞膜相互作用中作为结合位点， 与壳聚糖分子反应，改变菌体膜透性并引起菌体膜破裂，导致细菌死亡。 关键词：壳聚糖；微球；分散体系；抑菌作用 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f c h i t o s a nm i c r o s p h e r e s -一 i nd i s p e r s i n gs t a t e a b s t r a c t c h i t o s a ni san a t u r a lp o l y s a c c h a r i d ew h i c hi sap a r t i a l l yn - d e a c e t y l a t e d d e r i v a t i v eo fc h i t i n d u et ot h eu n i q u ep o l y c a t i o n i cn a t u r e ，c h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v e s h a v eb e e np r o p o s e df o rv a r i o u sa p p l i c a t i o n si nb i o m e d i c a l ，f o o d ，a g r i c u l t u r ea n d e s p e c i a l l ya p p l i e da s a n t i m i c r o b i a la g e n t i n v e s t i g a t i o n sa b o u tt h ea n t i b a c t e r i a l p r o p e r t yo fc h i t o s a na n di t sd e r i v a t i v ep r o v et h a tc h i t o s a nh a san a r l r a la n db r o a d s p e c t r t m ao fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e s t h e r eh a sb e e ng r e a ti m p r o v e m e n ti n t h e k n o w l e d g eo ft h ea n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m ，h o w e v e r , t h ec e r t a i nh a sn e v e rb e e n k n o w ny e t a d d i t i o n a l l y , s i n c ec h i t o s a ni si n s o l u b l ei nw a t e r , m o s to ft h er e s e a r c h e s a b o u tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yw e r ef o c u s e do nt h es o l u t i o n m a n ye f f o r t st op r e p a r e f u n c t i o n a ld e r i v a t i v e sb yc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n soi n c r e a s et h es o l u b i l i t yi nw a t e r h a v eb e e nr e p o r t e d i nt h i sp a p e r , p r e p a r a t i o na n dp h r s i o c h e m i e a lp r o p e r t i e so f c h i t o s a ni c r o s p h e r e si ns o l i dd i s p e r s i n gs t a t eh a v eb e e ns t u d i e d ，i no r d e rt oi n v e s t i g a t e t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fc h i t o s a nt h r o u g hi n t e r f a c i a le f f e c t c h i t o s a nm i c r o s p h e r e s ( c m s ) a r ep r e p a r e db ye m u l s i f i c a t i o nc r o s s - l i n k i n gm e t h o d , w h i c hh a v eb e t t e rt h e r m a ls t a b i l i t ya n dd i s p e r s ew e l la t1 10r p mi nc u l t u r e t h ec m s a l es m o o t h s u r f a c ea n ds p h e r i c a ls h a p eo fd i a m e t e ro fa b o u t12 4 【n f t i rs p e c t r u m o ft h ec m si n d i c a t e st h ed i f f e r e n c e sb e t w e e ns a m p l e sw i t hd i f f e r e n td e g r e eo f d e a c e t y l a t i o n ( d d ) ，a n dt h eo l e o y lg r o u p sa r ei n t r o d u c e di n t ot h ec m s a so c m s t h e d do f t h et h r e es a m p l e sa r e9 7 3 、8 3 7 、6 2 6 ，r e s p e c t i v e l y w h i l et h ed e g r e eo f s u b s t i t u t i o no fo c m sa l e5 a n d10 t h ep r o t o n a t i o no fc o n s t a n tp k os h o w s c h a n g e sc o r r e l a t i n gt ot h ed i f f e r e n tc o n s t r u c t i o n s ，w h i c hw i l la f f e c tt h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t yo ft h ec m s c m ss h o wi n h i b i t o r ye f f e c ta g a i n s te c o l ia n ds a u r e u s t h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t i e si n c r e a s ew i t ht h ei n c r e m e n to fc o n c e n t r a t i o n so ft h ec m s ，a n dd e c r e a s ew i t h t h et h ei n c r e m e n to ft h ep hv a l u e ，a sw e l la se x e r ta tn e u t r a lc o n d i t i o n o w i n gt ot h e d i f f e r e n ts t r a i no ft h et e s t e db a c t e r i u m ，t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa r ed i f f e r e n t c m s i n h i b i t a u r e u sb yc o o p e r a t i v ee f f e c t so fp r o t o n a t i o na n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n ， w h e nt h el a t t e rp l a y sag r e a t e rr o l e f o rt h eec o l i , t h ei n h i b i t o r ye f f e c ti sm o s t l y d e p e n d e do nt h ef r e ea m i d oo nt h e c h i t o s a nm o l e c u l e ，w h e nt h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o np l a y sa ni m p o r t a n te f f e c tb u tn o tt h ep r i m a r y t h ee f f e c to fm a g n e s i u mo nt h es t a b i l i t yo ft h eb a c t e r i a lc e l lw a l li n d i c a t e st h a t t h ec o m b i n a t i o no ft h ed i v a l e n tc a t i o n so nt h ec e l lw a l l ，w h i c ha r ee s s e n t i a lt ot h e s t a b i l i t yo ft h ew a l l ，i n f l u e n c e st h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fc h i t o s a n u n d e ra c i d i c c o n d i t i o n , t h ep r o t o n a t i o no ft h es u r f a c e sm a k e sc m sc o m p e t ew i t ht h ed i v a l e n t c a t i o n st oc o m b i n ew i t l lt h ea n i o ne x i s t i n go nt h eb a c t e r i a ls u r f a c e a tn e u t r a lp h ，f o r g r a m - p o s i t i v eb a c t e r i u m ，t h eh y d r o p h o b i cp a r t sc h a n g et h ec o n f o r m a t i o no ft h e p e p t i d o g l y c a nl a y e ra n dc a l l s ei t d e s t a b i l i z e db yc h e l a t i n gt h ed i v a l e n tc a t i o n s i nt h e c a s co fg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i u m , t h ef r e ea m i d oo nt h es u r f a c eo fc m sc o u l dc h e l a t e t h ed i v a l e n tc a t i o n sd i r e c t l y , a n dr e s u l ti nt h ed e s t a b i l i z a t i o no ft h eo u t e rm e m b r a n e t h ec o r r u p t i o no ft h ec e l lw a l la f t e rt h ei n t e r r a c i a le f f e c tb e t w e e nc m sa n dt h e b a c t e r i u m , w h i c hc a u s c st h ep h o s p h o l i p i d se x p o s e d ；i st h ef i r s ts t e pt h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y n l ee f f e c to nt h em e m b r a n ep r o t e i n ss h o w st h a tc m sc o u l dc h a n g et h e c o n s t r u c t i o no ft h ec e l lw a i l 嬲w e l l 弱m e m b r a n ee v e n , a n da l t e rt h ec o n f o r m a t i o no f t h ep r o t e i ne x i s t i n go nt h ew a l la n dm e m b r a n e t h es c a ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p e ( s e m ) p h o t o g r a p h se x h i b i tt h ec m sc o m b i n ew i t ht h eb a c t e r i u ma n di n h i b i tt h e i rg r o w t h t h r o u g hi n t e r f a c i a li n t e r a c t i o no nt h es u r f a c e t h ep h o t o sa l s oo f f e rd i r e c te v i d e n c eo f t h ed e p l e t i o no ft h ec e l la n dt h e l e a k a g eo ft h ei n t r a c e l l u l a r s u b s t a n c e s n 圮 p e r m e a b i l i t y e v a l u a t i o ni l l u m i n a t e sc m si n c r e a s et h eb a c t e r i a lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y a n dw e a k e nt h e p r o t e c t i o n o ft h e i n t r a c e l l u l a rs u b s t a n c e s c o r r e s p o n d i n g l y t h ed i s r u p t i o ns t r e n g t h e n e d 、j l ，i mt h ei n c r e a s eo ft h eh y d r o p h o b i c e f f e c t t h ee x p e r i m e n to fl e c i t h i ni n f l u e n c ei n d i c a t e st h a tp h o s p h o l i p i d sa r e t h e c o m b i n i n gs p o to nt h em e m b r a n e ，w h e r ec m s i n t e r a c tw i t i lt h ee c o l ia n dsa u r e u s t h ei n t e r a c t i o na l t e r st h em e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dm a k e st h em e m b r a n ec o r r u p t e d ； w h i c hl e a d st ot h ed e a t ho ft h eb a c t e r i u mc o n s e q u e n t l y k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；n i c r o s p h e r e ；d i s p e r s i n gs y s t e m ；a n t i b a c t e ri a l a c t i v i t y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：身初碉 签字日期：渺彦年歹月仍日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 盈时 导师签 签字日期：咖舌年i 月加日 签字日期：枷，年r 月i , d 日 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 0 前言 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 0 1 壳聚糖及其衍生物抗菌性的研究进展 壳聚糖是由甲壳素在强碱性条件下脱乙酰基后形成的种重要的衍生物，呈 白色或灰白色无定形、半透明、略有珍珠光泽，在自然界中产量仅次于纤维素壳 聚糖的化学结构与纤维素相似，是由多个n 乙酰氨基葡萄糖通过q ( 1 4 ) 糖苷键 连接起来( 成庆利，2 0 0 6 ) 。壳聚糖包含超过5 0 0 0 个葡萄糖氨单位，商业上，一 般通过碱液( n a o h ，4 0 5 0 ) 水解虾、蟹壳中的几丁质( n 乙酰葡萄糖氨聚合 物) 制备壳聚糖( 图0 1 1 ) ( g o o s e n ，1 9 9 7 ；h a n , 1 9 9 9 ；l i t h2 0 0 1 ) 。 图0 1 1 从甲壳质制备壳聚糖 f i g o l - 1p r e p a r a t i o nc h i t o s a nf r o mc h i t i n 最近的发酵工程领域的研究表明，真菌( a s p e r g i l l u sn i g e 黑曲霉) 培养为壳 聚糖来源提供了另一选择( t e n g ，2 0 0 1 ；p o c h a n a v a n i c h ，2 0 0 2 ) 。壳聚糖是甲壳 素n 脱乙酰化产物，但脱乙酰的程度不可能达到1 0 0 。甲壳素与壳聚糖在n 脱 乙酰化程度上没有严格而清晰的界定。与人工合成地可替代纤维素的含氮量 ( 1 2 5 ) 相比，壳聚糖与甲壳素具有较高的含氮量( 6 8 9 ) ，因此蕴含较大的 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 商业价值，这也使得壳聚糖成为一种很好的螯合剂。由于大多数多聚物都是人工 合成的，它们的生物相容性及生物可降解性与纤维素、葡萄糖、甲壳素、壳聚糖 等天然多聚物及其衍生物相比，显示出很大局限性。与此同时，这些天然聚合物 也受到其自身参与反应与可加工处理的限制。 壳聚糖的特性可根据特定应用进行改变，如改变脱乙酰度和分子量。壳聚糖 溶液的粘度受到壳聚糖本身脱乙酰度( d d ) 、分子量和浓度，及溶液离子浓度、 p h 条件和温度等因素的影响。一般而言，壳聚糖溶液的粘度随着温度的升高而 降低，p h 对粘度的影响与特定的酸相关。当p n 3 0 0 ) 刀 d 为单个微球的粒径；1 1 为被测样品总计入微球数；d 为被测样品平均粒径。 1 2 1 3 不同脱乙酰度壳聚糖微球的电位滴定 采用双突跃法( j i a , 2 0 0 1 ) ，准确称量壳聚糖微球样品o 2 9 加入定量的0 i m o l l h c l ，搅拌至全溶，用o 1m o l l 的标准n a o h 溶液滴定，记录消耗的n a o h 溶液 体积和相应的p h 值，做p h 值v n a o h 滴定曲线和一级微商曲线，找出突跃起点， 按下式计算样品的脱乙酰度： q ：坐兰竺幽兰! q 三兰! 鱼 m 0 0 9 9 4 式中： v 二个突变点消耗的n a 0 h 体积之差( m 1 ) ； n a 0 h 的浓度m o l l ； m 样品质量g ； a 脱乙酰基程度； 1 6 氨基的相对分子质量； 0 0 9 9 4 理论氨基含量。 1 2 1 4 微球分散性研究 将干燥后的微球样品至于蒸馏水中，转子搅拌下，观察微球分散情况并拍照。 1 2 1 5 微球的红外光谱分析 将样品微球研磨成粉末，通过k b r 压片制的薄片，用f t i r 8 2 0 1 红外光谱 仪测定壳聚糖粉末和各种微球的红外光谱。 1 2 1 6 微球的热稳定性评价 将微球浸没于牛肉汤培养基( n b ) 中，经过巴氏灭菌( 1 2 0 。c ，1 5 0k p a ， 2 1 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 2 0 分钟) 后，检验微球的完整性。 1 2 1 7 不同壳聚糖微球在不同p h 时p k o 的测定 在酸性溶液中，壳聚糖的自由基解离按以下公式计算： r - n h s + + n e o 口r - n h z + h s o + p k o = r - 面n h 而2 h 3 0 + p k o = 一l o g 疋 根据上式，任何一个解离度下对应的艺可以计算出来。壳聚糖的解离度由 下式可以得出： a = a + 旷 c ( 1 ) 其中仅为壳聚糖表观解离度。 变量p k a 是以0 l 为参数可由p h 推断出的函数，按, 照k a t c h a l s k y 方程： p k a = p h + 1 0 9 【( 1 _ a ) a = p k o 迨掣 ( 2 ) 结合公式( 1 ) 、 ( 2 ) 即可求得不同p h 时的p k 。 1 2 2 实验结果和讨论 1 2 2 1 微球外观形态的观察 本文利用乳化交联发制备的壳聚糖微球的表面形态电镜观察如图1 - 1 所示， 微球球形完整，表面光滑，边界清晰。 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 图1 1 壳聚糖微球的电镜照片 f i gl 1s e mm i c r o g r a p h so fc m s 1 2 2 2 微球的粒径分布 粒径分布表明，由乳化交联法制备的壳聚糖微球的粒径大小比较集中，大多 数都分布在7 8 1 7 2l x m ( 士3 至士6 ) 范围内，如图1 - 2 所示，平均粒径d 为1 2 4g m 。 所有的壳聚糖微球样品的形态外观及粒径分布上都相近。微球的自然状态如图 1 3 所示。 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 01 74 7 7 81 0 91 4 11 7 2 2 0 32 3 42 7 33 0 0 3 3 0 3 6 0 d i a m e t e ro f c m q m ) 图1 2 壳聚糖微球的粒径分布 f i gl 一2s i z ed i s t r i b u t i o no fc m s 图1 3 壳聚糖微球的显微镜照片 f i gl - 3m i c r o s c o pp h o t oo fc m s 2 4 粥 笏 扔 巧 5 o 一邑豁盘gg也 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 1 2 2 3 壳聚糖微球样品的脱乙酰度 电位滴定结果如图1 4 所示，每个样品都有两个突越点，但两位点之间消耗 的n a o h 溶液的体积数各不相同。第一个突越位点表示的是壳聚糖溶液中过量 的游离盐酸刚好被n a o h 所中和，第二个突越位点则表示壳聚糖链的n h ；上所 带的氢离子刚好完全被o h 中和，变成- n h 2 。这两个位点的精确位置可以从壳聚 糖滴定曲线的一级微商曲线( 图1 5 ) 中得出。通过计算，三种壳聚糖微球样品的 脱乙酰度为s a m p l ea ：9 7 3 ，s a m p l eb - 8 3 7 ， s a m p l ec ：6 2 6 ，符合实验 设计的高、中、低不同脱乙酰度的要求。 1 3 1 2 1 l 1 0 9 8 z 7 6 5 4 3 2 l 0 1 52 02 53 03 54 04 55 0 n a o h ( m 1 ) 图1 - 4 壳聚糖微球样品的滴定曲线 f i g1 - 4p o t e n t i o m e t r i ct i t r a t i o no f c h i t o s a nm i e r o s p h e r e s 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 司 z q 司 6 0 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 o 0 0 o2 0 3 04 05 0 n a o h ( m 1 ) 图1 5 壳聚糖微球样品的滴定一级微商曲线 f i g1 5t h et i t r a t i o nc u r v eo fc h i t o s a nm i c r o s p h e r e s 1 2 2 4 壳聚糖微球在水中的分散性 2 6 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 图1 - 6 壳聚糖微球在水中的分散性 f i g1 - 6t h ed i s p e r s i o no fc h i t o s a nm i c r o s p h e r ei nw a t e r 壳聚糖微球在水中的分散性如图所示，微球在转子搅拌下能够在水中均匀分 散并保持较为稳定状态。 1 2 2 5 微球的红外分析 不同类型的壳聚糖微球样品之间的结构差异可以从样品的红外图谱分析中 得到说明( 图1 7 ) 。1 6 4 9 1 4 1 6 6 4 8 6e m l 是酰氨i 吸收峰，不同脱乙酰度的样 品之间，该峰的位移不大，但1 6 5 1 5 5e m 。1 酰氨i 峰的峰值与脱乙酰度成正比。 图中，样品a 酰氨i 峰的吸收值高于样品b ，表明样品a 的d d 高于样品b 。1 5 9 8 7 0 c m 。1 是酰氨i i 吸收峰，对于不同脱乙酰度的样品a 、b 、c 而言，此峰的峰位有很 大差异。样品c 、d 、e 均有此吸收峰，样品a 、b 此峰消失，表明氨基上乙酰基 基团的减少或被其他基团取代( z h a o ，1 9 9 8 ) 。酰氨i i 吸收峰峰值的增加表明引 入取代基团量的增加，因此出现峰高样品e 样品d ；同时此峰峰高还与取代基团 的疏水性即碳链长度相关，随取代基团碳链长度的增长而增高，因此出现样品d 、 e 样品c 。对于样品c 、d 、e 酰氨i 吸收峰的位移，主要是由于壳聚糖分子内与 分子外氢键( c = o ”h o 与n h o = c ) 的形成造成的( z h a o ，1 9 9 8 ) 。油酰壳 聚糖( 样品d 、e ) ，与样品a 相比较( 由样品a 衍生而来) ，表现出很多变化： 1 5 9 8 7 0e r a l ( 氨基n - h ) 谱带的消失，但出现1 6 3 5 8 6c m 1 与1 5 3 7 3 1e v a 1 两个峰； 此外，2 9 0 0 c m 1 附近谱带( c h ) ，1 4 5 0 c m 1 附近谱带( 8 c h 2 ) 的增强，表明取代 基碳数和取代度的增加。这些数据表明，壳聚糖分子中已成功引入了油酰基团。 2 7 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 1 i 7 0 2 0 n h w 奸i t 一湛( e r a - 1 ) 图1 - 6 壳聚糖微球的红外图谱：a ( c m ，9 7 5 ) ，b ( c m ，8 3 7 ) ，c ( c m ，6 2 6 哟， d ( o c m ，5 ) ，e ( o c m ，l0 ) f i g1 - 6t h e f t - i r s p e c t r ao f t h ec m s ：a ( c m ，9 7 5 ) ，b ( c m ，8 3 7 ) ，c ( c m ， 6 2 6 ) ，d ( o c m ，5 ) ，e ( o c m ，10 ) 1 2 2 6 微球热稳定性评价 经过高压灭菌后的微球，大量依然保持球形完整，只有极少量有破碎，这可 能是收集微球时挤压造成的。此外，未出现聚集现象。微球的稳定性主要归因于 在制备过程中戊二醛的使用，微球表面的壳聚糖氨基与戊二醛形成牢固的氢键， 使得微球不易出现破碎。 1 2 2 6 壳聚糖微球在不同p h 时p 疋的测定 本文选择5 5 、6 5 、7 5 三个不同的p a ，测定样品各自在不同p h 时的p k o 变化情况，也为后文微球抑菌机理的研究提供证据。如表1 1 所示，对于s a m p l e a 和b ，即当d d 在8 0 1 0 0 之间时，壳聚糖处于多聚阳离子状态，所带电荷密 度随d d 升高而增大，而酸性环境使壳聚糖更易携带质子，引起静电排斥力增强， 有助于解离。因此，随p h 升高，分子解离度会下降，引起p k o 下降。当壳聚糖 壳聚糖锾球分散体系的抑菌性研究 d d 低于8 0 时，随引入的乙酰基越来越多，只是疏水作用越来越强( a m i j i ， 1 9 9 5 ) 。s o r l i e r 等( 2 0 0 1 ) 发现氨基的解离度随取代基链的长度增长而增大。对 于o c m s 而言，虽然氨基取代度并不高，但由于疏水性变得更强，分子由聚合 电解质状态转变为带有孤立电荷基团的分子，并被疏水环境所隔离。处于酸性环 境时，分子间易形成氢键；随p h 增大，疏水作用成为主要作用，则促进电荷的 解离。因此，当p h 由5 5 升高至7 5 时，s a m p l ed ，e ，f 的p k 逐渐上升。o 表1 1 ：壳聚糖微球样品不同p h 条件下的成 t a b l e1 - 1t h ep k oo fd i f f e r e n tc m s s a m p l eu n d e r v a r i e dp hc o n d i t i o n s 研究c m s p k , , 的变化，对于壳聚糖与细菌菌体表面的相互作用具有十分重要 的意义，取代基团的引入必将改变分子的p k o ，而这将会直接影响借助表面接触 才能产生的抑菌效果。 1 3 小结 采用乳化交联法制备的不同类型的壳聚糖微球样品球型完整，边缘清晰，表 面光滑，具有良好的热稳定性，能够在1 1 0r p m 的培养基中形成良好稳定的固体 分散体系。粒径分布表明，微球大小均一，平均粒径为1 2 4p a n 。红外图谱分析 表现了不同微球样品之间结构的不同：不同脱乙酰度样品的差异在特征吸收峰的 变化上体现出来；同时，特征吸收峰表明油酰基团成功引入了壳聚糖分子。不同 壳聚糖样品间的差异也体现在其化学性质上，电位滴定法计算出了三种不同脱乙 酰度样品的d d 分别为9 7 3 、8 3 7 、6 2 6 ，符合实验高、中、低不同脱乙酰 度的要求；红外图谱法计算得油酰壳聚糖微球的取代度分别为5 和1 0 。此外， 不同样品在不同p h 条件下的解离常数p k o 也呈现出了与结构相关的变化，这些 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 变化会影响壳聚糖微球样品的抑菌行为。 以上表明，利用乳化交联法制备的不同壳聚糖样品，符合作为一种固体分散 体系的要求，是一种可行的制备方法。 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 2 壳聚糖固体分散体系抑菌活性的研究 2 1 实验材料与方法 壳聚糖固体分散体系，由第一章所述方法制备 菌种：革兰氏阳性菌大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i 革兰氏阴性菌金黄葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 2 1 1 菌种的培养 2 1 1 1 菌种的复苏与活化 分别挑取保存在- 8 0 。c 中的受试菌株，在空白培养基上划线，3 7 ( 2 下培养4 8 小时使菌复苏。挑取培养基上的单菌落，在1 0m 1 无菌水中分别将它们分散，取 l o 、1 0 。3 、1 0 q3 个浓度在营养琼脂平板上培养，每一个浓度3 个平行样，3 7 下培养4 8 小时使菌活化，而后将得到的单菌落在4 c 保存。每个一段时间需将 菌重新活化一次。 2 1 1 2 壳聚糖固体分散体系的抑菌实验 从4 保存的平板上挑取分别大肠杆菌和金黄葡萄球菌菌落，分散在肉汤培 养基( o 5 蛋白胨，o 5 牛肉浸膏和o 5 n a c i ，p h7 5 ) 中3 7 ( 2 培养过夜，作 为实验用种子液。配制肉汤养基，5 0m l 瓶分装于若干2 5 0m l 三角瓶中。按照 实验设计将准确称量的不同壳聚糖微球样品分别与培养基混合，研究不同样品对 细菌生长的抑制情况。为了研究固体分散体系在不同浓度对受试菌生长情况的抑 制作用，每种微球样品都是按照一定的浓度梯度与培养基进行混合，其中能够产 生抑制细菌生长的最小微球样品的浓度定义为最小抑菌浓度( m i c ) ，能够使培养 基中细菌完全致死的最小微球样品的浓度定义为最小杀菌浓度( m b c ) 。研究不同 p h 条件对抑菌实验的影响是在配制培养基时，用6m o l l 的n a o h 溶液将其p h 按照实验设计分别调节为5 5 、6 5 、7 5 。培养基与壳聚糖微球样品混合完成后， 1 2 1 高压灭菌2 0 分钟。取种子液，用无菌水稀释至6 2 0n m 下吸光度为0 4 0 0 2 ，制成接种菌悬液。取im l 菌悬液，分别加入到培养基中，3 7 c ，11 0r p m 培养1 0 小时。壳聚糖微球在ll o r p m 转速下能够形成均匀的固体分散体系。 实验中，每个实验组设置3 个平行对照，空白组不添加壳聚糖微球样品。 2 1 2 浊度法测定抑菌效果 固体分散体系对细菌生长的抑制情况采用浊度法测定( m u h a n n a d ，2 0 0 2 ； 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 j e o n ，2 0 0 0 ) 。将培养后的样品取出，再6 2 0 n m 下测定培养基的吸光度，以空白培 养基为对照。在利用浊度法测量值是应当注意数据的有效范围，只有落在 0 2 - 0 8 之间的数值才是准确的，范围之外则误差较大。因此，应当根据实际测 量值将待测菌悬液按比例稀释，保证结果准确。 2 2实验结果与讨论 2 2 1 壳聚糖微球对金黄葡萄球菌的抑制作用 2 2 1 1 不同p h 对壳聚糖微球抑制金黄葡萄球菌作用的影响 为了研究p h 对壳聚糖微球抑制金黄葡萄球菌作用的影响，参照壳聚糖本身 的解离常数在6 0 - 6 5 分布，选择5 5 、6 5 、7 5 作为实验p h 条件。 2 5 0 2 1 5 0 u h 罨 1 0 0 0 0 0 0 s a = p l eas a m p l ebs a a a p l ecs a 且p l eds m a p l ee 图2 - 1 - 1 不同p h 对c m s 抑制金黄葡萄球最小抑菌浓度( m i c ) 的影响 f i g 2 - 1 - 1 t h ee f f e c to fp ho nt h em i co fc m sa g a i n s t & a t o e u s ( ) n om i ch a s d e t e c t e d 不同p h 对壳聚糖微球对& a u _ r e u s 的抑菌效果如图2 1 1 所示。由图可见， 壳聚糖微球对金黄色葡萄球菌的生长表现出较好的抑制作用，并表现出的最小抑 菌浓度( m i c ) 。每一种壳聚糖微球样品在不同的p h 时的m i c 有很大区别，如 样品a 、b 在p h = 7 5 时未表现出最小抑菌浓度，而样品c 、d 、e 在所有的p h 都有最小抑菌浓度出现。这些不同与微球的不同材料相关，但所有样品的m i c 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 随p h 的变化具有一个共同的趋势，即随p h 值得升高而升高。如样品a 在p h = 6 5 时的m i c 是p h = 5 5 时的2 倍，样品c 在p h _ 7 5 在中性环境时的m i c 是酸性。 环境时的2 0 倍。这些现象说明，壳聚糖微球对sa 唧姻的抑制作用随着环境 酸性的增强而增强，这一点与其他文献壳聚糖溶液状态下抑菌的相关报道是一致 的。t s a j 等曾报道壳聚糖在酸性环境中具有更强的抑菌活性。这主要是因为壳聚 糖氨基在酸性环境中的质子化，- n h 2 + 1 - 1 + 一一删，能够与带负电性的菌体通 过表面静电相互作用而发生反应，并进一步对菌体造成损害。当p h 降低时，意 味着体系中存在更多的旷可以与壳聚糖氨基结合，这种质子化作用增强了固体 分散体系对& a u r e u s 的抑制作用( t s a i ，1 9 9 9 ) 。具体作用方式将在抑菌机理一 章中讨论。 2 2 1 2 不同浓度对壳聚糖微球抑制金黄葡萄球菌作用的影响 表2 一卜1 浓度对不同c m s 抑制金黄葡萄球菌效果的影响( p h5 5 ) t a b l e2 - 1 1t h ee f f e c to fc o n c e n t r a t i o no fc m so na n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa g a i n s t & a u r e u sa t p h55 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fc m s ( t u r b i d i t ya t6 2 0r i m ) c o n c 吼1 掣1 黑o f c m sa bc ( m g m 1 ) 乙 壳聚糖微球分散体系的抑菌性研究 表2 一卜2 浓度对不同取代度0 c m s 抑制金黄葡萄球菌效果的影响( p h5 5 ) t a