（微生物学专业论文）hccb10124抗真菌活性的初步研究.pdf

上海师范大学硕士学位论文 中文摘要 捅晏 本论文利用上海来益生物药物研发中心筛选得到的一株产广谱、高活性抗真 菌广：物的h c c b l 0 1 2 4 菌株，通过纸敏片法测定抗菌谱，发现其对2 0 余种真菌， 其中有些是植物和动物的病原菌，有显著拮抗作用，另外，对金黄色葡萄球菌和 藤黄八叠球菌也有抑制作用；并对对菌丝体提取物进行不同浓度稀释，进行抗真 菌活性的测定，发现活性很高。根据1 6 s r d n a 序列分析，该菌株与链霉菌 s f ，印f 伽弦p sa 6 打曹f j c “j 具有9 9 的序列同源性。 在分离纯化之前，对链霉菌h c c b l o l 2 4 进行发酵条件和培养基成分进行初步 优化，以期获得较高产量的活性代谢产物。优化后培养基基本组成成分为：2 葡萄糖、2 可溶性淀粉、4 药媒、o 0 4 钼酸铵、0 4 的碳酸钙。 检测了菌丝体提取物及发酵液上清中生物活性产物对温度、p h 值的稳定性； 利用捷克八溶剂系统纸色谱的方法对生物活性产物进行了研究，发现其对温度、 p h 值较稳定。初步的研究结果为进一步分离提取打下一定的基础。 通过p h 沉淀、有机溶剂萃取和树脂吸附、硅胶柱层析、中压色谱层析等实验， 确定的工作流程为先将发酵上清液的p h 调至6 除去离心未除去的固形物，以大孔 吸附树脂吸附上清液和菌丝体丙酮抽提液，除去色素，不同浓度的乙醇洗脱，洗 脱液浓缩，进行硅胶柱层析，以丙酮：甲醇= 1 0 ：1 、5 ：1 、3 ：l 、2 ：l 、l ：l 、1 0 0 甲醇分段洗脱，充分除去色素，对活性物质进行初步分离。最后，用中压色谱进 行实验，除去部分杂质，达到对样品富集和纯化的目的。 鉴于链霉菌h c c b l 0 1 2 4 所产抗真菌物质具有广谱、高活性、高稳定性等优点， 因此具有潜在的、重要的应用价值和理论意义。其所产抗菌活性物质有望开发为 一种可广泛地应用于真菌病害的生物防治或人畜真菌性疾病的抗真菌抗生素。 关键词：h c c b l 0 1 2 4 ，抗真菌活性，菌种鉴定，1 6 s r d n a 序列，发酵优化，分离纯 化 a b s 垂1 a e 垂 i nt h i sr e s e a r c hw o r k ，t h es n a i nc o n s e r v e di nh c c b l o l 2 4 ( r & d ) w a sf o u n dt ob e s l r o n g l ya c t i v ea g a l n s 童鑫s e r 主e so f n g i ， s o l n eo fw h i c ha 1 ep l a n to l ia n f n a l 芦壤o g 鞠i e ，s 毛| e ha s & 磁兹惫赢丢馘& 眺兹螽懈e 纪。强el6 s 擅喊as e q u 蹦c e a n a l y s i sc o m b i n e dw i t ht r a d t i o n a li d e n t m c a t i o nm e t h o d sw a su s e dt oi d e n t i 黟t h e s t r a i n b a s e do nt h er e s u l t s ，t h i ss t r a i nw a si d e n t i 行e da s & 呐现眦甜扔施，缸甜屈 瓷s 耄so 魏e u l l u r e 撩e 纛i 鑫雒莲e l l 孰豫le 艟癌i l i o n s 凳萋瓣c c b l o l 2 4 ，s 魏g w e dt h a 圭c a 娃o 程 s o u r c ea n dn i t r o g e ns o u r c ep r e s e n t c dt h em o s ts i g n i 6 c a n te 鼹瓯o nt h ep r o d u c t i o no f b i o a c t i v i t y t h eo p t i m i z e dm e d i u mw a sc o m p o s e do fg l u c o s e2 ，s o l u b l ea m y l u m 2 ，c o 技o n s e e dp o w d e r3 ，a m m o n i u 黻m o l y b d a t eo 。0 4 ，c a l c i u mc a r b o n a t eo 4 。 奠1 0e 虢c t so | fh o a 毒鞠dp ho 魏镪es 秘i l i 移q f 维eb i 0 8 c l i v e 辨b s 鑫珏e e 飘强e f e r m e n t c db r o t hw e r es t u d i e d 1 飞ew a t e rs o i u b i i i 妙a n di o nc h a r a c t e ro ft h ea n t b i o t i c s w e r ea n a l y s i z e db yp hp a p e rc h r o m a t o g r a p h ya n dt hi n - i a y e rc h r o m a t o g r a p h y t h e f e s u 埝赡o w e d 壤a t 嘲ew e a k l ya c 避l ea n t 洒i o t l c sw e r es _ t a b l e 约h e a t 绷dp 差稚l e p h y s i o l o g i e a l 柏db i o e h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i e so ft h eh i 曲l ya c l i v i l i v e 鞠t i b i o t i c s u b s t a n c e sw e r es t u d i e di no r d et op r o v i d eh e l p 亿l i n f o m l a t i o nf o rt h e 如r t h e ri s o l a t i o n a n dp u r i 矗c a t i o n ab r i e fp r o c e s sf o rt h ep r i m a 掣i s o l a t i o no ft h ea c t i v es u b 渤n c ew a s 啪文e do 疆 。 i na l l 勋印f d 哪c 鼬甜6 施加材，fc 粕p r o d u c ef a i r l ys t a b i ea n db r o a d sp e c t m m ， s t r o n g i y a c t i v e a n t i 如n g i s u b s t a n c e s oi t sah o p e 如la n t i b i o t i c s p r o d u c i n g 抛拶谬y e 醯l h a ti t sa 髓t i 缸n g a ls u b s _ 辘n e ew i l lb ev a l u eo fp o t e n t i a la p p l i c a t i o ni n a g r i e u l t u r ea n dh e a l 镪 k e y w o r d ：h c c b l o l 2 4 ，a n t i 如n g a la c t i v i 坝s t r a i ni d e n t i f i c a t i o n ，1 6 s r d n a ， f e 嬲e 蕤铤i 傩。两爨i z 懿i 黼，l 辩l 蘸 绷黼dp 珏f i 磊e a i o 牲 i i 圭瀣蛭燕塞堂亟堂缝途塞论塞蕉剑选庭嘎 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中 除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的 研究成果。其袍同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声 明并表示了谢意。 名：捞争期：硎7 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阏；学校可以公布论文的全部 或部分内容，可以采蒲影印、缩邸或其它手段保存论文。保密瓣论文在解密艨 遵守此规定。 一 硝萌年一q 末蚀吼 6 3 第一章文献综述 抗真菌药物作用机制的研究 2 0 世纪5 0 年代至7 0 年代临床真菌感染的病症和死亡率都比较稳定，因此， 对于真菌感染性的问题没有引起足够的重视。事实上，自2 0 世纪7 0 年代以来， 在临床治疗过程中，真菌感染疾病和由于无法控制真菌感染而造成的死亡率逐渐 提高，这与广泛使用对人体免疫系统有损害的药物和大量使用广谱抗菌药物有直 接的关系。另外，与临床使用体内植入物和像a i d s 这样的慢性免疫抑制病毒 的感染有关乜1 。因此，研究开发安全的、新型的和有效的抗真菌药物显得非常重 要引。 抗真菌药物的研究和应用，从上世纪的发展情况来看，大致可以分为以下几 个阶段：第一个发现并被用于临床的为上世纪3 0 年代末，从微生物发酵代谢产 物中分离得到的灰黄霉素：1 9 4 4 年报道了唑类化合物的抗真菌作用；1 9 4 9 年从 微生物代谢产物中分离得到了制霉菌素；1 9 5 6 年报道了两性霉素b 的抗真菌活 性：1 9 5 8 年灰黄霉素被用于临床；同年，上市了第一个唑类抗真菌药物：1 9 6 0 年两性霉素b 被用于临床；1 9 6 2 年报道了氟胞嘧啶( f l u c y t o s i n e ) 的抗真菌活 性；1 9 6 9 年咪康唑和克霉唑( c l o t r i m a z 0 1 e ，局部) 被用于临床；1 9 7 4 年依康 唑被用于临床；1 9 7 9 年咪康唑非肠道制剂在英国上市；1 9 8 1 年酮康唑口服制剂 在美国得到批准上市；同年第一个烯丙胺类药物萘替芬( n a f t i f i n e ) 进入临床 试验；1 9 8 7 年开始研究开发多烯类药物的脂质体制剂：1 9 8 8 年开始试验第一个 棘白菌素类( e c h i n o c a n d i n s ) 药物：1 9 9 0 1 9 9 2 年氟康唑和依曲康唑开始在美 国使用；1 9 9 3 1 9 9 5 年报道了第代三唑类抗真菌药物；1 9 9 5 1 9 9 6 年通过了 第二个烯丙胺类药物特比萘芬( t e r b i n a f i n e ) ，以及通过了两性霉素b 脂质体制 剂；1 9 9 7 年通过了依曲康唑口服溶液制剂；2 0 0 1 年上市了第一个棘白菌素类药 物卡帕芬净( c a s p o f u n g i n ) ：2 0 0 2 年上市了第二个棘白菌素类药物米卡芬净 ( m a g f u n g i n ) h 9 1 。 作为微生物药物，来源于微生物代谢产物或其结构修饰物的抗真菌药物，在 临床上起到了极其重要的作用，特别是近年来，又发现了微生物来源的一类具有 新作用机制( 抑制真菌细胞壁重要组成葡聚糖生物合成) 的抗真菌药物。 抗真菌药物的作用靶位集中在细胞表面：干扰细胞膜的合成如唑类药物氟康 唑等和多烯大环内酯类如两性霉素b 等；干扰细胞壁中几丁质的合成如日光霉 素和多氧菌素等：干扰细胞壁中l ，3 d 葡聚糖的合成如卡帕芬净等；干扰细胞表 面目露糖蚩白复合物的合成如普那米星( p r a d i m i c i n ，普拉迪霉素) 等( 如图l l 所示) l o 。6 1 。 表面甘露囊 蕾置白 i ，- 1 l 曩一 锄叠 露聚镑蛋白 合物抑嗣铟 b a 储n 翻n 嘲 p 阳【d h 蝴 隔 图1 1不同抗真菌药物的作用靶位 l 作用于真菌细胞膜合成的抗真菌药物 目前在临床上广泛使用的这类抗真菌药物有三种结构类型：唑类、多烯类和 烯丙胺硫代氨基甲酸酯类( a l l y l a m i n e t h i o c a r b a m a t e s ) 。这类药物的作用靶位为真 菌细胞膜的主要组成麦角甾醇。 1 1 唑类抗真菌药物作用机制 早在2 0 世纪6 0 年代，就开始研究这类化合物的抗真菌作用。目前应用于临床 的这类药物包括有：咪康唑、依康唑、酮康唑、氟康唑、依曲康唑、奥昔康唑 ( o x i c o n a z o l e ) 、酮康唑( t e r c o n a z o l e ) 、噻康唑( t i o c o n a z o l e ) 等，特别是 氟康唑，由于其具有良好的临床效果和安全性，因而被广泛地使用 。但是，随 着这类药物的广泛使用，耐药性真菌出现的频率愈来愈高，从而鞭策人们不断地 去开发征服抗耐药性真菌的新一代药物。图2 2 所示为一些目前应用于临床的、 正在进行临床研究的唑类抗真菌药物的化学结构。 2 曩栩船藤 。卜o 歹_ 回固 圄 图卜6 真菌细胞膜i ：b 一( 1 ，3 ) 一d - 葡聚糖合成酶复合物( f k s l 和f k s 2 ) 以及其他一些参与调节网络的蛋白 ( 1 ，3 ) 一b d 一葡聚糖合成酶是一个分子量为2 1 0 k d a 、整合于细胞膜的杂合二 聚蛋白。( 1 ，3 ) 一b d 一葡聚糖是构成真菌细胞表面结构的重要物质，合成这种物 质的酶的活性受到抑制，则由于这类物质的缺少或完全丧失，导致细胞表面结构 的破坏而使细胞不能存活。 2 2 作用于真菌细胞壁中几丁质合成的抗真菌抗生素 许多能抗病原真荫的或杀虫的抗生素，多半具有抑制几丁质生物合成的作 用。多氧菌素a ( p 0 1 y o x i na ) 和日光霉素都能抑制真菌细胞壁的合成，其中多 氧菌素d 是真菌细胞壁几_ 】质合成酶最有效的抑制剂，它的化学结构与合成几丁 质的二磷酸尿嘧啶核苷一n 一乙酰葡萄糖胺( u d p n a g ) 相类似，是一个极强的竞争性 抑制剂瞵1 。日光霉素是由唐德链霉菌( s 芒印幽p ) 产生的、结构类似于多氧菌 素的核苷类抗生素。它通过二肽渗透酶进入靶细胞，能抑制真菌几丁质的合成， 是一个很有前途的杀虫杀菌农用抗生素，近期研究表明其有可能作为抗真菌药用 于临床。图卜7 所示为u d p n a g 、多氧菌素、日光霉素的化学结构。 f r 一9 0 0 4 0 3 的化学结构不同于多氧菌素和日光霉素，其为腺苷，且肽结构部 分与核苷的c 一3 残基相连接。其对白念珠茵有效，但对丝状真菌无活性。从 缸拍r f 刀，册咖p d 印鲫姗发酵液中分离得到的环状缩肽( d e p s i p e p t id e ) 化合 物a r t h r i c h i t i n ，以及从海洋真菌伽似一加d c p 幼力册发酵液中分离得到的 l l l 5 g 2 5 6y ，都具有抑制真菌几丁质合成的能力，具有广谱抗真菌的活性。 9 o h 一 、日 料口叮 i i - li 卜“、，y ；y 如 oo，_ h o h o o z 工 i i ：日光霉素x ；i i ：日光霉素z 图卜7u d p n a g 、多氧菌素和日光霉素的化学结构 2 3 以细胞壁中甘露聚糖为作用靶位的抗真菌抗生素 甘露聚糖是真菌壁中含量最多的一类多糖，它主要是通过n 一乙酰一葡糖胺 残基上的b 一( 1 ，4 ) 二糖共价地连接在蛋白质上形成甘露聚糖蛋白复合物。在其 细胞膜的糖化合物中，甘露聚糖的含量高达5 0 以上，在真菌细胞壁的外周，这 种糖蛋白的含量最高，其构成这种细胞的主要抗原，它可以作为抗菌药物的作用 靶位。已经发现的贝那霉素( b e n a n o m y c i n s ) 和普那米星( p r a d i m i c i n s ) ，被认 为是作用于甘露聚糖蛋白的抗真菌抗生素。其作用机制是，这类抗生素首先在钙 离子存在时，其游离的羧基与细胞表面甘露聚糖蛋白的糖部分形成复合物，接着 对细胞壁产生作用，引起胞内钾离子的流失，最终使真菌细胞溶解。但是，至今 还没有发现单一甘露聚糖蛋白的缺失会导致细胞的死亡，提示以此作为抗真菌药 物的筛选靶位值得进一步研究嘶 3 。 3 抑制蛋白质合成的抗真菌抗生素 粪壳菌素( s o r d a r i n ) 早在1 9 7 1 年就作为抗真菌抗生素从勤池r 妇删7 p d s a 代谢产物中分离获得，但其作用机制在2 0 多年后，从删j 衄舢加枷拈代 谢产物和胁，c j j j 删脚拍，d u 芒p 册代谢产物中分别分离获得结构类似物 g r l 3 5 4 0 2 和b e 3 1 4 0 5 后才得以了解。来源于蜡状芽孢杆菌( 毖c f ，sc 咖晒) 1 0 吖p一 肼又 o 代谢产物的顺环戊氨酸( c i s p e n t a c i n ) 和西唐链霉菌( s t r e p 芒删c 已ss p r 册j j ) 代谢产物的f r l 0 9 6 1 5 ，以及它们的结构类似物如b a y l 0 8 8 8 8 似乎具有双重作用 模式。顺环戊氨酸既能够干扰氨基酸的传输，也能够干扰氨基酸代谢的调节。图 卜8 所示为粪壳菌素和顺环戊氨酸的化学结构【圳。 o 一 s o f d a r j l i c i s p e n t ac i n 卜8 粪壳菌素和顺环戊氨酸的化学结构 o o h 4 作用于核酸合成的抗真菌药物 4 1 抗真菌合成药物5 一氟胞嘧啶 这类药物对许多酵母菌具有活性，如念珠菌和新型隐球菌。许多真菌对该药 物容易产生耐药性。从对白念珠菌分离株的两组调查表明：6 0 和5 7 的分离株 对药物敏感：3 6 和3 7 的分离株对该药物部分耐受；4 和6 的分离株对该药物 产生高度耐受。目前，临床上很少单独使用，而往往与其他抗真菌药物如氟康唑 和两性霉素b 等合并使用m 1 。 5 一氟胞嘧啶( f l u c y t o s i n e ，5 f c ：结构如图卜9 所示) 在渗透酶的帮助下进 入真菌细胞，一旦进入胞内，则通过胞嘧啶脱氨酶转化成为5 一氟鸟嘧啶( 5 f u ) ， 随后，通过u m p 一焦磷酸酶转化为5 一氟鸟苷酸( f u m p ) ，其进一步被磷酸化后掺入 到r n a ，最终破坏蛋白质的合成。5 f u 也能够被转化为5 一氟脱氧鸟嘧啶单磷酸， 其能够抑制参与d n a 合成和细胞核分裂的胸苷酸合成酶。因此，5 f u 的抗菌作用 机制涉及到干扰嘧啶的代谢、r n a 和d n a 的合成以及蛋白质的合成等m 1 。 图卜95 一氟胞嘧啶的化学结构 h 真菌对5 f c 产生耐药性的主要作用机制是由于降低了药物的吸收( 即失去了 渗透酶的活性) ，或是失去了将该药物转化为f u 肝的能力。尽管酿洒酵母和c 动妇招对5 f c 产生耐药性的主要作用机制是由于药物吸收被降低的缘故，但 对白念珠菌和新型隐球菌来说并非如此。 有较多的研究表明：当真菌由于缺少胞嘧啶脱氨酶或鸟苷磷酸核糖基转移酶 ( u r a c ilp h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e ，u p r t a s e ) ，使5 f c 不能转化为f u m p 时， 则足以对该药物产生耐药性。胞嘧啶脱氨酶和u p r t a s e 构成嘧啶补救途径，而在 正常环境下嘧啶是从头合成的，因此对菌体的生长不是必需的。在大多数临床和 实验室分离的对5 f c 产生耐药性的白念珠菌和新型隐球菌，其主要原因是由于不 能合成嘧啶补救途径的酶。在白念珠菌中，u p r t a s e 活性的降低与基冈剂量依赖 方式的耐药性有关。纯合子彤杉能y 具有较高的u p r t a s e 专一性活性( 大约3 个 单位) ，而杂合子彤髟位y 的酶活性较低( 大约1 - 5 个单位) ，纯合子纪r 伽矿则 几乎测不到u p r t a s e 专一性活性m 1 。 尽管在抗细菌药物中没有核苷类药物，但有些药物需在胞内被生物修饰后才 具有活性。抗真菌药物甲硝唑在胞内，首先是在无氧的情况下，将5 一硝基咪唑 分子中的硝基还原。耐受甲硝唑的真菌很少( 这可能是与其他药物相比，使用频 率较低的缘故) ，产生耐药性的原因可以认为是由于细胞吸收药物的能力降低， 或是胞内还原硝基的速率降低所造成。另外一个更为相关的比较是：疱疹单型病 毒( h e r p e ss i m p l e xv i r u s ) 对抗病毒药物阿昔洛韦( a c y c l o v i r ) 产生的耐药 性。该药物由病毒编码的胸苷激酶活化成为单磷酸阿昔洛韦，后者再经过细胞酶 作用成为三磷酸阿昔洛韦，其作为活性物质在复制病毒d n a 中，起着终止d n a 链 延长的作用，从而达到抗病毒作用。病毒对阿昔洛韦产生耐药性的主要作用机制 是：降低了或是改变了药物与胸苷激酶的亲和力，从而阻止了将药物在胞内活化 成为三磷酸阿昔洛韦的可能性h 。 4 2 抗真菌抗生素灰黄霉素 灰黄霉素( g r is e o f u l v i n ) 是由0 x f o r d 等于1 9 3 9 年首先发现，从而开创了 抗真菌抗生素的历史( 结构见图卜1 0 ) 。当时的产生菌为灰黄青霉( 胁力j _ ，j 删 s p 甜w 蹦动。灰黄霉素于1 9 5 8 年开始应用于临床，至今仍是一个广泛应用的 抗皮肤真菌抗生素。许多种类的青霉，如展青霉( 砌j c j j 姗册芒，j ，痢、寻麻 青霉伊e n i c i n i u mu n i c a 亩蕊黑青霉0 p e n i c j l n 唧n j g r i c a n 岛等都能产生这种 化合物m 1 。中国采用寻麻青霉来生产灰黄霉素。 灰黄霉素能够有效地抑制表皮癣菌、小孢子菌和毛发癣菌等的生长。其作用 机制可能是具有鸟嘌呤相似结构的灰黄霉素以竞争性抑制作用干扰真菌细胞的 1 2 d n a 合成，从而抑制其生长。它作用于敏感真菌后可致菌丝肿胀成球形，细胞壁 丧失完整性，胞浆膜则近乎消失，仅遗留少量皱缩的残余物和巨大的脂类贮存颗 粒。它对生长期的真菌菌丝作用更强。口服灰黄霉素后沉积于皮肤角质层，并与 皮肤毛囊及甲、爪的蛋白质相结合，防止癣菌的继续侵入，最后病原体随皮肤和 毛发的自然或人工脱落而离开人体。临床中还未见有耐药菌出现。它对寄生性浅 部霉菌( 皮肤丝状菌) 的作用最显著，可用于头癣、叠瓦癣及手足甲癣等体表霉菌 感染的治疗h 引。 另外，利福霉素类抗生素可通过抑制依赖d n a 的r n a 多聚酶的活性来影响蛋 白质合成的启动，尽管这类抗生素在体外并未显示抗真菌活性，但利福霉素s 衍 生物利福布汀的体外试验显示：其与两性霉素b 具有协同抗真菌作用，且组织穿 透性强h 4 拍1 。 0 灰黄霉素 鸟嘌呤 图卜1 0 灰黄霉素和鸟嘌呤的化学结构 微生物的多样性和微生物代谢产物的多样性，永远是发现新药的无穷宝藏。 随着生命科学的发展，一些新的抗真菌药物作用靶点的发现，必将有更多更有效 的抗真菌抗生素被发现和应用。在过去的2 0 年问，棘白菌素类抗生素的发现和 应用，更增强了人们从微生物代谢产物中寻找抗真菌抗生素的信心。在今后的若 干年间，将会有更多的作用靶位用于抗真菌抗生素的筛选，并一定能够由此获得 更多更有效的抗生素。这些筛选靶位包括：1 ) 针对胞内代谢的中间产物如核酸、 氨基酸和多胺代谢；2 ) 针对微管功能如影响微管聚集或干扰微管结构完整性；3 ) 针对细胞信号传导如影响蛋白激酶和磷酸酶系统；4 ) 针对真菌繁殖周期如影响 细胞分裂等；5 ) 针对真菌毒力如改变毒力基因调节等。 5 结语 微生物的多样性和微生物代谢产物的多样性，永远是发现新药的无穷宝藏。 一方面扩大产抗微生物来源的寻找，如近年来，人们已经从海洋真菌中发现了许 多的具有抗真菌活性的化合物，为解决目前由真菌感染导致的疾病提供潜在的药 源。另一方面随着生命科学的发展，一些新的抗真菌药物作用靶点的发现，必将 有更大更有效的抗真菌撬生素被发现和应用。 五十年来，抗真菌药物的研发主要以作用于真菌细胞膜和核酸的药物占主导 地位，随着这两大类较为传统的药物的使用，耐药性发生率不断增加，新的作用 机制及高效低毒的药物仍然是抗真菌药物筛选的重任。 近年来抗真菌药物研究已经取得较大进展，现已发现了一些新的作用靶点和 新结构类型的先导化合物。新型抗真菌药物的研究方向可以致力于从天然产物中 发掘活性好的先导化合物的开发及优化，并深入研究各类药物与靶点的作用机 制，弱时将基因缝学、计算视分子模拟技术及组合亿学技术等薪方法应耀于抗真 菌药物的研究。天然产物由于可能作用于新的靶点和具有较高选择性，将成为今 后抗真菌药物研究开发的一个重要方向。 6 本课题研究内容、臣的及意义 微生物的次生代谢产物是生物活性物质的重要来源，开展新药的研究与开 发，就必须加强对微生物活性物质的筛选。内于放线菌特别是链霉菌产生大量有 用的抗生素，力了能发现更多有价值的生物活性亿合物。隧着分子生物学和其缝 相关学科的发展，人们能够发现并认识更加理想的药物作用靶点，建立枉新型生 物模型基础卜的筛选方案，将对生物活性物质的筛选和新药开发具有十分重要的 作用。开展微生物来源生物活性物质的筛选，经常会发现舆有新活性的已知化合 物，我们应该霆视开发己絮化合物於薪活性耜荻焉途。慧之，当前徽生物活性物 质的研究进入了快速发展的时期，如果我们在菌种资源、筛选手段等方面紧跟世 界研究发展趋势，必然会有很多成果出现。 本课题对上海来益生物药物磺发中心傈藏的一株高活性的链霉菌菌株 l c c b l o l 2 哇的代谢产物进行了系列研究：进行以白色念珠菌、青霉菌、曲霉、枯 草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等为敏感指示菌的抗菌筛选，通过抗菌 模型筛选出活性菌株；利用传统的方法和现代方法对该菌进行菌种鉴定；选用合 适发酵条件对嚣e 转1 0 1 2 4 进行发酵培养和条件帮培养基成分进行优化；采震滤纸 片法对发酵培养产物不同极性溶剂萃取部位：对代谢产物的理化性质进行了研 究，包括对温度、酸碱的稳定1 生及极性大小、离子特性等；采用活性指导下的靶 囱追踪分离方法，配合柱层柝分离、树脂柱层析、中压色谱技术等系列分离纯化 手段对活性较好的部位进行进步的分离纯化，希望能够得到一种对生产实践和 科学研究有意义的化合物。 土壅垭垫太堂亟堂位迨窒 筮三童竖婴地丝尘凰笠丛亟盐蓝羞塑荭基堂噩世趑 第二章h c c b l o1 2 4 固体及液体培养物抗真菌活性的测定 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 活性菌株：h c c b l 0 1 2 4 活性筛选用指示菌： h c c b 2 0 1 0 4 h c c b 2 0 0 2 9 h c c b 2 0 0 2 3 h c c b 2 0 0 2 6 h c c b 2 0 0 2 4 h c c b 0 3 6 4 l h c c b 0 3 6 4 8 h c c b 0 3 6 7l h c c b 0 4 8 0 6 h c c b 0 3 6 8 4 h c c b 0 4 7 4 8 h c c b 0 3 6 8 6 h c c b 0 4 7 9 2 h c c b o o1 6 4 h c c b 0 3 3 2 9 h c c b 0 2 3 1 0 h c c b 0 3 6 6 8 h c c b 0 0 6 9 9 h c c b 0 4 6 5 l h c c b 0 1 7 9 8 h c c b 0 4 8 51 h c c b 0 4 7 6 5 h c c b 0 4 8 3 0 h c c b 0 2 6 9 4 h c c b 0 3 2 6 9 c 口”诫出口舾地册s 白色念珠球菌 西f 加，缸乃勿c 0 豇 大肠杆菌 b 白c f s z f 6 f 订括 枯草芽孢杆菌 & 印厅) ，肠c c 螂口甜陀淞 金黄色葡萄球菌 勋彤f m ，甜纪a 藤黄八叠球菌 胎”缸册甜s p 青霉属 n 盯缸玎，讹s p 青霉属 凡s 甜m 所s p 镰孢霉属 ，伽f 删s p 镰孢霉属 g 护f c 乃甜所s p 地霉属 g e o 驴f c 厅”m s p 地霉属 爿胖r g 肼觚s p 黑曲霉属 彳点妒曙f 淞s p 黑曲霉属 c “w “肠，妇s p 弯孢霉属 c z 删“枷妇s p 弯孢霉属 如”f f 组s p 串珠霉属 如胛玎玩s p 串珠霉属 砌口朋玎胁s p 枝顶孢霉属 砀a m n 础s p 枝顶孢霉属 么加朋缈衄s p 链格孢霉属 彳加朋甜池s p 链格孢霉属 开f c d 出s p 木霉属 乃七办d 如s p 木霉属 r 向沱d 删s s p 根霉属 尺办忍d p 淞s p 根霉属 1 5 蓥三童蔓鳗! q ! 呈! 【型签缝煎 奎量羞塑埴墓萱适丝的型定上盘衄塾太堂亟堂位途童 以上菌种均由上海来益生物药物研发中心保藏。 1 1 2 主要实验试剂 葡萄糖中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 黄豆饼粉北京康明威培养基技术有限公司 棉籽蛋白北京康明威培养基技术有限公司 牛肉膏中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 可溶性淀粉上海精析化工科技有限公司 蔗糖中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 酵母浸出粉上海源聚生物科技有限公司 n a c l 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 琼脂粉青岛冻粉厂 蛋白胨中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 丙酮上海试剂一厂 乙酸乙酯上海试剂一厂 k n 0 。中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 k h ：p o 。中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 z n s 0 4 7 h ：0中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 轻质c a c 0 3浙江新昌制药厂 m g s 0 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 f e s o 。中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 生物素中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 1 1 3 主要实验仪器与设备 t g l 一1 6 型高速台式离心机 上海医用分析仪器厂 a v a n ti j 一2 5 高速冷冻离心机 美国b e c l ( m a n h v 一8 5 全自动湿热灭菌锅日本h i r a y a m a d z f 一6 0 2 0 型真空干燥箱 上海益恒实验仪器有限公司 p h s 一2 c 数显型酸度计 上海宇隆仪器有限公司 x s p 一2 c 型显微镜江苏海门市麒麟医用仪器厂 a s 型电热鼓风干燥箱天津市兴水科学仪器厂 冷冻干燥仪 c h i s t l a b o r o t a 4 0 0 0 旋转蒸发仪 h e i d o l p h b l 6 0 0 电子天平德国s a r t o r i u s b a c l ( m a n 离心管美国b a c l ( m a n 公司 1 6 纸敏片 w h a t m a n w f z u v 一2 1 0 0 型紫外可见分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司 1 1 4 培养基 细菌培养用牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏3 克、蛋白胨l o g 、氯化钠5 9 、水1 0 0 0 m 1 ，p h7 2 7 5 ，琼脂粉按2 分装到各瓶。 链霉菌培养用高氏一号固体培养基： 可溶性淀粉2 0 9 、k n 0 3 1g 、n a c lo 5 9 、k 2 h p 0 4 0 5 9 、m g s 0 40 5 9 、f e s 0 4 o 0 lg 、水1 0 0 0 m l ，p h7 2 7 4 ，琼脂粉按2 3 分装到各瓶。 链霉菌种子培养基： 可溶性淀粉1 5 9 、黄豆饼粉1 5 9 、葡萄糖1 0 9 、蛋白胨5 9 、硝酸钾2 5 9 、 酵母浸出粉5 9 、轻质碳酸钙4 9 ，水1 0 0 0 m 1 ，p h 为7 o 。 链霉菌发酵用液体培养基： 黄豆饼粉2 5 9 、酵母浸出粉3 5 9 、棉籽蛋白1 0 9 、可溶性淀粉7 5 9 、葡萄 糖2 2 5 9 、z n s o 7 h 。00 5 9 、轻质c a c 0 。6 9 、k h 2 p 0 40 1 9 ，水1 0 0 0 m l ，p h 自然。 培养白色念珠球菌用的酵母完全培养基( y p d ) ： 葡萄糖2 0 9 、蛋白胨1 0 9 、酵母浸出粉5 9 、加水1 0 0 0 m 1 、p h 自然，琼脂粉 按2 分装到各瓶。 真菌培养用改良马铃薯葡萄糖琼脂( p d a ) 培养基： 土豆2 0 0 9 、葡萄糖2 0 9 、生物素0 1 9 、蛋白胨2 9 ，加水1 0 0 0 m l 、p h 自然， 琼脂粉按2 分装到各瓶( 土豆去皮切成丝状，水煮l h 后用纱布过滤，使用过滤液， 滤渣去除) 。 以上各培养基经高压灭菌锅1 2 1 高压灭菌3 0 m i n ，备用。 1 2 方法 1 2 1 活化菌种 将实验室分离保藏的h c c b l o l 2 4 接种于高氏一号培养基斜面，细菌接种牛肉 膏蛋白胨培养基试管斜面，白色念珠球菌( 以下简称白念) 接种于y p d 斜面，其 它真菌接种于p d a 斜面，其中细菌和白念置于3 7 恒温培养箱培养，细菌培养2 4 h 、 1 7 白念培养4 8 h ，奠它真菌2 8 恒温培养箱培养9 6 h 。 王。2 。2 平扳琼脂移块法测定敝c b l o 王2 4 抗菌谱 存已灭菌的平板( 直径9 0 嗍) 上倒入2 5 m l 左右的高氏一号固体培养基，共倒 三块，待其凝固后，用直径6 蝴打孔器打出若干琼脂块放到另外一个已灭菌的空 自平叛( 壹径1 4 0 姗) 上，在窆自的乎扳中央放置一个装宥无菌水的瓶盖，起到 裸湿的作用。将活化后的嚣c c b l o l 2 4 分别接种到每一个琼脂块上，在2 8 恒温箱 正置培养2 d 。 在无菌的条 牛下，将白色念珠球菌、大肠杆菌、桔草芽孢杆菌、金黄色葡萄 球菌、藤荚，叠球菌、青霉属、睦霉属、根霉属、本霉属、弯孢霉羼、串珠霉属、 枝顶孢霉属、链格孢霉属、地霉属等二十五种指示菌的菌蓄，分别接入3 0 m l 含有 0 7 n a c l 的无菌水中，用玻璃珠打散，制备成菌悬液。分别取1 m l 不同指示菌悬 液翱入相应的加热冷却至4 5 左右的培养基( 5 0 璎1 ) 中摇匀，分别铡入己灭荣的平 板中，每个平袄中培养基为2 0 糯l 左右，每种指示菌铺两块平扳作为平行，待其冷 却凝固备用。 用己灭菌的镊子把培养两天长有 c c b l o l 2 4 菌落的琼男嚣块分别取出放置于每 个对应的指示蓠平板上。自念、藤黄、金黄色葡萄球菌、梏草芽稳杆菌放在3 7 恒温培养箱正置培养；而其它真菌则在2 8 恒温培养箱正置培养，每1 2 h 观察 一次敏感指示菌生长状况和抑制情况，并测量抑菌圈直径。 羔。2 。3 菌丝体提取物与发酵液抗真菌活性的测定 根据实验1 2 2 观测到h c c b l o l 2 4 代谢产物的抑菌结果，为了进一步确认抗真 菌活性物质是分布在发酵液中还是分布于菌丝体内，特设计此实验，并可为以后 的分离纯化所需豹样品擞些积累。 挑取少量菌株h c c b l o l 2 4 单菌落接种于装有2 5 m l 2 5 0 m l 三角瓶的链霉菌种子 培养基中，2 8 摇床( 2 2 0 r m i n ) 培养2 d ，按1 0 的接种量接种到2 5 m 1 2 5 0 m 1 三 角瓶的链霉菌液体发酵培养基内，放置于2 8 摇床培养4 d ，取出将其l o ，o r 越i n 离心l o m i n ，分掰取其上清液和下层的菌丝体，茵丝体用与上清液同体积丙酮浸 泡过夜。 1 2 。3 1 发酵液抗菌活性测定 用移液枪吸鞭2 0 鼙l 发酵液上清分别加到5 2 个直径为6 黼的到纸敏片上，放在 超净台紫外照射6 0 m i n ，一方面进行消毒，另方面有充分的时间让t 清中的水 分挥发掉，保持纸敏片干燥。 土姿娅堇太堂亟堂位睑塞笙三童丛鳗! q ! 窒垒固签丛速签垃菱塑拉墓菌适世笪型定 制备鉴定平板，分别加菌悬液1 m l 至对应的培养基中摇匀倒平板，贴在十三 种指示菌平板上，细菌与白色念珠球菌在3 7 恒温培养箱倒置培养；而其它真菌 在2 8 恒温培养箱正置进行培养，每1 2 h 观察一次指示菌生长状况，记下抑菌圈 直径。 1 2 3 2 菌丝体提取物抗菌活性测定 将丙酮浸泡过夜的菌丝体在1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，取上清，除去沉淀，取 2 0pl 上清到直径为6 咖的纸敏片上；另外，取2 0ul 丙酮溶剂加到纸敏片上，待 溶剂挥发后再将其放置在接有各个指示菌的平板上作为对照，细菌与白念在3 7 恒温培养箱倒置培养；而其它真菌在2 8 恒温培养箱进行培养，测量并记录抑 菌圈直径。 1 2 3 3 不同浓度菌丝体提取物抗茵活性测定 将丙酮浸泡过夜的菌丝体在1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，各取上清0 1 m 1 分别加到 6 个e p 管中，然后用丙酮依次将6 个管中样品稀释0 倍、2 倍、5 倍、1 0 倍、2 0 倍、 1 0 0 倍后，各取2 0pl 上清加到直径为6 衄的纸敏片上进行抑菌实验，分别以藤黄、 青霉属、曲霉属、链格孢霉属、地霉属、镰孢霉属、木霉属等为指示菌，每1 2 h 观察一次指示菌生长状况，记下抑菌圈直径。 2 结果与分析 2 1 平板琼脂移块法测定抗菌谱 通过平板琼脂移块法对菌株h c c b l 0 1 2 4 进行抑菌实验，即：通过平板琼脂移 块法，利用抗生素在培养基内的扩散作用，将培养两天的h c c b l 0 1 2 4 琼脂块放置 于含有指示菌的培养基的平板上，经培养后，在抗生素到达的适当范围内，形成 一定浓度的圆形区，产生透明的抑茵圈，通过测量抑菌圈的大小反映抑菌能力。 结果表明，菌株h c c b l 0 1 2 4 的代谢产物除对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌物没有抑 制外，对其它的指示菌均有不同程度抑制作用。测定结果见表2 1 ，真菌白念和 细菌生长较快，1 2 h 就可以看出抑菌圈，但是不够清晰透明，而2 4 h 后观察，抑 菌圈清晰透明如图2 一l 的a 、b 分别是对白念和藤黄抑菌图片；对于丝状真菌， 生长相对较慢，青霉属、曲霉属等孢子丰富的真菌一般在2 4 h 后才能隐约看出模 糊的透明抑菌圈，在3 6 h 后抑菌圈就会比较清晰如图2 1 的c 、d 对应的曲霉和 青霉的抑菌结果图片；其他丝状真菌生长较慢，一般在7 2 h 后才能观察到抑菌圈 的出现。 1 9 图2 一lh c c b l o l 2 4 琼脂移块法对白念( a ) 、藤黄( b ) 、曲霉( c ) 、青霉( d ) 的抑制作用 表2 1 平板琼脂移块法测定抑菌结果直径单位：衄 “一”表示无抑菌作用 2 0 r i 一 錾 土盘娅蒸太堂亟堂位睑塞箜三童竖鳗! q 1 2 垒固签丛退i 查垃差塑蕴真苴适丝的测定 2 2 菌丝体提取物及发酵液抑菌实验结果 通过对链霉菌h c c b l o l 2 4 发酵液和菌丝体的提取物对不同指示菌的抑菌实 验，显示其发酵液和菌丝体内均存在对指示菌具有较强的抑制作用的活性物质。 但上清液和菌丝体提取物的抑菌效果有一些差异，荫丝体提取物对指示茵有较明 显的抑菌效果，上清液的效果相对弱一些。抑菌结果见农2 2 。 表2 2 菌丝体提取物及发酵卜清液测定抑菌结果直径巾位：咖 “一”表不无抑菌作用 由表2 2 可以看出，在| 一样加样量的情况下，菌丝体提取物的活性相对于发 酵液上清的活性要强，可能是因为活性物质在菌体的细胞内，分泌出来的只是小 部分，大部分的抗真菌物质要有溶媒抽提才能释放出来。另外，表2 1 、2 2 相 比，琼脂块的活性要明显的高于发酵液和抽提物的活性，是因为在琼脂移块的条 件下积累的活性产物较多的结果。指示菌的结果显示，该活性物质对丝状的真菌 具有普遍的抗性，即初步可以认为抗菌谱较广。 2 3 不同浓度菌丝体提取物的抗菌活性实验 经稀释不同倍数的菌丝体提取物抗菌活性结果见表2 3 ，图2 2 、2 3 。 表2 3 稀释不同倍数的荫丝体提取物抗真菌结果直径单位：哪 2 l 笠二童旦堡! q ! 坌垒圃签缝速签筮差塑荭墓萱适丝的型定 ! ：盘哑整盔堂亟堂焦诠塞 由表中结果看出，菌丝体提取物具有较高的活性，特别是对曲霉、链格孢霉、 镰孢霉具有较好的抗性，在稀释1 0 0 倍后仍有活性。 图2 2 稀释不同倍数样品对镰孢 霉0 4 8 0 6 抑菌图 图2 3 稀释不同倍数样品对白 念2 0 1 0 4 抑菌图 3 讨论 采用琼脂移块法进行抑菌实验，原因是平板代谢物质可在固体基质中进行大 量的积累，有利于进行抑菌效果的初步判断。在实验中发现，抑菌圈大小与指示 菌的接种量和平板的厚度有关。指示菌接种量大或平板倒得较厚，抑菌圈会明显 的减小。所以在操作的过程中很难做到接种量和平板厚度的准确，故测定的抑茵 圈大小只是一种定性的方法。但是，抑菌圈透明度还是很说明问题的，透明度越 高抑菌效果越好。有些平板的抑菌圈会随着培养时间增加而减小，可能是因为抑 菌效果是在指示菌的幼龄较好，随着指示菌的生长繁殖，而待测菌的代谢产物分 泌不足所致。另外，抑菌圈大小与代谢物在琼脂中的渗透性、培养温度、培养基 成分、酸碱度、实验菌种的菌龄、产生抗生素的茵体浓度等多种因素有关。 菌株h c c b l o l 2 4 所产抗真菌活性物质还未定性，是一种未知物质，故没有标 准品作参照，为了以后跟踪分离纯化过程活性物质的需要，暂且确定其检测采用 微生物测定方法中国际上最普遍采用的在琼脂平板上的纸敏片法，选定生长快、 培养时间短，可避免染菌、抑茵圈透明、抑菌圈边缘清晰等优点白色念珠菌为首 选的指示菌，另外选择其他几种辅助指示菌，测定抑菌圈直径来粗略衡量其效价， 也可以用薄层层析法，使不同的物质在板上分开，然后把它贴在琼脂平板一卜进行 生物鉴定，根据抑菌圈的位置来确定哪个条带是对应的抗真菌的活性物质。待活 性物质提取到一定程度，可依据其紫外吸收特征，借助于用h p l c 法或其它方法对 其进行定量分析。 h c c