（药物化学专业论文）新型载体pei修饰树脂固定化脂肪酶及其在对2氯丙酸酯拆分中的应用.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 新型载体p ei 修饰树脂固定化脂肪酶 及其在对2 一氯丙酸酯拆分中的应用 摘要 2 氯丙酸是合成农药、染料和农林化学品的重要中间体，然而只 有光学活性的2 氯丙酸合成的产品才具有较高的生理活性或药理作 用。由2 氯丙酸及其酯外消旋体为原料合成的农药和医药中间体，由 于其含有低效或无效或有毒副作用的对映异构体，不仅活性低，而且 会加剧环境污染。因此，研究如何高效地获取光学活性的2 氯丙酸具 有十分重要的意义。 本文以2 氯丙酸为模型化合物，研究了猪胰脂肪酶( p p l ) 、解脂假 丝酵母脂肪酶( c l l ) 和褶皱假丝酵母脂肪酶( c r y ) 催化对映选择性酯水 解反应制备该化合物的基本规律，确定了最佳酶和酶促拆分的最佳反 应条件。为了克服游离酶催化的一些不足之处，我们制备了新型固定 化载体p e u d l 5 2 复合树脂对脂肪酶c r l 进行固定化，寻求最佳固定 化方案，并将固定化酶应用于2 氯丙酸甲酯的拆分。 实验结果表明，在p e i 浓度为6g l ，反应温度为3 5 。c 时制备的 p e i d 1 5 2 复合树脂效果最佳，p e i 吸附量达1 5 0m g g ( * * ) 。以p e i d 1 5 2 为载体，用载体表面涂布法在p h = 7 2 的磷酸缓冲溶液中，2 5 下对4 0 m g 脂肪酶c r l 1gp e i d 1 5 2 载体进行固定化，能得到活性最大的固定 化酶，且固定化酶的酸碱稳定性和热稳定性均较游离酶有所提高。将 浙江工业大学硕士学位论文 固定化酶应用到催化拆分外消旋2 氯丙酸甲酯反应中，固定化酶仍能 保持游离酶的催化拆分优势，当转化率 3 ) ，反应过程中生成的水将富集在亲水性酶分子表面，随着反应 的进行水将会在酶分子表面形成一个独立的水相，使逆反应大大加快，不利于酯 化反应的进一步进行。而在亲水性太强的有机溶剂中，溶剂会夺取保持酶分子正 常构型的“必需水 3 5 1 ，而使酶分子失活而不能催化酯化反应的进行。所以，找 到一种合适的有机溶剂是脂肪酶促酯化反应的关键。 如，杜伟等【3 6 1 以无水环己烷为反应介质，利用脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 催化酮基布 洛芬与丙醇的酯化反应，反应3 0h ，转化率6 8 ，s 酮基布洛芬对映体过剩值可达 9 2 。 1 3 3 3 脂肪酶催化不对称酯交换反应 相比脂肪酶催化的水解和酯化反应，酯交换反应应用的并不是很多，因为酯 交换反应的条件不容易控制，往往伴随着少量的水解反应。它是拆分外消旋醇的 比较方便方法。 如，董亚琴等【3 7 】利用n o v o z y m 4 3 5 在正丁醇体系中催化酯交换反应，对外消旋 扁桃酸乙酯进行了动力学拆分( 如图1 3 所示) ，当转化率达到5 6 时，获得光学纯度 为9 2 4 的s 扁桃酸乙酯。 9 浙江工业大学硕士学位论文 一o c h2 c h3 + h 3 c - c h2 - - c h2 - - c h2 一o h o 一( c h2 ) 3 c h3 + h a c c h2 一o h 图1 - 3 脂肪酯交换拆分扁桃酸乙酯 1 3 4 脂肪酶催化反应对映体选择性的提高方法 l i p a s c 在实际生产过程中，酶的拆分效果往往要通过下列手段得到加强以满足工业 化生产的要求【3 8 】。 1 、介质工程。即通过溶剂调控酶的选择性。很多酶促反应是在有机溶剂中进 行的，而许多有机溶剂能夺取酶表面微量的“必需水 而使酶失活。选择适当的 溶剂能保持酶的构型甚至表现出“激活 作用。常用的溶剂体系如：反胶束体系、 混合溶剂体系等。 2 、预处理酶。酶的预处理可包括提纯、化学修饰、固定化等。商品酶或粗酶 中的杂酶或添加剂会降低酶的对映体选择性，因此纯化酶可以提高其选择性。酶 的化学修饰也是提高应专一性和产率行之有效的方法，如表面活性剂包衣酶【3 9 j ， 此外酶的固定化也可大大提高酶的立体选择性和活性、稳定性【柏】。 3 、添加剂的影响。加入添加剂是提高酶选择性的一种方法，而且较为简单易 行。一些大环添加剂可以提高对映体选择性和反应产率，如冠醚等。某些表面活 性剂的加入也能增大某些反应的立体选择性，例如：l i p a s eo f 粗酶和纯化酶催化 拆分酮基布洛芬的反应中，加入吐温8 0 能使酶反应e 值由8 0 增大至大于 0 0 1 4 1 1 。 4 、其它影响。除上述方法外，微波辐射、加入对映选择性抑制剂等方法也能 提高酶促反应的立体选择性。 1 4 酶的修饰及固定化 随着脂肪酶在工业化生产中越来越广泛的应用，游离酶的一些不足之处也暴 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 露了出来。游离酶稳定性差，易失活，会与产物混合在一起，难以纯化和回收利 用，大大增加了生产成本，阻碍了其在大规模工业化生产中更广泛的应用。因此， 在2 0 世纪6 0 年代逐渐兴起了对酶的固定化方法的研究。在1 9 7 1 年第一届国际酶工 程会议上，正式建议采用“固定化酶 ( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 的名称。所谓固定化 酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可 以重复回收使用【4 2 】。 1 4 i 固定化载体 载体的好坏是固定化成功与否的关键。常用的载体大体可分为三类：a 、无机 载体，如硅胶、硅藻土、分子筛、氧化铝、活性碳等无机多孔吸附剂；b 、有机载 体，如纤维素、尼龙、聚乙烯、聚酰胺、琼脂糖、大孔树脂等；c 、复合载体，即 将一些具有吸附作用的活性化合物涂布在普通载体表面制得的既有强吸附作用又 有好的机械性能的合成载体【4 3 】。 1 4 2 固定化方法 所谓酶的固定化，就是将水溶性的游离酶分子束缚在载体上，但不能改变酶 原有的活性，使其能重复进行催化反应的技术。固定化酶的方法主要可分为四种： 吸附法、包埋法、共价法和交联法。 1 4 2 1 吸附法 吸附法是最简单的固定方法，酶与载体之间的亲和力是范德华力，离子键和 氢键。此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 1 、物理吸附法 4 4 1 ：使用对蛋白质具有高度吸附力的非水溶性载体，如活性炭、 几丁质，多孔玻璃等作为吸附剂，将酶吸附到载体表面使酶固定化。该方法操作 简单，反应条件温和，载体可以反复利用，但结合不牢固，酶容易脱落。按照操 作过程不同，物理吸附法又可分为水相固定法、载体表面涂布法、溶剂沉淀法和 游离固定法。这四种方法各有优点，可用于不同反应。 2 、离子吸附法：利用酶蛋白在解离状态下可用电荷引力而固着于带有与酶蛋 白电荷相异的离子交换剂( 水不溶性载体) 上的固定化方法。此方法操作简单，固定 较为牢固，在工业上用途颇广，常用的载体有阴离子交换剂，如d e a e _ 纤维素、 t e a e 一纤维素、d e a e _ 葡聚糖凝胶和阳离子交换剂如羧甲基纤维素。 1 4 2 2 包埋法【4 5 4 6 】 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中，这样可 浙江工业大学硕士学位论文 以防止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相接触。此法较为简便，酶分 子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用。包埋法还 可分为凝胶包埋和微胶囊包埋。 1 4 2 3 共价法 4 7 , 4 8 酶蛋白分子上的官能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键连 接的方法。其有点是酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，但反应条件激烈， 操作复杂，控制条件苛刻。主要有重氮法，肽键法，烷基化法和芳基化法。 1 4 2 4 交联法 使酶与带两个或两个以上官能团的多官能团试剂进行反应，生成不溶于水的 二维交联聚集体，交联形成的固定化酶称为交联酶。与共价结合法一样，都是靠 化学结合的方法使酶固定化。但区别在于交联法使用了交联剂。常用的交联剂有 戊二醛、鞣酸等。单纯的用交联法固定得到的固定化酶颗粒很小，使用不方便， 往往要将交联法与其他固定化方法结合起来，以达到良好的固定化效果。如用壳 聚糖固定假丝酵母9 9 1 2 5 脂肪酶后，用戊二醛交联等【4 9 】。 1 4 2 5 各种固定化方法的比较 不同的固定化酶的方法在制备、酶活力、结合力等方面存在着差异，如表1 2 所示。 表1 - 2 几种固定化方法的比较 1 4 3 固定化酶的优点 与游离酶相比，固定化酶具有以下几方面优点。 ( 1 ) 反应完成后经过滤或离心等简单的方法就可以回收，可重复使用，降低了 1 2 浙江工业大学硕士学位论文 酶制剂的成本。 ( 2 ) 可以装成酶柱，当底物溶液流经酶柱时，就能发生酶促反应，适合工业化 生产。 ( 3 ) 酶经过固定化后，稳定性一般都有所提高。 ( 4 ) 有些固定化酶具有比游离酶更高的对映体选择性。 1 5 聚乙烯亚胺( p e i ) 新型载体的研究 聚乙烯亚胺，英文名：p o l y e t h y l e n i m i n e ，结构式为： t 肖1 t n n h 2 它是一种水溶性聚胺，也是重金属离子吸附剂，工业上常将其结合在某些载 体上用以吸附富集水中的重金属离子。如安富强等【5 0 1 利用p e i 偶联硅胶来吸附铜离 子，刘粤丽等【5 l 】利用p e i 螯合树脂吸附废水中的锌离子，高保娇等【5 2 】利用p e i 表面改 性硅藻土来吸附苯酚，等。 一 聚乙烯亚胺大分子链上拥有大量氨基，当p h 1 0 时，其分子链上的氨基多处 于质子化状态，因此聚乙烯亚胺又是一种带正电荷的聚电解质。而大部分酶在p h 1 0 时带负电，因此聚乙烯亚胺在该酸碱度下对酶分子具有静电吸引作用，它能 使酶分子发生离子吸附而被固定化 5 3 , 5 4 。 p a l o m o 5 5 】等人曾用聚乙烯亚胺修饰的s e p a b e a d s 树脂固定化褶皱假丝酵母脂肪 酶( l i p a s ef r o mc a n d i d ar u g o s a ) 用以酶促水解扁桃酸甲酯，发现该固定化酶的对映 体选择性大大优于游离酶。c e s a rm a t e o 5 6 】等人用聚乙烯亚胺制成了多种可重复回 收使用的复合载体用于酶的可逆固定化，取得了很好的效果。 国内对p e i 复合载体固定化酶的研究还比较少，王旭朋等人【5 7 】曾通过丫氯丙基 三甲基硅烷的媒介，将p e i 化学偶联到硅胶表面制成复合载体，并成功地将其用于 青霉素酰化酶的固定化。 可见，聚乙烯亚胺复合载体是一种高性能的新型复合载体，在酶固定化领域 有着重要的研究意义。 1 62 氯丙酸及其酯的拆分 2 - 氯丙酸( 2 一c h l o r o p r o p i o n i ca c i d ，2 - c p a ) ，又名q - 氯丙酸，c a s 号为5 9 8 7 8 7 ， 浙江工业大擘硕士学位论文 化学式为c 3 h 5 c 1 0 2 ，分子量为1 0 8 5 2 ，密度1 2 7 9 m l ，熔点为- 2 0 c ，沸点为1 8 6 。c 。 常温下为无色透明液体，易挥发，具有强腐蚀性，能溶于水、乙醇、苯、丙酮。 1 6 12 氯丙酸的用途 2 氯丙酸是合成农药、染料和农林化学品的重要原料【5 8 1 。可用以生产除草剂 新燕灵、茅草枯等，也可用于制乳酸和低级醇酯，还可用于生产消炎药布洛芬， 药物中间体2 丙氨酸及农药中间体氯丙酸甲酯等【5 9 1 。 2 氯丙酸是手性分子，拥有r 型和s 型两个对映异构体，它们有着不一样的药 效，在不同方面可有着不同的应用。以外消旋体作为药物可能会降低药效，甚至 产生毒副作用，因此如何制备单一对映体2 氯丙酸具有重要的意义。有关这方面的 综述文献国内已有报道。 1 6 2 光学纯2 氯丙酸及其酯的制备 与制备其他光学纯化合物一样，制备光学纯2 氯丙酸或其酯也有很多种方法， 也可分为不对称合成法和外消旋体拆分法两大类6 0 1 。 1 6 2 1 不对称合成法制备2 氯丙酸及其酯 j o h n l 6 1 】在1 9 8 0 年就已经发现了可以从廉价的l 哥l 酸直接酯化后，通过二氯亚 砜直接氯化可以得到构型保持的( s ) 2 氯丙酸酯，添加催化剂( 如吡啶) 后则可以得 到构型翻转的( r ) 。2 氯丙酸酯。其反应如图1 4 所示： 固x 翌x 图l - 4 从l 乳酸制备2 氯丙酸酯的两个对映体 u g o 6 刁等则先合成光学纯的2 甲磺酰丙酸酯，再和三氯化铝反应得到很高e e 值的2 一氯丙酸酯( 如图1 5 所示) 。反应中铝原子与2 甲磺酰丙酸酯之间形成配位化合 物而使氯原子只能从手性碳的背面进攻，然后得到构型翻转的酯。但不同溶剂和 反应温度等条件对2 氯丙酸酯的光学纯度影响很大。 1 4 r 心 o c 、j p 、j ， 浙江工业大学硕士学位论文 回邺旦晚c c 嗽、0 8 0 2 c 心 c “、c i 州 k o p p e n h o e f e r 等1 6 3 1 曾用( s ) 2 氯丙醇合成了( s ) 2 氯丙酸作为合成环氧化合物 固嚆c n c 、 一, l l - 邺c h o h 、c i r 0 2 c 。c i 例 k o p p e r t h o e f e r a - 亭1 6 4 1 由光学纯的2 氨基丙酸合成光学纯的2 氯丙酸( 如图1 7 所 固r o 心z c x 导r 0 2 c m “ 气c t 0 d a 等人 6 5 】将2 氯丙酸的外消旋体与联菲及其衍生物在室温下放置得到一种 即通过外消旋体与光学纯形成非对映体，再利用非对映体间的物理性质差异 将其拆分嘲。其通式为： ( r ，8 ) a + ( 8 ) b 叶( r ) ( s ) b + ( 8 ) a 日) ( 1 ) 经典成盐法 外消旋体拆分剂非对映体 浙江工业大学硕士学位论文 即先形成非对映体盐后再通过逐级结晶的方法拆分外消旋体的方法，该方法 是制备手性化合物最重要和最普遍的方法之一。 如f 巧i 嘲等【6 刀将外消旋的( r ，s ) 2 氯丙酸和光学纯的缬氨酸加热到5 0 ，然 后冷却到室温，光学纯的缬氨酸与( r ) 2 氯丙酸以成盐的形式结晶出来，溶于盐酸 溶液并用乙醚提取得到1 1 ( r ) 2 氯丙酸，o e 达9 6 7 。 c h i n c h i l l a 等 6 8 】等用( r ) 1 ( 4 吡啶) 乙醇与卤代丙酸酯化可以有效地拆分卤代 丙酸外消旋体，其e e 可达7 6 。 成盐法最关键的是拆分剂的选择，不同的化合物拆分需要不同的拆分剂，而 且许多拆分剂价格昂贵，使得该方法存在着一定的局限性。 ( 2 ) 包结组合拆分法 此法主要利用主客体分子间存在很强的分子识别作用，而使得手性化合物通 过氢键及分子间次级键作用选择性地与某一对映体形成稳定的包结络合物而析 出，从而实现对映体的分离。 t 0 d a 等【6 9 】使用了一种新的手性化合物1 0 ，1 0 ，二羟基9 ，9 ，二菲拆分丙酸、丁酸衍 生物，得到很好的拆分效果。a l l a n 等曾采用优先络合无机化合物方法光学拆分外 消旋2 氯丙酸、酒石酸和乳酸混合物彻。 1 6 222 色谱法拆分 2 氯丙酸酯的拆分大多以气相色谱( g c ) 为基础，具有操作简便，效率高，拆分 效果好等优点，但一次性处理量少，无法应用于大规模工业化生产。用以拆分2 一 氯丙酸的固定相主要有两类。 ( 1 ) p i 蹦e 型手性固定相：c h a n g 7 1 1 研究了手性氢键气相色谱拆分各种光学异构 体，发现当以n 十- - ( 烷) 酰l 脯氨酸叔丁酰胺为拆分剂拆分2 卤代羧酸时能获得较 好的拆分效果。i 百w a t a b e t t z 研究了以n - 十二( 烷) 酰仅( 1 萘基) 乙胺为固定相对2 氯 丙酸的各种烷基、环烷基、芳基酰胺衍生物进行色谱拆分。 ( 2 ) 环糊精衍生物手性固定相：v e n e m a 等【7 3 】用全甲基化1 3 环糊精毛细管气相色 谱成功分离t 2 氯丙酸酯和低级醇；a r m s t r o n g 7 4 】等制备了全甲基( s ) 羟丙基b 环糊精和八( 2 ，6 二o 三氟乙酰) - 丫- 环糊精并以其为气相色谱固定相成功地拆分了 一些羧酸、丙酯、卤代羧酸；k 0 e n d e 等【7 5 1 使用八( 3 o 丁酰2 ，6 二o 戊基) 吖环糊 精毛细管气相色谱对2 氯丙酸甲酯等对映体进行了有效的拆分；“等【7 6 】合成7 2 ，6 二一o - 戊基3 一三氟乙酰环糊精，并制成毛细管色谱柱( d p t f a ，p 丫- c d 毛细管柱) ， 1 6 浙江工业大学硕士学位论文 对包括2 卤代羧酸在内的1 5 0 多种对映体进行了成功的拆分。我国的学者也在该领 域做了一些研究，并取得了一些成效。 1 6 2 2 3 萃取法拆分 该方法是利用萃取剂与外消旋体中两个对映体的亲和力作用的差异或化学作 用的差异来进行拆分的一种新型方法。日本科学界飚t a g a 、a 等7 刀以七( 2 ，6 o 二辛 基3 o 三氟乙酰) - d 环糊精作为光学拆分剂，假单胞菌液作为稀释剂，以光学拆分、 分级萃取蒸馏的方法成功地拆分了2 氯丙酸甲酯，( r ) 2 氯丙酸甲酯e e 值达9 9 。 1 6 2 2 4 生物酶法拆分 上述的各种方法在生产光学纯的2 氯丙酸及其衍生物时都存在着一定的不足。 生物酶具有高催化效率、高对映体选择性、反应条件温和等众多优点，已经越来 越广泛地应用于光学活性化合物的合成及外消旋体的拆分。目前报道的应用于拆 分2 氯丙酸及其衍生物的酶都是脂肪酶，它主要通过以下四种反应类型来拆分2 氯丙酸及其酯的。 一 ( 1 ) 不对称水解 即先将2 氯丙酸外消旋体进行酯化，然后利用脂肪酶的立体选择性进行水解反 应，获得一个对映体酸和一个不反应的对映体酯，然后利用酸和酯的不同物理性 质将其分离。 l a d n e r 等e 7 叼开发了一种水解酶( p s e u d o m o n a sl i p a s e ) 用以拆分2 氯丙酸酯，发现 该酶只对( s ) 2 一氯丙酸酯有水解作用而对( r ) 2 氯丙酸酯几乎无催化作用，反应得到 光学纯度大于9 9 的( s ) 2 氯丙酸。 。 c a m b o u 等【咧研究了柱状假丝酵母脂肪酶催化2 氯丙酸各种酯的外消旋体水解 反应，发现柱状假丝酵母脂肪酶对2 氯丙酸辛酯表现出很高的立体选择性，产物 ( 购2 。氯丙酸对映体过量值很高，而对2 氯丙酸甲酯的立体选择性并不高。原因可 能是该酶必需在油水界面上才能体现出对映体选择性。 d o h o d 等t 8 0 1 从假丝酵母菌中提取的脂肪酶在p h = 7 o 下拆分外消旋的2 氯丙酸 甲酯，反应4 2 h ，得8 4 ( s ) 2 氯丙酸甲酯。 a n t o t i n e 等【8 1 】研究了不同的底物浓度下褶皱假丝酵母脂肪酶不对称水解2 氯 丙酸甲酯的对映体选择性，通过动力学拆分试验得到的产物对映体选择性e 值为 2 1 。 ( 2 ) 不对称酯化 1 7 浙江工业大学硕士学位论文 不对称酯化通常是外消旋酸与低级醇，或低级脂肪酸与外消旋醇在脂肪酶催 化下进行反应，保留一个对映体酸或醇，而另一个形成酯。酯化反应的产物中有 水，因此该反应在水相中进行会增加逆反应速度，故酶促酯化通常都在有机溶剂 中进行。 k l i b a n o v 等嘲在有机溶剂中利用假丝酵母脂肪酶对外消旋2 卤丙酸进行了不 对称酯化，并酯化制备生物活性除草剂( + ) r - 2 苯氧基丙酸。将4 3 4g2 - 氯丙酸、2 g 假丝酵母脂肪酶和11 0m l 正丁醇加入至u 4 0 0m l 正己烷中，3 0 。c 下搅拌反应1 4 5h 后，2 氯丙酸转化率达6 8 ，( - ) s2 氯丙酸e e 达9 5 。 b o d n a r 等【8 3 1 对有机溶剂中的2 氯丙酸酶促酯化反应条件进行优化，发现0 0 1 m o l2 一氯丙酸和0 0 6m o l 正丁醇，在5 0m l 正己烷溶剂中，加入0 2 5g 柱状假丝酵母 脂肪酶，最初含水量0 2 5 ，反应温度3 0o c 下进行酯化反应，能得到最高的转化 率和光学选择性。 上述反应进行一段时间后，由于水的产生而是逆反应迅速加快，从而使酯化 反应难以再进行下去。k i m 等1 8 4 】发现加入n a 2 s 0 4 1 0 h 2 0 能有效调控系统水活度且 不会改变酶的光学选择性，从而是酯化反应顺利进行。 ( 3 ) 不对称酯交换 不对称酯交换反应在外消旋体拆分中的应用相比酯化和水解比较少见，它反 应产物中没有水的产生，相比酯化反应更有优势。 如，a v i r o n v i o l e t 8 5 1 采用从青霉菌和白地霉菌提取的脂肪酶催化2 氯丙酸乙酯 和异丁醇的酯交换反应，生成的( s ) - 2 氯丙酸异丁酯光学纯度达6 8 。 ( 4 ) 不对称氨解 酯的氨解反应是指一种酯与胺反应生成酰胺和醇的反应，以氨为酰基受体的 酶促氨解反应是一种新兴的反应类型，它具有较高的对映体选择性，可以有效拆 分外消旋羧酸。 b a 由i c 【8 6 】等用溶胶一凝胶硅玻璃固定化的假丝酵母脂肪酶催化2 氯丙酸乙酯和 胺的氨解反应，发现当酯与胺的摩尔比为2 ：1 时，反应达到最佳状态。 1 7 本课题研究的意义和主要内容 2 氯丙酸是一种重要的药物中间体，用以生产多种农药及医药。具有光学活性 1 8 浙江工业大学硕士擘住论文 的2 - 氯丙酸具有更高的生理活性和药理作用，主要应用于合成光学纯的芳氧丙酸类 除草剂和一些杀菌剂等农药。目前大部分2 氯丙酸合成的药物都是外消旋体，这不 仅会降低药效、容易让病虫产出抗药性，甚至还可能会产生毒副作用，因此如何 生产光学纯的2 氯丙酸具有重要的意义。 在众多合成2 一氯丙酸光学纯的方法中，微生物酶促拆分具有反应条件温和，立 体选择性高，操作简便，成本较低等优点，具有一定的工业化前景，因此本课题 选用以固定化脂肪酶下催化水解2 氯丙酸甲酯制取光学纯的2 氯丙酸。其主要研究 内容有： ( 1 ) 考察了三种不同来源的脂肪酶对2 氯丙酸外消旋体进行水解拆分的活性 和选择性，筛选出适合的一种脂肪酶作为研究对象，进一步考察了其拆分2 氯丙酸 甲酯反应的最佳反应温度、最佳反应p h 值和最佳酶用量。 ( 2 ) 尝试自制了聚乙烯亚胺表面涂布的d 1 5 2 型树脂作为新型载体，开展脂肪 酶进行了固定化的研究，探讨载体、固定化温度、p h 值以及酶量对固定化脂肪酶 的性能影响，确定适宜的化条件。 一 ( 3 ) 具有高活性的固定化酶用于2 氯丙酸甲酯选择催化水解制备光学纯2 氯 丙酸，通过工艺条件优化，确定合适的催化水解条件，从而为其应用于工业化生 产提供了理论依据。 浙江工业大学硕士学位论文 第二章脂肪酶催化水解拆分2 氯丙酸酯的研究 2 1 引言 2 氯丙酸是一种重要的药物中间体，可用以生产多种农药、消炎药布洛芬和医 药中间体2 丙氨酸等，在医药、农药、精细化工等领域有广泛的应用前景。但2 氯丙酸是手性分子，通常是以外消旋体形式存在，这可能会影响其生理活性和药 理作用，甚至造成毒副作用。因此，如何制备光学活性2 氯丙酸具有十分重要的 意义。2 氯丙酸及其酯的拆分主要有化学法、色谱法、萃取法、生物法等，在这方 面，国外已有不少报道，国内研究还较少。 因为生物酶法具有反应效率高、立体选择性强、反应条件温和、操作步骤简 便等多方面优点，我们开展了利用脂肪酶在水相中催化2 氯丙酸酯的水解反应获 得光学活性的2 氯丙酸的研究，选用了三种商品化的脂肪酶( 褶皱假丝酵母脂肪酶、 解脂假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶) 来水解2 氯丙酸甲酯，并着重对褶皱假丝酵母 脂肪酶拆分2 氯丙酸甲酯的反应温度、p h 值、酶用量等影响因素进行了考察，以 得到最佳反应体系，为脂肪酶光学选择性水解机制的理论研究打下了良好的基础。 2 2 实验试剂与仪器 2 2 1 脂肪酶 褶皱假丝酵母脂肪酶( c a n d i d ar u g o s al i p a s e ，t y p ev i i ，缩写为c r l ) ：生化试 剂，s i g m a 公司提供。 解脂假丝酵母脂肪酶( c a n d i d al i p o l y t i c al i p a s e ，缩写为c l l ) 生化试剂，浙 江海宁金潮实业有限公司提供。 猪胰脂肪酶( p o r c i n ep a n c r e a sl i p a s e ，缩写为p p l ) ：上海东风生化技术有限公 司提供。 2 2 2 主要试剂 2 氯丙酸甲酯( 实验室自制) ；乙醇( a r ，衢州巨化试剂有限公司) ；丙酮( a r ， 衢州巨化试剂有限公司) ；二氯甲烷( a r ，浙江杭州双林化工试剂厂) ；磷酸二氢钠 浙江工业大学硕士学位论文 ( a r ，湖州湖试化学试剂有限公司) ；磷酸氢二钠( a r ，湖州湖试化学试剂有限公司) ； 邻苯二甲酸氢钾( a r ，北京北化精细化学品有限公司) ；氢氧化钠( a r ，浙江杭州萧 山化学试剂厂) ；酚酞( a r ，国营北京市制药厂) 。 2 2 3 仪器与设备 8 5 2 恒温磁力搅拌器( 常州国华电器有限公司) ；恒温水浴锅；真空干燥箱( 上 海森信实验仪器有限公司) ；1 1 0 2 型气相色谱仪，带氢火焰离子检测器( 上海分析仪 器厂) ，超越2 0 0 0 色谱工作站( 浙江省科学器材厂) 。 2 3 实验方法 2 3 1 溶液的配制 2 3 1 1o 1m o l ln a 2 h p 0 4 1 2 1 4 2 0 溶液的配制( a 液) 准确称取3 5 8 2g n a 2 p 0 4 1 2 h 2 0 固体于大烧杯中，用蒸馏水使其完全溶解后， 转移到1 0 0 0m l 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为o 1m o l l 的n a 2 p 0 4 1 2 h 2 0 溶液，备用。 2 3 1 2o 1m o l ln a h 2 p 0 4 2 h 2 0 溶液的配制液) 准确称取1 5 6 1g n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 固体于大烧杯中，用蒸馏水使其完全溶解后， 移入1 0 0 0m l 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为o 1m o l l 的n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 溶液，备用。 2 3 1 30 1m o l l 缓冲液的配制 根据资料【8 7 1 ，按不同比例制成相应的不同p h 值的o 1m o l l 缓冲液。 表2 - 1 缓冲溶液的配制 2 1 浙江工业大学硕士学住论文 2 3 1 4 9 5 ( 体积分数) 乙醇的配制 用量筒准确量取9 5m l 无水乙醇和5m l 蒸馏水混合均匀，备用。 2 3 1 5o 0 5m o l ln a o h 溶液的配制 称取2g 的n a o h 固体于大烧杯中，加入蒸馏水使其溶解，冷却后定容成1 0 0 0 m l ，准确称取事先烘于的邻苯二甲酸氢钾，用其对n a o h 溶液进行标定。 2 31 61 0g l 酚酞指示液的制备 称取1 0g 酚酞粉末溶于6 0m l 乙醇中，用蒸馏水稀释至1 0 0m l ，即得1 0g l 酚酞指示液，备用。 2 3 2 磷酸缓冲液中的酶促反应 在1 0 0m l 具塞锥形瓶中分别加入5 0m l 不同p h 值的缓冲液，一定量的2 氯 丙酸甲酯外消旋体，一定量的脂肪酶，置于恒温水浴震荡器内震荡反应，定时取 样。 2 3 3 底物转化率的测定方法酸碱滴定法 用移液管量取2 0m l 的反应液于小锥形瓶中，加入2 滴酚酞指示剂，用0 0 5 m o l l 的n a o h 溶液滴定，空白对照，根据2 氯丙酸的生成量来计算底物的转化率。 2 3 4 对映体过量值的测定方法色谱分离法 用二氯甲烷对反应体系中的2 氯丙酸甲酯进行萃取，分离油水两相，用手性 固定相气相色谱分析样品中的2 氯丙酸甲酯两个对映体的含量，并计算对映体过 量值( e e ) 。 对映体过量值e o 的概念式如下： 纪= 然- 慨 酶促反应产物2 氯丙酸的光学纯度计算方法： 酸( e e ) = 酯( e e ) c 酯( e 0 ) ( 式中c 为底物转化率) 气相色谱条件： 色谱柱：c y c l o s i l b3 0m 0 2 5r a m 0 2 5v a n ( 手性柱) 固定相：七( 2 ，3 二o 甲基6 叔丁基二甲基硅烷) 1 3 一环糊精 柱温：7 0 + 1 ；汽化室温度：2 0 0 ；检测器温度：2 0 0 c 。 载气) 流速：1 0 m l m i n ；氢气流速：5 5 m l m i n ；空气流速：1 9 5 m l m i n 。 分流比：7 5 ：l 浙江工业大学硕士学位论文 2 4 结果与讨论 2 4 1 不同脂肪酶对2 氯丙酸甲酯拆分效果的影响 脂肪酶是指能分解脂肪的一类酶的总称，它的来源非常广泛，可来源于动植 物或微生物。不同来源的脂肪酶在性质和对映体选择性上可能存在很大差异，脂 肪酶水解拆分2 氯丙酸甲酯的反应式如图2 1 所示： 0 + + o o 图2 一l 酶拆分2 氯丙酸酯 主要考察了猪胰脂肪酶( p o r c i n ep a n c r e a sl i p a s e ，缩写为p p l ) 、解脂假丝酵母 脂肪酶( c a n d i d al i p o l y t i c al i p a s e ，缩写为c l l ) 和褶皱假丝酵母脂肪酶( c a n d i d a r u g o s al i p a s e ，缩写为c r l ) 这三种不同来源的商品化脂肪酶对2 - 氯丙酸甲酯的拆 分的影响。 于干燥的1 0 0m l 具塞锥形瓶中依次加入2 氯丙酸甲酯外消旋体0 6 1 2 5 g ( 0 0 0 5t 0 0 1 ) ，磷酸缓冲液( 0 1m o l l ，p h = 7 2 ) 5 0n i l ，再分别称取脂肪酶p p l l 0 0m g ， 脂肪酶c l l1 0 0 m g ，脂肪酶c r l2 0 m g ，在3 0 水浴恒温震荡器( 转速2 0 0r r a i n ) 中开始反应，间隔一定时间取样，用酸碱滴定法测底物转化率，用气相色谱测底 物e e 值变化。结果如表2 2 、2 3 、2 - 4 所示： 表2 - 2 脂肪酶c l l 水解拆分2 氯丙酸甲酯 夕= | r 浙：z r - r - i 大学硕士学位论文 表2 3 脂肪酶p p l 水解拆分2 氯丙酸甲酯 表2 - 4 脂肪酶c r l 水解拆分2 氯丙酸甲酯 从上述实验结果可以发现，这三种脂肪酶都对2 氯丙酸甲酯表现出一定的对 映体选择性，脂肪酶c r l 和c l l 都对( s ) 2 氯丙酸甲酯的水解表现出更高的反应 活性，而脂肪酶p p l 则对0 t ) 2 氯丙酸甲酯的水解有更高的反应活性。相比之下， 脂肪酶c r l 无论是催化效率还是对映体选择性都是这三种酶中最高的。为此选择 c r l 游离酶选择性催化水解2 氯丙酸甲酯进行深入的研究。 2 4 2 脂肪酶c r l 选择性催化水解2 氯丙酸甲酯 2 421 反应温度对脂肪酶c i 也拆分的影响 酶原本存在于生物体的细胞或体液中，都有着一定的活性范围，只有当外界 条件符合酶的活性范围时酶才具有催化活性。反应温度是影响生物酶催化活性的 重要因素之一，在一定范围内，酶的活力随着温度升高而升高，但当温度高过这 一范围时，酶蛋白侧链的相互作用被破坏，从而破坏了酶的正常生理构象，使酶 蛋白变性以致失活。因此，酶促反应存在着一个最佳温度。 于洁净的1 0 0m l 具塞锥形瓶中依次加入外消旋2 氯丙酸甲酯0 6 1 2 5g ( 0 0 0 5 t 0 0 1 ) ，p h 7 2 磷酸缓冲溶液( 0 1m o l l ) 5 0m l ，脂肪酶c i 也2 0m g ，在不同温度 ( 2 5 5 0o c ) 水浴恒温震荡反应2 0m i n ，定时取样，用酸碱滴定法测定底物转化率， 用气相色谱测定底物e e 值，其实验结果如图2 2 和2 3 所示。 浙江工业大学硕士学位论文 9 8 9 6 趔9 4 墨9 2 蔷9 0 雾8 8 k 8 6 8 4 8 2 2 02 53 03 54 04 55 05 5 反应温度( ) 图2 - 2 反应温度对脂肪酶c r l 拆分转化率的影响 2 5 3 03 54 04 55 0 5 5 反应温度( ) 图2 - 3 反应温度对脂肪酶c r l 拆分2 - 氯丙酸甲酯的产物酸e e 值的影响 从图2 2 可以看出，当反应温度为4 5 时，酶促反应速度最快，当温度低于 4 5o c 时，反应速度随着温度的增高而增高，当温度高于4 5o c 时，反应速度随温 度的增高而降低。可能是因为4 5o c 是脂肪酶c r l 最适的生理温度，超过或低于 4 5o c ，酶都不能体现最高活性，而且高温容易破坏酶的结果而使酶失活。由图2 3 可以看出，产物( s ) 一2 一氯丙酸对映体过量值基本上是随着反应温度的增高而降低的， 其原因可能是：温度升高时，酶对两个对映体的反应速率都增大，但慢反应速率 增大快于快反应的增大，导致快慢反应速率差值的减小而引起对映体选择性的下 降。对比图2 2 和图2 3 可见：当反应温度为3 0 - - - 3 5o c 时，反应既有较高的水解 率也有较高的对映体选择性，所以选择反应温度为3 0 。3 5o c 。 诣蚰孙筋坫加5 o 毋v龉摹辛耄 浙江工业大学硕士学位论文 2 4 2 2p h 值对脂肪酶c r l 拆分的影响 在酶催化水解反应中，p h 值是一个重要的参数，因为脂肪酶是一种蛋白质， 它的基本单位都是氨基酸。在这些生物单体内，含有碱性、中性或酸性的侧链基 团。在一定p h 值下，酶可以含有正电荷或负电荷的基团。因此，p h 值的变化引 起这些基团电离情况发生改变，从而影响酶的活性。反应体系的p h 值通过影响酶 和底物的解离状态而影响反应。降低或提高反应体系p h ，一方面使部分酶失活， 酶促反应变得更加缓慢，反应需要更长的时间；另一方面影响酶的组成残基的解 离状态，从而影响酶的空间构象，最终影响酶的对映体选择性。 于干燥的1 0 0m l 具塞锥形瓶中依次加入2 氯丙酸甲酯外消旋体0 6 1 2 5 g ( 0 0 0 5t 0 0 1 ) ，不同p h 值( 6 o 8 0 ) 的磷酸缓冲溶液( 0 1m o l l ) 5 0m l ，脂肪酶c r l2 0 m g ，在3 0 下恒温水浴振荡反应2 0m i n ，定时取样，用酸碱滴定法测底物转化 率，用气相色谱法测对映体过量值。 由图2 _ 4 和图2 5 可见，当p h 值为7 2 左右，反应转化率最高。酶在过酸或 过碱的环境下进行反应表现的催化活性均不高，尤其是在过碱性条件下，酶活力 下降很快。这可能是p h 值改变了酶的活性中心氨基酸，引起酶的不可逆性失活的 缘故。而产物( s ) 2 氯丙酸对映体过量值也是在p h 等于7 2 左右达到最高。因此该 反应的最佳p h 值为7 2 。 3 5 3 0 2 5 专2 0 瓣 s1 5 擗 1 0 5 0 66 577 58& 5 p 啦 图2 - 4p h 值对脂肪酶c r l 拆分转化率的影响 浙江工业大学硕士学位论文 9 6 9 4 蚓9 2 水 o9 0 a ) 甾8 8 s l8 6 8 4 8 2 5 5 66 5 7 7 58 p h 值 8 5 图2 - 5p h 值对脂肪酶c r l 拆分2 氯丙酸甲酯的产物酸e e 值的影响 2 4 2 3 脂肪酶用量对脂肪酶c r l 拆分的影响 在酶催化拆分过程中，脂肪酶用量也是一个值得仔细研究的重要参数，脂肪 酶的用量可能直接影响酶活性的充分表达，如果添加量过大不仅会造成浪费甚至 还会聚集成团，降低酶的活性，不利于反应的进行。 4 0 3 5 3 0 盆2 5 瓣2 0 s 擗1 5 l o 5 o 05 1 01 52 02 53 03 5 脂肪酶用量( m g ) 图2 - 6 脂肪酶用量对酶拆分转化率的影响 浙江工业大学硕士学位论文 051 01 52 02 53 03 5 脂肪酶用量( m g ) 图2 7 脂肪酶用量对脂肪酶c r l 拆分2 氯丙酸甲酯的产物酸e e 值的影响 于干燥的1 0 0m l 具塞锥形瓶中依次加入0 6 1 2 5g2 氯丙酸甲酯外消旋体，磷 酸缓冲溶液5 0m l ( 0 1m o l l ，p h = 7 2 ) ，不同量的脂肪酶c r l ( 5 - 3 0m g ) ，在3 0o c 下恒温水浴振荡反应2 0r a i n ，定时取样，用酸碱滴定法测底物转化率，用气相色 谱法测对映体过量值。 由图2 - 6 可见，在底物浓度一定的情况下，在酶用量少于2 0m g 时，底物转化 率几乎随酶用量呈正比上升，当酶用量超过2 0m g 时，这种上升趋势明显减缓。 这可能是底物已接近被酶饱和，再增大酶量会使酶分子之间的空间位阻增大，不 利于活性中心有效点和底物的结合，同时也造成酶的浪费。由图2 7 可见，在酶用 量较低时，酶催化选择性很高，随着酶用量的增大，酶的选择性逐渐下降，原因 可能是过大的酶用量会是慢反应底物有更多机会与酶分子反应，从而加快了慢反 应的速度，导致两种对映体反应速率差的减小，从而使产物光学纯度下降，另外， 不同的加酶量对应的转化率的不同也会对产物( s ) - 2 氯丙酸对映体过量值产生影 响。因此加酶量选择2 5m g 为宜。 2 5 小结 ( 1 ) 不同来源的脂肪酶催化水解外消旋2 氯丙酸甲酯时，表现出不同的催化活 性和光学选择性。褶皱假丝酵母脂肪酶( c r l ) 和解脂假丝酵母脂肪酶( c l l ) 对( s ) 2 的 铋 卯 ； 舛 g s 虬 避水aa甾霉钆 浙江工业大学硕士学位论文 氯丙酸甲酯的水解表现出较高的反应活性和选择性，而猪胰脂肪酶( p p l ) 则对( r ) - 2 一 氯丙酸甲酯的水解有更高的反应活性和选择性。 ( 2 ) 通过对反应温度、介质的p h 值、加酶量等反应条件对褶皱假丝酵母脂肪 酶( c r l ) 选择性催化水解2 氯丙酸甲酯的催化活性和对映体选择性的影响的研究， 确定了c r l 选择性催化水解拆分2 氯丙酸甲酯外消旋体的最佳反应条件为： 酶用量：2 0 2 5m g 0 0 0 5m o l2 氯丙酸甲酯； 反应温度：3 0 3 5 ： 磷酸缓冲溶液( p h = 7 2 ) ：5 0m l ； 在此条件下催化水解2 0m i n ，2 氯丙酸甲酯的水解率为3 0 3 5 ，水解产物 ( s ) 2 氯丙酸的e e 值达9 2 3 9 3 5 。 浙江工业大学硕士学住论文 3 1 引言 第三章脂肪酶的固定化研究 酶作为生物催化剂，以其高效、反应条件温和、污染少等多种优点广泛应用 于生物医药、食品加工和精细化工行业 s s l 。但游离酶在反应中易溶于反应液，不 仅难以回收再利用还会影响产物纯度。且酶制剂的价格较高，一次性使用会大大 增加生产成本，不利于工业化生产。为了解决这个问题，人们开始了对酶的固定 化研究，他们通过各种方法把易溶于水的游离酶和不溶于水的固体材料结合在一 起，在反应结束后只要通过过滤等方法就可以对酶进行回收。随着对酶固定化技 术研究的日益深入，人们惊喜地发现固定化酶不仅解决了游离酶回收难的问题， 而且酶的固定化使酶的稳定性大大增加，甚至还可能增加酶的催化活性。 固定化酶的性能主要取决于固定化方法和所使用的载体材料。而载体的优劣 是固定化成败的关键。载体材料的性能直接影响其固定化酶的催化活性。酶的固 定化对载体材料有很高的要求。理想的载体材料应具备良好的机械强度、热稳定 性和化学稳定性、耐生物降解性及对酶的高度亲和性、并能保持较高的酶活性等 【8 9 】 o 目前工业上大规模使用的载体有硅藻土、硅胶、氧化铝、活性炭、大孔树脂 等，它们都具有比较大的比表面积，能对酶产生物理吸附作用，但是这种吸附力 很弱，被吸附的酶同时也容易脱附，使得固定化酶的重复利用率不高，大大增加 了工业生产成本。因此，设计、开发和制备性能更加优异的载体材料已成为固定 化酶研究的重点之一。 本章研究了新型复合载体一聚乙烯亚胺表面涂布的d 1 5 2 大孔树 旨( p e v d l 5 2 ) 的制备过程，对试剂用量进行了优化，并对该载体进行了红外表征。并用该载体 对褶皱假丝酵母进行固定化研究，优化了固定化方法，确定了脂肪酶c r l 在新型 载体p e i d 1 5 2 上的最佳固定化条件。 3 2 实验试剂与仪器 3 0 浙江工业大学硕士学位论文 3 2 1 脂肪酶 褶皱假丝酵母脂肪酶( c a n d i d ar u g o s al i p a s e ，t y p ev i i ，缩写为c r l ) ：生化试 剂，s i g m a 公司提供。 3 2 2 主要试剂 聚乙烯醇( p v a ，聚合度1 7 5 0 _ _ + 5 0 ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司) ；橄榄 油( c p ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司) ；乙醇( a r ，衢州巨化试剂有限公司) ； 丙酮( a r ，衢州巨化试剂有限公司) ；邻苯