（植物学专业论文）中国莲金属硫蛋白和小分子热激蛋白基因克隆及其表达分析.pdf

摘要 植物抗氧化系统，包括抗氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、金属硫蛋白 ( m t ) 和热激蛋白( h s p ) 等，对延缓植物衰老具有极其重要的意义。莲( n e l u m b o n u c i f e r ag a e r t n ) 种子被科学鉴定为寿命最长的植物种子，我们认为其抗氧化 系统在抗逆境胁迫和延缓种子衰老方面发挥着巨大的作用。 本研究利用e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) 和r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o n o fe d n ae n d s ) 技术克隆到4 个莲长寿命相关基因h s p i & h s p l 9 , m t 2 b 和m t 3 的 全长e d n a 。 利用半定量r t - p c r 方法，分析了莲种子长寿命相关基因m t 2 a ，m t 2 b 、m t 3 、 h s p l 8 和h s p l 9 在种子发育和萌发过程中，在温度胁迫以及化学物质胁迫等不同 条件下的表达状况。研究表明，莲种子在受粉后l o 3 0 天( d a p ) 内的发育 过程中，m t 2 a 、m t 2 b 、m y 3 ，h s p l 8 和h s p l 9 基因的表达都存在组织特异性，除 t l s p l 9 外的四个基因在发育的胚轴中始终表达，但表达丰度有所变化。h s p l 8 仅 在1 0 d a p 的子叶中低丰度表达，1 5 d a p 后则基本检测不到它们在子叶中表达。 h s p l 9 仅在1 5 d a p 前的胚轴内有表达，之后及子叶中均无表达。金属硫蛋白基因 在胚轴和子叶中都存在稳定的表达。种子萌发过程中，3 个金属硫蛋白基因 在萌发6 h 后胚轴中表达量均开始升高，m t 2 a 和m t 2 b 在萌发2 4 h 后表达量达到 顶峰，m t 3 在萌发3 0 h 后表达量达到顶峰。萌发1 天后的莲种子在短时间的 热激( 4 2 ) 与冷胁迫( 4 ) 处理下都能诱导胚轴中的h s p l 8 与h s p l 9 表达 量增高，但随着胁迫时间增长，这种诱导效果逐渐减弱，2 4h 后温度胁迫诱导效 应完全消失。化学物质h 2 0 2 ( 1 5 ) 能增强胚轴中3 个金属硫蛋白基因的表 达，而a b a ( 1 0 0 州) 、p e g 6 0 0 0 ( 2 0 ，w v ) 和n a c i ( 3 0 0 m m ) 溶液抑制 表达。c u 2 十能够增强胚轴中m t 2 a 与m t 2 b 的表达，z n 2 + 则减弱其表达，p b 2 + 和c d 2 + 的作用不明显：m t 3 在受到z d + 、c u 2 + 、p b 2 + 和c d 2 + 胁迫时，表达量 均升高，且对z n 2 + 和c d + 更为敏感。 关键词：中国莲，小分子热激蛋白，金属硫蛋白，半定量r t - p c r a b s t r a c t t h ea n t i o x i d a t i v es y s t e m , c o m p r i s i n gp o d ，s o d ，c a r ，m e t a l l o t h i o n e i n ( m t ) a n dh e a ts h o c kp r o t e i n ( h s p ) e t c ，i si m p o r t a n tt od e l a ys e n e s c e n c eo fp l a n t s t h e s e e d so fn e l u m b en u c i f e r ag a e r t n w e r ei d e n t i f i e da st h em o s tl o n g l i v e ds e e d a n d t h ea n t i o x i d a t i v es y s t e mi nt h e s es e e d sm u s tp l a yas i g n i f i c a n tr o l ei nd e l a y i n g s c n e s e e n c e f o u rf u l l 1 e n g t hc d n a s h s p l 8 、h s pl9 、m t 2 8a n dm t 2 be n c o d i n gs a c r e d 、o t u s l o wm o l e c u l a rh s p sa n dm t sw e r ei s o l a t e db yu s i n ge s tf e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) a n dr a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ) e x p r e s s i o n p a t t e r n so t h s p l 8 、h s p l 9 、m t 2 a 、m t 2 b a n dh l r 3 i n d e v e l o p i n g a n d g e r m i n a t i n gs a c r e dl o t u se m b r y o n i ca x e sw e r ei n v e s t i g a t e db yar t p c ra n a l y s i s m o r e o v e r , t h ee x p r e s s i o no ft h e5g e n e si ng e r m i n a t i n ge m b r y o n i ca x e so fs a c r e d l o t u si nr e s p o n s et ov a r i o u ss t r e s s e s ，s u c ha sh e a ts h e c k ，c h i l l i n g ，a n de x p o s u r et o s t r e s s r e l a t e dc h e m i c a l s w a sa l s os t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： a l lo f t h eg e n e sw e r et i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s e dd u r i n gt h ed e v e l o p m e n tc o u r s e i ns a c r e dl o t u ss e e d 凇2 a 、m 2 b 、艟t 3a n dh s p l 8 c a na l 、b ed e t e c t e 矗f r o m 、0 d & 协 3 0 d a pi nt h ee m b r y o n i ca x e s b u tt h ee x p r e s s i o na b u n d a n c e sa r ed i f f e r e n t t h e e x p r e s s i o no fh s p l 8i nc o t y l e d o n sw a s a tl o wl e v e l si nt h ee a r l y s t a g eo f d e v e l o p m e n t ，w h i l et h e r ew a s n od e t e c t a b l eh s p l 8t r a n s e r i p ti nt h ec o t y l e d o n sd u r i n g t h el a t ee m b r y o g e n e s i ss t a g e h o w e v e r , h s p l 9o n l ye x p r e s s e si ne m b r y o n i ca x e s b e f o r el5 d a p w h i l e1 a t e ri td o e sn o te x p r e s sa n yl o n g e r , m o r e o v e r 脚1 9n e v e r e x p r e s s e si nc o t y l e d o n s t h eg e n eo fm te x p r e s s e ss t e a d i l yi ne m b r y o n i ca x e sa n d c o t y l e d o n s t h ee x p r e s s i o na b u n d a n c e so f3g e n e se n c o d i n gm t sb e g i nt or i s e i n g e r m i n a t i n ge m b r y o n i ca x e so fs a c r e dl o t u sa f t e rs i xh o u r s 1 1 1 ee x p r e s s i o no f 肋 a n d ，f t 2 br e a c ht h es u m m i t2 4h o u r sl a t e lw h i l et h ee x p r e s s i o no tm 3r e a c h e st h e s u m m i t3 0h o u r sl a t e r h e a ts h o c ka n dc h i l l i n gt r e a t m e n tc a ni n d u c et h ee x p r e s s i o no fh s p i 8a n d h s p l 9 b u tt h ei n d u c t i v ee r i e c tg r a d u a l l yw e a k e na l o n gw i t ht h ei n d u c t i o nt i m e i n c r e a s i n g ，t h ee f f e c tv a n i s h e dc o m p l e t e l y2 4 h l a t e r 3g e n e se n c o d i n gm t sw e r ei n d u c e di ng e r m i n a t i n ge m b r y o n i ca x e sb y o x i d a t i v es t r e s s ，w h i l es t r o n g l yi n h i b i t e db ya b a ( 1 0 0 肛h d 、p e g6 0 0 0 ( 2 0 ， w v ) a n dn a c i ( 3 0 0 m m ) c u ”c a nb o o s tt h ee x p r e s s i o na b u n d a n c eo f f 丁孙a n dm t 2 bi ng e r m i n a t i n g e m b r y o n i ca x e so fs a c r e dl o t u ss e e d s ，o nt h eo t h e rh a n d ，z 一c a nw e a k e ns u c h e x p r e s s i o na b u n d a n t e w h i l ep b 2 + a n dc d ”si m p a c ti su n c o n s p i c u o u s ；s t r e s s e db y z 2 + 、c u 2 + 、p b 2 + a n dc d ”，t h ee x p r e s s i o na b u n d a n c e so fm 乃a l la r ee n h a n c e d ， 举i a l l yb vz + a n dc u 2 + k e yw o r d s ：s a c r e dl o t u s ，s m a l lh s p s ，m e t a l l o t h i o n e i n ，s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r i l a b a a m p b l a s t b p c d c n d a p d e p c d n t p e s t e t b r h s p i p t g k b k d a m r r p b p c r p e g r a c e s sc d n a u v x - g a l z n 缩略语表 a b s c i s i ea c i d a m p i c i l l i n b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c ht b o l b a s ep a i r c a d m i u m c o p p e r d a ya f t e rp o l l i n a t i o n d i e t h y l p y r o e a r b o n a t e d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e x p r e s s e ds e q u e n c et a g e t h i d i u mb r o m i d e h e a ts h o c k p r o t e i n i s o p r o p y l3 - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e k i l o b a s ep a i r s k i l o d a l t o n m e t a l l o t h i o n e i n p l u m b u m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s s i n g l e - s t r a n dc o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d u l t r a v i o l e t 5 一b r o r n o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l - b d g a l a c t o p y r a n o s i d e z i n c 脱落酸 氨苄青霉素 局部相似性基本查询工具 碱基对 镉 铜 受粉后天数 焦碳酸二乙酯 脱氧核苷三磷酸 表达序列标签 溴化乙锭 热激蛋白 异丙基硫代一b d 一半乳糖苷 千碱基对 千道尔顿 金属硫蛋白 铅 聚合酶链式反应 聚乙二醇 e d n a 末端快速扩增 单链互补d n a 紫外光 5 一溴一4 氯一3 吲哚b d 半乳 糖苷 锌 巾山大学硕士学位论文中国莲金属磕蛋白和小分子热激蚩白基因克隆及其表达分析 1 前言 1 1 植物衰老理论研究进展 衰老( a g i n g ，s e n e s c e n c e ，s e n i l i t y ) 是指生物体的细胞、组织、器官以 至整体生理功能下降和紊乱并趋向死亡的不可逆的综合表现。它通常发生在生物 发育成熟后，产生机能减退、内环境稳定性下降、结构中心组分退行性变化等一 系列特定生物学变化，最终导致生物生命功能终止。 1 1 1 植物衰老时的生理生化变化 1 1 1 1 植物衰老时生物细胞形态的变化 衰老细胞的形态变化主要表现在细胞皱缩、膜通透性和脆性增加、核膜内折 以及细胞器数量特别是线粒体数量减少，最终出现细胞凋亡或坏死。总体来说衰 老细胞的各种结构呈退行性变化。 l - 1 1 2 植物衰老时细胞含水量的变化 细胞衰老与细胞内水分下降正相关，进入衰老期的时间越长，细胞含水量越 少。随着细胞含水量的减少，细胞出现收缩、体积减小、失去讵常球型的状况。 衰老细胞含水量降低的原因是由于构成蛋白质亲水胶体系统的胶粒受时问或其 它因素的影响，逐渐失去电荷而相互聚集，胶体失水。同时，胶粒的分散度降低， 不溶性蛋白质增多，导致细胞硬度增加，代谢减慢而趋于老化。 1 1 1 3 植物衰老过程中蛋白质的变化 衰老时，蛋白质总体含量明显下降。如烟草叶片衰老三天时，可溶性蛋白和 膜蛋白的含量下降了1 5 ，其中可溶性蛋白中8 5 是r u b i s e o 。而在未离体的叶 片中，衰老时氨基酸能够以酰胺形式转移至茎或其它器官被再度利用。但衰老时， 部分特异蛋白的含量可能反而会增加，如纤粘连蛋白在衰老细胞中会大量合成， 估计与细胞的纤维化有关。 解释蛋白质含量下降的原因有两种学说，一种学说认为由于核糖体的效率、 山大学硕：卜学位论文巾囤莲会心硫蛋白和小分子热激监白基因克降驶其表达分析 准确性以及蛋白质合成延伸因子的数量和活性的降低，即由于蛋白质合成能力的 减弱导致蛋白质含量的下降。例如，用能延缓衰老的植物激素处理旱金莲 ( t r o p a e o l u mm a j u s ) 叶片时，参与到蛋白质内的1 4 c 一亮氨酸数量比对照多。另 一种学说则认为，由于蛋白质的分解速率远远大于其合成速率，导致了蛋白质含 量的下降。例如，当蚕豆叶片衰老时，肽酶和蛋白酶等活性增强，蛋白质分解剧 烈。由此看来，在细胞中两种机制都可能存在，它们共同作用导致细胞内蛋白质 的显著变化。 在总蛋白含量明显下降的同时，细胞内蛋白分子发生糖基化、氨甲酰化和脱 氨基等修饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性和可消化性等性质的下降，使蛋白 质肽断裂、交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋。部分酶分子的活性中心被氧化， 金属离子c a 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 + 和f e 2 + 等丢失，酶分子的二级结构、溶解度和等电点 发生改变。总的效应是蛋白功能丧失和酶失活。 1 1 1 4 植物衰老时核酸的变化 衰老发生时，r n a 总量下降，尤其是r r n a 的减少最为明显。其中以叶绿 体和线粒体的r r n a 对衰老最为敏感，而细胞质的t r n a 衰退最晚。虽然r n a 总量下降，但某些酶( 如蛋白酶、核酸酶、酸性磷酸酶、纤维素酶、多聚半乳糖 醛酸酶等) 的m r n a 的合成仍在继续。研究发现，衰老时r n a 含量的下降主要 是与r n a 合成能力的降低有关。 衰老时d n a 含量也下降，但下降速度较r n a 为小。如在烟草叶片衰老处 理3 天内，r n a 含量下降1 6 ，但d n a 只减少3 。d n a 的复制与转录在衰老 时受到抑制，端粒d n a 丢失，线粒体d n a 特异性缺失，d n a 发生氧化、断裂、 缺失和交联，甲基化程度降低。但也有部分基因异常活跃，如胶原蛋白酶基因在 衰老细胞中的表达量很高。 1 1 1 5 植物衰老过程中细胞质膜的变化 衰老时，由于不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之m 或与脂蛋白之间交联，膜 的流动性降低。同时，衰老细胞中细胞质膜中的磷脂含量逐渐下降，使胆固醇和 q i 山大学硕士学位论文 中国莲金届硫蛋白和小分子热激蛋白赫因克降及其表达分析 磷脂的比值升高，细胞质膜的粘性增加，失去弹性，流动性降低，细胞兴奋性降 低，离子转运效率下降，细胞信号转导、细胞识别和对内外胁迫的灵敏性等随之 丧失。膜脂的脂肪酸饱和程度逐渐增高脂肪链加长，使膜由“液晶态”逐渐转变 为“凝固态”，磷脂尾部完全失去运动能力，膜结构逐步解体。一些具有膜结构 的细胞器的膜结构发生衰退、破裂甚至解体。 1 1 1 6 植物衰老过程中呼吸速率的变化 在衰老早期，线粒体体积变小、褶皱膨胀并且数目减少，然而其功能一直到 衰老末期还保留着。在植物叶片衰老时，呼吸速率迅速下降，后来又急剧上升， 再迅速下降，似果实一样，有呼吸骤变，这种现象和乙烯出现高峰有关，因为乙 烯加速透性，呼吸加强。应当指出，在离体叶的试验中，整个衰老过程的呼吸熵 与正常呼吸时有所不同，这说明衰老时的呼吸底物有改变，它利用的不是糖，而 是氨基酸。此外，衰老时呼吸过程的氧化磷酸化逐步解偶联，产生的a t p 量也 减少了，细胞中合成过程所需的能量不足，更促进衰老的发展。 1 1 1 7 植物衰老过程中光合作用的变化 植物叶片是进行光合作用的重要场所。植物叶片衰老时，光合色素雀失是叶 片衰老最明显的特征。但光合色素的丧失不是同步的，类胡萝b 素比叶绿素降解 要慢并且要晚。具体来说，衰老时，叶绿体的基质被破坏，类囊体膨胀、裂解， 嗜锇体的数目增多、体积加大。同时，叶绿素含量迅速下降、并伴随着蛋白水解 酶活性的增强和核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶的减少，光合电子传递和光合磷酸 化受到阻碍，光合速率下降。 1 1 1 8 植物衰老过程中内源激素的变化 在植物衰老过程中，植物内源激素有明显变化。一般情况是，吲哚乙酸 ( i a a ) 、赤霉素( g a ) 和细胞分裂素( c t k ) 在植株或器官的衰老过程中含量 逐步下降，而脱落酸( a b a ) 和乙烯( e t h ) 含量逐步增加。 1 , 1 2 植物抗衰老机理研究进展 中山大学硕士学位论文 叶i 国莲金属硫蚩白和小分子热激蛋白旗闪兜隆发其表达分析 关于衰老的机理具有许多不同的学说，目前已经对衰老的机制作了许多推 测，提出了许多假说。尽管这些假说都各自获得了一些实验证据的支持，但至今 仍不能用一种假说全面地解释衰老的现象。随着衰老的研究及分子生物学的迅猛 发展，使衰老的机制研究从细胞水平、亚细胞水平逐渐走向分子与基因水平。 由于衰老是一个十分复杂的生命现象，又受多种因素影响，因此出现了大量 的生物衰老解释机理，主要有以下几种： 整体水平的衰老学说：自体中毒衰老学说( m e t c h n i k o i f , 1 9 0 4 ) 、磨损衰老 学说( s a c h e r ，1 9 6 6 ) 等。 细胞水平的衰老学说：细胞膜衰老学说( z s n a g y ，1 9 7 8 ) 、体细胞突变衰 老学说( s z i l a r d ，1 9 5 9 ) 、溶酶体衰老学说( b r u n k ，2 0 0 2 ) 等。 分子水平的衰老学说：d n a 修复缺陷衰老学说( v i l e n c h i k ，1 9 7 0 ) 、自由基 衰老学说( h a r m a n ，1 9 5 6 、2 0 0 3 ) 、氧化衰老学说( s o h a l 1 9 9 0 ) 等等。 其它衰老学说：熵增衰老学说( s a c h e r1 9 6 7 ) 、数理衰老学说和各种各样的 综合衰老学说( y i n 等2 0 0 2 ) 。 尽管关于衰老的机理具有上述多种不同的学说，但概括起来主要有差错学派 ( e r r o rt h e o r i e s ) 和遗传学派( g e n e t i c p r o g r a m m e dt h e o r i e s ) 两大类，前者强调 衰老是由于细胞【 _ i 的各种错误积累引起的，后者强调衰老是遗传决定的自然演进 过程。其实，现在看来两者是相互统一的。这是因为，上述多种学说都足从衰老 发生的不列层面上研究衰老问题的，而衰老过程已经被认识到是生物受内外环境 因素影响的缓慢渐进的损伤和防御相拮抗的过程( m e d v e d e v ，1 9 9 0 ：h a y f li c k ， 1 9 9 8 ) ，这过程必然涉及到生物体各个层面的应答与反应，必然是生物体作为 整体而统一产生的在调控、防御、修复和代谢等诸多系统中的多个基因家族、细 胞群体乃至特异组织共同协调作用，抵御内外环境损伤的总结果。 综合分析目前有关人类、动物和植物衰老机理的研究资料( n o o d e n 等l9 8 8 ， s o h a l 等1 9 9 6 ，张建刚等1 9 9 9 ) ，我们认为自由基理论与氰化应激学说在解释生 物衰老机理方而有特别重要的意义。无论哪种学说，其最终的理论依据都是生物 体由于生理防御与修复功能的退化，缺乏对有害细胞代谢产物( 主要是自由基一 类的活性物质) 的清除能力。当有害代谢产物超过某一阈值时，会阻碍细胞的物 质交流和信号传递、产生大分子交联，进而损伤d n a 和部分细胞器，导致衰老。 叶1 山大学硕士学位论文 一 国莲金属硫蚩白和小分子热激蚩白基因克降及其表达分析 1 1 2 1 自由基及其性质 自由基是一类由于在基态吸收能量而瞬时形成的在原子核外层轨道上具有 不成对电子的原子或功能基团，普遍存在于生物系统中。主要包括：氧自由基( 如 羟自由基、超氧自由基和h 。o ：) 、氢自由基、碳自由基和脂自由基等，其中氧自 由基的化学性质最活泼。 1 1 2 2 自由基的产生 生物体内自由基的产生有两方面：一是环境中的高温、辐射、光解、化学物 质等引起的外源性自由基；二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。内源性 自由基是生物体自由基的主要来源，其产生的主要途径有：由线粒体呼吸链电 子泄漏产生；由经过氧化物酶体的多功能氧化酶( m f o ) 等催化底物羟化产生； 当n a d p h n a d f 值高时，电子从叶绿素分子或p s i 组成物上传递到0 。时，通常 会有自由基的产生；由脂肪酸1 3 一氧化和过氧化物体中光呼吸产生：黄嘌呤 氧化酶、乙醛氧化酶、黄素脱氢酶发生催化作用时，也会产生一些超氧化物。 1 1 2 3 自由基的危害 所有自由基都含有未配对电子，具有高度反应活性，可引发链式自由基反应， 会对细胞造成伤害，引起衰老各种现象的发生。 自由基与核酸分子中的碱基发生加成反应，羟自由基等能够加到碱基( 胸腺 嘧啶c 6 或c 5 ，腺嘌呤c 8 ) 的双链上，使之完全失去碱基配对特异性，甚至使 相邻的胞嘧啶也被错误复制，产生基因突变。 自由基常攻击肽链上的脯氨酸残基，引入羰基生成一吡咯烷酮，造成蛋白 质断裂。此外，自由基还引起蛋白质交联、蛋白质残基侧链基团发生改变以及蛋 白质高级结构的破坏等。 自由基可加成到膜脂及其它脂类不饱和脂肪酸的双链中，引起脂质过氧化， 并可产生新的自由基，使机体受到更大损伤。 一些卡尔文循环的酶对双氧水十分敏感，双氧水在体内积累过多会直接抑制 二氧化碳的固定，造成无法弥补的代谢机能障碍，导致细胞死亡。 在线粒体氧化磷酸化生成a t p 的过程中，大约有卜4 氧转化为活性氧 。卜山大学颔十学位论文一| i 困莲金属硫蛋白和小分子热激蚩白雀冈克降硬其表达分析 ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，因此线粒体是活性氧浓度最高的细胞器。 m t d n a 裸露于基质，缺乏结合蛋白的保护，最易受活性氧伤害，而催化m t b n a 复 制的d n a 聚合酶不具有校正功能，复制错误频率高，同时缺乏有效的修复酶，故 m t d n a 最容易发生突变。m t d n a 突变使呼吸链功能受损，进一步引起活性氧堆积， 如此反复循环，造成细胞生物功能的下降导致衰老。 1 1 2 4 衰老的自由基学说的完整提出 结合上述的研究成果后，美国科学家h a r m a n 于1 9 5 5 年正式提出衰老的自由 基学说。该学说包括三条核心内容：所有的生物衰老现象都可以归结为自由基 对细胞成分的有害进攻造成的；对衰老起主要作用的自由基是氧自由基：维 持生物体内适当的自由基清除剂和抗氧化剂水平可以延缓生物衰老。 1 1 3 植物衰老相关的基因 生物衰老时，部分基因的m r n a 水平有所提高，即咳基因的表达是受衰老上 调的( u pr e g u a t e d ) ，通常将这类基因称为衰老相关基因 ( s e n e s c e n c e a s s o c i a t e dg e n e s ，s a g s ) 。现通过实验已经确定的与衰老有关的 基因多达三十种( f i n c h ，t a n z i1 9 9 7 ；w a r n e r ，2 0 0 5 ) ，如在拟南芥、番茄和 水稻中都发现了大量s a g s 。s a g s 一般都编码蛋白酶、r n a 酶和磷脂酶等降解酶 类和部分参与营养物质转运的蛋白。s a g s 可分为两大类，一类在生物自然生长 的早期就有表达，但进入衰老期后，表达量迅速增高；另一类在生物正常生长期 没有表达，仅在衰老期有所表达。后者被称为衰老特异基因 ( s e n e s c e n c e s p e c i f i cg e n e s ，s s g s ) ，如蜊甜卫s a g l 3 和l , 5 e 5 4 等，其中l s c 5 4 在衰老的叶片、茎、花瓣和心皮等多个器官中都有所发现。 l o h m a n 等( 1 9 9 4 ) 从拟南芥中克隆得到了6 个s a g s 的全长c d n a ( s a g l 2 翻7 ) ，序列分析表明s a g l 2 编码一种类似胱氨酸蛋白酶的蛋白质。 b u c h a n a n 等( 1 9 9 4 ) 从油菜中获得包括l s c 5 4 在内的几个衰老相关基因，它们 的表达丰度随着衰老的加剧而增强。k a m a c h i 等( 1 9 9 2 ) 在拟南芥、水稻和萝h 三种植物的衰老叶片巾都检测了高水平表达的天冬酰胺合成酶和谷氨酰胺合成 酶基因。k i n g 等( 1 9 9 5 ) 也在石刁柏衰老叶片中发现b 一半乳糖苷酶基因和上述 6 中山大学硕士学位论文中国莲金属硫蛋白和小分子热激蛋白基因克隧及其表达分析 两个基因的高丰度表达现象。此外，陈昆松( 2 0 0 0 ) 在中华猕猴桃果实中扩增得 到一个旷半乳糖昔酶e d n a 片段，分析表明旷半乳糖苷酶在启动果实成熟方面起 作用，推测这三个基因也属于s a g s 。b a r i o l a 等( 1 9 9 4 ) 证实从拟南芥中克隆 的3 个核酸酶基因中的r n s 2 在衰老的叶片中有较高表达，功能分析显示r n s 2 属 于一类参与降解和磷元素运输的s a g s 。 1 2 植物抗衰老物质研究进展 由于植物衰老可以概括为，内外胁迫产生的自由基导致植物发生氧化应激反 应，并诱导s a g s 表达，近而造成生物大分子、器官及整体各个层面生理功能紊 乱的过程。因此，抗应激类物质( 如热激蛋白等应激蛋白) 、抗氧化系统( 包括 超氧歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、金属硫蛋白和小分子抗氧化剂等) 以及 大分子修复酶对延缓植物衰老具有重要的意义。 1 2 1 植物热激蛋白研究进展 热激蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n s ，h s p s ) 是生物体受到高温、缺氧、重金属 离子等不良环境因素影响时诱导合成的一类应激蛋白。在逆境条件下，从细菌 到人类都能诱导合成热激蛋白，以保护细胞免受进一步的损伤，因此对生物抗逆 境胁迫有重要的作用。 1 2 1 i 植物热激蛋白的分类及其特点 h s p s 种类很多，通常根据分子量的大小，将其分为高分子量热激蛋白( h i g h m o l e c u l a rw e i g h th s p s ，m w 5 0 k d ) 和低分子量热激蛋白( l o wm o l e c u l a r w e i g h th s p s ，m w 5 0 k d ) 两大类。按照s d s 电泳的表观分子量大d , n 可以把植 物h s p s 分为五大类：h s p l 0 0 ，h s p 9 0 ，h s p 7 0 ，h s p 6 0 以及小分子量热激蛋白s m h s p ( 陈忠等，2 0 0 0 ) 。 植物热激蛋白的显著特点是低分子量h s p s 相当丰富。高等植物中存在约2 0 多种l m wh s p s ，这些l m wh s p s 大小差别很大( 从1 2 k d - - 3 0 k d ) ，分布在细胞质、 内质网、叶绿体和线粒体等有监护蛋白( c h a p e r o n e ，c p n ) 的部位。如大豆，1 8 2 5 k d 的h s p s 数量众多，在双向电泳中至少可以分出3 0 一4 0 种蛋白质。已研究 中山大学颁j ：学位论文小，国莲金屑硫蚩白车1 1 小分于热激益白基因兜隆投其表选分析 过的豌豆、向日葵、小麦、水稻、玉米、绿豆和黍等植物中l m wh s p s 都很丰富。 l t m wh s p s 在植物中则较少，种类也不那么复杂。双向电泳表明：在大豆、 豌豆、黍、棉花和谷类中，常见的h m l vh s p s 是6 8 、7 0 、8 4 和9 2 k d 的种类，而 且分布明显相似，应属于高度保守的l i s p s ，它们在生物体正常的生理代谢或胁 迫响应中担负不同的功能。此外，某些还具有特大分子量的h s p s ，如番茄的 h s p 9 5 、大麦的h s p 9 9 、小麦的h s p l 0 3 、棉花的h s p l 0 0 、烟草的h s p l 0 0 和h s p l 2 0 以及大豆的h s p l l 0 等。 1 2 1 2 植物热激蛋白的功能 植物热激蛋白对植物抗逆境胁迫有巨大的作用。在植物受到冷、热、旱、盐 等胁迫时，h s p s 都能参与防御，起到保护作用。 在热激时，h s p s 迅速移向核内，并在核仁和核质中积累。当热激消失后，义 回迁到细胞质，具有保护细胞免受损伤的作用。s c h r s t e r ( 1 9 8 8 ) 证明了大豆 h s p 2 8 可保护光台系统( p sii ) 的反应中心在热激时免受损伤。s h r a v a n 等 ( 2 0 0 2 ) 把编码h s p l 6 1 的转录因子凰捌基因转入蕃茄中，在热激条件下， h s f a 的表达量为对照的1 0 倍，并且获得了一定的耐热能力。研究还发现将 h s p l 0 0 基因转入大豆中，在热激下仍p ，不断地表达，清楚地表明了h s p l 0 0 对热激的响应( s h a r o n 等，2 0 0 0 ) 。 c o l l i n s 等( 1 9 9 5 ) 首先证实了h s p s 和耐冷性的直接关系。随后的研究证实 在水稻( s i n g l a 等，1 9 9 7 ) 、马铃薯( j a c o b ，1 9 9 3 ) 、黄瓜( 1 a f u e n t e 等，1 9 9 1 ) 、 油菜( k r i s h n a 等，1 9 9 5 ) 、大豆( k u z n e t s o v 等1 9 8 7 ) 和玉米( y a c o o b 等， 1 9 8 6 ) 等植物中，h s p s 在植物受到冷胁迫时能够被诱导合成，对植物起保护作 用。 水分胁迫时，向n 葵中i i s p j 7 占与丘垆z9 表达水平与水分丧失成i f 相关。 在车前草、燕麦和玉米等植物中也发现h s p s 在于旱状态下能增强植物的耐脱水 能力，并作为一种调节蛋白而参与渗透调节，起保护细胞结构，制约离子吸收的 作用。 在植物衰老过程中，蛋白质会出现4 i 诈确折叠而丧失生物学功能。l i s p s 作 为分子伴侣( m o l e c u l a rc h a p e r o n e s ) 维持蛋白的正确折叠状态，目前已经证明 h s p 6 0 、i i s p g o 、i i s p 7 0 和小分子h s p s 都具有分子伴侣作用。从这个意义上讲， 中山大学硕士学位论文 中国莲金属硫蛋白和小分子热激蛋白抖因克隆及其表达分析 h s p s 能够延缓植物细胞的衰老。 1 2 1 3 植物热激蛋白基因的相似性 通过克隆玉米h s p 7 0 与大豆h s p l 8 的基因，己确定了它们的d n a 分子序列， 而且进一步研究发现，玉米h s p 7 0 基因与果蝇体细胞基因在编码区存在7 5 同源 性；大豆的三种h s p l 8 基因也存在9 0 同源性，而且它们与果蝇体细胞2 2 2 7 k d 的h s p 也存在相似性。 1 2 1 4 植物热激蛋白在转录水平上的调控 植物h s pm r n a 的快速积累主要是由l i s p 基因转录水平提高所致。已经发 现在h s p 基因转录中起调控作用的d n a 序列，即热激元件( h e a ts h o c kd e m e n t ， h s e ) 。首先是在果蝇上发现，为一种顺式元件，位于热激蛋白基因5 端的启 动子区域，经热激而活化的热激因子h s f ( h e a t s h o c kf a c t o r ) 可识别存在于 l i s p 基因上游启动子区域的热激元件而诱导h s p 的转录( p e l h a m ，1 9 8 6 ) 。常温 下，h s f 以单体形式与阻遏蛋白结合，而不能结合到h s e 上。热刺激下，h s f 与 阻遏蛋白分离，在h s e 附近形成三聚体，三聚体一旦形成，便与h s e 特异结合， 促进基因转录起始。 h s e 是以5 个碱基( 57 一n g a a n 一3 ) 为一个单位，并相互逆向排列，它至少 要与3 个单位的h s f 结合。57 一n g a a n n t t c n n g a a n 一37 结构对于h s p 基因的表 达很重要，并显示出在植物中的5 一a g a a g 一37 的h s e 核心序列与h s f 结合最 有效。 b a u m a n 等( 1 9 8 7 ) 对转基因烟草中的大豆g # g l s p i z 争阳基因5 端进行一系 列启动子缺失，发现一1 1 5 与一2 9 8 间有多个h s e 其中一1 8 1 与一1 5 4 这段d n a 对于 g m h s p l z3 1 3 基因转录的诱导起决定性作用。 1 2 1 5 植物h s p 基因在翻译水平上的调控 热激可以改变受刺激细胞的翻译状况，从而使细胞倾向选择h s pm r n a 而 不选择非h s pm r n a 进行翻译。植物的不同发育阶段对h s pm r n a 也表现出选择 作用。k a l i a s k i ( 1 9 9 5 ) 发现，大豆中h s p 7 0 的m r n a 量在不同组织、不同发 9 巾山大学颁十学位论文- l 一幽莲金属硫主| i 白和小分子热激蚩白单冈克降发其表达分析 育阶段以及每天中不同时川内变化很大，但反映在蛋白质水平上的波动则很 小。 有研究发现，h s p 7 0 的表达凋控与a t p 有关，h s p t o 家族的所有成员在n 一末 端含一4 4 k d a 的a t p a s e 保守区域，在c 一末端含有一1 5 k d a 的多肽结合位点，a t p 结合到该序列上，形成的结合产物较a d p 与该序列结合物亲和性低。因此，可能 由于a t p 与a d p 间的相互转化而实现了对h s p 的调控。 1 2 2 植物金属硫蛋白研究进展 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n ，m t ) 是一类低分子量( 通常低于l o kd a ) 、 富含半胱氨酸、可被金属诱导的结合蛋白，j “泛存在于人体、动物、植物以及微 生物体内。植物中，m t 可被重金属、强光照及电离辐射等逆境条件诱导。m t 的 生物学功能涉及机体生长、发育、生殖、代谢等各个方面，由于m t 具有清除自 由基、解除重金属毒性的突出功能，其在对抗逆境胁迫、防止植物衰老方面可能 起关键作用。 1 2 2 1 植物金属硫蛋白的分类及其特点 依据半胱氨酸的排列方式可以对金属硫蛋白进行分类。以前将金属硫蛋白分 成3 人类：c l a s si 、c 】a s si i 和c l a s si i i 。绝大多数植物金属硫蛋白属于 c l a s si ，因此，对植物：金属硫蛋白的分类研究则主要集中在了c l a s si 。c o b b c t t 等于2 0 0 2 年将c l a s si 金属硫蛋白分为四类。 t y p e1m t 具有6 个“c y s x c y s ”结构单元，且都集中在蛋白末端c 端和 n 端结构域之间是由4 0 个左右的氨基酸组成的不含半胱氨酸的间隔区。t y p e2m t 与t y p elm t 相似，但第一个c y s 般出现在蛋白序列的第三或第四位，且在n 端有一个较为保守的“c y s g l y g l y a s n c y s g 1 yc y s 一6 1 y ”序列，c 端结构域 有三个“c y s x c y s ”结构单元。t y p e3m t 的n 端有4 个半胱氨酸，前面3 个 在n 端多以一个较为保守的“c y s g l y a s h c y s a s p c y s ”形式出现，第四个c y s 多包含在“g l n c y s x l y s g l y ”单元中，c 端结构域有多个c y s ，且都以 “c y s x c y s ”形式出现。t y p e4m t 具有三个富含半胱氨酸的结构域，每个结 巾山大学硕士学位论文中困莲金属硫蛋白和小分子热激蛋白基因克隆及其表达分析 构域都含有5 6 个c y s 残基，结构域之间为l o 1 5 个氨基酸残基组成的间隔区。 1 2 2 2 植物金属硫蛋白的功能 金属硫蛋白在植物中广泛存在，其丰富的巯基含量及重金属结合能力决定了 它在抗逆境胁迫、延缓植物衰老方面有重要的意义。 许多实验证实，m t 基因的表达受重金属影响较大。例如，c u 2 + 可以诱导拟南 芥、水稻、小麦和烟草等植物中m t 基因的表达。s t e f f e n 等( 1 9 8 6 ) 将番茄组织 细胞置于正常情况下足以致死的c 矿浓度下进行筛选，所获得的抗性细胞中m t 的 积累大大高于正常细胞，因而推测植物金属硫蛋白可与重金属离子如c u “、z n ”、 c 矿等配位