（物理化学专业论文）一些与生物相关分子作用的荧光猝灭光谱分析.pdf

l s o m ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gs p e c t r a la n a l y s i s i n t e r a c t e dw i t hb i o r e l a t e dm o l e c u l e s b y l vp i n b e ( c h a n g s h au n i v e r s i t yo fs c i e n c e t e c h n o l o g y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e p h y s i c a lc h e m i s t r y c h a n g s h au n i v e r s i t yo fs c i e n c e & t e c h n o l o g y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rc a oz h o n g m a y , 2 0 1 1 长沙理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 一 作者签名：昌冼 日期：炒j ! 年j 月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权长沙理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本论文收录到中国学位论 文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 日期：为“年歹月万日 日期：为1 1 年j 月巧日 n 弘 乙 趾 喙 默需 名 名 签 签 者 师 作 导 摘要 近年来，分析仪器和生命科学等技术都得到了突飞猛进的发展，荧 光分析方法已经成为光谱化学分析的一种重要的手段，广泛应用于生物 物质、无机物、药物等方面的鉴别和测定。 本文第一部分采用化学还原法制备了粒径为l2 n m 的球形金纳米溶 胶，并对其进行了透射电子显微镜( t e m ) 表征。以p h = 7 4 0 的p b s 为 缓冲溶液，研究了金溶胶对致癌基因c m y c 蛋白的荧光猝灭效应，其中 激发波长为2 9 5 n m ，发射波长为4 5 0 n m ，同时对其现象的形成机理进行 探讨。计算表明，猝灭常数为6 2 9l 10 8 l m o l ，结合常数为1 9 3 10 6 l m o l ，金溶胶与c m y c 蛋白结合位点数为0 9 9 6 9 ，属于静态猝灭。而 且，该荧光猝灭强度与c m y c 蛋白浓度呈线性关系，检测下限可达到 2 5lx10 。1 0 t m o l l 。该方法重现性和稳定性好，回收率在9 4 2 9 10 7 14 范围内，所以可用于致癌基因c m y c 蛋白的检测，在生物医学和分子生 物学方面有重要的基础研究价值和应用前景。 本文第二部分探讨了一种基于邻甲氧基四苯基卟啉超分子化合物 检测环境废水中痕量c d ”的高灵敏性、高选择性的荧光光谱分析方法。 采用t r i s h c l 四氢呋喃作缓冲溶液，最佳p h 值调至8 8l ，最佳卟啉浓 度固定为5 0 l0 - s m o l l ，当c d 2 + 浓度在5 o l0 墙1 0 10 - 6 m o l l 时，荧 光熄灭值与其浓度呈线性关系，其线性相关系数为0 9 9 7 4 ( n = 10 ) ，c d z + 的检测下限可推算出为4 0 7 10 - s m o l l 。该方法重现性和稳定性好，一些 常见金属离子对测定的干扰很小，检测c d ”的回收率在9 8 2 0 l0 2 0 0 范围之间。将该方法用于实验室废水和湘江水样品中微量镉的测定结果 良好，表明本方法在测量环境废水中痕量c d 2 + 方面具有可行性，在居民 生命健康和环境保护方面有重要应用价值。 本文第三部分发展了一种检测药品中槲皮素含量的方法，利用槲皮 素可以使牛血清白蛋白发生荧光猝灭的现象来测定槲皮素的含量。在 p h = 7 4 0 的p b s 缓冲溶液，激发波长2 8 8 n m ，发射波长35 6 n m 的条件下 进行实验。研究发现，槲皮素与牛白蛋白猝灭常数为5 2 3 3 10 4 l m o l ， 结合常数4 4 7 10 0 l m o l 一，结合位点数为0 5 3 6 2 ，属于静态猝灭。而且， 该荧光猝灭强度与槲皮素浓度呈线性关系，检出下限达到2 4 3 10 为 g m o l l 。该方法重现性好，稳定性好，回收率在9 9 37 1 0 2 2 9 范围， 可用于肾石通和普乐安药品中槲皮素的检测，在生物医药工业有重要应 用价值。 关键词：荧光猝灭；c m y c 蛋白；镉离子；槲皮素；静态猝灭 a bs t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，a n a l y t i c a li n s t r u m e n t sa n db i o - s c i e n c eh a v e s e e nr a p i d d e v e l 。p m e n t ，a n dt h ef l u 。r e s c e n c es p e c t r o s c o p y f o rc h e m i c a la n a l y s i sh a s b e c o m eav e r yi m p o r t a n tt 。1 ，w h i c h h a sb e e nw i d e l ya p p l i e d t 。t h e d e t e r m i n a t i o no fb i o l o g i c a ls u b s t a n c e s ，i n o r g a n i c s u b s t a n o e s ， a n dd r u g s ， t h ef i r s tp a r to ft h i sp a p e r i n c l u e d e dt h ep r e p a r a t i o n o fg o l ds o l s o l u t i o no fs p h e r i c a ln a n o p a r t i c l ew i t h 12 n mb yc h e m i c a lr e d u c t i o na n d c h r a c t e r i z a t i o n w i t h t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) t h e f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gc a u s e db yt h ei n t e r a c t i o no fg o l dn a n o p a r t l c l e s w l t h c m y co n c o g e n ep r o t e i nh a sb e e ni n v e s t g a t e di np b sb u f f e rs o l u t i o n ( p h5 7 4 0 1w i t ha ne x c i t a t i o nw a v e l e n g t ho f2 9 5 n ma n da ne m i s s l o nw a v e l e n g t n o f4 5 0 n m t h eq u e n c h i n g m e c h a n i s mh a sb e e ne x a m i n e db y t h e o r i t i c a l c a l c u l a t i o n ，i n d i c a t i n gt h a tt h eq u e n c h i n gc o n s t a n t w a s6 2 9 1 1 0 i mo l - i ， t h eb i n d i n gc o n s t a n tw a s1 9 3 x10 6 l m o l ，a n dt h eb i n d i n g s ot h eq u e n c h i n gi n t e r a c t i o nb e l o n g e d t os t a t i cq u e n c h i s i t e sw a s0 9 9 6 9 ， n g t h e r ew a s a l i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nc - m y cp r o t e i nc o n c e n t r a t i o na n df l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ， a n dt h ed e t e c t i o n l i m i tc o u l dr e a c h 2 51x10 。1 0p m o l l t h e p r e s e n t e dm e t h o dh a dg o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yw i t h ar e c o v e r yo f 9 4 2 9 10 7 14 ，s ot h ea p p r o a c hf o rd e t e c t i o no fc m y co n c o g e n ep r o t e l n 1 s f e a s i b l e ，s h o w i n gi t sp r o m i s i n ga p p l i c a t i o n o nb i o m e d i c a la n dm o l e c u l a r b i o s c i e n c e i nt h es e c o n dp a r t ， af l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t r y b a s e do n o - m e t h o x y lt e t r a p h e n y l p o r p h y r i n ( o - o c h 3 t p p ) f o ra n a l y s i s o ft r a c ea m o u n t o fc a d m i u mi o ni ne n v i r o n m e n t a lw a s t ew a t e rw i t h ah ig hs e n s i t i v i t ya n d h i g hs e l e c t i v i t y b a sb e e nd i s c u s s e d i nt h i sp a p e r w h e nt h eo p t l m a l c o n c e n t r a t i o no ft h ep o r p h y r i nw a sf i x e da s 5 0 x10 5 m o l la n dt h eo p t l m a l p hv a l u e w a sa d j u s t e d t o8 81 u s i n g t r i s h e l _ t e t r a h y d r o f u r a n b u f f e r s o l u t i o n ，t h e f l u o r e s c e n c e e x t i n c t i o nv a l u e w a s p r o p o r t l o n a l t ot h e l o g a r i t h m i c v a l u eo fc d 2 +c o n c e n t r a t i o n w i t ht h er a n g eo f5 o 1o 叼 t o 1 o lo 6m 0 1 l ，a n dt h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tw a so 9 9 7 4 ( n 2 lo ) t h e d e t e c t i o nl i m i t f o rc d 2 +c o u l db ee v a l u a t e d t ob e4 0 7 1 0 峭m o l l i n a d d i t i o n ， n oo b v i o u si n t e r f e r e n c e sf r o m s o m ec o m m o nm e t a l i o n sw e r e i i i o b s e r v e d a l s o , t h ep r e s e n t e df l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t r yp o s s e s s e da v e r yn l c e r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yw i t har e c o v e r yr a t e o f9 8 2 0 10 2 0 0 , i n d i c a t i n gt h a t i tw a so ff e a s i b i l i t y f o rd e t e r m i n a t i o no ft r a c e a m o u n to fc d z 十 i n e n v i r o n m e n t a lw a s t e w a t e r ， s h o w i n gi t sp r o m i s i n g a p p j l c a t l o no np e o p l e sh e a l t hl i v i n ga n de n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n 1h et h i r dp a r to ft h i sp a p e rr e l a t e dt o d e t e c t i o no fq u e r c e t i ni n d r u g s q u e r c e t l nc ou l dm a k et h eb s af l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g ，a n dt h i si st h e p r i n c i p l ef o rd e t e r m i n a t i o no fq u e r c e t i nc o n t e n t t h e c o n d i t i o n so ft h e e x p e r l m e n t1 su n d e rp b sb u f f e r s o l u t i o n ( p h = 7 4 0 ) w i t ha ne x c i t a t i o n w a v e l e n g t h o f2 8 8 n ma n da n e m i s s i o n w a v e l e n g t ho f3 5 6 n m t h e c a l c u l a t i o ns h o w e dt h a tt h e q u e n c h i n gc o n s t a n tw a s5 2 3 3 10 4 l - m o l t h e b l n d l n gc o n s t a n tw a s4 4 7 10 6 l m o l l ，a n dt h eb i n d i n gs i t e sw a so 5 3 6 2 s o t h eq u e n c h i n gi n t e r a c t i o nb e l o n g e dt o s t a t i cq u e n c h i n g t h e r ew a sal i n e a r r e l a t l o n s h l pb e t w e e nt h eq u e r c e t i nc o n c e n t r a t i o na n df l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y w l t had e t e c t i o n l i m i to f2 4 3x10 。6 p , m o l l t h i sm e t h o dh a d g o o d r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t yw i t har e c o v e r yo f9 9 37 1 0 2 2 9 ，w h i c hc a n b ew e l l a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft h e q u e r c e t i ni nd r u gs a m p l e s ， s h o w i n gi t sp r o m i s i n ga p p l i c a t i o ni np h a r m a c e u t i c a li n d u s t r v k e yw 。r d ：f l u 。r e s c e n c eq u e n c h i n g ；c m y c p r o t e i n ；c d 2 + ；q u e r c e t i n ； s t a t i cq u e n c h i n g 2 3 5c m y c 蛋白样品的测定18 2 4 结果和讨论l8 2 4 1 基本原理18 2 4 2 最佳激发波长及发射波长的确定19 2 4 3 以金溶胶为基体的c m y c 蛋白标准曲线的测定19 2 4 4 荧光淬灭机理分析2 1 2 4 5 选择性分析2 1 2 4 6 重现性、稳定性与回收率的测定2 3 2 4 7c m y c 蛋白样品的测定2 5 第三章基于荧光猝灭方法的废水中痕量镉离子的分析检测 3 1 前言2 6 3 2 实验部分2 7 3 2 1 实验仪器与试剂2 7 3 2 3 溶液配制2 8 3 3 结果和讨论2 9 3 3 1 荧光激发和发射波长的确定2 9 3 3 2 荧光猝灭效应的检测3 0 3 3 3 测定标准曲线的最佳条件的选择31 3 3 4 标准曲线的测定3 2 3 3 5 干扰离子的影响3 4 3 3 6 重现性、稳定性的测定3 4 3 3 7 回收率的测定3 6 3 3 8 水样的测定3 6 3 3 9 机理探讨3 7 第四章基于荧光猝灭方法的药品中槲皮素含量的分析检测 4 1 前言3 9 4 2实验部分4 0 4 2 2 主要仪器4 0 4 2 3 实验方法4 0 4 3 结果和讨论4 1 4 3 2 基本原理4 l 4 3 3 最佳激发波长及发射波长的确定4 l 4 3 4 槲皮素对牛血清蛋白的荧光猝灭效应4 3 4 3 5 重现性和稳定性的测定4 8 4 3 6 选择性的测定4 9 4 3 7 回收率的测定5 0 4 3 8 槲皮素样品的测定5 0 结论与展望5 3 参考文献5 5 致谢6 4 附录( 作者在攻读硕士学位期间发表的学术论文) 6 5 第一章绪论 1 1 引言 157 5 年，西班牙的植物学家首次记录了荧光现象；l8 5 2 年，g e o r g e s t o k e s 首次采用“荧光”这一术语；l8 67 年，科学家进行了科学史上的 第一次荧光分析工作。现在，已经有越来越多的科学工作者把荧光分析 作为一种重要手段，新的世纪来临之际，分析仪器和其它科学技术得到 了突飞猛进的发展，无论是从理论角度还是实际应用角度来讲，荧光分 析方法已经成为光谱化学分析的一种重要的手段。其具有灵敏度高、选 择性好、方法简单、取样量少等优点并被广泛应用于生物物质、药物、 无机物、有机物等方面的鉴别和测定。 荧光猝灭也叫做荧光熄灭，定义为任何可以使荧光强度减弱即荧光 量子产率降低的作用。利用这一荧光猝灭作用建立起来的荧光测定方 法，称为荧光猝灭法。总的来说，比起直接荧光测定法，荧光猝灭法 具有更高的选择性和灵敏性。本论文中的荧光猝灭是指荧光物质分子与 溶剂或溶质分子发生相互作用，从而导致的荧光强度下降的化学或物理 作用的过程。而导致荧光强度降低的物质，则叫做荧光猝灭剂【l 】。 荧光猝灭过程可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭则是激发态荧 光分子与猝灭剂碰撞使光的强度减弱，静态猝灭是指处于基态荧光分 子与猝灭剂之间形成不发光的复合物。荧光猝灭是用来获取有关荧光 分子结构和动力学的信息的一种重要的手段，通常情况下，其中荧光强 度的降低时由各种溶质分子间的相互作用引起的，如激发态反应，能量 转移，分子重排，碰撞猝灭和基态复合物的形成等【2 ， 。大部分静态猝灭 和动态猝灭的发生都需要和荧光猝灭剂接触，其区别是，两个淬灭机制 具有同样的物理基础。 1 1 1 动态猝灭 通过与自发的发射过程相碰撞来降低激发态分子的寿命的过程是动 态猝灭过程。溶液中的荧光物质分子与猝灭剂之间的相互碰撞来引起荧 光猝灭，可由s t e r n v o l m e r 方程表示： r f = l + k 印【q j ( 1 1 ) f o 为无猝灭剂情况下的荧光强度，f 为猝灭剂存在的情况下的荧光 强度，k s v 为s t e r n v o l m e r 常数，s t e r n v o l m e r 方程表明，f o f 与猝灭剂 的浓度具有线性关系，若以f o f 对【q 】作图可得一条直线，从而求出直线 的斜率k 。v ，如果是有效地猝灭剂，k 。v 在l0 2 l0 3 l t o o l 之间。 1 1 2 静态猝灭 前面我们所讨论的动态猝灭与时间有关的碰撞猝灭，而有些现象却 无法用上述猝灭来理解。某些荧光物质的溶液加入猝灭剂后荧光强度明 显的下降，吸收光谱发生变化。这是因为形成了不发光的基态配合物而 造成的静态猝灭。可以表示用化学方程式来表示： m + 9 m q( 1 2 ) k = 】阻】【q 】( 1 3 ) 可推出猝灭剂浓度与荧光强度的关系 阻】o = i m p + 阻】( 1 4 ) 即 ( f o f ) f = t i m 。一阻d m = m o i l m = k q 】 ( 1 5 ) 可得 r f = 1 + k q 】( 1 6 ) 其中【m o 为荧光分子总的浓度。这个关系式与动态猝灭的相似，只是猝 灭常数被配合物的形成常数所替代。当然对与复杂的，具有多个结合位 点的静态猝灭过程，其关系式应该另外推导。 与扩散有关的动态猝灭，温度升高的时候，加快了分子运动的速度， 从而增大了扩散系数，继而增大了猝灭常数。相反，温度升高的时候， 配合物的稳定程度降低，静态猝灭的程度也随之减小【1 1 。 动态猝灭只影响荧光分子的激发态，所以其吸收光谱不改变，但基态 配合物却能引发荧光物质吸收光谱的变化。 1 1 3 分子荧光光谱法分析 分子由于吸收了紫外和可见电磁辐射从而被激发跃迁至激发电子态， 大多数的分子因为与其它分子相碰而散发掉部分能量，另外部分的分子则 以光的形式放射能量，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的 辐射，这种现象称为光致发光f 4 1 。分子荧光光谱分析就是基于这类光致发 光现象而建立起来的分析方法。具有灵敏度高、选择性强、用量少、操作 简便等特点。可应用于环境检测领域5 】；食品和药物分析，如维生素【6 ，7 1 、 抗菌药【8 1 、镇静药9 1 等分析；生命科学中的应用，如多种氨基酸的分析10 1 、 d n a r n a 的相关研究【1 1 ，12 1 、酶 1 3 1 和蛋白质【1 4 】作用研究等、叶绿素【15 1 的 测定等。 2 1 1 4 荧光分光光度计 19 世纪以前，科学家依靠肉眼来观察荧光现象，19 2 8 年，世界上第 一台光电荧光计问世。总的来说，荧光分析中常用到的荧光分光光度计 一般由光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器、数据处理仪 器组成。如图1 1 所示。光源一般采用高压汞灯、氙汞弧灯、氙灯等， 其具有强度大，适用波长范围宽两大特点。激发单色器是放置在光源和 样品池之间单色器，用以分离出特定的激发光谱。样品池分为两种，即 液体样品用的石英池和粉末或片状样品用的固体样品架，测定液体时， 光源与检测器成直角；测定固体时，光源与检测器成锐角。 图1 1 荧光分光光度计结构不恿图 发射单色器是放置在样品池和检测器之间的单色器，用以分离出发射光 谱。光栅常被作为单色器。检测器一般采用光电管或光电倍增管，其作 用是将光信号放大并转为电信号，联结于数据处理仪器( 计算机) 读出 荧光信号。 由光源发出的光经过切光器时变为断续的光，然后经激发单色器成为单 色光，此光即为被测物质的激发光，被测物质在激发光照射下所发出的荧光， 经过单色器变成单色荧光，单色荧光照射在测定样品用的光电倍增管上，产 生光电流，经过放大器放大输出到记录仪上，激发单色器和发射单色器的光 栅都被电动机带动的凸轮控制，当绘制被测物质的发射光谱时，将激发单色 器的光栅固定在最适当的激发光波长处，而让发射单色器的凸轮转动，将得 到的发射光的强度信号输出到记录仪上，所得到的光谱即发射光谱，又称荧 光光谱。当绘制激发光谱时，将发射单色器的光栅固定在最适当的发射波长 处，此时让激发单色器的凸轮转动，将得到的激发光的强度信号输出到记录 仪，所得到光谱即激发光谱。这就是荧光光分光光度计的工作原理。 1 2 蛋白质与纳米材料的荧光光谱分析 蛋白质在生物体中是非常重要的生命物质，无论是在生命的运动或发 展都起到了关键的作用，运用各种物理化学方法来研究其构象以及药理信 息等，己引起了许多学科包括生命科学、临床医学、药学、化学等方面的 科研工作者的普遍关注。而纳米材料也因为具有独特的物理特性而引起了 人们的广泛的关注，纳米粒子与金属粒子、半导体之间的差别是其将电子 和空穴禁锢在体积很小的纳米颗粒中，纳米颗粒表面的原子数目和里面的 是相当的，因此，纳米颗粒表面的性质对于确定材料的物理性能更为重要， 纳米数量级的尺寸使其表现出特殊的光电学性质，在临床医学、生命科学、 材料科学【1 6 。8 】等方面表现出了巨大的应用价值。尤其是纳米材料的荧光特 性，在光信号存储和通信等方面有望获得重要应用。这两方面的结合将是 将来技术发展的一个趋势。而常用的荧光光谱法又可以分为荧光增强法、 荧光猝灭法、三维荧光法、同步荧光法、荧光偏振法等。 1 2 1c m y c 蛋白概述及其检测的意义 可易位基因c m y c 归属于m y c 基因家族。是一种可促进细胞分裂， 使细胞无限增殖的基因，因此c m y c 基因多与肿瘤发生有关。c m y c 基 因的表达一般与细胞的生长状态有关，其表达产物c m y c 蛋白在调节细 胞生长、分化或恶性转化中发挥重要作用。扩增和染色体易位重排都可以 激活c m y c 基因，某些组织肿瘤已发现c m y c 或c m y c 相关序列的扩 增，如视网膜母细胞瘤细胞系，粒细胞性白血病细胞系，乳腺癌细胞系、 神经母细胞病细胞系，某些肺癌细胞系等。目前在人的结肠癌细胞系中也 观察到了c m y c 基因的扩增，其扩增的程度与肿瘤的发病进程有关，而 且c m y c 的过量表达与早期肿瘤复发有关1 1 9 - 2 1 】。因此检测c m y c 是否过 量表达是具有极其重要的意义的。 1 2 2 金纳米粒子简介 l6 世纪，医生开始利用“饮用金 来治疗精神类疾病，纳米金就开 始在科学史上展开了它的征程。l8 5 7 年法拉第在双相系统中( 水c s 2 ) 采用 三氯化磷还原氯金酸盐获得了金纳米的深红色溶液，并且对其作了系统 的研究，研究发现如果在其中加入少量电解质，可使溶液的颜色发生改 变，由最初的红色变为蓝色，最终变为无色，这种颜色的改变可以通过 加入明胶等大分子物质来可阻止。这些发现为奠定了纳米金的应用研究 4 的科学基础；18 8 5 年的美国，纳米金溶液成为了治疗酗酒的药物主要成 分；1 8 9 0 年金的的表面无结核杆菌存活被k o c h 医生证明；l9 39 年科学家 k a u s c h e 和r u s k a 开始用金颗粒标记的烟草花叶病毒。19 71 年f a u l k 和 t a y l o r 首次将金纳米颗粒与兔抗沙门氏菌抗血清相结合，开创了纳米金免 疫标记技术的先河【22 1 。在未来，通过材料物理和化学的发展，电和磁将 向生物检测系统转化，新的控制纳米尺寸的手段将带来新型的生物传感 器，这些新系统将能应用于活细胞水平的单分子检测，收集更多种检测 信号，使同步实验的多样性增强【2 3 1 。 金纳米粒子的制备方法有许多种，如蒸气合成法、惰性气体蒸发法、 磁控溅射及化学气相沉积法等方法用以制备粒径分布窄、尺寸小的纳米粒 子。但是这些制各方法都不够便捷，因为其需要的仪器设备或前驱体化合 物材料并不容易获得。所以，近年来化学还原法和生物合成法等倍受欢迎， 也得到了广泛应用。这些方法不仅具有简单、方便、低廉、量大等优点， 且能控制颗粒的形态、尺寸。接表征金纳米粒子的方法有：透射电子显微 镜( t e m ) 、扫描电子显微镜( s e m ) 、原子力显微镜( a f m ) 、扫描隧道显微镜 ( s t m ) 及场离子显微镜( f i m ) 等。间接表征的方法有：x 射线衍射( x r d ) 、 电子自旋共振( e s r ) 、电子衍射、红外光谱( i r ) 、核磁共振( n m r ) 、光电子 能谱( x p s ，u p s ) 、表面增强拉曼散射( s e r s ) 、紫外可见光谱、表面光电 压光谱( s p s ) 、荧光光谱等。通过这些手段均可以获取金纳米颗粒的结构、 形态、电子能级等信息。 目前，生物纳米技术依托生物学、材料学等各种自然学科得到了强势 发展，纳米材料不仅也可作为药物载体1 2 4 - 2 6 】，也能用在疾病诊断和生物检 测和1 2 7 - 2 9 】。在种类繁多的纳米粒子中，金纳米粒子因为具有优异的磁学、 电学、光学和生物相容性等特殊性质，已经成为生物医学研究的热点。 1 2 3 荧光光谱法在蛋白质研究中的应用 水溶液蛋白质的分子构象我们通常通过荧光光谱法来研究，无论是动 态还是静态的猝灭都是需要猝灭剂与荧光发色基团接触。对于动态猝灭来 说，猝灭剂必须在激发状态内与蛋白质的荧光发色基接触，荧光发色团将 不发射光子，返回激发态。对于静态猝灭来说，猝灭剂与荧光发色基团形 成了配合物，此配合物是不发荧光的。鉴于荧光猝灭研究所具有的这些特 点，可以揭示出蛋白质中荧光发色基团的位置和猝灭剂的渗透程度，同时 因为猝灭剂具有选择性，还可以用猝灭作用来研究蛋白质分子在溶液中的 构象 3 0 1 。 荧光光谱法可以用来定量的测量蛋白质，比分光光度法的灵敏度高 1 3 1 1 ，由于蛋白质中因为含有能够吸收2 7 0 3 0 0 n m 的紫外光的酪氨酸、色 氨酸或者苯丙氨酸的残基，而发射荧光。但实际上其本身所具有的内源荧 光灵敏度低，无法满足痕量分析的要求，这就需要通过其他方法来研究并 获取蛋白质分子的更多的信息。某些物质在与蛋白质结合后，能引发溶液 荧光强度增强或减弱，在一定浓度范围内和蛋白质浓度呈线性关系，因此 可应用于蛋白质含量的测定。 1 3 卟啉与金属离子的荧光光谱分析 卟啉所具有的独特结构特征，使金属卟啉具有了许多独特的物理化 学性质和功能性质。研究表明，金属卟啉作为光电功能材料和良好的催 化剂在材料科学和化学工业方面有广阔的应用前景，在许多生物系统中， 都具有重要的功能。例如血液中传递氧的血红蛋白，其催化作用的过氧 化氢酶都是金属铁卟啉化合物，而叶绿素则是金属镁卟啉化合物；维生 索r 是金属钴卟啉化合物等等【3 2 】。自z e l a s k i r l 在19 0 2 年第一次合成了铜和 锌的无机金属卟啉化合物以来，金属卟啉在众多研究领域发展迅速，具 有新的性质和功能的有机无机杂化卟啉一直是深入研究的对象。卟啉超 分子已经跨越电子、化学、医学、和生物等多个学科，展现了前所未有 的开发和应用前景。 1 3 1 卟啉的结构特点和功能特性 卧啉是外环上带有取代基的卟吩的同系物或衍生物，其广泛存在与 自然界中，卟吩是由4 个次甲基和4 个吡咯环桥联起来的大7 【共轭体系。 l9l2 年k u s t e r 首次合成大环的“四吡咯”结构的卟啉，但当时人们认为 这不是一种稳定结构；19 2 9 年，f i s h e r t 和z e i l e 合成了氯高铁卟啉，其 结构才被证实。迄今为止，卟啉衍生物在包括化学，物理学，地质学， 生物学在内的很多个领域发挥了重要的作用。世界各地的科学家们均从 不同角度对其独特的性能进行深入的研究，例如，卟啉在可见光领域普 遍具有强兀一兀幸吸收带，并具有广泛的氧化还原性 3 3 , 3 4 】。 卟啉与无机主体材料配合的重点是光学性能的研究，卟啉因为是具 有刚性构的共轭大环化合物，在光的照射下，容易被激产生荧光。19 81 年，h a r r i m a n 和h o s i e 对1 1 种苯溶液中的四苯基卟啉衍生物进行了光学 方面的研究，研究发现，实际上大多数卟啉与四苯基卟啉具有相同的发 射光谱和吸收光谱。当引入强的推电子基团( 如n ( c h ) 3 ) 或强的吸电子基 团( 如n 0 2 ) 在苯环的对位的时候，卟啉的荧光参数会发生变化。 6 1 3 2 金属卟啉配合物简介 环系在一个平面上的卟啉是一个高度共轭的体系，因此其性质稳定， 并且大多数具有较深的颜色。卟吩环易因取代基的影响而变形，其本身 具有1 1 个共轭双键，吡咯环及次甲基的电子效应极容易对其产生影响， 从而产生各种各样的电子光谱。进一步来说，可以通过控制光化学或电 化学的性能来改变取代基，引入不同的中心金属离子，改变不同亲核性 的轴向配体，从而使卟啉具有不同的性质，即具有不同的功能【35 1 。金属 卟啉定义为被金属离子取代了氮上2 个质子的卟啉。 图1 2 卟吩结构式图1 3 金属卟啉结构式 金属卟啉和卟啉都是高熔点的深色固体，一般不溶于水和碱，可溶 于无机酸，具有热稳定性，溶液有荧光。卟啉体系最著名的化学特性易 生成1 ：1 的金属卟啉配合物，元素周期表中的各种金属( 包括稀土金属) 与卟啉的配合物几乎都已经得到，大多数在生理功能方面有着重要作用 的吡咯色素都是金属卟啉配合物，如铁存在于血红素中，镁存在于叶绿 素中【3 6 】。但因为能量转移效应及重原子效应，一些金属离子形成的金属 卟啉配合物是非荧光配合物。其独特的性能及结构，吸引着越来越多的 科研工作者对其进行深入的研究探讨。 19 5 7 年，s m i t h k m 开始了关于卟啉类化合物所具有的荧光性能研 究的先河。在我们国内，19 8 9 年，王富芝对铷铯金属卟啉配合物进行了 荧光性能方面的研究；l9 9 4 年，徐勉懿等对受表面活性剂影响卟啉荧光 光谱进行了研究；19 9 8 年，丁亚平，程丽娅首次解析了高灵敏度得多元 金属卟啉螯合体系的重叠荧光光谱，并同时提出了测定痕量锌镉铅的算 分析方法；2 0 0 0 年，罗兆福等系统地研究了m e s o 一四( 4 吡啶基) 卟啉( t p y p ) 与金的荧光猝灭效应；2 0 0 2 年，郭灿城等合成了一种新型红色荧光卟啉； 2 0 0 4 年，龙立平建立了利用m e s o 5 ，l0 ，15 ，2 0 四( 4 甲氧基苯基) 卟啉与铅 能形成无荧光的稳定络合物的方法，测定环境水样中铅含量；2 0 0 6 年， 郭喜明等合成了l 一谷氨酸桥连的卟啉二联体配体及其铜的金属配合物； 7 2 0 0 8 年，周再春等设计了一个具有双包合功能的剪刀型的双卟啉锌化合 物；同一年，徐勇军等设计了l0 个氯化m e s o 四( 对烷氧基苯基) 卟啉 合铁( i i i ) 配合物；2 0 0 9 年，张丽娜等利用荧光光度法研究了m e s o 四 ( 4 羟基苯基) 卟啉锌金属卟啉( t p p z n ) 与牛血清白蛋白之间的结合 反应。2 010 年，吕艳阳等合成了一个为报道过的化合物，四( 对甲氧基苯 基) 卟啉钐( i r ) 化合物1 3 7 - 4 8 。由上述可知，我国的金属卟啉方面的研究已 经取得了巨大的进步。 1 3 3 卟啉在金属离子检测方面的应用 卟啉是一种重要的测定金属离子的显色剂，其灵敏度高，稳定性好， 络合比固定，具有操作简便、测定快速等优点。19 7 4 年，四苯基卟啉三 磺酸作为测定铜的光度试剂以来，卟啉类试剂就被称作为“超高灵敏度 的显色剂 【49 1 。目前，水溶性的磺酸基苯基卟啉是最常用的显色剂，传 统的利用卟啉测定金属离子的方法有选择性差、测定较为繁琐、反应速 率慢等缺点。所以，探索理想的掩蔽剂、简化实验步骤、提高反应速率、 降低检出限以及使测定物质种类更为丰富是摆在科学家前面的一个难 题。 金属卟啉的形成是因为自由碱卟啉与金属卟啉的摩尔吸光系数和紫 外吸收峰的峰型具有明显差别。自由碱卟啉具有5 个紫外光谱吸收峰，金 属卟啉却只有3 个峰，摩尔吸光系数也是自由碱卟啉的要大得多。因此光 度法可用作检测不同的金属离子。已有文献报道的可测定的金属离子包 括c u ( i i ) 、z n ( i i ) 、h g ( i i ) 、a g ( i ) 、c o ( i i ) 、m n ( 1 i ) 、p b ( ) 、p d ( i i ) 、 c d ( i i ) 、a u ( i i i ) 、f e ( i i i ) 等等。合成金属卟啉配合物的常用的经典合成法 分别由a l d e r 于l9 6 7 年，l i n d s e y 于19 8 7 年提出。a l d e r 的方法不需要将容 器密封，运用此方法可以简便的合成中位取代卟啉衍生物，然后只要在 适当的有机溶剂中引入所需要的的金属盐类进行回流，就可以得到得到 相应的金属卟啉；l i n d s e y 采用氮气做为保护气体合成卟啉，优点是条件 温和，易于控制，但此方法有一个显著地缺点，就是反应浓度低，最大 反应容积只有ll ，放大后效果不好 5 0 5 1 】。此外随着科学技术的发展，一 些新的合成方法应运而生，如微波诱导法、酶催化法、生物合成法等等。 经科学家们研究发现，不同的金属与自由碱卟啉之间的荧光猝灭程 度相差比较大，因此，研究人员在此基础上进行了大量的研究工作，成 功的研制了各式各样的以卟啉作为载体的传感器，即使是同一种卟啉类 物质，研究人员也从不同角度对其进行探讨，得到了多方面的研究成果。 例如，四甲氧基苯基卟啉制成的p v c 敏感膜就对于铅离子具有很好的响 8 应。由文献【4 3 】可知，龙立平基于此建立了p b 2 + 荧光化学传感器。此p v c 敏感膜对p b 2 + 具有快速的可逆的响应，可用于环境水中p b 2 + 的测定，稳定 性好，方便快捷。谢顺萍等 5 2 】则基于此将其制备成微胶囊，用于重金属 离子汞的检测。这一研究结果将减少有机相的使用，保护环境。 1 3 4 啉在荧光分析中的应用 利用卟啉的荧光性质来检测金