（分析化学专业论文）生物大分子毛细管电泳分离与预浓集方法研究.pdf

a t h e s i si na n o n l i n ep r e c o n c e n t r a t i o na n ds e p a r a t i o no f b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sb yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s b yl ij i n 西i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw hz h i y o n g n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j a n u a r y 2 0 0 8 、 _ ， p：，。i，- 0qj 1，1吖l ，、，1lll i i r ，i i fi 独创性l 声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 ：茧 恧。 学位论文作者签名：杏晶晶 日 期： 珈晦l 目侈日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部或部 1分内容编入有关数据库进行检索、交流。 l ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： ，；，、，i-i 1，0lj 东北大学硕士学位论文 摘要 生物大分子毛细管电泳分离与预浓集方法研究 摘要 核酸和蛋白质作为生命科学中最重要的生物大分子，一直是人们研究的重点。毛细 管电泳以其高效、快速、样品用量少等特点而成为生命科学中研究生物大分子的重要分 析分离手段。 论文在毛细管电泳原理、分离模式介绍的基础上，论述了管壁涂层技术和毛细管电 泳在线预浓集技术的研究进展。 针对蛋白质分离的吸附问题，用自制的装置制备了交联键合型聚丙烯酰胺涂层柱， 有效抑制了电渗流和碱性蛋白的吸附，分离柱效达到1 0 5 理论塔板数米，日内重现性和 日间重现性均在5 之内。在无胶筛分模式下对蛋白质s d s 复合物显示了良好的分离效 能。 首次尝试了利用原位刻蚀的多孔导电膜和非涂敷的石英毛细管在区带电泳模式下 对实际样品进样了浓缩分离。以血浆蛋白为研究对象，对富集和分离的条件进行了探讨， 初步实现了血浆蛋白的浓缩和分离。以峰面积估算经3 0 0s 在线浓集取得了约1 2 0 倍的 浓缩。 首次将d n a 的无胶筛分与毛细管电泳多孔导电膜电进样浓缩相结合，通过对富集 和分离条件的优化，实现了低浓度d n a 样品片度的浓缩和分离。经3 0 0s 电进样浓缩 取得了1 0 6 0 倍的浓缩( 峰面积) ，从而使常规紫外检测器( 2 5 4n m ) 的检测限降至o 0 5 n 鲋l 。 毛细管上的多孔导电膜不仅能够对生物大分子的标准品进行浓集，而且还能对成分 复杂的实际样品进行浓集。与传统样品处理方法相结合，基于多孔导电膜的毛细管电泳 在线浓缩，脱盐，分离、检测一体化的分析系统有可能成为一种实际样品中低丰度蛋白 和低浓度d n a 分析有力手段。 关键词：毛细管电泳：生物大分子；蛋白质；d n a ；在线浓集；多孔导电膜 囊 l f _ o n - l i n ep r e c o n c e n t r a t i o na n ds e p a r a t i o no f b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sb yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s a b s t r a c t n u c i e i ca c i d sa n dp r o t e i n sa sm o s ti m p o n a n tb i 0 一m a c r o m o l e c u l e si nl i f cs c i e n c eh a v e b e e nt h cf b c u so fr e s e a r c h e r sf r o md i f 诧r c n tf i e l d s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i s 锄 i m p o n a n ts e p a r a t i o nm e a n sf o rt h e s em o l e c u l e sd u et oi t sh i 曲s e p a m t i o ne 艏c i e n c y ，h i 曲 s p e e d ，a n dl e s sc o n s u m p t i o n0 fs a m p l e s t h ep r i n c i p l e0 fc e ，s c p a r a t i o nm e t h o d s 柚dr e s e a r c ha d v 柚c c0 fc a p i l l a r yc o a t i n g t e c l l i l i q u e sa n d0 n - l i n ec 0 n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e sa r er e v i e w e d as i m p l ed e v i c e 锄dan e wp r o t o c 0 lf o rt h ep r e p a r a t i o n0 fc r o s s l i i l l ( e dp o l y a c r y l a m i d e ( c p a jc o a t i n gc o l u m nw e r ed e v e l o p e di n t h e l i g h to fp r o t e i n sa d s o 叩t i o n i s s u e t h e e l e c t r 0 0 s m o t i cn o ww 弱s u p p r e s s e de a e c t i v e l y 柚dt h ea d s o 叩t i o n0 fb a s i cp r o t e i n sw 硒 o b v i o u sa l l e v i a t e d s e p a r a t i o ne 仃i c i c n c yu pt o1 旷p l 柚t s mw 弱a c h i e v e dw i t hr s dl e s st h 锄 5 b o t hf o ri n t m d a y 髂s a y 锄df o ri n t e r - d a y 弱s a y n o n - g e ls i e v i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s o fp r o t e i n - s d sc o m p l e x e sw 舔w e ud e m o n s t r a t e ds u c c e s s f u l l yw i t ht h ec p ac o a t e dc o l u m n i n j e c t i o np r e c o n c e n t r a t i o no fr e a ls 锄p l e ，p i a s m a ，w a sc a 玎i e do u tf o rt h ef i r s tt i m ew i t h ap o r o u sc o n d u c t i v ej o i n tp r e p 缸e db yh fe t c h i n go faf u s e ds i l i c ac a p i l l a r y p r e c o n c e n t r a t i o n 柚ds e p a r a t i o no fp l a s m ap r o t e i n sw a sr c a l i z e dw i t h 柚u n c o a t e dc a p i l l a r ) rc o l u m n ，觚d w o r l 【i n gc o n d i t i o n sw e r ee x p l o r e d a b o u t1 2 0t i m e s c o n c e n t r a t i o nw 勰a c h i e v e db y3 0 0 s e c o n d sp r e c o n c c n t r a t i o na se s t i m a t e db yp e a ka r e a e l e c t r 0 - i n j e c t i o np r e c o n c e n t r a t i o n 锄dn o n g e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t i o no f d n aw 弱a l s od e m o n s t r a t e df o rt h ef i r s tt i m ew i t hab a r ec a p i l l a r yw i t ht h ep o r o u sj o i n t l o w c o n c e n t r a t i o no fd n aw 弱a c h i e v e da f t e rc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n d n ad e t e c t i o nl i m i t 鹤l o w a s0 0 5 n g 肛l lw a sd e m o n s t r a t e db yau v2 5 4n mp h o t o m e t r i c d e t e c t o rw i t h3 0 0s e c p r e c o n c e n t r a t i o n ，c o r r e s p o n d i n g1 0t 06 0t i m e sp r e c o n c e n t r a t i o na sc s t i m a t e db yp e a ka r e a t _ l l c p o r o u s m e m b r a n ec o u l dn o t o n l y b eu s e df o r p r e c o n c e n t r a t i o n o f b i o - m a c r o m o l e c u l e s ，b u ta l s of o ra n a l y s i so fr e a ls a m p l e0 fc o m p l e xm a t r i x t b g e t h e rw i t h 1 i i 一 0 j 一 _ 气i 东北大学硕士学位论文 目录 目录 独创性声明1 摘要i i a b s t r a c t i l i 第一章绪论1 1 1 研究背景1 1 2 毛细管电泳概述1 1 2 1 毛细管电泳的研究进展1 1 2 2 毛细管电泳基本原理及分离模式2 1 3 毛细管电泳在生物大分子分析中的应用3 1 4 电渗流控制及防止管壁吸附的办法。4 1 4 1 电渗流和吸附现象的影响4 1 4 2 毛细管内壁涂层技术5 1 5 毛细管电泳的样品预浓集技术8 1 5 1 基于电泳法的样品预浓集。9 1 5 2 基于萃取法的样品预浓集1 1 1 6 毛细管原位刻蚀技术1 3 1 7 本课题的研究意义和研究内容1 5 第二章聚丙烯酰胺涂层的制备及评价1 7 2 1 引言1 7 2 2 仪器与试剂1 7 2 2 1 实验仪器1 7 2 2 2 实验试剂1 8 2 2 3 缓冲溶液与样品溶液的配制1 8 2 3 实验操作1 9 2 3 1 交联键合型聚丙烯酰胺涂层柱的制备1 9 2 3 2 电渗流的测定2 0 2 3 3 碱性蛋白的分离2 0 2 3 4 无胶筛分分离蛋白质s d s 复合物2 0 v 4 1 引言4 2 4 2 仪器与试剂4 2 4 2 1 实验仪器4 2 4 2 2 实验试剂4 2 4 2 3 缓冲溶液与样品溶液的配制4 3 4 3 实验操作一4 3 4 3 1 d n a 毛细管无胶筛分电泳分离4 3 4 3 2 无胶筛分模式下d n a 样品的浓集4 4 v i 、 东北大学硕士学位论文 目录 4 4 结果与讨论4 4 。“； 4 4 1 电泳条件的优化4 4 4 4 2 无胶筛分模式下d n a 样品的浓集4 8 4 5 本章小结5 0 第五章结论。5 1 参考文献5 3 到【谢。6 1 攻读硕士期间发表论文情况6 3 v i i 东北大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论帚一早珀t 匕 2 0 0 3 年，人类基因组计划( h u m 锄g e n o m ep r o i e c t ，h g p ) 的完成标志着生命科学的 发展进入了一个新的阶段一后基因组时代，研究的重点已从揭示遗传信息的结构基因组 学转移到功能基因组学上来【，功能基因组学包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。 核酸和蛋白质作为生命科学中最重要的两类生物大分子，直是人们研究的重点，而对 核酸和蛋白质的分离分析方法的研究也成为生命科学领域中重要的组成部分。 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i s ，c e ) ，以高效、快速、微量、分析对象范围广 等特点得到研究工作者的青睐，特别是“人类基因组计划的实施，大大地推动了毛细 管电泳技术的发展。进入2 1 世纪后，由于c e 符合了以生物工程为代表的生命科学各 领域中对多肽、蛋白质( 包括酶、抗体) 、核苷酸、脱氧核糖核酸( d n a ) 的分离分析要 求，得到了迅速的发展。 1 2 毛细管电泳概述 1 2 1 毛细管电泳的研究进展 1 9 6 7 年，瑞典科学家h j e r t e m 【2 l 首次提出毛细管电泳的概念，并用内径3m m ，内 壁涂有甲基纤维素的石英毛细管对金属离子进行了分离。1 9 7 4 年，v i n 柚e n 【3 j 采用内径 为2 0 0 5 0 0 m 的毛细管进行了电泳分离，展示了使用细的毛细管提高分离效率的潜力， 但由于所加电场较小( 5 0v 托m ) ，所取得的效率并不高。同年，p r e t o r i u s 等1 4 l 提出了电 渗流的概念并阐明了电渗流的基本原理。1 9 7 9 年，m i l ( 1 ( e r s 等【5 】从理论上研究了电场聚 焦影响区带电泳效率的现象，并采用内径2 0 0 m 的聚四氟乙烯毛细管分离了1 6 种有机 酸，获得了小于1 0 m 板高的高柱效，这是区带电泳发展史中的第一个重大突破。1 9 8 1 年，j o r i 驴n s o n 和l u k a c s 掣6 j 首次使用内径7 5 肛m 的熔融石英毛细管利用电迁移进样和 荧光检测对丹磺酰氯衍生的氨基酸进行分离，在3 0k v 电压下取得了4 1 0 5 塔板数米 的效率。1 9 8 3 年后，h i e n e n 先后建立了毛细管凝胶电泳【7 l 和毛细管等电聚焦【8 1 电泳模式。 1 9 8 4 年，t e r a b e 等人1 9 】建立了胶束电动色谱模式，运用含十二烷基磺酸钠( s d s ) 胶束的 缓冲溶液分离了中性组分。1 9 8 8 年第一批毛细管电泳商品仪器推出，标志着毛细管电 泳走向应用阶段。此后，各种大小国际会议连年不断，毛细管电泳开始进入了全面发展 1 东北大学硕士学位论文第一章绪论 的阶段。 微流控芯片技术是继m a n z 等【1 0 1 在2 0 世纪9 0 年代首次提出“微全分析系统” ( m i n i a t u r i z e dt o t a la m a l y s i ss y s t e m s ，1 a s ) 的概念后，基于c e 技术发展起来的。芯片 电泳与传统的毛细管电泳相比有许多优点，如进样量小、散热性能好，因此允许采用较 高的电场，可以大大提高分离速度等。芯片通道设计灵活，不仅可以直接使用石英毛细 管制作电泳芯片【1 1 】，还可以利用芯片多通道设计来实现高通量、集成化、便携化。目前， 芯片电泳已经在核酸和蛋白质的分析中得到广泛的应用【1 2 j 。除此之外，芯片电泳还用于 分析茶碱【1 3 】、生物胺【1 4 】、环境污染物【1 5 】等。目前，微流控芯片用于生物样品的分离分 析已成为生物领域的研究热点之一，并正在以极快的速度向前发展，其中，毛细管电泳 芯片因为具有易实现微型化的特点，发展十分迅速，是极有希望引起分析化学下一次革 命的新技术【1 2 1 。 1 2 2 毛细管电泳基本原理及分离模式 毛细管电泳又称高效毛细管电泳( h i 曲p e r f o 加柚c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， h p c e ) ，是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中主要按淌度不同进行高效、快 速分离的一种电泳技术。 根据分离机理不同，c e 可分为很多类型的分离模式，最常见的分离模式如下： ( 1 ) 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t f o p h o r e s i s ，c z e ) 毛细管区带电泳是最常见的一种分离模式，也称为毛细管自由溶液区带电泳。在这 种分离模式中，溶质基于各自电泳迁移速率的不同而进行分离。组分在毛细管区带电泳 中的流出顺序与组分的荷质比有关，不同荷质比的组分具有不同的迁移速度。 ( 2 ) 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t m l ( i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o 伊a p h y ，m e c c ) 胶束电动毛细管色谱是一种非常特殊的毛细管电泳分离模式，是把一些表面活性剂 如s d s 加入缓冲溶液中，当溶液中表面活性剂的浓度超过形成胶束的极限浓度即临界 胶束浓度( c m c ) 时，表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束一准固定相， 溶质基于在水相和胶束相问分配系数的不同而得到分离。 ( 3 ) 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e ie l e c t m p h o r c s i s ，c g e ) 毛细管凝胶电泳综合了毛细管电泳和平板凝胶电泳的优点，以凝胶或聚合物网络为 分离介质，基于被测组分的荷质比相同而分子大小形状不同，如d n a 、蛋白质s d s 复 合物等而被分离的一种电泳模式。c g e 中以水溶性线性聚合物溶液代替凝胶，被称为 毛细管无胶筛分电泳( n g c e ) 。 ， 东北大学硕士学位论文第一章绪论 ( 4 ) 毛细管等电聚焦( c a p i l i a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 毛细管等电聚焦是一种在毛细管内基于组分等电点的不同而进行分离的电泳技术。 通常使用等电点有一定分布的同系的混合两性电解质溶液做为背景电解质，通电后两性 电解质会形成p h 梯度，样品会各自向其等电点移动，直到迁移到p h = p i 的区带时则停 止移动，利用气压压力将已等电聚焦的样品推动，经检测器进行检测。 ( 5 ) 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ，c i t p ) 毛细管等速电泳是一种不连续介质毛细管电泳技术。在c i t p 中，通常使用两种缓 冲体系( 前导电解质和尾随电解质) ，造成所有被分离的区带等速迁移的状态。溶质在毛 细管电泳中达到平衡后，各区带相随，分成清晰的界面以等速移动，并完成分离。 ( 6 ) 毛细管电色谱( c a p i l l a r ) re l e c t - 0 c h r o m a t o 伊a p h y c e c ) 毛细管电色谱是将色谱固定相引入毛细管中，如在毛细管内壁上键合或涂渍固定相 或在毛细管内填充液相色谱载体，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗 流为流动相驱动力的色谱过程。 ( 7 ) 非水相毛细管电泳( n o n - a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i s ，n a c e ) 非水相毛细管电泳是指分析物在有机溶剂中进行电泳的分离模式。有机溶剂的粘度 和介电常数影响样品离子迁移和电渗流水平，使用非水相介质可增加方法的选择性。 ( 8 ) 亲和毛细管电泳( a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两种分子受体和其配体间，发生特异性相互 作用形成受体一配体复合物。通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变 化，可获得有关受体一配体亲和力大小、结构变化、作用产物等多方面的信息。 1 3 毛细管电泳在生物大分子分析中的应用 随着生命科学日新月异的发展，c e 以其分离效率高、分析速度快、样品用量少等 特点，成为最重要的生物样品分离分析手段，已被广泛应用于核酸、多肽、蛋白质、糖 类、细胞等领域的分离分析。 ( 1 ) 蛋白质和多肽 蛋白质和多肽的分析是c e 最初的应用之一，而且应用十分广泛。包括蛋白质的鉴 别【1 6 t 1 7 l ，结构分析，纯度检测，非均一性、多样性研究，稳定性研究，结合和动力学研 究，物化常数如等电点、分子量1 1 8 】的测定，蛋白质和多肽的质量控制以及微量制备等。 ( 2 ) 核酸 以d n a 体外重组为主导的基因工程是生物技术中最为重要的一个环节，与之有密 3 簟 东北大学硕士学位论文第一章绪论 切关系的基因分析则是c e 技术重要的应用领域。核苷酸与细胞功能、生化过程、能量 传输等方面都有着密切的联系。c e 在d n a 研究中的内容很多，比如碱基、核苷酸的 分析，d n a 测序【1 9 】，纯度检测，片段收集和微量制备，p c r 产物分析【2 0 l 和d s d n a 分 析，蛋白质d n a 相互作用测趔2 ，基因突变测定【捌，基因表达测定等。 ( 3 ) 糖类 糖类是构成生命的基本物质之一，从细菌到高等动物的肌体内都含有糖，因此，以 糖类为研究重点的糖工程被认为是继基因工程、蛋白质组后生物化学和分子生物学中重 要的研究领域。过去由于糖类一般为电中性物质且没有紫外吸收及荧光发光基团而造成 c e 在糖类分析中应用较少。近年来，随着c e 技术的不断发展，各种新的糖衍生化反 应和检测技术的发展，c e 已成为分析糖类化合物的有力武器【2 3 ，2 4 1 。 ( 4 ) 单细胞分析 细胞是生物体的基本单元，单个细胞分析是生命科学研究中艰巨而又十分吸引人的 课题。单细胞c e 分析早期主要集中在神经科学领域，以巨大神经细胞为研究对象，分 析物为各种神经递质。随着单个细胞进样技术及高灵敏检测技术的不断完善和发展，研 究对象已涉及各种哺乳动物细胞和植物细胞，分析物种类也日益扩大。 1 4 电渗流控制及防止管壁吸附的办法 1 4 1 电渗流和吸附现象的影响 目前毛细管电泳中绝大多数情况下使用熔融石英毛细管。电渗流( e l e c t f 0 0 s m o t i c n o w e o f ) 是c e 中经常出现的一种现象，是毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发 生的一种定向运动。在不同的c e 分离模式中，电渗流的作用不同。在c z e 中，适当 大小的e o f 对阴离子的分离有利，过大的e o f 不利于阳离子的分离。而在m e k c 中， 必须要有强大的电渗流带动胶束和被分离组分同向移动。但是对于c g e 、n g c e 和c f 来说，电渗流一般是要加以抑制，因此有效地控制电渗流是c e 研究中一个不可忽视的 部分。 一 理论上，生物大分子由于具有很低的分子扩散系数，在c e 其分离效率可以达到几 百万的理论塔板数。但是由于蛋白质、d n a 等在毛细管壁上有严重的吸附，实际上往 往达不到理论预测值。在c e 中，细内径的毛细管是获得高效分离的重要条件，但是毛 细管直径的减小增加了管的比表面积，分析物与管内壁的吸附现象就变得更加显著。吸 附可以改变毛细管内壁特性，对分离的影响主要是引起峰展宽、峰变形，严重的情况下， 东北大学硕士学位论文第一章绪论 检测器甚至检测不到峰信号，从而大大降低了c e 的分离效率和重现性。b o n v e n t 【2 5 1 使 ， 二 用原子力显微镜观测了酸性蛋白质铁蛋白在毛细管内壁上的吸附现象，如图1 1 所示， 并证明即便溶液的p h 值高于蛋白质的等电点，蛋白质还是能在管壁吸附。吸附的原因 可源于疏水作用、静电作用和其他多种两相分配机制，碱性蛋白质的吸附问题更为明显。 图1 1 铁蛋白在毛细管壁上的吸附【2 5 l ( a ) 未涂层石英毛细管的内表面：( b ) 吸附铁蛋白后的石英毛细管内表面 f i g 1 1a d 叩t i 0 ff e r r i t i n eo n t oi 加e fs u r f a o ff u d s i l i c ac a p i l l a r y 【2 5 l ( a ) i h ei n n e rs u r f a c eo f 岫c o a t e df u 辩d s i l i c ac a p i n a r y ；( b ) t h ei 衄e rs u r f a c eo ff i i 辩d - s i l i c ac a p i l l a 叮a f t e r a d 叩t i o n0 ff 色玎i t i n 1 4 2 毛细管内壁涂层技术 对毛细管内壁进行改性是控制电渗流和防止吸附发生的有效方法，也是毛细管电泳 柱技术的重要组成部分。内壁改性技术大致分为三类，即动态吸附、物理涂布和化学键 合。从涂层制作的角度讲，动态吸附涂层最简单，物理涂布次之，化学键合最为繁琐。 1 4 2 1 动态吸附涂层 动态吸附十分简单，只需向缓冲溶液中添加适量的欲涂布的物质，并让其与管壁充 分平衡即可。极端p h 值条件下的电泳事实上也存在h + 或0 h 。的动态吸附。作为添加剂 的这种物质一般是比较容易在石英和玻璃表面上吸附的，经常添加的物质有以下几类： ( 1 ) 中性分子 中性聚合物如纤维素类1 2 6 1 、聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 【2 7 l 、聚乙烯醇 东北大学硕士学位论文第一章绪论 ( p o l y v i n y la l c o h o l ，p v a ) 【捌、聚乙烯吡咯烷酮( p o l y v i n y l p y r r 0 1 i d o n e ，p v p ) 【2 引、葡聚糖、 聚丙烯酰胺【刈、聚二甲基丙烯酰胺( p o l y d i m e t h y l a c r y l a m i d e ，p d m a ) 【3 l 】等及这类聚合物 混用时【3 2 】能增加毛细管壁附近液层的粘度，降低管壁的z e t a 电位，从而使电渗流得以 抑制。另外，它们还可通过分子间作用力如氢键等，与毛细管内壁的硅羟基作用，屏蔽 硅羟基，防止吸附。 ( 2 ) 有机胺类j 胺类【3 3 】能够通过较强的静电作用吸附在毛细管内壁，当浓度足够高时，可以使管壁 带上正电荷，改变z e t a 电位的符号，使电渗流反转。常用的胺类有：乙胺、三乙胺、 三乙醇胺等单胺；丁二胺、戊二胺等二胺；还有精胺，四乙烯五胺等寡聚胺。由于胺类 在碱性条件下会去质子化，故这类添加剂的适用p h 值被限制在酸性范围内。 ( 3 ) 无机阳离子 金属离子i 蚓可以通过置换作用吸附在毛细管上改变管壁的电荷密度，抑制电渗流的 产生，同时也有一定的防止蛋白质在管壁上吸附的作用。但吸附的阳离子也可能对负离 子样品组分的分离产生影响。 ( 4 ) 表面活性剂 表面活性剂也是电泳中常用的添加剂，包括阴离子、阳离子、中性和两性离子表面 活性剂等四种类型，尤以阳离子和两性离子表面活性剂使用最多。十六烷基三甲基溴化 胺( c e t y t 血n e t h y l 锄m o n i u mb r o m i d e ，c m 气b ) 【3 5 1 、双十二烷基二甲基溴化胺 ( d i d o d e c y l d i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ，d d a b ) 【3 6 】和氟表面活性剂等阳离子表面活性剂 一般以其亲水性头部与毛细管壁的负电荷结合，露出疏水性尾部在溶液中。由于尾部不 溶于水，就和剩余的表面活性剂分子疏水端连接，使带正电的头部暴露在缓冲溶液中。 因此，毛细管壁电荷反转，形成反向的电渗流。阴阳离子表面活性剂容易与蛋白质作用， 会使其不可逆失活。两性离子表面活性剂则相对比较温和，它们通过静电吸引结合在毛 细管壁上，掩蔽了硅羟基的吸附作用，但不改变电渗流的方向。 1 动态吸附涂层的优点是制作简单方便，没有使用寿命的问题，涂层可再生；缺点是 涂布试剂可能影响样品和缓冲溶液的性质，也可能会影响检测。而且有的涂层试剂需要 7 对毛细管长时间的平衡，否则很难获得重现的分离结果。 1 4 2 2 物理涂布涂层 物理吸附涂层的制备比较容易。一般只需对毛细管进行简单预处理后，将待涂布的 高分子试剂吸入毛细管中，然后在常温或加热条件下用氮气吹干即可。这种涂层与管壁 是通过作用力较弱的氢键或静电吸引力结合的。用这种涂层柱进行电泳的重复性高，但 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 柱稳定性较差，需要不断进行涂层更新或在缓冲液中加入少量涂层试剂以减小涂层脱落 对分离分析造成的不良影响。一般来说，吸附性强、粘性大的高分子试剂适合于制备物 理吸附涂层。物理吸附涂层主要有中性聚合物和阳离子聚合物两类。 ( 1 ) 中性聚合物 物理涂布中常用的中性聚合物有纤维素及其衍生物、p v a 、p e g 、聚氧化乙烯 ( p o l y ( e t h y l e n e o x i d e ) ，p e o ) 【3 7 l 等。这类聚合物通常是以氢键与毛细管内壁结合屏蔽硅羟 基，但通常只抑制e o f ，不改变e o f 的方向。中性的聚合物已被广泛地用于d n a 和 其他一些生物大分子的分离分析中。亲水性的聚合物，如甲基纤维素，聚糖等不能很好 的吸附在管壁上，稳定性较差，但不会对蛋白造成吸附。疏水性强的聚合物如p v p 、 p d m a 与管壁的作用力较强，可以形成稳定的涂层，但对蛋白质存在吸附作用。所以， 应该针对分析的对象和方法选择合适的涂层材料。 ( 2 ) 阳离子聚合物 常用的阳离子聚合物包括聚胺、壳聚糖【3 8 】、聚乙烯亚胺( p o l y e t h y l e n e i m i n e ，p e i ) 【3 9 】 等胺类聚合物和聚阳离子【砌。这些聚合物因为带有正电荷会与管壁发生静电吸附，带正 电荷的蛋白质会与涂层产生静电排斥，防止吸附的发生。另外，对于正电荷的聚合物来 说还可以结合一些带有电荷的聚合物如磷脂【4 l j 等，形成多层吸附涂层。 物理吸附涂层的高分子一般在很稀的水溶液中吸附到毛细管壁上，因而可以避免使 用有机溶剂和高粘度的液体，不少情况下还可以避免加热。由于操作的简便性，不少物 理吸附涂层制备方法可以在商品化的仪器上实现。容易脱落虽然是物理吸附涂层的一个 缺点，但是在芯片电泳中，可更新的涂层方法显得更为实际。对于昂贵的非一次性芯片 来说，容易冲洗更新的涂层往往是一个较好的表面处理方法。 1 4 2 3 化学键合涂层 化学键合涂层技术利用毛细管内表面上硅羟基的化学活泼性，使之与涂层材料分子 发生化合成键反应。从引入双功能活性基团的成键类型看，可分为s i o c 、s i o s i r 和s i c r 三种。其中，s i o c 型涂层的化学键易生成，但也易水解，因此，此类涂层 应用不多。另外一种就是利用硅烷化试剂进行桥连而行成的s i o s i r 型涂层，但利用 硅烷化试剂偶联生成的s i o s i 键在碱性条件下不够稳定。利用格氏反应生成的s i c r 型涂层在碱性条件下的稳定性要优于s i o s i r 型涂层。但由于格氏反应需要高度无水， 反应条件比较苛刻，因此涂层制备比较困难。所以大家还是倾向于制备成键容易且相对 稳定的s i o s i r 型涂层，这也是目前应用最广泛的化学键合涂层。化学键合的涂层材 料一般是亲水性的高分子，主要有以下几类：中性聚合物、阳离子聚合物、阴离子化合 东北大学硕士学位论文第一章绪论 物和两性化合物。 ( 1 ) 带电聚合物 电渗流本身不具备分离选择性，但是有时可利用e o f 实现快速分离。引入带电的 亲水性涂层能在保持较大电渗流的同时还可能减少蛋白质的吸附。以带电涂层材料制备 的涂层柱，其e o f 随着缓冲液p h 值的改变可以保持不变，也可以改变大小和方向。这 类涂层一般是利用带正电、负电的材料或者两性离子聚合物，以带正电为主。带正电的 涂层能有效抑制碱性蛋白的吸附，但有对带负电的酸性蛋白则不利。 ( 2 ) 中性聚合物 用于这类涂层的材料主要有聚丙烯酰胺( p o l y a c r y l 锄i d e ，p ! a ) 及其衍生物、环氧化合 物、聚氨酯类、p e g 、p e o 、p 、，a 、p ，及纤维素类聚合物等，这类涂层试剂的亲水性 很好，能在不同程度上抑制电渗流，防止吸附。 聚丙烯酰胺及其衍生物是公认的性能很好的涂层材料。h i e r t e n f 4 2 】首先报道了化学键 合聚丙烯酰胺涂层柱的制备方法。这个方法一般包括两个部分，先用偶联剂对毛细管壁 进行修饰，常用的偶联剂如表1 1 所示【4 3 1 ，然后再用丙烯酰胺单体在柱内进行原位聚合 形成线性聚丙烯酰胺。但线性聚丙烯酰胺涂层最大的问题是线性聚丙烯酰胺分子不能完 全覆盖毛细管内壁，在此基础上，产生了添加交联剂使聚丙烯酰胺交联生成的交联键合 聚丙烯酰胺涂层。据报道，交联键合型聚丙烯酰胺涂层能有效的覆盖毛细管内壁表面 的硅羟基1 4 5 1 ，与线性聚丙烯酰胺涂层相比具有更好的稳定性。 表1 1 化学键合涂层柱常用的几种硅烷化试剂【4 3 j 1 阻b l e l 1s i l y l a t i o n 圮a g e n t su di i lt l l ep r e p a r a t i o no fc o v a l e n u yb o n d e dc a p i l l a d r 【4 3 l 1 5 毛细管电泳的样品预浓集技术 毛细管电泳进样体积小( 纳升级) 是其重要特点。然而，毛细管内径小( 小于1 0 0 0 东北大学硕士学位论丈 第一章绪论 “m ) ，检测光程短，从而大大降低了常用的柱上光度检测的灵敏度，紫外吸收检测限比 h p l c 要高1 2 个数量级。激光诱导荧光检测器是一种灵敏度很高的检测器( 其浓度检 出限可达1 0 d o 1 0 d 2m o l l ) 。但很多物质不具备荧光或荧光特性很弱，因此必须进行衍 生引入荧光发色团。很多物质由于分子结构的限制难于进行衍生，使其应用受到很大的 限制。激光诱导荧光检测器价格昂贵也限制了其普遍应用。因此，发展样品浓缩技术对 提高常规检测方法的检出能力具有非常重要的实际意义。现有浓集技术按机理分可以分 为两大类，基于电泳法的样品预浓集和基于萃取法的样品预浓集。 1 5 1 基于电泳法的样品预浓集 基于电泳法的样品预浓集是指基于离子淌度和溶液电导差异的电泳富集方法。具体 包括场放大样品堆积、大体积样品堆积和等速电泳等。 1 5 1 1 场放大样品堆积 场放大样品堆积( f i e l d 锄p l i f i e ds 锄p l es t a c k i n g ，f a s s ) 是最简单的柱上浓缩技术。 1 9 7 9 年m i k k c r s 等f 5 j 首先研究了低电导基体中的样品浓缩，以后b u 晒和c h i e n f 删系统 研究了样品堆积现象，并建立了优化缓冲溶液浓度的简单模型。它的基本原理是在进样 前首先进少量低电导的溶液( 通常是水) ，由于其电导很小，因此在施加电压后，所在区 分配的电压比较大，所在区的电场很强，因此在电动进样时，分析离子会快速的迁移通 过水区，达到分离电解质的界面时因电场强度的显著降低而快速的降低迁移速率，从而 在界面附近堆积，也就是说分析物离子在分离前得到有效浓集，从而使检测能力得到提 高。f a s s 可用于d n a 片断分析，尿液中药物分析，和违禁药物分析等方面。然而， f a s s 的限制就在于样品溶液的离子强度必须远远低于背景缓冲液的离子强度，因此对 于含有大量无机盐的生物样品难以直接应用。 1 5 1 2 大体积样品堆集 为了克服场放大作用进样体积不能太大的缺点，进一步提高灵敏度，c h i e n 和b u 晒 等m 提出了大体积样品堆积技术( 1 a 唱e - v o l u m es a m p l es t a c k i n g ，l ，v s s ) 。在毛细管中通过 流动方式先进一段较长的样品塞，进样后在毛细管两端加反极性高压，使电渗流反向将 样品中的水推出毛细管，而阴离子分析物则高速移向检测器并在样品与高浓度缓冲溶液 界面处进行堆积。在这个过程中，需要监测电流，当电流值到达初始值的9 5 9 9 时，证 明大部分水已排除。这时恢复正常的电泳极性，使样品区带场强变得均匀。这种方法可 以将大体积的样品堆积成窄带，既提高了分析的灵敏度，又解决了其对分辨率及分离效 率的影响。这种方法的局限性在于每次都只能富集带同种电荷的离子。 东北大学硕士学位论文第一章绪论 1 5 1 3 等速电泳堆积 等速电泳( i o s t a c h o p h r e s i s ，i t p ) 又称“移动边界”电泳技术，是基于离子淌度差异 的一种电泳富集模式。样品注入到前导( 电泳迁移速率最高) 和尾随( 电泳迁移速率最低) 电解质之间。施加高压后，随着样品中各组分的分离，每个样品组分区带的电场在发生 变化。电泳迁移速率大的离子电导率大，区带的电场强度小，其迁移速率就会逐渐降低。 到平衡时，样品各组分的电泳迁移速率均与前导电解质的相同，建立一种稳态迁移模式。 从原理上讲，r r p 是一种理想的样品富集技术，它对痕量样品起到浓缩的作用，而 对样品中的基体成分则起稀释作用。此外，l 口的负载量比毛细管区带电泳高得多，进 样量可达微升级。r r p 的应用范围包括荷电小分子和蛋白质等生物大分子，这种方法非 常适用于生物样品等复杂样品基质的体系，如血样、尿样以及环境样品等【矧。 1 5 1 4p h 调制堆积 p h 调制堆积( p hm e d i a t e ds t a c 硒n 彭是采用酸碱中和反应而发生富集的一种富集方 法。p h 调制堆积可分为两种：酸富集(