（发育生物学专业论文）激素调控拟南芥离体苗再生的研究.pdf

英文缩写 6 b a 2 ，4 - d d d h 2 0 g m g u s i a a i p t g n a a p h t w e e n - 2 0 x g a l z t 中英文缩略表 英文名称 6 - b e n z y l a m i n o p u d n e 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n l x y a c e t i a c i d d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r g e r m i n a t i o nm e d i u m 1 3 - g l u c u r o n i d a s e i n d o l e 3 a c e t i ca c i d i s o p r o p y l t h i o 1 3 - d - - g a l a e t o s i d e n a p t h a l e n ea c e t i ca c i d p o n d u s h y d r o g e n i i 中文名称 6 卞氨基嘌呤 2 ，4 二氯苯氧乙酸 重蒸水 萌发培养基 p 葡萄糖苷酸酶 3 吲哚乙酸 异丙基一p d 一硫代半乳糖苷 萘乙酸 氢氧离子浓度指数 p o l y o x y e t h e n e - 2 0 - s o r b i t u m 吐温 5 - b r o m o 4 - - c h l o r o 3 i n d o l y l - d g a l a c t o s i d e z e a t i n 5 - 溴- 4 一氯- 3 一吲哚- p - d - 半乳糖苷 玉米素 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，、均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 世缉 红么 名 名 签 釜 秘 签 作 师 文沦 导 山东农业大学硕士学位论文 摘要 离体器官的再生受到多种内外因素的影响，但是目前还没有工作对这 些因素进行系统的研究。本文首先以拟南芥的根为外植体，建立了一步法 拟南芥苗离体再生体系。该体系简单易操作，实验周期短，离体苗再生频 率高、同步性好，为进一步的研究提供了良好平台。在此基础上，我们从 外植体遗传背景、组织来源、激素种类、浓度等方面系统地分析了影响拟 南芥苗再生的因素。结果如下： 1 不同种类的生长素对于愈伤组织的形成影响较大。n a a 与2 ，4 - d 比i a a 更易诱导愈伤组织的形成。 2 不同种类的激素在一定浓度范围内促进离体苗再生。细胞分裂素 6 - b a 能够分化苗的上限浓度比z t 低，即细胞分裂素z t 在一定浓度范围 内诱导苗再生；生长素l a a ，n a a ，2 ，4 d 同样在一定浓度范围内诱导苗 再生，浓度范围分别在1 0 0 2 0 0l x m ，1 0 1 0 0 州，o 1 州左右。因此激 素的种类其浓度范围对分化苗起重要作用。 3 不同生态型之间离体苗的再生频率变化较大。w s 生态型比c o l 生 态型分化频率高，分化时间短，且再生苗发育正常。 4 根的不同组织来源( 分生区和伸长区、根毛区) 对于拟南芥离体 苗的再生影响较小，平均每块愈伤组织分化苗的数目随着细胞分裂素的升 高略有降低。 5 离体苗的再生需要特定的基本培养基。在同样激素条件下，m s 培 养基不能诱导正常的愈伤组织以及苗的再生，而b 5 培养基则能够高效诱 导苗的再生。 关键词：根激素苗再生拟南芥 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 h q g u l a t e d nv i t r os h o o tr e g e n e r a t i o n t i o r m o n e s - r e g u l a t e d i nv i t r ot m o tr e g e n e r a t i o no f a r a b i d o p s i s o r g a nr e g e n e r a t i o n nv i t r oi sa f f e c t e db ym a n yf a c t o r s ，b u tl i t t l ei sd o n et o a n a l y z es y s t e m a t i c a l l yt h e s ef a c t o r s i nt h i ss t u d y , ao n e - s t e pa d v e n t i t i o u s s h o o tr e g e n e r a t i o nm e t h o dw a sd e v e l o p e du s i n gr o o t so fa r a b i d o p s i sa s e x p l a n t s c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a lm e t h o d ，t h i sm e t h o di se f f i c i e n t , s i m p l e a n dr a p i d s oi t p r o v i d e sag o o ds y s t e mt or e s e a r c ht h es h o o t r e g e n e r a t i o n nv i t r o b a s i n go nt h es y s t e m ，w ea n a l y z e dt h ee f f e c t so fs e v e r a l f a c t o r s , s u c ha se c o t y p e ，e x p l a n t , h o r m o n et y p ea n dh o r m o n ec o n c e n t r a t i o n ， o nt h es h o o tr e g e n e r a t i o nn er e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： 1 ) d i f f e r e n tk i n d s o fa u x i nr e s u l ti nd i f f e r e n tc a l l u sm o r p h o l o g y n l e f o r m a t i o no fc a l l ii sm o r ee f f i c i e n to nm e d i u mc o n t a i n i n gn a ao r2 , 4 - d 2 ) f o rd i f f e r e n th o r m o n e s ，t h ec o n c e n t r a t i o nm a ti ss u i t a b l ef o rt h es h o o t r e g e n e r a t i o n nv i t r oi sr e l a t i v e l yf i x e d 1 1 1 ec o n c e n t r a t i o nr a g eo fz t , o n ek i n d o f c y t o k i n i n , a n d i t su p p e rl i m i ti sh i g h e rt h a n6 - b a n l cc o n c e n t r a t i o nr a n g e s o fa u x i n ss u i t a b l ef o rs h o o tr e g e n e r a t i o na l er e l a t i v e l ys t a b l e n l es u i t a b l e c o n c e n t r a t i o nr a n g e so f l a a ，n a a ，2 ，4 - da l e1 0 0 2 0 0 州，1 0 1 0 0 州，o 1 州，r e s p e c t i v e l y i naw o r d ，t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo fh o r m o n e si se n s s e n t i a l t os h o o tr e g e n e r a t i o n 3 ) mf r e q u e n c i e so fs h o o tr e g e n e r a t i o nf r o md i f f e r e n te c o t y p e so f a r a b i d o p s i sa r e d i f f e r e n t 1 1 圮s h o o tr e g e n e r a t i o nf r o me x p l a n t so fw s ( w a s s i l e w s k i j a ，w s ) e e o t y p ei sm o r ee f f i c i e n t , m o r en o r m a lt h a nt h a tf r o m e x p l a n t so fc o l ( c o l u m b i a ，c 0 1 ) e c o t y p e 4 ) d i f f e r e n to r g a nr e s o u r c e sh a v el i t t l ei n f l u e n c eo nt h ef r e q u e n c yo fs h o o t r e g e n e r a t i o n ，b u tt h en u m b e ro fr e g e n e r a t i o ns h o o ti ne a c hc a l l u sd e c r e a s ea b i tw i t hi n c r e a s e dc y t o k i m nc o n c e n t r a t i o n 5 ) s p e c i f i cm e d i u mi sn e c e s s a r yf o rs h o o tr e g e n e r a t i o n u n d e rt h es o m e 2 山东农业大学硕士学位论文 h o r m o n ei n d u c t i o n , c a u ia n ds h o o t sc a nn o tb ei n d u c e do nm sm e d i u m i n s t e a do fb 5m e d i u m ， k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；h o r m o n e s ；r o o t ；s h o o tr e g e n e r a t i o n ； 3 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 1 引言 1 1 植物器官离体再生的历史进程 植物的离体器官发生是指离体的组织或细胞在培养的条件下形成不 定芽、根和花芽等器官的过程( b o n g a e ta 1 ，1 9 8 8 ) ，这是植物再生完整植 株的最主要的方式之一。它不仅广泛应用于植物的无性繁殖方面，而且是 植物遗传改良的前提和基础。许多生物技术，如细胞融合培养体细胞杂种、 利用花粉和胚乳获得单倍体或多倍体植株和培育转基因植物等均需要进 行离体器官发生和植株再生。此外，离体器官发生还涉及到植物发育调控 机制等基础理论问题。因而它既是重要的实践问题又是重要的理论问题 ( 谷瑞升等，1 9 9 9 ) 。以再生的器官为划分标准，器官离体再生的研究大致 可分为诱导花芽的离体再生、根和芽的离体再生、花器官的离体再生和果 实的离体再生这四个阶段。 1 1 1 花芽的离体再生 离体条件下诱导器官的形成约在一个世纪前就获得成功。1 9 0 8 年， w i n k l e r 通过培养长叶蝴蝶草( t o r e n i aa s i a t i c al ) 的叶切段，观察到了花 芽从叶切段上的直接再生( w i n k l e r , 1 9 0 8 ) 。以后从烟草( n i c o t i a n at a b a c u m l ) ，紫雪花( p l u m b a g oi n d i c al ) 和蓝猪耳( t o r e n i a f o u m i e r il i n d e n ) 等 植物材料上相继观察到了花芽的直接形成。由于受当时的条件所限，克隆 花芽的成功并没有被用来对花的发育进行深入的研究。直到1 9 7 3 年烟草 的薄层培养成功的诱导了花芽的直接再生，情况才有了变化。t r a nt h a n v a n 通过调节培养基中碳源和激素浓度的变化，对烟草花梗进行了纵向薄 层细胞培养，成功诱导出无序愈伤组织，或是直接产生花、芽或根( t r a n t h a n hv a n , 1 9 7 3 ) 。由于此种方法重复性好，因此在之后的很长一段时期 里，花芽的直接再生被作为一种离体的实验系统，广泛应用于生殖生理的 研究( t i b u r c i oe ta 1 ，19 8 8 ；k a u r - s a w j n e ye ta 1 ，19 8 8 ；李文安等，19 8 9 ；章美 云和韩碧文，1 9 9 2 ) 。 山东农业大学硕士学位论文 1 1 2 根和芽的离体再生 2 0 世纪3 0 5 0 年代，根和营养芽等营养器官的直接再生在许多植物中 获得了成功。这一时期，w h i t e ( 1 9 4 3 ) 通过培养番茄的根尖，获得了根 尖的大量离体再生；s k o o g 和t s u i ( 1 9 4 8 ) 则诱导了营养芽的直接形成。 而利用拟南芥根为外植体在高浓度生长素的条件下( c a l l u si n d u c em e d i u m , c m ) 进行预培养。四天后，转移到高浓度细胞分裂素的条件下( s h o o t i n d u c em e d i u m ，s m ) 继续培养直至分化出营养芽( 图1 1 ) ( v a l v e k e n se ta 1 ， 1 9 8 8 ) 。 a r a b e d l d l l o n p g s 拳i 薯宝s 出l n g 拳； 量 莓竺l 一够， r o o j t s h o o t s e x p l a n t s tt t 营置 誊 曼量茎“ti 图1 - 1 两步法诱导拟南芥苗离体再生模式图 f i g 1 - 1s h o o tr e g e n e r a t i o np r o c e s so f a r a b i d o p s i s 1 1 3 花器官的离体再生 从2 0 世纪7 0 年代初开始，克隆器官的研究进入了克隆花器官的时代。 1 9 9 4 年，h i c k s 和m c h u g h e n 在烟草胎座组织的培养中成功地克隆了柱头 和心皮状结构( h i c k sa n dm c h u g h e n , 1 9 9 4 ) 。1 9 8 4 年，m a t s u z a k i 在烟草 ( n i c o t i a n at a b a c u ml ) 花柱的培养中克隆了大量的花柱( m a t s u z a k i ， 1 9 8 8 ) 。陆文棵等人通过风信子( h y a c i n t h u so r i e n t a l i sl ) 和水仙( n a r c i s s u s 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 t a z e t t al ) 花被的培养成功地克隆了花被片、雄蕊和胚珠( l ue ta 1 ，1 9 8 8 ； l u ，1 9 9 0 ) 等花器官。1 9 9 2 年，人们以小麦( t r i t i c u ms a t i v u ml ) 稃片和 颖片为外植体首次成功地克隆了小穗( 陆文棵，1 9 9 2 ) 。 2 0 世纪9 0 年代初，花序的克隆也获得成功。花序的克隆分2 种情况： 一种是通过苗端的培养使顶端分生组织直接分化花序。这在玉米中获得了 成功( z h o n ge ta 1 ，1 9 9 2 ；李学红和张举仁，1 9 9 9 ) 。另一种情况是通过诱导 外植体形成愈伤组织，然后再诱导愈伤组织直接分化花序，在花叶千年木 ( d r a c a e n a f r a g r a n sc v m a s s a n g e a n ah o r t ) 获得了成功( 陆文襟，2 0 0 2 ) 。 在克隆花序的同时，花序分枝的克隆也获的了成功( 陆文棵，2 0 0 3 ) 。在 模式植物拟南芥中成功诱导花序的离体再生( g u a ne ta 1 ，2 0 0 6 ) ，为深入 研究离体器官发生的分子机理提供了重要实验系统。 1 1 4 果实的离体再生 随着花器官的成功克隆，果实的离体再生也在多种植物中取得成功。 在人参( p a n a xg i n s e n gc a m e y ) 和番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) 中成功获得其再生果实( 陆文棵和梁斌，1 9 9 4 ) 。陆文棵和梁斌( 1 9 9 4 ) 通过番茄幼子房和幼果的培养获得了大量番茄无籽果实，它们在培养基上 可以发育成熟，味道与自然情况下的完全相同( 陆文棵和梁斌，1 9 9 4 ) 。 1 2 外植体对离体器官再生的影响 迄今为止，被子植物中包括营养器官和生殖器官在内的几乎所有的器 官均可以在离体条件下得到再生。植物离体器官再生过程中，外植体对离 体器官的再生有很大影响，主要体现在外植体的大小、年龄及其自身的遗 传背景等方面。 1 2 1 外植体大小对离体器官再生的影响 外植体的大小能够影响离体器官再生。愈伤组织最早来自于外植体的 切口处，外植体越小，产生的愈伤相对面积就越大。当然过小的外植体均 不能很好的存活，也不利于愈伤的产生。外植体过大则存在不易控制及容 6 山东农业人学硕上学位论文 易污染等问韪。1 9 7 9 年，d a v i e s 和d a l e 以澳洲茄( s o l a n u r nl a c i n i a t u m ) 的叶片为外植体，发现外植体直径小于2 m m 和直径为5 m m 时，其能够 存活的外植体再生苗的数目一致但是直径小于2 m m 的外植体的死亡率 很高。外植体直径为1 0r n m 时，其脱分外在分化的形态特征及分化芽点 数与直径为5m m 的外植体的分化结果相似，但是直径1 01 1 1 1 1 3 的外植体在 培养过程中，容易卷曲且脱离培养基，不利于操作( d a v i e sa n d d a l e ，1 9 7 9 ) 。 以b r q s s i c om o n n j e r i 茎的节间为外植体，当其长度从1m m 增长至4m m 时，分化苗的比例以及每块愈伤分化芽点的数目均随之增长( t h a k u ra n d g a n a p a t h y 1 9 7 8 ) 。以a l b i z i ar i c h a r d i a n a 的下胚轴为外植体，长度为1m m 时产生丈量的愈伤组织，而苗端只有在外植体达到1 0m m 时才产生( t o m a r a n dg u p t a , 1 9 8 8 ) 。 122 外植体极性对离体器官再生的影响 外植体的极性也会影响离体器官再生。当b r “5m a l u s 的子叶被切成 两部分( 图1 2 ) ，来自于近轴端的外植体比来自于远轴端的外植体再生苗 的能力强( b r o w n i n ge ta 1 1 9 8 7 ) 。外植体来源于幼嫩植株组织特别是 幼苗，通常对于离体培养的反应比较敏感，而来源于成熟组织的外植体则 不易完成脱分化和再分化过程。 o fa t t a c h m e n t r oe 帕r y o 圈1 - 2n r 船于n i 再生苗的檀性( b r o w n i n gc ta l 1 9 8 7 ) 。 f i gi - 2 t h ep o l m i l yo f a d v e n t i t i o u ss h o o t f o r m a t i o no n 丹r 时m a l u sc o t y l e d o np i e c e s ( b r o w n i n ge la 1 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 1 2 3 外植体分化时期对离体器官再生的影响 分离外植体的器官在植物个体发育中所处的分化时期对于离体器官 的再生尤其是再生器官的种类有着重要影响。分化时期越早，来源于这种 器官的外植体在培养时形成的细胞的再分化潜能越低，再生器官的种类越 少；反之再生器官的种类则越多。这表明外植体来源的器官在植株个体 发育中形成的时期决定了其细胞在离体培养中能够再生器官的种类( 陆文 梁，2 0 0 5 ) 。 1 2 4 外植体遗传背景对离体器官再生的影响 许多实验表明，影响离体器官再生的因素，除了培养条件及外源诱导 因素外，其自身遗传背景也是重要因素之一。基因型影响离体器官再生主 要是通过可确认的遗传因素，比如核基因( b u l l o c ke ta 1 ，1 9 8 2 ； f o r o u g h i w e h re ta 1 ，19 8 2 ；l a z a re ta 1 ，19 8 4 ；r h o d e se ta 1 ，19 8 6 ；s z a k e se t a 1 ，19 8 8 ；m a t h i a sa n df u k u i ，19 8 6 ；l a l le ta 1 ，2 0 0 4 ) ，细胞质基因( m a t h i a se t a 1 ，1 9 8 6 ；n a r a s i r n h u l ue ta 1 ，1 9 8 8 ；w - 觚e ta 1 ，1 9 8 8 ) 以及基因互作( k e y e s a n db i n g h a m ，1 9 7 9 ；w 如e ta 1 ，1 9 8 8 ) 等。 以拟南芥不同生态型，比如c o l ，l e t ( 1 a n d s b e r g , l e r ) ，c v i ( c a p e v e r d e , i s l a n d , c v i ) ，以及w s 的叶片和根为外植体进行离体培养，发现不管是再 生过程中的生长状态还是再生苗的频率均不同( c a n d e l ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。关 春梅等人在关于拟南芥花序轴离体再生系统的报道中提到，来自于w s 生 态型拟南芥植株的外植体诱导愈伤组织形成的频率最高，可达1 0 0 ，而 且愈伤组织生长状态良好；然而来自于c o l 生态型植株的外植体尽管可以 膨大，但形成的愈伤组织致密程度太高，无法分化出器官；来自l e r 生态 型植株的外植体形成愈伤组织的频率则最低( g u a ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 1 3 激素调控植物生长发育 植物激素是植物生长发育过程中产生的一种活性物质，其种类主要有 8 山东农业大学硕士学位论文 两大类，一种是植物自身合成的天然植物激素，主要有五大类：生长素、 细胞分裂素、赤霉素、乙烯和脱落酸。此外，新的天然激素还在继续发现， 如油菜素内脂、正十三烷醇、月光花素等。第二大类是人们仿照天然植物 激素的化学成分结构进行人工合成的植物激素，常见的有2 ，4 d 、萘乙酸、 6 b a 、矮壮素等。尽管激素在植物体内含量极低，但对植物的生长发育 起着重要的调节的作用。因此，近年来，人们对激素的作用机制，尤其是 生长素和细胞分裂素的信号转导、运输及其对器官再生开展了大量的研 究，有了进一步的认识。 1 3 1 生长素对植物生长发育的作用 生长素是一种与色氨酸有关的小分子。l a a ( i n d o l e 3 一a c e t i ca c i d ，吲 哚乙酸) 是植物中生长素最主要的形式。生长素在植物的生长和发育过程 中发挥重要的作用，这些作用包括生长素可刺激细胞增大和茎干生长、刺 激形成层及组织培养中( 与细胞分裂素一起) 的细胞分裂、刺激木质部和 韧皮部等维管组织的分化、刺激根的发生和分化、介导重力和光的向性反 应、维持顶端优势、延缓叶片衰老和果实成熟、抑制或刺激( 通过乙烯) 叶片和果实脱落、诱导座果与生长( 在某些果实中) 、增加同化活动向生 长素源分配、刺激化器官生长、促进雌雄异株花的雌性化、促进的凤梨科 植物的开花( 通过乙烯) ( d a v i e se ta 1 ，1 9 8 7 ；d a v i e se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。此外， 生长素还影响早期胚胎发育中的胚轴形成( w e i j e r se ta 1 ，2 0 0 5 ) ，影响原 基发育( h e i s l e re ta 1 ，2 0 0 5 ) ，以及协调植物的形态发生( b e r l e t he ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 近年来，通过对生长素信号转导的研究，人们对于生长素的作用机理 有了一定的认识。生长素反应受a u x 和a r f ( a 1 i nr e s p o n s e f a c t o r ) 两大蛋白质家族调控。此外，泛素介导的蛋白质降解途径也在 生长素反应中发挥作用。 代表性的a u x i a a 融合蛋白定位于细胞核( a b e l e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。现已 鉴定的a u x i a a 基因有i a a 3 s h y 2 ( 删th y p o c o t y lzs h y 2 ) 、 l 憎6 s h y l ( 、s h o r th y p o c o t y l1 s h y l ) 、i a a 7 厶仪r 2 、王a a l2 愿d l ( b o d e n l o s 、b d l 、) 、i a a l 4 s l r ( s o l _ l ，l a r y r o o t , s l r ) 、l t a l 7 九t x r 3 、 9 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 1 a a l 8 ，洲j 9 m s g 2 、i a a 2 8 等1 3 个( r o u s ee ta 1 ，1 9 9 8 ；t i a na n dr e e d ，1 9 9 9 ； n a g p a le ta 1 ，2 0 0 0 ；r e e de ta 1 ，2 0 01 ；r o g ge ta 1 ，2 0 01 ；f u k a k ie ta 1 ，2 0 0 2 ； h a m a n ne ta 1 ，2 0 0 2 ；b e r l e t he ta 1 ，2 0 0 4 ；t a t e m a t s ue ta 1 ，2 0 0 4 ) ，分别影响植 物不同的组织和发育反应如根或芽的向地性、侧根形成、顶端优势、茎伸 长、叶增大及暗中叶形成等。a u x i a a 蛋白质是种短命的核蛋白，但 其作为转录调节因子却并不与d n a 直接作用，而是通过另外一组蛋白质 a r f 蛋白质进行的( l e y s e r e ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 遗传学分析表明，a r f 在不同生长过程中发挥作用，如胚胎发生 l 4 r f s m e ( m o n p t e r o s ,m e ) ， a 尼w7 、根发育 ( 、a r f 7 ，n p h 4 ，r i r 5 ，m s g l 、a r f i o 、a r f l 6 、a r f l 9 、) 、前咬痛( a r f l 、 a r f 2 、a r f 3 e 删、a r f 6 ，a r f 8 ) 、和老化( a r f 2 ) ( t i w a r ie ta 1 ，2 0 0 3 ； o k u s h i m ae ta 1 ，2 0 0 5 ；e l l i se ta 1 ，2 0 0 5 ；h a r d 墩ee ta 1 ，2 0 0 4 ；m a l l o r ye ta 1 ， 2 0 0 5 ；n a g p a le ta 1 ，2 0 0 5 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ，w i l m o t he ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 生长素在茎端的分生组织区合成，并向根尖方向运输。通过在根皮层 和表皮组织再定向而产生向基的( 即远离器官端的) 生长素浓度梯度。对 生长素的测定表明，在正发育的幼叶和根中有额外的生长素合成。但不论 是在茎尖分生组织和幼叶中，还是在根中，生长素均以相似的机制进行运 输。生长素的极性运输为诸如维管分化、顶端优势、器官发育和向性生长 等发育过程提供必须的方向和位置信息。通过基因突变或生长素运输抑制 剂处理破坏生长素定向运动，可导致植物产生严重的发育缺陷( b l a k e s l e e e ta 1 ，2 0 0 5 ；f r i m l ，2 0 0 3 ) 。 1 3 2 细胞分裂素对植物生长发育的作用 细胞分裂素最初是m i l l e r 等人在鲱鱼精子d n a 热压水解产物中发现 了一种可以促进植物细胞分裂与分化的物质，将其命名为激动素( m i l l e re t a 1 。1 9 5 5 ) 。随后，一些有着相同生理活性的、具有腺嘌呤环结构物质也陆 续被发现，因而被统称为细胞分裂素。最初，人们利用细胞分裂素促进组 织培养中细胞的增持和生长( f e m a n d oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。随后，发现细胞分裂 素在植物生长和发育的很多过程起到重要作用，包括种子萌发、维管束发 育、细胞增殖、顶端优势和叶的衰老等( v i o l1 9 9 4 ；m o ka n dm o l2 0 0 1 ) 。 1 0 山东农业大学硕士学位论文 内源低水平细胞分裂素能够引起多重发育过程中的变化，包括延迟叶的起 始和扩张，延迟开花时间，增加不育，促进根的生长( w e m e re ta 1 ，2 0 0 6 ； w e n 埘吼a 1 ，2 0 0 3 ) 。相反，如果通过异位表达细胞分裂素生物合成基因 口r ( 五如p e m 砚t r a n s f e r a s e , 1 1 f ) 增加内源细胞分裂素则能够降低 顶端优势，抑制根的发育，改变叶形以及增强组织培养中苗端的再生( s a e ta 1 ，2 0 0 1 ；l ie ta 1 ，1 9 9 2 ) 。虽然细胞分裂素对植物生长发育起着极为重要 的作用，但是直到近十余年来，人们利用对模式植物拟南芥深入研究了细 胞分裂素的合成，转运及信号转导，细胞分裂素调控植物发育的机理才得 以揭示。 植物响应细胞分裂素的信号转导模型类似于细菌感受响应外界环境 刺激的双元组分系统( d a g o s t m oe ta 1 ，2 0 0 0 ；s a k a ie ta 1 ，2 0 0 1 ；m a s o ne t a 1 ，2 0 0 5 ) 。三个组氨酸激酶，a h k 2 ( a r a b i d o p s i sh i s t i d i n ek i n a s e 2 ，a h k 2 ) ，a h k 3 和a h k 4 c r e l 作为跨膜细胞分裂素受体( h o u ee ta 1 ， 2 0 0 1 ；h w a n ga n ds h e e n ，2 0 0 1 ；f e r r e i r aa n dk i e b e r ，2 0 0 5 ；斑e n e re ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。与细胞分裂素结合后，组氨酸激酶自磷酸化，并将磷酸基团从激 酶区的组氨酸转移到信号接收区的天冬氨酸，然后再传递到胞质中的磷酸 转运蛋白( a r a b i d o p s i sh i s t i d i n e p h o s p h o t r a n s f e r p r o t e i n s ， 触伸s ) ，磷酸化的a h p $ 进入细胞核并将磷酸基团转移到a 型和b 型反 应调节因子( a r a b i d o p s i sr e s p o n s er e g u l a t o r s ，a r r s ) 上，进 而调节下游的细胞分裂素反应。b 型a r r 是一类转录因子( h w a n g 锄d s h e e n ，2 0 0 1 ；s a k a ie t 甜，2 0 0 1 ；m a s o ne ta j ，2 0 0 5 ) ，作为细胞分裂素的正调 控因子起作用，可激活a 型a r r 基因的转录( h w a n ga n ds h e e n ，2 0 0 1 ；t o e ta 1 。2 0 0 4 ) 。a 型a r r 作为细胞分裂素的负调控因子可以抑制b 型a r r 的活性( f e r r e i ma n dk i e b e r ，2 0 0 5 ；t o e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，形成了一个负反馈循环， 从而控制下游响应事件( 图1 3 ) 。对拟南芥细胞分裂素信号转导途径相关 基因的单突变体和多突变体分析表明这些基因虽然具有重叠性，但是在植 物发育和生理过程中分别起着不同的作用。 细胞分裂素能够保持根的分生组织。在拟南芥中，根中的干细胞包围 着- d , 群被称为静止中心( q u m c e n tc e n t e r , q c ) 的细胞，组成一个 依赖兕刀( 脚t h o r aj ，咒刀) ，p l t 2 ，s c r ( 双r e c r o 形s c r ) ，s h r 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 。( j s 胃石啵t r o o t , s h r ) 等基因( s a b a t i i l ie ta 1 ，2 0 0 3 ；a i d ae ta 1 ，2 0 0 4 ； s c h e r e s ，2 0 0 7 ) 的干细胞小环境( s t e mc e l ln i c 脏，s t n ) 。干细胞能 够产生并转变为扩增细胞，从而形成分裂区( n 也d i v i s i o nz o n e ，d z ) 和成熟区( t h ee l o n g a t i o n d i f f e 砌三n t i a t i o nz o n e ，e d z ) ( d o l a n e ta 1 ，1 9 9 3 ) ，以及位于其之间的转变区( n 也t r a n s i t i o nz o n e ，t z ) ， ( 图l - 4 ) 。最近研究表明，细胞分裂素能够在根分生组织t z 诱导细胞分 化。因为a h k 3 a r r l ；a r r l 2 双元细胞分裂素信号转导途径，能够调节 特别是t z 细胞分化速率，进而控制根分生组织大小和根的生长，从而揭 示了细胞分裂素在根的分生组织保持过程中的分子机制( d e l l oe ta 1 ， 2 0 0 7 ) 。 祸酾酾= 百葡蒂黼 图i 3 细胞分裂素信号转导模式( j e n n i f e ra n dj o s e p h , 2 0 0 8 ) f i g 1 - 3m o d e lo f c y t o k i n i ns i g n a l i n g ( j e n n i f e ra n dj o s e p h ，2 0 0 8 ) 相对于细胞分裂素对与保持根分生组织具有负调控作用，高浓度细胞 分裂素则对与维持苗端是必要的( s h a n ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。研究表明，具有保 1 2 持细胞分裂而又防止细胞分化的基因s h o o tm e r l s t e m l e s s ( s t m ) ( w i l l i a m sa n df l e t c h e r , 2 0 0 5 ) 能够激活一个重要的细胞分裂素合成基因 m i p l 7t a t p ，a d p 1 s o p e n t e n y l t r a n s f e r a s e 7 a t i p t 7 ) t s h a f te ta 1 2 0 0 6 ；j a s i n s k ie ta 1 2 0 0 5 ：y 翻a ie ta 1 2 0 0 5 ：s a k a m o t oe ta l ，2 0 0 6 ) 。此外， 胚胎发生过程中干细胞命运的正调节因子w u s 能够直接抑制a 型a r r s ( s h a n ie ta l ，2 0 0 6 ；l e i b f t i e de ta l ，2 0 0 5 ) 。 b s t n 删_ 一夕。斧 图l 细胞分裂索调控根的发育的基因网络。 a 根尖组织的模式圈；b 细胞分裂寨调控根的发育造径。 f i g1 - 4 c y t o k i n i nc o n t r o l l o o td e v e l o p m e n t s t r u c t u r eo f t h er o o t m e r i s t e m ；bt h er e g u l s t o r yn e t w o r kc o n t r o l l i n g t o o l m e r i s t e md e v e l o p m e n t 4 激素在离体器官再生过程的作用 r 、 人卜 毛j 洲 激素调控拟南芥离体苗再生的研究 外施激素作为再生的一个重要的外因，越来越为人们所关注。近年来， 人们分别对离体培养的植物组织对生长调节物质的吸收和代谢，生长素和 细胞分裂素的互作对离体器官再生的作用机制以及内源外源激素互作对 离体器官再生的作用机制等方面进行了深入的研究。 1 4 1 激素的吸收和代谢 生长调控因子进入外植体，通过细胞和组织可能会产生梯度分布。以 番茄子叶为外植体进行离体培养的实验证明了靠近培养基的表皮和表皮 下的细胞经诱导发生凋亡改变时，细胞分裂素和生长素是通过两种途径从 培养基运输到外植体进入细胞的( w a n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) 。一种途径是质外体 途径，即激素通过细胞间隙进行传输；另一条途径则通过共质体途经，即 激素进入并通过细胞进行信号传递，在此过程中通过信号转导机制起作 用。 利用h p l c 分离和e l i s a 定量定性相结合技术分析了离体培养的植 物组织对生长调节物质的吸收和代谢的特点。结果显示，外源细胞分裂素 可以为外植体直接吸收，并在体内进行修饰和转化，形成了多种分子形式 共存的状态。其中有活化形式，也有贮藏和运输形式。活化与钝化分子间 的转化和存在的平衡调节着细胞的分裂和形态发生( c h r i s t i n ee ta 1 ， 1 9 9 1 ) 。在烟草培养中发现，外源b a 可以很快被外植体吸收，其中一部分 迅速转化为核苷、核糖核苷，尤其是葡糖苷的形式( b a r e n d s ee ta 1 ，19 8 7 ) 。 在烟草细胞培养中也发现，施用的玉米素、二氢玉米素以及其它自由碱基 形式的玉米素的大部分在细胞内很快被转化成为各自的核糖核苷 ( c h r i s t i n ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。分析表明，在离体培养的植物组织中存在着多种 形式的细胞分裂素，如呋喃甲基腺嘌呤( k e a t i n , k t ) 、n 6 一异戊烯腺嘌 呤( z t ) 、n 6 ( 2 异戊烯基) 腺嘌呤( i p ) 、二氢玉米素 ( d i i - i ) z 、9 一d 核 糖呋喃基玉米素【( 9 r ) z 】等等。通常认为细胞分裂素自由碱基形式是活性 形式，而其核糖核苷形式是其运输或贮藏形式( c h r i s t i n ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。外 源细胞分裂素进入组织后，其中一部分很快被转化成核糖核苷，成为钝化 形式。l e t h a m 和p a l n i 认为7 和9 糖苷的形成以及通过细胞分裂素氧化酶 对侧链的剪切可能是存在于植物组织中降低细胞分裂素活性的两种主要 1 4 山东农业大学硕士学位论文 机制( l e t h a ma n dp a l n i ，1 9 8 3 ) 。在烟草细胞培养中，使用二氢玉米素较玉 米素在诱导细胞形成花芽上更为有效( c h r i s t i n ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。这可能与二 氢玉米素核糖核苷不是细胞分裂素氧化酶的底物有关。因而细胞分裂素的 核糖核苷形式与自由碱基形式相互转变中的酶学控制机制在保持植物细 胞中有足够的活性细胞分裂素方面可能发挥着重要作用。 吲哚类生长素和n a a 等生长调节物质均可进入植物体内发挥作用。 然而植物体内存在的生长素主要是i a a ( c h r i s t i n ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。在对烟草 花枝外植体诱导花芽的培养中发现，外源施用l 认可以迅速提高内源i 从 水平，一天后即可达到最高峰，然后迅速下降。施用n a a 也表现出相同结 果。l 认、n a a 等生长素类物质水平在体内达到高峰后下降，与其在体内 氧化分解有关( c h r i s t i n ee ta 1 ，1 9 9 1 ；w e m i e k ea n dm i l k o v i t s ，1 9 8 7 ) 。然而 在其它研究中证实：施用n