（有机化学专业论文）碳糊电极上生物大分子及金属离子的电化学研究.pdf

，i i n v es t i g a t i o na n da p p l i c a t i o no f v o it am m e t r yo fb i o m a c r o m o l e c u l ea n d i o n so fm e t a la tc a r b o np a s t ee l e c t r o d e s at h e s i ss u b m i t t e dt o s h a a n x iu n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n tf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e t h e s i s s u p e l a p r o f e s s o r e r v l s o r ：f r o t e s s o rg 丛l i n g 虹丛l 曼n g m a y , 2 0 1 0 碳糊电极上生物大分子及金属离子的电化学研究与应用 摘要 研究生物大分子的伏安行为是生物电化学的重要内容，蛋白质和d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) 是生物体的重要组成部分，用电分析化学对蛋白质 和d n a 进行分析研究越来越受到重视，寻找高效灵敏的d n a 和蛋白质的 电化学探针对生化分析和食品分析有着重要的意义。 本文共分五部分，第一部分阐述了碳糊电极的发展应用，修饰碳糊电极 的修饰方法，修饰剂的作用类型，电化学常用的测定方法，d n a 、蛋白质 和微量铝的研究意义及研究进展以及x o ( x y l e n o lo r a n g e ) 和e b t ( e r i o c h r o m eb l a c kt ) 的物理化学性质。 第二部分以电化学法和光度法对铬黑t 与d n a 的相互作用进行了研 究。结果表明铬黑t 能与d n a 相互作用产生一有电化学活性的络合物。实 验最佳扫速为o 1 v s ， 以3 0 m l p h 为4 5 6 的b 。r 缓冲液为最佳支持电解 液。在优化条件下，d n a 浓度在o 0 0 1 - - 一0 0 1 e l 范围内，峰电流a i r 与d n a 浓度呈线性关系，线性方程为i p ( 衅) = 4 1 6 8 c ( 1 0 弓e g l ) + 1 2 2 7 ，检测 限为o 0 0 0 s e 江。实验还探讨了e b t 和d n a 的结合机理并用光度法对其结 合机理进行了验证。 第三部分以电化学法和光度法对铬黑t 与牛血清白蛋白的相互作用进 行了研究。研究表明：在p h - 5 2 9 的( b r i t t o n r o b i n s o n ，b r ) 缓冲液中，e b t 有两氧化峰和两还原峰，加入b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) 后e b t 峰电位 不变，峰电流下降，据此建立了一种测定b s a 的电分析方法。在优化条件 下，峰电流下降值与所加的b s a 量在2 0 x 1 0 。6 1 o 1 0 m o l l 、 2 0 1 0 。6 6 o x l o 。7 m o l l 和6 0 x l o 5 0 x 1 0 。8m o l l 范围内呈线性响应，检测 限为1 0 1 0 一m o l l 。通过测定b s a 引入前后的一些电化学参数，推测e b t 与b s a 相互作用生成了一种非电活性的超分子化合物，并且探讨了b s a 与 e b t 的结合反应机理。 第四部分以c u ( i i ) a c 。二元配合物为电化学探针，采用线性扫描溶出 伏安法测定牛血清蛋白。牛血清蛋白能使c u ( i i ) 的溶出峰变小，峰电位不 变。在优化条件下，峰电流下降值与所加的b s a 量在 1 0 x 1 0 。7 m o l l 1 0 x 1 0 母m o l l 范围内呈线性响应，检测限为1 o x l o m o l l 。 线性方程为i p ( 衅) = 1 1 7 3 2 c ( 1 0 7 m o l l ) + 1 5 9 9 3 。该方法测量牛血清 蛋白灵敏度高。 第五部分用电化学的方法研究了二甲酚橙与铝的相互作用，二甲酚橙本 身不能在电极表面进行吸附，当往二甲酚橙体系中加入a i ( i i i ) 时，循环 伏安法扫描出现一个不可逆的还原峰，该还原峰电流的大小与a 1 ( i i i ) 浓 度在1 o 1 0 。6 m o l l - - 1 0 x1 0 7 m o l l 范围内呈良好的线性关系。线性方程为 i p ( 昨) = 8 8 1 7 1 + 1 7 4 6 8c ( 1 0 。7m o l l ) ，相关系数r = 0 9 9 0 2 ，检出限为 9 0 x1 0 一m o l l 。 关键词：碳糊电极，生物大分子，电化学，铝，铬黑t ，二甲酚橙 i i v o it a a 压m e t r yo fb i o m a c r o m o l e c u l ea n d i o n so fm e t a la tc a r b o np a s t ee l e c t r o d es a b s t r a c t v o l t a m m e t r i cb e h a v i o ro fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e si sa ni m p o r t a n t b i o e l e c t r o c h e m i c a l p r o t e i na n dd n aa r ei m p o r t a n tc o m p o n e n to fo r g a n i s m s u s i n ge l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d sf o ra n a l y s i so fp r o t e i na n dd n a i sa ne f f e c t i v e a n a l y t i c a lc h e m i s t r yr e s e a r c hm e t h o d s t os e a r c hf o rs e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a l d n aa n dp r o t e i np r o b e sh a v ei m p o r t a n ts i g n i f i c a n c ef o rb i o c h e m i c a la n df o o d a n a l y s i s t h i sp a p e ri sd i v i d e di n t of i v ep a r t s 1 h ep a r tie x p o u n d e dd e v e l o p m e n ta n d a p p l i c a t i o no fc a r b o np a s t ee l e c t r o d e ，t h em o d i f i e dm e t h o do fm o d i f i e dc a r b o n p a s t ee l e c t r o d e ，t h er o l e o fm o d i f i e r t y p ec o m m o n l yu s e d ，t h em e t h o do f e l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o n ，t h er e s e a r c hs i g n i f i c a n c ea n dr e s e a r c hp r o g r e s so f d n aa n dp r o t e i n sa n dt r a c ea l u m i n u m ，t h ep l a y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fe b t a n dx o t h ei n t e r a c t i o no fe b tw i t hd n aw a ss t u d i e db ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d a n ds p e c t r o p h o t o m e t r yi np a r ti i t h er e s u l t ss h o w e dt h a te b tc a ni n t e r a c tw i t h d n at op r o d u c eae l e c t r o c h e m i c a lc o m p l e xc o m p o u n d 1 1 1 eb e s te x p e r i m e n t a l c o n d i t i o na sp h = 4 5 6i ns u p p o r to ft h eb rb u f f e re l e c t r o l y t e ，t h ed o s a g ei s 3 0 m la n dt h es c a nr a t ei s0 i v s u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n t h ei n c r e a s e o ft h ep e a kc u r r e n t so fe b tv e r s u sd n ac o n c e n t r a t i o nh a sl i n e a rr e g r e s s i o n e q u a t i o n si nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo fo 0 0 1 o o l g l dw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i t o fo 0 0 0 5 g l t h el i n e a re q u a t i o ni sa i p ( 心) = 4 16 8 c ( 10 3 9 l ) + 1 2 2 7 d i s s c u s st h eb i n d i n gm e c h a n i s mo fe b ta n dd n a t h eb i n d i n gm e c h a n i s mw a s v e r i f l e db ys p e c t r o p h o t o m e t r y t h ei n t e r a c t i o no fe b tw i t hbs aw a ss t u d i e db ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d a n ds p e c t r o p h o t o m e t r yi np a r ti i i e b th a st w oo x i d a t i o np e a k sa n dt w o r e d u c t i o np e a k s t h ea d d i t i o no fbs at ot h ea b o v es o l u t i o n ，t h ep e a kc u r r e n to f h i b o v i n es e r u ma l b u m i n p a r tv s t u d yt h ei n t e r a c t i o no fx 0a n da l ( i i i ) b ye l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d x oc a nn o tb ea d s o r b e dt ot h ee l e c t r o d es u r f a c e a d d e da l ( i i i ) t ot h ex 0 u s e dc y c l i cv o l t a m m e t r ys c a na p p e a r sa ni r r e v e r s i b l er e d u c t i o np e a k t h e a d d i t i o no f a l ( i i i ) t ot h ex 0s o l u t i o n ，t h ep e a kc u r r e n to fx 0i n c r e a s e s u n d e r t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ，t h ei n c r e a s eo ft h ep e a kc u r r e n t so fx ov e r s u sa l ( i i i ) c o n c e n t r a t i o nh a sl i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o n si nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 1 o lo - 6 m o l l 1 o 10 t m o l lw i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f9 o xlo s m o l l t h e l i n e a re q u m i o ni si p ( 心) = 8 8 1 7 1 + 1 7 4 6 8c ( 1 0 m o l l ) k e yw o r d s ：c a r b o np a s t ee l e c t r o d e ，b i o m a c r o m o l e c u l e ，e l e c t r o c h e m i c a l ， a l u m i n u m ，e r i o c h r o m eb l a c kt x y l e n o lo r a n g e i v 论文使用的缩写说明 v 目录 摘j i l 享i a b s t r a c t i i i 1 绪论。1 1 1 碳糊电极1 1 1 1 碳糊电极的发展1 1 1 2 修饰碳糊电极1 1 1 3 化学修饰剂的作用类型2 1 2 电化学研究方法3 1 2 1 电位阶跃技术3 1 2 2 线性扫描技术：3 1 2 3 极谱分析技术3 1 3 研究进展分析4 1 3 1 蛋白质的定量分析方法研究进展4 1 3 2 脱氧核糖核酸( d n a ) 的电化学研究5 1 3 3 微量铝的测定意义方法及研究进展7 1 4 铬黑t 与二甲酚橙的性质简介8 1 4 1 铬黑t 8 1 4 2 二甲酚橙8 2 碳糊电极上d n a 与铬黑t 的相互作用1 0 2 1 实验方法与药品1 0 2 1 1 仪器与试剂1 0 2 1 2 碳糊电极的制备1 0 2 1 3 实验方法11 2 2 结果与讨论1 l 2 2 1 铬黑t 的电化学行为及其与d n a 的相互作用1 1 2 2 2 实验条件的选择1 3 2 3 线性方程1 7 2 4 干扰物质17 2 5 模拟样的检测1 7 2 6 结合分光光度法验证d n a 与e b t 的作用机理1 7 2 7 小结：1 8 3 电化学法研究蛋白质与铬黑t 的相互作用1 9 3 1 实验部分1 9 3 1 1 仪器和试剂1 9 3 1 2 电极制备和处理1 9 3 1 3 实验方法1 9 3 2 结果与讨论2 0 3 2 1e b t 在碳糊电极上的电化学行为2 0 3 2 2e b t 与b s a 的相互作用2 l 3 2 3e b t 与b s a 作用条件探讨2 2 3 3 样品测定2 3 3 3 1 线性范围和检测限2 3 3 3 2 干扰物质的影响，2 4 3 3 3 模拟样品测定一2 4 3 4 电化学参数的测定2 4 3 4 1 电荷转移系数口2 4 3 4 2 扩散系数d 。：2 5 3 4 3 电极反应速率常数k “2 5 3 5e b t 与b s a 结合机理的探讨2 6 3 6d 、结：1 7 4 以c u ( ) & 二元配合物为电化学探针测定牛血清蛋白2 8 4 1 实验部分2 8 4 1 1 仪器和试剂2 8 4 1 2 实验方法2 8 4 1 3 电极制备和处理2 8 4 2 结果与讨论。2 8 4 2 1c u ( i i ) 的阳极溶出过程2 8 4 2 2c u ( ) a c 。二元配合物与b s a 的相互作用2 9 4 2 3 最佳实验条件探讨3 0 4 2 4 干扰试验3 2 4 3c u ( i i ) a c 对牛血清响应的标工作曲线3 2 4 4 模拟样品测定3 2 4 5 小结3 3 5 电化学法研究二甲酚橙与铝的相互作用3 4 5 1 实验部分3 4 5 1 1 仪器与试剂3 4 5 1 2 电极制备和处理一3 4 5 1 3 铝标准储备液的配置- 3 5 5 1 4 实验方法3 5 5 2 结果与讨论3 5 5 2 1 铝与x o 作用的循环伏安图3 5 5 2 2 测定铝条件的选择3 6 5 2 3 干扰试验3 6 5 3 线性方程3 6 5 4 机理研究3 7 5 5 样品测定3 8 5 6 小结3 8 6 结论与展望3 9 6 1 结论3 9 6 2 展望3 9 致谢4 1 参考文献4 2 攻读学位期间发表的学术论文目录4 8 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明4 9 碳糊电极上生物大分子及金属离子的电化学研究 1 绪论 1 - 1 碳糊电极 1 1 1 碳糊电极的发展 碳糊电极是由碳粉和粘合剂组成，产生于1 9 5 8 年。它本身有许多传统的滴汞电极无 可比拟的优越性如低毒、残余电流低、表面更新简单、电位范围宽等。所以碳糊电极发 展得比较快，已经将其应用于药物、生物传感器等方面的研究。k a l c h a r m 对碳糊电极的 伏安法应用做了一些综述。评价碳糊电极性能优越与否由其组成材料、制作方法等因素 决定。碳粉粒径越小，和粘合剂混合得越均匀，其整体电化学性能会比较优越。粘合剂 有非导体粘合剂和电解质粘合剂组成。非导体粘合剂主要有液体石蜡、固体石蜡和硅油 等等。易兰花【2 】等制作了石墨：硅油为4 ：l 的碳糊电极用于测定培氟沙星，结果表明培 氟沙星在碳糊电极上有一电位为1 0 3 的吸附伏安氧化峰，检出限为4 0 1 0 一m o l l ，测 定结果令人满意。张玲帆 3 1 等制作了石墨：固体石蜡为4 ：1 的碳糊电极用于直接检测腺 嘌呤( a ) 和单链d n a 的含量，结果表明在此碳糊电极上应用微分脉冲伏安法可得到线 性关系比较好的杨氧化峰，可用于直接检测腺嘌呤( a ) 和单链d n a 的含量。电解质溶 液粘合剂主要有n a o h 、h c l 0 4 ，此类粘合剂制作的碳糊电极优点是残余电流比较低， 缺点是寿命比较短，坚固性比较差。 1 1 2 修饰碳糊电极 由于碳糊电极发展迅速，单纯的石墨碳糊电极已不能适应发展的需要，于是有研究 者将具有优良化学性质的分子、离子、聚合物设计固定在电极表面，在电极表面进行分 子设计使电极具有某种特定的化学和电化学性质。迄今为止，修饰碳糊电极已在无机物 分析m 、有机物分析 7 - 9 1 及药物分析0 0 l 、电化学【1 1 m 】和生物传感器 1 4 , 1 5 1 等研究中得到广泛的 应用。它是电化学、电分析化学、生物电化学等领域十分活跃的研究方向、也是学科交 叉、研究与应用的焦点。所以对修饰电极的研究不但推动了电极过程动力学的发展，而 且还增进了人们对点击界面结构与行为之间关系的认识，进一步拓展了电化学在生命、 能源、环境及信息等尖端领域的应用范围。 修饰碳糊电极c m c p e 的制备方法有以下两种： ( 1 ) 采用直接混合法或者溶解法直接将修饰剂混于石墨中。直接混合法是将化学修 饰剂，石墨粉，粘合剂三者按适当比例直接混合，这种方法比较常用来修饰电极 1 a l 。评 价一只采用直接混合法制成的电极性能的好坏关键是要使修饰剂在电极表面分布均匀 点，修饰剂有固体和液体，可采用超声震荡的方法将修饰剂与石墨混合均匀后再与粘合 剂混合，研磨要充分，一般为3 0 分钟左右。液体修饰剂有两功能，其一是充当修饰剂， 其二它也可以充当粘合剂，这样可以增加液体修饰剂在碳糊电极表面上的活性点。李陟 陕西科技大学硕士论文 t t l 等采用直接混合法将稻壳基活性炭、石墨和固体石蜡按一定比例混合制成了稻壳基活 性炭修饰的碳糊电极，稻壳基活性炭有大的比表面积和丰富的表面官能团，将其修饰到 电极上用来测量多巴胺，效果令人满意，这其中修饰电极对多巴胺起到了催化氧化作用。 溶解法实现将修饰剂与粘合剂混合，带混合均匀后或者修饰剂完全溶于粘合剂中在与石 墨进行研磨支撑修饰电极【t 叼。这种方法有一定的局限性，难点在于修饰剂要很好的跟粘 合剂相容，这使得修饰剂要有一定的亲油性。采用离子液体修饰电极就可以用这种方法 【t 9 1 。孙伟冽，等用离子液体1 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐与石墨混合制备了离子液体修 饰电极，并研究了血红蛋白在该电极上的直接电化学。 采用直接混合法制备的电极表面修饰物如果脱落会影响电极的性能造成电极的重现 性不好，如果将修饰剂修饰在吸附能力极强的活性炭上，电极重现性能不好的情况就能 有所避免。这种用活性炭当基准物质的电极更新还比较容易，只要比较合适酸度的底液 淋洗就可以了，齐菊锐铮：】在此种电极上做了一定的研究。 m a j i d t 2 2 1 将萘二胺单体乙氰后与石墨混合制成萘二胺修饰碳糊电极，并利用电聚合的 原理将萘二胺聚合于碳糊电极内制得聚萘二胺修饰的电极，通此法可以方便地获得对重 金属离子如a r 、p b 2 + 、h 9 2 + 、c u 2 + 、敏感的修饰电极【2 3 】。 ( 2 ) 采用自组装或者滴涂得方法或电聚合的方法将修饰物修饰于碳糊电极表面。白 组装的方法时将碳糊电极放置于含有修饰物的溶液中，通过分子间的各种相互作用力图 吸附作用【2 4 1 等将修饰物修饰于电极的表面。滴涂法是采用微量注射器将修饰物滴在点击 表面，注意要滴的均匀薄厚一致，在红外灯中烤干或者用自然晾干的方法进行固定。电 聚合法是采用各种电化学法将溶液中的修饰物聚合在电极的表面。王宗花，等【2 5 】利用电 聚合方法把茜素红修饰到碳纳米管上，克服了碳电极暴露面敏感的缺点并且该电极有效 的将碳纳米管的结构特性与茜素红的分子特性结合起来，利用该修饰电极对多巴胺和抗 坏血酸同时进行测定，结果发现该电极可以对多巴胺和抗坏血酸进行催化氧化，两者的 氧化峰电位可达2 4 0 m v 。张雷，等【2 6 】采用电氧化法将丫一氨基丁酸修饰到玻碳电极上，通 过x 射线光电子能谱发现丫氨基丁酸以c - n 键共价键合到电极表面上。该修饰电极对 多巴胺、尿酸和抗坏血酸都具有良好的电化学催化特性，三者的电位分别位于o 4 5 v 、 0 2 5 v 、o 0 7 v 。刘传银 2 7 1 ，等采用自组装的方法将2 一氨基5 巯基一 1 ，3 ，4 - - - - 氮唑修饰于 电极上，通过电化学法和s e m 法研究了新试剂在金电极表面的自组装结构，并且研究 了多巴胺在此电极上的伏安行为。 1 1 3 化学修饰剂的作用类型 在c m c p e 中混合粘合剂即修饰剂是重要的组成部分，它和被测组分或离子之间的 反应是电极检测性能的关键。碳糊电极对分析物的富集是依靠吸附和萃取作用，而增加 了碳微粒的吸附作用或增强粘合剂的萃取作用，从而提高电极的测定灵敏度和选择性。 2 碳糊电极上生物大分子及金属离子的电化学研究 这类反应主要有三种类型。 ( 1 ) 配位反应，电极表面修饰的络合剂或螯合剂与待测离子发生配位而使其富集， 多数化学分析应用的螯合剂都可成功的用作电极表面修饰剂。( 2 ) 离子交换，离子交换 型修饰碳糊电极是通过修饰表面的静电作用，吸引荷相反电荷的离子使其富集。( 3 ) 弱 相互作用，被测物与电极表面的修饰剂可通过形成氢键，超分子及静电作用而被富集分 离。基于聚酞胺对含有羟基化合物形成氢键的吸附效果很好。 1 2 电化学研究方法 1 2 1 电位阶跃技术 电位阶跃技术是一类重要的电化学暂态研究方法，可用于测定电子交换数( n ) 和扩 散系数( d ) 等。其原理为将电极点位瞬间升至某一特定值，然后记录工作电极上的电 流随时间的衰减曲线。主要包括单电位阶跃计时电流法、电位溶出分析法、计时电量法、 双电位阶跃计时电流法、控制电位电解库仑法。前三种方法在研究中比较常用。 1 2 2 线性扫描技术 主要包括了线性扫描伏安法、循环伏安法、塔菲尔曲线和线性扫描溶出伏安法。其 中线性扫描伏安法主要用来做成分分析，循环伏安法一般用于研究电极的过程，是一个 十分有用的方法。塔菲尔曲线切线的斜率和截距可以用来分析动力学参数，可以计算出 电子交换系数和电流交换密度等。线性扫描溶出伏安法是将待测物质部分的用控制点位 电解的方法富集于工作电极上，然后电位扫描使待测物质从电极上溶出进入溶液，记录 溶出过程电流随电位的变化曲线。 1 2 3 极谱分析技术 。 极谱分析法是布拉格的j 海洛夫斯基的研究成果。海洛夫斯基给一个滴汞阴极和一 个汞池形成的阳极加以一个连续增加的负电势。他观察到，如果与电极接触的溶液含有 还原性离子或离子团的话，电流就会按等级地而不是连续地增加。海洛夫斯基因发现和 发展了他在1 9 2 2 年描述的极谱法而知名。这是所有分析技术中最能应付多方面的技术之 一。它的根据是：在电解时离子在电极放电，如果电极小，则电流能为离子移动到电极 表面的速度所限制。在极谱法中阴极是一小滴汞( 恒定地形成和滴下以保持表面清洁) 。 缓慢地增高电压，并绘制电流对电压的曲线。电流以台阶形增加，每一台阶相当于溶液 中一种特有类型的正离子。台阶的高度表明该离子的浓度。由于他的成就，海洛夫斯基 被授予1 9 5 9 年诺贝尔化学奖。尽管海洛夫斯基在1 9 2 5 年就阐述了极谱仪的原理，但过 了许多年它才开始具有实用价值。赫恩、海洛夫斯基、柯尔托夫和林根发表的有关该方 面的书也有助于引起人们的注意。当时市面上可买到的极谱仪被用来测定混合物中低浓 度的物质，即经初步分离含量己达最小的物质。极谱仪可用于测定阳离子，像铬酸根、 硝酸根和溴酸根那样的阴离子以及含有电还原基因的有机化合物。它还可用于物理化学 3 陕西科技大学硕士论文 方面来研究有关溶质的性质和溶液反应的机理。虽然极谱仪难得应用到不定期的分析中， 但它在解决已做了必要研究的特殊问题方面却是非常有用的。 1 3 研究进展分析 1 3 1 蛋白质的定量分析方法研究进展 a 蛋白质的电化学研究意义 探索生物分子结构与功能之间的关系是生命科学研究领域的核心问题。鉴于生物大 分子多为核电分子，因此相对于其他分析技术，电化学技术最有条件实现对生物大分子 存在行为和调控的同时监测。开展对蛋白质性质的研究；其意义一方面体现在通过借助 各种电化学手段进一步了解蛋白质的电荷分布特性，从而可以更好的知道蛋白质分离纯 化技术，如电泳，盐沉淀，离子交换等技术的发展，另一方面则体现在可通过对氧化还 原蛋白行为的研究，进一步了解生物体系内电子传递特性，为仿生催化体系和能量体系 的研究奠定基础。 b 蛋白质的光度法研究 ， 蛋白质的光度法研究主要集中在紫外可见分光光度法、荧光光度法核共振光散射法。 紫外可见分光光度法主要有双缩脲法1 2 8 1 、l o w r y 2 9 1 法和以染料及其染料的金属配合物为蛋 白质的的光谱探针光度法。双缩脲法其基本原理为用三氯乙酸或钨酸或磷钨酸或 t s u c h i y a 试剂来使蛋白质沉淀，并用双缩脲反应测定尿蛋白。该方法的优点在于干扰物 质少，不受温度的影响。但是双缩脲并非蛋白质的特效反应，所以必须在测定前先使蛋 白完全沉淀以除去干扰物质才能得到较准确的结果，该方法操作比较复杂，较难实现仪 器的自动分析。l o w r y 法结合双缩脲法中铜盐反应与酸试剂f o l i n c i o c a l t e a u 反应的特点， 通过芳香族氨基酸残基t y r 和t r y 的迅速反应与肽链、极性测链或两者的铜络合物较馒 的反应，而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色，在波长7 5 0 n m 处测定a m a x 。该方法的优点 是灵敏度较高，但是由于酸试剂与蛋白的反应是非特效反应，所以该方法的抗干扰能力 比较差。用染料来做蛋白质的光谱探针是利用染料在偏酸性条降下带负电荷，而蛋白质 的等电点较大，一般带正电荷，在这种环境下，染料会和蛋白质以各种分子间的作用力 结合形成复合物从而引起染料光谱的改变。比较常用染料型的光谱探针主要有考马斯亮 蓝g 一2 5 0 如1 、铍试剂l i e ，t 】、偶氮氯膦i 3 2 1 、偶氮胂i 3 2 1 、邻溴偶氮胂【3 2 】、偶氮胂1 1 i t 3 2 1 、邻溴 偶氮氯膦【把1 、偶氮胂k 3 ，1 、钛( ) - 4 ，5 一二溴苯基荧光酮0 4 1 、钼( v i ) 二溴羟基苯基荧 光酮【3 5 1 、镱( i i i ) 。偶氮胂1 1 1 1 3 6 1 、锌( i i ) 锌试剂 3 r l 、铁( i i i ) 铬天青s t 3 a 。荧光法是利 用某些染料会和蛋白质发生猝灭等现象使其荧光强发生改变。利用荧光的改变可以对蛋 白质进行测量。用作荧光探针的染料主要有茜素红8 1 3 9 1 、铬天青1 4 0 1 、四磺基铝酞菁、克 仑特罗 4 2 1 、吖啶红【4 3 】、灿烂甲酚蓝】等。共振光散射法是由于蛋白质可以对染料的光散射 信号进行放大且其含量和信号增强有一定关系。以用此原理可进行蛋白质的定量检测。 4 碳糊电极上生物大分子及金属离子的电化学研究 蛋白质的共振光散射探针常见的有铬天青s 4 5 、丽春红2 r 岬、依来铬青r 4 r l 、溴邻苯三 酚红【鹌】、邻苯三酚红嗍、酸性铬蓝k 【卿、四磺基锰酞菁【s 】等。 c 蛋白质的电化学研究 蛋白质的电化学活性中心即氧化还原中心藏匿于蛋白株内，这使得蛋白质成为一个 电化学惰性物质。因此要实现蛋白质分子的电化学过程就必须要使蛋白质的氧化还原中 心尽量靠近电极的表面，鉴于蛋白质的荷电分布的不均匀性以及蛋白质分子的难扩散性， 使蛋白质的氧化还原中心游离出来靠近电极表面有一定的难度。所以研究蛋白质的直接 电化学没光度法来得多。现在采用电化学法研究得比较多的有蛋白质的极谱法研究、蛋 白质和有机小分子的电化学研究以及蛋白质在电极上的的直接电化学。研究蛋白质与有 机小分子的相互作用有助于帮助阐明以一些药物的抗癌机理，国内的焦奎等用溴甲酚紫 【5 2 】、茜素红s t s 3 、铬天青s 酬、溴甲酚绿【5 5 】、钙色素【5 6 】、灿烂甲酚蓝 5 7 1 、金橙g 【s s l 、钙色素 【5 9 j 、鸡冠花红【印，等燃料为电化学探针对蛋白质进行测量，测量结果令人满意。研究蛋白 质在电极上的的直接电化学可以帮助表征蛋白质的结构。但由于蛋白质活性中心的隐藏， 在电极上的直接研究蛋白质的电化学性能较为困难，但如果采用将电极表面功能化，即 为蛋白质营造一个可有序固化点击界面就有可能获得蛋白质的直接电化学过程。因此如 何购置一个功能性的电极界面，既要保证蛋白质在该电极表面有很好的附着能力，可实 现电化学及其光谱学性质的检测，同时又要保证蛋白质分子维持其原有的构象和活性， 成为蛋白质直接电化学过程研究的重点。孙伟【2 0 】等用离子液体对碳糊电极进行修饰，研 究了血红蛋白在该电极上的直接电化学，结果表明血红蛋白在该电极上有一对准可逆氧 化还原峰，并计算出电子转移数为0 8 8 5 ，电荷传递系数为0 5 7 8 ，表观异相电子转移速 率常数为0 1 4 9 s 。 1 3 2 脱氧核糖核酸( d n a ) 的电化学研究 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 又称去氧核糖核酸，是一种生物大分 子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。d n a 是一种长链聚合物，组成 单位称为核苷酸，而糖类与磷酸分子由酯键相连，组成其长链骨架。每个糖分子都与四 种碱基里的其中一种相接，这些碱基沿着d n a 长链所排列而成的序列，可组成遗传密 码，是蛋白质氨基酸序列合成的依据。读取密码的过程称为转录，是根据d n a 序列复 制出一段称为r n a 的核酸分子。最早分离出d n a 的弗雷德里希米歇尔是一名瑞士医生， 他在1 8 6 9 年，从废弃绷带里所残留的脓液中，发现一些只有显微镜可观察的物质。由于 这些物质位于细胞核中，因此米歇尔称之为“核素”( n u c l e i n ) 。到了1 9 1 9 年，菲巴斯利 文进一步辨识出组成d n a 的碱基、糖类以及磷酸核苷酸单元，他认为d n a 可能是许多 核苷酸经由磷酸基团的联结，而串联在一起。不过他所提出概念中，d n a 长链较短，且 其中的碱基是以固定顺序重复排列。1 9 3 7 年，威廉邛可斯特伯里完成了第一张x 光绕射 陕西科技大学硕士论文 图，阐明了d n a 的双螺旋结构规律性。d n a 是大分子高分子聚合物，其溶液为高分子 溶液，具有很高的粘度。d n a 对紫外线有吸收作用，当核酸变性时，吸光值升高；当变 性核酸可复性时，吸光值又会恢复到原来水平。温度、有机溶剂、酸碱度、尿素、酰胺 等试剂都可以引起d n a 分子变性，即使得d n a 双键间的氢键断裂，双螺旋结构解开。 因此研究d n a 与小分子之间的相互作用，以帮助阐明某些物质的致畸形致突变致癌的 机理以及某些药物的抗癌机理。电化学在研究d n a 方面有着独特的优势，其研究方法 简便，研究成本较低，使得电化学成为研究d n a 传感器的热门技术。 a 核酸的痕量分析 核酸具有电化学活性，对核酸分子的电化学检测已成为分子生物学中核酸分析的一 种常用技术。现代极谱技术特别是微分脉冲极谱可以检测到毫克每升浓度级的d n a 。吸 附溶出伏安发可以测定比微分脉冲伏安法低两个数量级浓度的核酸。p a l e c e k 用吸附转移 溶出伏安法可依对纳克级和亚纳克级的d n a 进行测定。该方法只要5 1 0 此的核酸溶液， 所以可以用来检测病毒或质粒d n a 。吸附转移溶出伏安法还可实现在有大量d n a 和核 算单体存在下对小于1 的r n a 的检测，这是紫外和电泳技术所不及的。 bd n a 与小分子之间相互作用及其电化学研究 某些氧化剂、烷化剂会对d n a 造成不同类型的损害，举例而言，氧化剂如自由基 或过氧化氢，可造成多种不同形态的损害，尤其可对鸟苷进行碱基修饰，并且使双股分 解。根据估计，在一个人类细胞中，每天大约有5 0 0 个碱基遭受氧化损害。在各种氧化 损害当中，以双股分解最为危险，此种损害难以修复，且可造成d n a 序列的点突变、 插入与删除，以及染色体易位。许多突变原可嵌入相邻的两个碱基对之间，这些嵌入剂 大多是芳香性分子及平面分子，包括乙锭、道诺霉素、阿霉素与沙利窦迈。必须先使碱 基之间的空隙变大，才能使嵌入剂置入碱基对之间，整体而言，d n a 会因为双螺旋解开 而扭曲变形。结构改变会使转录作用与d n a 复制过程受到抑制，进而导致毒害与突变。 因此d n a 嵌入剂通常也是致癌物，常见的例子有二醇环氧苯并芘、吖啶、黄曲毒素与 溴化乙锭等。但是这些物质也因为能够抑制d n a 的转录与复制，而可应用于化学治疗 中，用以抑制癌症细胞的快速生长情形。通常情况下，小分子与d n a 的作用方式主要 有静电作用，沟槽作用和嵌插作用。这几种作用方式都可以用电化学方法进行考究。陈 仪娜等研用电化学法研究了灿烂甲酚蓝与d n a 之间的相互作用，结果表明灿烂甲酚蓝 与d n a 之间能形成一种有电化学活性的物质，两者之间以静电方式相结合。时巧翠【6 1 】 等用电化学法研究了环丙沙星与d n a 的相互作用，结果表明环丙沙星与d n a 以嵌插的 方式相结合。电化学技术不仅可以研究d n a 与小分子的作用方式还可以研究药物分子 与d n a 分子间作用的热力学性质。 6 碳糊电极上生物大分子及金属离子的电化学研究 1 3 3 微量铝的测定意义方法及研究进展 由于生活中广泛使用铝制品、广泛使用铝盐净化水，从而使人体中的含铝量较高。 铝不是人体的必需元素，人体缺乏铝时，