（分析化学专业论文）环境雌激素的免疫分析研究(1).pdf

聊城大学硕士学位论文 摘要 环境雌激素在环境类激素中占有很大比例，主要指那些进入动物或人体后，能对机 体内正常内分泌物质的合成、释放、运转、代谢以及结合等产生干扰，激活或抑制内分 泌系统功能，从而破坏其维持机体稳定性和调控作用的外源性化合物。雌激素作为非常 重要的内源性激素，具有较强的生理作用和临床应用价值。雌激素的主要作用是刺激女 性生殖组织细胞进行有丝分裂，该作用是评价物质是否具有雌激素作用的标准。天然雌 激素主要有雌二醇( e s t r a d i o l ，e 2 ) 、雌酮( e s t r o n e ，e 1 ) 和雌三醇( e s t r i o l ，e 3 ) ，他们是 人和动物体内天然存在的雌激素，其中雌二醇的雌激素作用最强，雌三醇的作用最弱。 雌二醇( e 2 ) 对促进和调节女性副性器官的发育和第二性征的形成，对蛋白质、糖、脂 类、水、电解质及钙和磷的代谢有重要影响。临床上，雌二醇的长期监测可用于研究与 激素相关的致癌物作用机理。雌三醇的含量变化是反映胎儿胎盘功能的重要依据。例如 唐氏综合症的诊断就是以孕妇尿样中e 3 的含量为主要依据。因此研究其监测方法，己成 为国际上环境化学和分析化学的热门话题。 由于免疫分析的高特异性和操作简便、方便、经济，近年来在环境雌激素分析检测 中的研究成为了研究的热点。本文从完全抗原的制各，免疫动物产生抗体，建立免疫分 析方法为主展开工作，对雌二醇、雌三醇环境雌激素进行了分析方法研究，将高灵敏的 化学发光分析，电化学分析和高特异性的免疫反应结合起来，引入了生物素一亲合素的放 大作用，建立雌二醇、雌三醇的免疫分析新方法。为推动分析化学的理论和发展新型的 环境监测方法及扩大生物技术的应用，具有重要的理论和现实意义。 全文主要分为以下几个部分： 一、 完全抗原的合成与抗体的制备 雌二醇和雌三醇都是半抗原小分子，不具有免疫原性，与载体蛋白偶联，必须通过 “化学桥”连接。本文参考文献合成了雌二醇和雌三醇的完全抗原，并用于免疫健康的 家兔，制备了可用于免疫分析的抗体。 l 聊城大学硕士学位论文 二、甲基红- h 2 0 2 i - i r p 伏安酶联免疫分析法测定t t r p 及其标记物 提出了一种新的辣根过氧化物酶的底物甲基红，它本身具有电化学活性，能够在静 汞电极上发生还原反应，产生灵敏的伏安电流信号。以h 2 0 2 为氧化剂，h 】姆能催化氧化 还原反应的发生，使甲基红被氧化分解，其平衡浓度降低，对应的还原峰电流降低，峰 电流的降低值与h r p 的浓度在5 0 1 0 8 5 0 x 1 0 7e c m l 之间呈线性关系，对2 0 1 0 。g m l h r p 进行1 1 次测定的相对标准偏差为4 6 ，方法的检出限为1 8 1 0 一g m l 。应用于 i g g h r p 和a v i d i n h r p 的测定。 三、以甲基红作底物的电化学酶联免疫法测定雌三醇 应用这种新的辣根过氧化物酶的底物一甲基红，建立了甲基红h 2 0 2 一h r p 电化学 免疫分析新体系，并应用于雌三醇的测定。测定雌三醇的线性范围为1 0 1 0 0 0 0 n g m l ，检出限为0 3 3n g m l 。应用于水样和血清中雌三醇的测定，结果满意。 四、生物素亲合素放大系统伏安酶联免疫法测定环境水中1 7 p - 雌二醇 将生物素一亲合素放大系统引入酶免疫分析中，建立了一种测定雌二醇的电化学 酶免疫分析新方法。在这个体系中，生物素化的抗e 2 抗体和辣根过氧化物酶标记的 亲合素作为探针。标记酶的活性用以邻苯二胺为底物的电化学方法来检测。酶反应 的产物2 ，3 一氨基吩嗪，在静汞电极上有极高的灵敏度。用非竞争酶联免疫模式，用 e 2 卵清蛋白完全抗原来进行包被，电化学检测雌二醇的检测限为2 1 0p g m l ，测定 雌二醇的线性范围为5 0 0 5 0 0 0p g m l 。应用于河水中雌二醇的测定，结果满意。 五、利用免疫吸附柱流动注射化学发光法测定1 7 p 一雌二醇 采用固相免疫模式，一个固定有雌二醇卵清白蛋白完全抗原的免疫吸附柱引入到流 动系统中用来捕获雌二醇和h r p 标记的抗一e 2 抗体离线温育后没有被结合的h r p 标记的 抗e 2 抗体。被捕获的h r p 标记的抗一e 2 抗体通过注入鲁米诺一h 2 0 2 p i p 的底物来产生增强 2 聊城大学硕士学位论文 化学发光信号，建立了新的流动注射增强化学发光免疫分析方法测定1 7 1 3 雌二醇。方法 的检测限为3 0n g m l ，检测e 2 的线性范围为1 0 0 1 0 0 0 0n g m l ，相关系数为0 9 9 6 。离 线温育的反应过程为3 0r a i n ，随后一个样品的进样时间和化学发光检测时间为4 0 0s 。该 方法应用于血清中e 2 一生物素的测定，结果满意。 六、流动注射化学发光非竞争酶免疫分析法测定雌三醇 建立了一种新的流动注射增强化学发光免疫分析方法，用于测定雌三醇。采用非竞 争免疫模式，一个固定有雌三醇一卵清白蛋白完全抗原的免疫吸附柱插入到流动注射的流 路中用来捕获雌三醇和h r p 标记的抗e 3 抗体离线温育后没有被结合的h r p 标记的抗一e 3 抗体。被捕获的h r p 标记物抗体通过注入化学发光底物来产生增强化学发光信号。该方 法测定雌三醇的线性范围为1 0 0 4 0 0 0n g m l ，相关系数为0 9 9 7 ，检测限为5 0n m l 。 离线温育的反应时间为3 0m i n ，一个样品的进样时间和化学发光检测时间为4 0 0s 。该方 法利用酶联免疫分析法测定孕血清中的雌三醇，结果满意。 关键词：雌激素，免疫分析，化学发光免疫分析，酶免疫分析，雌二醇， 雌三醇，生物素一亲合素，伏安酶联免疫分析，吸附柱 3 聊城大学硕士学位论文 a b s t r a c t e s t r o g e ni sa ni m p o r t a n te n v i r o n m e n t a lc o n t a m i n a t i o n - e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ， w h e ni te n t e r st h eb o d i e so fa n i m a l sa n dh u m a n ，i tc a np r o d u c ei n t e r f e r e n t i a la c t i o nt o t h e n a t u r a ls y n t h e s i z e ，r e l e a s e ，n m n i n g ，m e t a b o l i z ea n dc o m b i n eo fi n t e m a ls e c r e t i o ns u b s t a n c e ， c o n s e q u e n t l yi td e s t r o y sr e g u l a t ea c t i o no ft h e i n c r e t i o ns y s t e m e s t r o g e ni sa ni m p o r t a n t i n t r i n s i ch o r m o n e i th a ss t r o n gp h y s i c a la c t i o na n dc l i n i c a l a p p l i c a t i o nv a l u e t h en a t u r a l e s t r o g e nm a i n l yi n c l u d e se s t r a d i o l ，e s t r o n ea n de s t r i 0 1 t h e ya r ec r u d ee s t r o g e ni nt h eb o d yo f h u m a na n dw i l d l i f e ，i nw h i c he s t r a d i o lh a st h eg r e a t e s te s t r o g e n i ca c t i v i t y , a n de s t r i o lh a st h e w e a k e s te s t r o g e n i ca c t i v i t y s i n c e17 1 3 一e s t r a d i o la n de s t r i o lh a v et h eg r e a t e s ta n dt h ew e a k e s t e s t r o g e n i ca c t i v i t ya n ds e e mt oh a v e b e e nd i s c h a r g e di n t ot h ee n v i r o n m e n ti nl a r g eq u a n t i t i e s ， t h e s ec h e m i c a l sh a v eb e e nm o n i t o r e di na ne n d o c r i n ed i s r u p t o rs u r v e y t h ec o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fe s t r a d i o la n de s t r i o la r et i m ec o n s u m i n g ，l o ws e n s i t i v i t y a n d r e q u i r el o n gp r e p a r a t i o ns t e p sa sw e l la ss u i t a b l ev o l a t i l ed e d v a t i v e s s oi ti si m p o r t a n tt o e s t a b l i s has e n s i t i v e ，r a p i d ，a u t o m a t i cm e t h o df o r t h ed e t e c t i o no fe 2a n de 3i nt h e e n v i r o n m e n t r e c e n t l y , t h es t u d yo fe s t r o g e n si ne n v i r o n m e n th a sb e e nag r o w i n gi n t e r e s td u et ot h e l l i g hs e n s i t i v i t y , e a s ei na u t o m a t i o n ，a n dr a p i ds p e e do fi m m u n o a s s a y t h i sw o r kc o n s i s t so f h a p t e ns y n t h e s i sa n dp r e p a r a t i o no fp r o t e i n - h a p t e nc o n j u g a t e ，t h ep r e p a r a t i o no ft h ep o l y c l o n a l a n t i b o d y as e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a le n z y m ei m m u n o a s s a ys y s t e ma n dan e wa p p r o a c ho f f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n ti m m u n o a s s a yw e r e d e v e l o p e da n da p p l i e dt od e t e r m i n e e s t r a d i o la n de s t r i o li ne n v i r o n m e n t a l i th a si m p o r t a n ta c a d e m i ca n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c et o i m p e lt h ed e v e l o p m e n to ft h ed e t e c t i o no fe n v i r o n m e n t a le s t r o g e n s t h i sp r e s e n tt h e s i sc o n s i s t so fs i xp a r t sa sf o l l o w s ： 1 h a p t e ns y n t h e s i sa n dp r e p a r a t i o no fp r o t e i n - h a p t e nc o n j u g a t e t h ei i d a t i u n es y s t e md o e sn o tr e c o g n i z er e l a t i v e l ys m a l lm o l e c u l e s ，s ow eh a v et ou s ea t r i c kt op r o d u c ea n t i b o d yw i t hb i n d i n gs i t e st h a ta r es p e c i f i cf o re s t r a d i o la n d e s t r i 0 1 e 2a n de 3 5 聊城大学硕士学位论文 a r es m a l lh a p t e n s t oi n c r e a s et h e i ri m m u n o g e n i c i t y , e 2a n de 3w e r el i n k e dt ob s a s i n c et h e y d on o th a v ea n yu s u a lc o n j u g a t i o ng r o u p ss u c ha sc a r b o x y lo ra m i n og r o u p s ，at w o - s t e p s t r a t e g yw a su s e dt ol i n kt h i sm o l e c u l et ob s a t h ea n t i b o d yw a sr a b b i tp o l y c l o n a la n t i b o d y ； i tw a sp r e p a r e db yi m m u n i z a t i o nw i t he 2 - - 3 - c m o b s ao re 3 3 c m o - b s aa n dp u r i f i e db ya m o d i f i e dc a p r y l i ca c i d s a t u r a t e da m m o n i u ms u l f a t em e t h o d 2 m e t h y lr e d - h 2 4 3 2 - h r pv o l t a m m e t r i ce n z y m e - l i n k e di m m u n o a s s a ys y s t e mf o rt h e d e t e r m i n a t i o no f 腿pa n dl a b e l so f 腿p t h ev o l t a m m e t r i cb e h a v i o u ro fm e t h y lr e d ( i nb r i t o n - r o b i n s o nb u f f e rs o l u t i o n0 h ， 4 3 5 ) h a sb e e ns t u d i e di n t h i sp a p e r an e we l e c t r o c h e m i c a ls u b s t r a t ef o rh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e m ri se s t a b l i s h e db a s e do nt h eh r pc a t a l y z e dr e d o xr e a c t i o no fm r a n dh 2 0 2 t h ea d d i t i o no fh r pc a l lg r e a t l yi n c r e a s e dt h eo x i d a t i o nr e a c t i o np r o c e s s e s a f t e rt h ea d d i t i o n o f 吣t h ed e c r e a s eo ft h ep e a kc u r r e n to fm ri si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fh r p o t h el i n e a rr a n g ef o rd e t e r m i n a t i o no f h r pi s5 0 x 1 0 - 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e s t r a d i o li ne v i r o n m e n t a lw a t e rb yv o l t a m m e t r i ce n z y m e i m m u n o a s s a y w i t hb i o t i n - a v i d i na m p l i f i c a t i o ns y s t e m a s i m p l e ，s e n s i t i v ee l e c t r o c h e m i c a le n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) f o rt h e d e t e r m i n a t i o no f17 1 3 - e s t r a d i o l ( e 2 ) w a sp r o p o s e di n t h i sp a p e r t h ec o m p l e xo fb i o t i n y l a t e d a n t i - e 2a n t i b o d ya n dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e l a b e l e da v i d i n0 - r a p a v i d i n ) w e r er e g a r d e da sa p r o b ei nt h i ss y s t e m t h ea c t i v i t yo fl a b e l e de n z y m ew a sm e a s u r e d 诵t he l e c t r o c h e m i c a l m e t h o d s u s i n go - p h e n y l e n e d i a m i n e a ss u b s t r a t e t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n p r o d u c ti s 2 , 3 一d i a m i n o p h e n a z i n e ，w h i c hc a nb ee a s i l yr e d u c e do nt h eh a n g i n gm e r c u r ye l e c t r o d ew i t h i m p r o v e ds e n s i t i v i t y c o u p l e dw i t ht h ep l a t ec o a t e da n t i g e ni n d i r e c te l i s af o r m a tu s i n g e 2 。o v a l b u m i n , t h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o nw a sp e r f o r m e df o re 2w i t ht h ed e t e c t i o nl i m i to f 21p e g m l ，a n dt h el i n e a rr a n g eo fd e t e r m i n a t i o no fe 2w a s5 0 0 5 0 0 0p g m l t h ep r o p o s e d m e t h o dh a sb e e nu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f e 2i nf i v e rw a t e rw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 5 f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c e i m m u n o a s s a yf o r1 7 1 - 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1 0 0 0 0 n e g r n lw i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to f0 9 9 6 t h e s a m p l i n ga n d c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nt i m ef o ro n es a m p l ew a s4 0 0sa f t e ra p r e i n c u b a t i o np r o c e d u r e o f3 0m i n s e r u ms a m p l e sd e t e c t e db yt h i sm e t h o dw e r ei ng o o da g r e e m e mw i t ht h er e s u l t s o b t a i n e db ye i a 、耐me 2 b i o t i n 7 聊城大学硕士学位论文 6 h o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fe s t r i o iw i t h n o n c o m p e t i t i v ee n z y m el m m u n o a s s a y an o v e la p p r o a c ho f f l o wi n j e c t i o nc h e m i l u m i n e s c e n ti m m u n o a s s a yw i t he n h a n c e m e n tt o d e t e c te s t r i o lw a sd e v e l o p e d b a s e do nn o n c o m p e t i t i v ei m m u n o a s s a yf o r m a t s ，ac o n j u g a t e d e s t r i o l - o v a l b u m i ni m m o b i l i z e di m m u n o a f f m i t yc o l u m ni n s e r t e di nt h ef l o ws y s t e mw a su s e d t o t r a p t h eu n b o u n dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) - l a b e l e da n t i b o d ya f t e ra l lo f f - l i n e i n c u b a t i o no fe s t r i o la n dh r p - - l a b e l e da n t i - - e s t r i o la n t i b o d y t h e 仃a p p e de n z y m ec o n j u g a t e w a sd e t e c t e db yi n j e c t i n gc h e m i l u m i n e s c e n c es u b s t r a t e st op r o d u c ea ne n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e t h el i n e a rr a n g ef o rd e t e r m i n a t i o no fe s t r i o lw a s10 0 4 0 0 0n g m lw i t h ac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to fo 9 9 7a n dad e t e c t i o nl i m i to f5 0n g n m t h es a m p l i n ga n d c h e m i l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o nt i m ef o ro n es a m p l ew a s4 0 0sa f t e rap r e i n c u b a t i o np r o c e d u r e o f 3 0m i n p r e g n a n c ys e r u ms a m p l e sd e t e c t e db yt h i sm e t h o dw e r ei ng o o da g r e e m e n t 谢mt h e r e s u l t so b t a i n e db ye l i s a i m m u n o a s s a y , c h e m i l u m i n e s c e n c ei m m u n o a s s a y , e n z y m ei m m u n o a s s a y , e s t r a d i o l ，e s t r i o l ，b i o t i n - a v i d i n ， m e t h y lr e d ，v o l t a m m e t r i ce n z y m e - l i n k e di m m u n o a s s a y , a n di m m u n o a m n i t yc o l u m n 8 聊城大学硕士学位论文 前言 随着人们对环境问题的日益关注，人们对环境质量要求也越来越高，常用的环境分 析方法如气相色谱法、液相色谱法等因其前处理复杂、所需仪器昂贵、检测费用高、检 测时间长等原因已不能完全满足要求，2 0 世纪6 0 年代发展起来的免疫分析技术正好弥 补了这些不足。近年来免疫分析技术在环境方面的应用取得了较大的成就，并已在区域 性环境质量评价中得到广泛应用。免疫分析有以下优点：价格便宜，灵敏度高，前处理 方法简便，监测对象确定后，可进行大批量的分析，同时还可以进行现场检测，因此前 景十分诱人。 雌激素是一类非常重要的内源性激素，具有较强的生理作用和临床应用价值。测定 人体内雌激素的含量，不仅可以用于疾病的诊断和治疗，而且对优生优育、提高人口素 质具有重要意义。而环境中的雌激素能对机体内正常内分泌物质的合成、释放、运转、 代谢以及结合等产生干扰，激活或抑制内分泌系统功能，从而破坏其维持机体稳定性和 调控作用。因此建立灵敏、快速、准确的雌激素免疫分析方法具有重要的意义。 本文从完全抗原的制备，免疫动物产生抗体，建立免疫分析方法为主展开工作，对 雌二醇、雌三醇环境雌激素进行了分析方法研究，将高灵敏的化学发光分析，电化学分 析和高特异性的免疫反应结合起来，引入了生物素亲合素的放大作用，建立雌二醇、雌 三醇的免疫分析新方法。 受本人学识和水平所限，文中一定会存在很多不足之处，敬请各位专家、老师及同 学批评指正。 l 林世蕾 2 0 0 6 年4 月 聊城大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 环境雌激素中的天然雌激素介绍 环境雌激素就其来源大体分为以下几类：天然雌激素、人工合成的化学品、医疗用 药。天然雌激素主要有雌二醇( e s t r a d i o l ，e 2 ) 、雌酮( e s t r o n e ，e 1 ) 和雌三醇( e a t r i o l ，e 3 ) ，它 们是人和动物体内天然存在的雌激素，其中雌二醇的雌激素作用最强，雌三醇的作用最 弱。雌激素为一个1 8 碳原子的雌烷衍生物，它们的a 、b 、c 环都相同，d 环不同，几 种雌激素的结构如下： h 图l 一1 雌二醇 h h 图1 3 雌三醇 图l 一2 雌酮 0 h 雌二醇( e 2 ) 是雌性激素中最重要和作用最强的一种激素，对促进和调节女性副性器官的发育 和第二性征的形成，对蛋白质、糖、脂类、水、电解质及钙和磷的代谢有重要影响。血浆中e 2 的浓 度是检查下视丘垂体生殖腺轴功能的指标之一，也是妇女妊娠和内分泌系统疾病生化检测的一个指 标。研究发现，人体中e 2 含量与某些肿瘤如乳腺癌、子宫癌和肝癌等密切相关。因此研究e 2 的检测 方法有重要意义。在孕期，雌三醇( e 3 ) 含量大大增加，这主要是由胎儿一胎盘处产生。因此，e 3 在 调节胎儿宫内发育、调节子宫肌运动等过程中有十分重要的作用。血清中e 3 浓度的测定对临床产科 2 聊城大学硕士学位论文 了解胎盘功能、胎儿宫内发育情况以及高危妊娠的监护有重要意义。例如唐氏综合症的诊断就是以 孕妇尿样中e 3 的含量为主要依据。因此随着雌二醇和雌三醇研究的进一步深入，建立简便、快速、 灵敏的分析方法具有重要的意义。 1 2 生物素亲合素简介 生物素( b i o t i n ，b ) 发现于1 9 3 6 年，是k o g l 和t o n n i s 从鸡蛋黄中分离得到。继而证 明它广泛存在于植物和动物组织中，以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又名辅酶r 或 维生素h 。可以从卵黄、植物、动物组织中提取或人工合成。纯品生物素为白色结晶化 合物，其分子量为2 4 4 3l ，分子式为c l o h l 6 0 3 n 2 s ，结构式为： o 麟人 ii i l c 土d i h 一。c h ：，。c 。h 图1 4 生物素 结构中的咪唑酮环是与亲合素结合的主要部位。另一四氢噻吩环的侧链末端羧基是标记 抗体或酶的唯一结构，修饰后的生物素称为活化生物素或生物素衍生物，以适合与各种 生物大分子的结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素n 一羟基丁二酰亚胺 ( b n h s ) 和生物素对硝基酚酯( p b - n p ) ，其中以b n h s 最常用。亲合素( a v i d i n ，a ) 的发现在 生物素之后，又称抗生物素蛋白、卵白素或亲合素，是从卵白蛋白中提取的种碱性糖 蛋白。纯品为白色粉末，分子量为6 8k d a ，易溶于水，在p h9 1 3 的溶液中性质稳定， 耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用；8 0 。c 加热2m i n ，仍保持活性，但对强光和f e 2 + l 匕 较敏感。亲合素是由4 个相同亚基组成，能结合4 个分子的生物素。1 9 6 4 年c h a i c t 等从 链霉菌培养滤液中获得结晶链霉亲合素( s t r e p t a v i d i n ，s a ) ，它能阻断微生物合成胞内生物 素，能从链霉菌培养滤液中提取链霉亲合素，是链霉菌培养过程中的分泌物。s a 的分子 量为6 5k d a ，由4 条序列相同的肽链组成。如同亲合素一样，s a 也能结合4 个分子的 生物素。s a 的每条肽链含1 5 9 个氨基酸残基，其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的含量 比亲合素少，反之酸性氨基酸含量较多，因此s a 是一种稍偏酸性的蛋白质。亲合素等 3 聊城大学硕士学位论文 电点高( p h1 0 5 ) ，并含糖基，用于抗体或抗原的检测，有一定的非特异性，而链霉亲合 素与生物素有相似的生物学特征，但等电点为p h6 0 ，且不含糖基，非特异性吸附显著 减少，灵敏度相应提高。因而，链霉亲合素有日渐取代亲合素之势。 生物素与亲合素具有高度的亲和力，特异性强，尤其是该系统特有的多级放大作用， 引人注目。7 0 年代，由于免疫化学技术的发展，建立了多种生物素标记技术，合成了各 种带有不同基因的生物素衍生物，使生物素一亲合素系统开始在免疫学中得以应用。生物 素与链霉亲合素的结合常数为1 0 1 5 m ，至少比抗原抗体的结合常数高1 万倍以上。1 分 子链霉亲合素可结合4 个生物素分子，两者结合快速而牢固，而且反应不受外界干扰， 具有高度特异性。将这对反应系统引入酶联免疫反应中，不但能放大抗原抗体反应，并 且能增强抗原抗体反应的特异性。因此，生物素亲合素酶联检测法是当前较普通酶联 法更敏感、更特异性的方法。 1 3 雌二醇与雌三醇的免疫分析法及免疫分析发展概述 传统的测定雌二醇和雌三醇的方法如紫外、荧光光度法等，往往需要复杂的分离步 骤，操作繁琐，灵敏度低，不能满足临床的需要。免疫分析法的出现给雌二醇和雌三醇 的测定带来了变革，提高了测定的灵敏度和特异性。目前测定雌二醇的方法有放射免疫 分析法( r i a ) 1 1 1 ，酶免疫分析法( e i a ) 2 4 】，荧光免疫分析法( f i a ) 【6 1 和化学发光与 生物发光免疫分析法【7 ，8 1 。目前测定雌三醇的方法有免疫分析法1 9 ，色谱法【1 0 】和色谱质谱 法【1 1 , 1 2 】等。 免疫分析的主要特点是高特异性、高灵敏度，能检测大多数临床上有意义的物质。 免疫分析技术很早就被广泛应用于生物化学、临床医学等领域，但是用于环境领域却晚 很多。到2 0 世纪8 0 年代，免疫分析技术在环境化学物质检测中的应用才受到了高度重 视。目前环境化学家已把它作为一种有效的检测方法。免疫分槲1 3 。1 5 1 发展至今，其方法 多种多样，各具千秋。在这些方法中，非均相免疫分析是目前免疫分析的主流。虽然均 相分析法花样翻新，但实际应用中的只占较少的比重。标记分析占据了绝大多数的免疫 分析，然而传统免疫分析法仍然占有非常重要的地位，特别是结合了标记分析原理的方 法，近年来也不断获得发展，有不少新方法出现【1 6 舶】。 在免疫分析的诸方法中，放射免疫分析【1 9 ( r a d i oi m m u n o a s s a y , r i a ) 是第一个定量方 法。放射免疫分析法的优点是特异、灵敏度高、精确、简便易行、仪器试剂价格低廉、 4 聊城大学硕士学位论文 技术成熟，可用于测定多种抗原和抗体，包括病毒、细菌、寄生虫、肿瘤以及小分子药 物等。然而缺点是操作人员需要接触放射性物质且放射性污染物的处理较麻烦。因此从 其诞生之日开始，研究工作者就开始寻找可以取代它的新方法。张丁联等【2 0 】制各了雌二 醇抗体和1 2 5