（基础兽医学专业论文）dvs乳酸菌种菌株传代和保存与遗传稳定性分析.pdf

摘要 摘要 乳酸菌已由过去的单纯应用于食品领域发展至现在已广泛应用丁人畜的防病治病及保 健等许多方面，因而乳酸菌制品的分离和保存就显得极为重要。较常用的乳酸菌有舣歧杆菌、 乳杆菌、链球菌等。正常条件下，乳酸菌较难分离和长期保存。直投式酸奶发酵剂( d v s ) 中的乳酸菌菌株只能在分离之后稳定传代3 次左右，如果长期传代则发酵性能变得不稳定， 使发酵乳产品质量下降。有关乳酸菌菌株在传代和保存过程中的遗传稳定性分析在国内外均 未见报道。本研究从d n a 水平、表型特征、全细胞蛋白质变化及发酵特性等生物学特性方 面对从直投式酸奶发酵剂中分离出来的3 株乳酸菌菌株传代和保存过程中的遗传稳定性进行 分析为建立乳酸菌传代和保存方法及开发d v s 菌种提供实验依据。 实验结果表明：在p y 改良培养基当中，乳球菌和杆菌1 可稳定传代1 5 次，r a p d 结果、 表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性无明显变化；而杆菌2 可稳定传代1 0 次。4 保存过程 中，乳球菌r a p d 结果、表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性均无明显变化，可连续保存至 3 0 d ；杆菌1 和杆菌2 可连续保存至1 5 d 。以p y 改良培养基加入1 5 甘油为保护剂于一8 0 冷冻保存过程中，乳球菌可保存3 0 d ，表型特征、全细胞蛋白质和发酵特性无明显变化：杆 菌1 、杆菌2 可保存1 5 d 。冻干保存前后3 个d v s 菌株均无明显变化，提示冻干法是乳酸菌 菌株长期保存的最佳方法之一。 本研究建立了适合d v s 菌株传代和保存的方法，同时也为建立一套完整、科学的检验 微生物传代和保存过程中遗传稳定性分析方法提供了实验依据。 关键词：d v s 菌株；传代：保存：遗传稳定性；r a p d 东北农业人学农学预卜学位论文 i i i i i r e s e a r c h0 ns u b c u l t u r ea n d s t o r a g e 【e t h o da n dg e n e t i ca n a i y s i so f l a c t i c a c i db a c t e r 【as e p a r a t e df r o md v s a b s t r a c t l a c t i c a c i db a c t e r i a ( l a b ) a r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nn a t u r ea n de x i s tn a t u r a l l ya si n d i g e n o u s m i e r o f l o r ao fg r a m p o s i t i v eb a c t e r i ai nr a wm i l ka n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nm a n yf o o da n df e e d f c r m e n l 【a t i o n s l a bi n e l u d el a c t o b a c i l l u s ，l a c t o c o c c u s ，p e 出o c o c c i j 3a n dl e u c o n o s t o c ，e ta 1 1 1 1 e ys t r o n g l yd e t e r m i n et h ef l a v o u r , t e x t u r ea n df r e q u e n t l yt h en u t r i t i o n a lv a l u eo ff o o da n df e e d p r o d u c t s i ti sv e r yd i f f i c u l tt os e p a r a t ea n ds t o r el a t t i ca c i db a c t e r i a l a c t i ca c i db a c t e r i as e p a r a t e d f r o md i r e c tv a ts e t v s ) c a bo n l ys u b c u l t u r e3t i m e s t h e r eh a s h ta n yr e p o r to nt h eg e n e t i c s t a b i l i t yo fl a c t i ca c i d b a c t e r i ad u r i n gs u b c u l t u r ea n ds t o r a g er e c e n t l y , t h i ss t u d ye v a l u a t e dt h e g e n e t i cs t a b i l i t yo ft h e3 l a c t i ca c i db a c t e r i as t r a i n sw h i c hw e r es e p a r a t e df r o md v sd u r i n g s u b c u l t u r ea n ds t o r a g eb yt h ef o l l o w i n ga s p e c t s ：d n ap a t t e r n sc h a n g e so fr a p d ，t h ew h o l ec e l l p r o t e i ns d s - p a g e ，f e r m e n t a t i o np r o p e r t i e s ，m o r p h oo g i c a lf e a t u r e s t h e r e s u l t sd i s c o v e r e dt h a ts t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u sa n dl a c t o b o c i l l u s ，c o u l db e s u b c u l t u r e di ni m p r o v e dp ym e d i u mf o r15t i m e s ；l a c t o b a c i l l u s2c o u l db eo n l ys u b c u t u r e d1 0 t i m e s t h er a p dp a t t e r n s ，m o r p h o l o g i c a lf e a t u r e s ，s d s p a g e ，f e r m e n t a t i o np r o p e r t i e so f s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sd i d n tc h a n g eal o td u r i n g4 cs t o r a g e ；s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s c o u l db es t o r e di n4 f o r 3 0 d ；l a c t o b a c i l l u sja n dl a c t o b a c i l l u s2c o u l db es t o r e di n4 f o r1 5 d ； d u r i n g 一8 0 2s t o r a g es t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u sc o u l db es t o r e d f o r3 0 dw h i l el a c t o b a c i l l u s1 a n dl a c t o b a c l u u s2c o u i db es t o r e df o r1 5 dw i t h o u tm u c hc h a n g e ；t h eb e s tc h o i c et os t & el a t t i c a c i db a c t e r i as e p a r a t e df r o md v sf o ral o n gt i m ei sb y l y o p h i l i z a t i o n t h ep r e s e n ts t u d yh a ss e tu pt h em e t h o d st os u b c u l t u r ea n ds t o r el a c t i ca c i db a c t e r i as t r a i n s s e p a r a t e df r o md v st h r o u g hm o r p h o l o g yo b s e a r v a t i o n ，f e r m e n t a t i o np r o p e r t i e s ，s d s - p a g ea n d r a p da n a l y s i s t h i si st h ef i r s tt i m et ou s er a p dt e c h n i q u ea sat o o ft oa n a l y s i sl a bs t r a i n s p r o p e r t yc h a n g ew h e nt h e ya r es u b c u l t u r e da n ds t o r e d k e yw o r d s ：d v ss t r a i n s ；s u b c u l t u r e ；s t o r a g e ；g e n e t i cs t a b l i l i t y ；r a p d i i l i uy a h f e n b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e a s s o c i a t ep r o f g a ox u e j u n 孳 言 1 写| 言 1 1 乳酸菌 1 1 1 乳酸菌基本概况 乳酸菌属于真细菌纲( e u b a e t e r i a c ) 真细菌曰中( e u b a c t e r i a l e s ) 的乳酸细菌科 ( l a c t o b a c i l l a c e a e ) 。乳酸细菌科根据细胞黾球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 革兰氏染色阳性，生殖方式为裂殖。发酵碳水化合物产生乳酸，有些菌种可产生甲酸、乙酸、 丙酸、丁酸、戊酸、乙醇和c 0 2 。接触酶阴性。微好氧到厌氧( 施安辉等，2 0 0 1 ) 。乳酸菌有 9 个属；其中5 个属呈球状，如乳酸球菌l a c t o c o c c u s 、迷走球菌v a g o c o c c u s 、链球菌 s t r e p t o c o c c u s 、明串珠菌l e u c o n o s t o c 和片球菌p e d i o c o c c u s ；四个属呈杆状，如肉食杆菌 c a r o n o b a c t e r i u m 、乳酸杆菌l a c t o b a c i l l u s 、双歧杆菌b i f i d o b a c f ，i u r a 和孢子乳酸菌 s p o r o l a c t o b a c i l l u s 。这些菌都和乳酸发酵有密切关系其中乳酸杆菌和双歧杆菌与人畜机体 保健更为密切( 赵红霞等。2 0 0 3 ) 。 乳酸菌具有较多的生物学功能，主要包括：促进营养成分的分解、吸收；乳酸菌的菌体 蛋白可增加蛋白质含量；抑菌抗病，增强消化系统机能；杀死具有抗药性的细菌，增加免疫 功能；维持和改善机体正常机能：抗癌功能：乳酸菌还可提高食品的贮藏性能延长贮藏时 间，并可赋予发酵产品特有的风味，酸奶就是具有良好风味的食品。 乳酸菌由于其众多的生物学功能而应用广泛。利用乳酸菌发酵乳糖产生乳酸而促使牛奶 凝固并产生乙醛等风味物质从而制得的酸牛乳即酸奶，以其丰富的营养而倍受人们欢迎，消 费量日益增多。利用乳酸菌的发酵特性还可生产出风味独特的饮料以及肉制品( 敬思群， 2 0 0 2 ) ，而且在葡萄酒、酱油发酵1 二业中也能起到提质增香的独特作用。 另外乳酸菌在医药领域也得到了，“泛的应用。乳酸茵制剂中的乳酸菌存在于动物和人 的肠道内，防止异常发酵，有调整肠的作用。例如，乳酶生片每克含活粪链球菌l0 0 0 万个 以上，口服后在肠道内生长繁殖，可起到整肠、助消化的作用。 在饲料工业上，乳酸菌饲料是目前新的研究亮点。乳酸菌饲料能通过产生酶类及微生物 营养素来增加畜禽的营养作用，同时还通过竞争性抑制使有益微生物增加、潜在致病菌减少 而增强机体特异性免疫功能。而其中乳酸菌发酵所用的原料，主要是农副产品加工中的下脚 料。其来源广泛，成本较低。目前已成为我国饲料行业发展的一个新趋势。 1 1 2 乳酸菌研究进展 早在几千年前人们就已经开始食用乳酸菌发酵的食物，如乳酪、酸奶等( c a p l i c e ，1 9 9 9 ) 。 2 0 世纪初人们才开始规范发酵奶制品的工艺流程并开始对其：【：艺和误差进行系统研究。有关 乳酸菌的研究太大促进了发酵奶制品的生产工艺的发展。过去的5 0 年中，人们通过各种可能 对其产生影响因素的研究获得了有关乳酸菌的遗传学、生理特性和生化特性的各种知识。对 这种微生物的深入了解使得生产商们能够通过选择更好的菌种和发酵二 艺来获得高产、优质、 安全的产品。 东j 表韭太学农掌蘸士学位论文 目前人们已使用直投式黢奶发酵剩代替传统的混台发酵剂。从菜种稷发上讲，这样就可 黻有效的解决噬菌体感染的闻题。但怒直投式酸奶发酵翔也在发酵乳中产生了复杂扮混合风 味，从而使得对酸奶发酵剂中乳酸菌的研究成为一个巨人挑战。 深入研究乳酸菌的必要条件就是能够准确的鉴别乳酸菌。西方发达国家在发酵剂所用菌 株鉴定方面研究比较透彻。过去的几年中，研究者们使用了多种分子分类学技术鉴别乳杆菌， 以克服传统分类方法的缺陷。这些方法包括全细胞蛋白s d s - p a g e ，肽聚糖水解酶电泳基 因方法如使用特定低聚核苷酸探针来进行常规和逆d o t b l o t 杂交，d n a 指纹图谱技术等。 s a n d r a ( 1 9 9 9 ) 等人根据已有的德氏乳杆菌保加利韭_ 弧种的脯氨酸亚氨基肽酶基因序列数据 设计特殊引物，建立了一个鉴定分离p c r 系统，用于德氏乳杆菌保加利亚亚种和德氏乳杆菌 乳酸亚种的区分，为清晰迅速地鉴别乳酸菌菌种及菌株打开了新局面。 另外，人们目前已经获知保加利亚乳杆菌的基因组分子量约为2 3 m b ，g c 含量约为5 0 ， 其中一个隐性质粒的基因已经完成测定。对其基因组的全序列确定将使得人们可以在基因水 平上进一步了解保加利, x - l 杆菌在奶产品中的作用，弗可以很好地控制其在食l i ! l 中的生物学 功能。 基于对乳酸菌长期的安全使用，人们已经开始着手使用乳酸菌作为某些疫苗的安全载体 ( w e l l s e t a l 2 0 0 3 ；m e r e e n i e r ，e t a l2 0 0 0 ) 。乳酸菌也以其微小的基因组差异使自己成为食品 工业和治疗用的食品级菌种，获得了研究者的青睐。 由于生产企业的需求，乳酸菌的代谢工程研究成为当务之急，目前，乳酸乳杆菌( l a c t o - c o c c u sl a e t i s ) 的遗传学和代谢工程已经完成。2 0 0 1 年( b o l o t i n ，2 0 0 1 ) 乳酸乳杆菌全基因 组的公布加速了对于乳酸菌代谢工程的研究进程。也有研究人员对乳酸乳杆菌做了大量、全 面的综述工作。而且，近来对两株嗜热链球菌的全基因组测序1 ：作已经完成，第三株的工作 也已接近完成( b u r g e s s ，2 0 0 4 ；s y b e s m a ，2 0 0 4 ) 。 但是，目前研究中应用的方法大都建立在基因扩增的基础之上。这一缺陷限制了基因研 究的进步。尽管目前已有办法将外来基因导入嗜热链球菌，但是可靠的、稳定的方法仍有待 探索。最近研究表明。t h e t a 型复制的质粒( t u r g e o n ，2 0 0 4 ) 可以作为向嗜热链球菌中导入诸 如半乳糖激酶( v a i l l a n c o u r t ，2 0 0 4 ) 和* 半乳糖苷酶基因( l a b r i e ，1 9 9 0 ) 的合适载体，这意 味着此问题将会逐步解决。嗜热链球菌的全基因组的破译也为研究其转录、翻译起始信号以 及密码子选择提供了决定性的信息。这也可能有助于人们建立更为有效的表达系统。 全面的研究乳酸菌的代谢机理及探明其如何适应外界刺激是透彻研究乳酸菌的必要基 础。乳酸菌全基因组序列的获得将使我们更好地研究其代谢机制。人们可以借助这些突破更 容易的在乳酸菌中导入其他有用的基因，生产出具有特殊功能的乳酪、酸奶等乳制品，使其 成为一个容易为人所用的细胞工厂。另外，乳酸菌全基因组的获得也使人们拥有了研究细菌 群落的进化以及研究乳酸菌在复杂的发酵进程当中对环境改变适应的机制。 1 2 乳酸菌的传代培养和保存方法 1 2 1 乳酸菌的传代培养方法 乳酸菌都能发酵糖类产生乳酸。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型发酵；凡发酵产物 2 等l 骞 中除乳酸外还有乙酸、乙醇、c 0 2 和香味成分者，称为异型发酵。 1 2 1 1 乳酸菌对营养物质的特殊要求 在培养乳酸菌的过程中除了要供给适量的水分、碳源、氨源和无机盐类外，还需要加入 维生素、氨基酸和肽等。大多数维生素是辅酶的组成结构，如烟酸经氧化生成烟酰胺，烟酰 胺是n a d ( 辅酶i ) 和n a d p ( 辅酶i i ) 的组成成分通过烟酰胺的氧化还原催化生物氧化 作用。氨基酸是许多乳酸菌所需要的生长因素，这与它们缺乏合成这些氨基酸的酶有关。在 有些情况下，细胞可以利用肽而不能利用氨基酸这是由于细胞对单个氨基酸的不渗透性造 成的。小分子肽很容易进入细胞，并随之被肽酶水解成氨基酸。 某些乳酸菌对生长因素的要求如表1 - 1 所示。 表1 1 某些乳酸菌对生民因素的要求 t a b 1g r o w t hf a c t o r so f s o m el a c t i ca c i db a c t e r i a 实验室培养乳酸菌时。需在培养基中加入一定晕的酵母膏、蛋白胨、牛奶或肝脏提取物 等营养物质，所以给利用乳酸菌进行工业化生产带来不便。对此，国内外的有关科技人员在 探讨廉价的促生长因素方面做了大量的工作。例如，日本研究人员就专门对乳酸菌的廉价培 养基进行了详细的研究。他们把玉米浆和鱼的下脚料以3 ：1 1 ：3 的比例加到糖蜜里作培养乳 酸菌用。国内的科技工作者，在研究利用西红柿汁、油酸、吐温8 0 等促进乳酸菌的生长方 面做了大量的工作。故在培养乳酸菌时，要适量加入以上物质。 1 2 1 2 乳酸菌与氧气 由于乳酸菌种类繁多，因此不同的菌种对氧气的需求也不尽相同。氧气与培养液中的n h 值的高低，对于乳酸的产量有一定的影响。在微厌氧的条件下，连续培养保加利亚乳杆菌 a t o b a c i l l u sb u l a g r i c u s ) ，当培养液的p h 由酸性变为碱性时。则会由同型乳酸发酵转化为异 型乳酸发酵，使乳酸的产量减少。在碱性条件下，乳酸盐脱氢酶的生物合成能力下降，而在 酸性条件下则会增加人们在酿造和发酵食品的生产过程中对这个问题比较关注。 1 2 1 t 3 乳酸菌与温度 温度是影响微生物生长繁殖的最重要理化因素之一，每种微生物都有自己的最适生长温 度，乳酸菌也不例外。随种类不同，不同乳酸菌的最适生长温度也不同，如来源于乳品的乳 杆菌的最适生长温度为3 7 ，而其他生境分离物也一般在3 0 c 左右培养低温来源的在2 2 ( 2 培养。 1 2 1 4 乳酸菌的传代 表j 寂渡太学农学疆士学位论文 。, , , , , i i 一一i l l l l l l l 一| l l 目_ 传代篆指细腿在墙养皿中生长一段对间之簿被分开接种到新的培养皿中。乳酸菌传代时 闻成选择程菌株处予生长蘸线的对数期至稳定期之闻，这样有利予保持菡种的性状稳定。并 鼠，培养溆度和培养环境也尽量不要波动，这样保证每次的传代中菌种都程同样的条件下繁 臻生长，馒菠季孛韪够援持均衡生长葬攘迟老拖。 1 2 2 乳酸菌的保存方法 乳酸菌菌种保藏成活率较低。乳酸苗主要的保藏方法包括以f 几种： 1 2 2 1 定期移植法 该法包括斜面培养、液体培养和穿刺培养等。这些是最早使用而且现在仍然普遍采用的 方法。该法是将在适宜培养基上生长良好的培养物，通常是使用对数生长期后期的细胞( 乳 酸菌一般是培养1 8 2 4 h 的培养物) 将其放置到低温处保存，使其停止生长或缓慢生跃。按 细菌在此条件保藏的不同存活期限进行定期移植。 液态活菌保藏成本低，营养丰富，但是保存期短( 韩雪等，2 0 0 3 ) 。其主要原因就是乳 酸菌在保藏过程中仍能继续生长、代谢，产生的乳酸可使培养基p h 下降，造成乳酸菌死亡。 目前，日本把培养的乳酸菌制成悬浮液密封在包装材料里( 包装材料可用合成树脂薄膜 制或用铝箔制成) ，其装量可根据具体情况而定，最少可为5 ml ，最多可为10 0 0 ml 。封 好的乳酸菌悬液，一定要保存在3 0 以下，最好在0 1 0 保存。 也可以将生长良好的培养物等量地与无菌甘油混合保存丁一2 0 c 或一8 0 ，可延长保存 期。 1 2 2 2 冷冻干燥法 乳酸菌的长期保藏方法多采用冷冻干燥法，简称冻干法。其基本原理是：菌体与保护介 质混溶，在共溶点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空f ，使菌品中的冰晶升华， 除去菌品中的多余水分，获得一定含水量的干燥发酵剂。关键的影响因素是冻干保护介质， 它不仅影响发酵剂在冻干过程中细胞存活率。还影响保藏期间细胞的稳定性( 栾金水，2 0 0 4 ) 。 这种方法保存期长，许多微生物用此法可保存i o 年以上，甚至2 0 年。因此各国采用冻 千法为保藏菌种的主要手段。冻千保藏的菌种其培养条件和菌龄对细菌的存活力都有影响。 对乳酸细菌一般要求都用最适宜的培养基和温度进行培养。 1 2 2 _ 3 液氟超低温保存法 虽然冻干法广泛用于保存各种微生物，但是用它冻干高度组织化的高等生物细胞存活率 却极低。近年来又发现冷冻干燥对一些微生物是致突变的，因此更促进了超低温冻结技术的 发展。采用液氮保存菌种能够更稳定的保持菌种原有的性状并且存活较好。 1 3 遗传稳定性的研究技术 对生物的遗传稳定性分析包括表型、细胞学、生化性质及分子生物学方面的监测。由于 染色体在生物的传代和保存过程中能够保持一定的稳定性和连续性，因此d n a 水平上的检 测是遗传稳定性研究中最常用的。而在众多的分子生物学检测技术当中r a p d 技术是最常用 的检测变异的手段之一。生化性质、表型分析这些手段虽然可用于检测生物的遗传稳定性， 但是它们也经常受到环境的影响，因此采用多种检测技术相结合评估生物的遗传稳定性是科 4 学可靠的方法。 1 3 1 动植物遗传稳定性的研究技术 在动植物的遗传稳定性研究方面一直以来报道比较少，国内开展的针对动植物遗传稳定 性的研究较早，其主要核心技术就是r a p d 技术。檬淑芳等( 2 0 0 3 ) _ h j5 条随机引物分析 n j s 小鼠( n j s 近交系小鼠是由中国人民解放军南京军区总医院实验动物中心在固定的普通 日粮下。通过全同胞交配和逐代定向选择培育而成，呈自发性高胆固醇血症和动脉硬化) 及 其亲本小鼠的遗传结构。结果两种小鼠均有相同的扩增片段且产生了各自的特异性条带；n j s 小鼠不同个体问拥有的r a p d 条带也具有差异，但拥有相同条带的个体小鼠比率较高。证明 n j s 小鼠个体间具有较好的遗传一致性和遗传稳定性，其群体分化程度处在一个较低的水平。 传统的监测人蚤种群遗传变化的方法是同工酶谱法。鲁亮等( 1 9 9 9 ) 运用交叉传代法保持种 群的遗传稳定性的同时还利用r a p d 技术对人蚤试验种群遗传结构的时间变化做了监测，以 确认遗传结构的稳定和传代方法的有效性，结果表明在5 个时间内人蚤试验种群的遗传结构 没有发生大的变化。 陈亮( 1 9 9 9 ) 等应用r a p d 技术对汝城早芽、云桂大叶等5 份茶树优质资源及其扦插后 代的遗传稳定性做了分析，结果显示多个随机引物在5 份茶树优质资源及其扦插后代的 r a p d 扩增结果在资源内是一致的，从而证明了这5 份茶树优质资源在无性繁殖前后在d n a 分子水平上的遗传是稳定的。林定波等( 1 9 9 9 ) 对通过芽变和实生变异途径获得的柑橘抗寒 细胞变异体及其再生植株与供体d n a 水平上的检测发现，r a p d 结果证实了供体与变异植 株可能在d n a 水平上存在细微的差异。但是在抗寒能力上变异植株显现出连年增高的趋势， 并且能基本保持遗传稳定。章志宏等( 2 0 0 0 ) 采用r a p d 方法对不定芽超低温保存的再生植 株与原始的单倍体植株进行分析，结果证明，经过超低温保存屙的再生植株在d n a 水平上 仍具有较好的遗传稳定性。 国外研究人员近年研究植物传代和保存过程中的遗传稳定性，常用技术除凡p d 外还包 括h p l c 等主要针对植物生物学特性方面的检测，从而更为完善地评价植物在传代利保存过 程中的遗传稳定性。l u i s a ( 2 0 0 4 ) 用4 0 种随机引物对醋栗的扦插后代进行了遗传稳定性分 析，尽管发现这些扦插后代在4 年后的生长参数与供体相比稍有变化，但是其r a p e ) 的结果 显示其d n a 多态性与供体无明显差异。 s o n a l i ( 2 0 0 3 ) 在对冻干保存后的黄独( d i o s c o r e ab u l b i f e r el ) 胚芽的遗传稳定性分析 中采用了r a p d 技术，对保存前后的培养组织的d n a 进行分析，并采用高效液相色谱法 ( h p l c ) 对其产生薯蓣皂甙元的变化进行分析，并结合表型观察，即从分子生物学、生物 化学以及形态学等方面对黄独冻干保存胚芽的遗传稳定性进行了全面的分析，结果证明其遗 传稳定。z h a i 等( 2 0 0 3 ) 用r a p d 方法对葡萄植株和其冷冻保存后繁殖的幼芽的遗传稳定性 进行分析。证实r a p d 技术是一种快速、简便、有效的评估冷冻保存材料遗传稳定性的方法， 这一方法不失为一种对研究冷冻保存材料的其他方法的有效补充。 1 3 2 微生物遗传稳定性研究技术 影响微生物生长的外界因素很多，当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形 5 末慧农建大学表掌壤士学寝谂文 态、生理、生长、壤殖等特镊的改变；当环境条件的变化超过一定极限对，则导致微生物的 死亡。 l _ 3 2 1 真菌的遗传稳定性分析技术 有关真菌的遗传稳定性研究对象主要集中于食用苗和植物的致病菌上，方法较多。郑文 明等( 2 0 0 0 ) 通过对感染小麦条锈菌ps t r i i f o r m fs p t r i t i e i 模式菌系的叶片和常用繁殖寄主 健康叶片总d n a 进行s o u t h e r n 分析，结果显示其基因组中的特异p s r 基因位点在有丝分裂 中是稳定遗传的，此方法可以用于真菌如小麦条锈菌的遗传分析。s i n g l ( 2 0 0 4 ) 应用r a p d 和1 6 s 2 3 s r d n a 内转录间隔区序列p c r ( i t s - p c r ) 方法对在超低温保存4 2 个月之后的蘑 菇菌株进行了遗传稳定性的分析，结果证明超低温保存后蘑菇菌株具有较好的遗传稳定性a 凌霞芬等通过观察菌落形态、生理生化特性和d n a 水平等方面研究般孢蘑菇菌株在4 c 冰箱 保存后的遗传特性，并用r a p d 方法对不同保存时间的样品进行分析，证明叔孢蘑菇在4 c 冰箱保存过程中遗传稳定。 1 3 2 2 细菌的遗传稳定性分析技术 针对细菌的遗传稳定性的研究方法多样。j o n a s ( 2 0 0 0 ) 在对苏力菌以色列变种( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i ss u b s p i s r a e l e n s i s ) 基因组的遗传稳定性研究过程当中采用了多位点酶电泳 ( m l e e ) ，r a p d 、脉冲场电泳( p f g e ) 和s o u t h e r nb l o t t i n g 等方法分别从基因组、生化 特性及特有蚊毒性基因等方面进行了分析，结果证明所有受试菌株均属于苏力菌以色列变种 h 1 4 型，并且这些菌株之间还发生了基因的转染。 n i e l s e n ( 2 0 0 3 ) 采用p e n n e r 热稳定血清型检验、h a e l l l 内切酶自动分析、脉冲电泳、r a p d 方法等4 种检验方法来检验3 种空肠弯曲杆菌( c a m p y l o b a c t e r j e j u n i ) 传代5 0 次后的血清型 和基因型的稳定性。这些菌株总共在小鼠体内转接共2 6 天，结果表明无论在体内还是体外， 这些菌株的d n a 条带都没有变化。然而其中1 株在小鼠体内繁殖后无法判断其类雪! ! 。其他 1 1 株分属4 个基因型的菌株均传代1 0 次以检验其稳定性。p f g e 结果和血清型结果都显示没 有变化。但是有3 株菌在混合培养基中表现出了不稳定性，这就可以解释这3 株菌d n a 条 带的变化。最终试验结果表明来源不同的空肠弯曲杆菌菌株是遗传稳定的。 综上所述，尽管近年来生物遗传稳定性研究逐渐增多，方法也多种多样，并且均衡考虑 了表型、生物学特性及分子水平上的分析检测。但是，完善可靠的检验动植物、真菌及细菌 传代和保存过程中的遗传稳定性的程序仍需逐步建立。 1 4 本研究的目的和意义 目前大型的乳品企业在生产酸奶时常用直投式发酵剖( d i r e c t v a t s e t ，d v s ) ，其作用一 是发酵出的酸奶质量稳定，二是操作方便。但直投式发酵剂要求活苗含量很高。直投式发酵 剂的生产，通常是先将不同的乳酸菌菌株在发酵罐中进行单菌种高密度培养，然后过滤( 或 高速冷冻离心) 分离菌体后，加保护剂后冷冻干燥，按比例混合后包装，此过程比较复杂。 而且目前国内乳品厂使用的绝大多数为进口酸奶发酵剂由于其是由2 种或2 种以上的乳酸 菌混合而成，所以无法传代，即使可以传代，也仅仅限制于3 代以内，超过这一范围则发酵 性能不稳定，无法投入生产。d v s 菌株在传代和保存过程中的发酵性能、生物学特性等是否 能够稳定遗传尚属未知，这大大限制了国内d v s 乳酸菌种的开发和研制工作。 6 号l 富 本研究执表型、生物学特性以及分子水平上对传代和保存过程中的d v s 菌株的遗传稳 定往避苻研究。采掰r a p d 方法对d v s 藩棘翡染色律d n a 送行援测，躐察其整香在传代黧 保存过程中存在变化；以s d s p a g e 方法对传代和保存过程中d v s 菌株的全细胞聋匀质的 燮纯进 梭潮，作势辕动摇豁；在传代和保存过程孛观褰乳酸毽拣的表型变化：监测其在不 同时间对乳的发酵健能的变化。本研究将为建立适台乳酸菌d v s 菡株的传代和傈存方法提供 理论和实验依据，井为开发和生产我闰自主研制的直投式酸奶发酵剂提供研究基础。 7 东托农照丈学表掌碉圭学位论文 2 1 实验材料 2 材料与方法 2 1 1 实验用菌株 e z a l m y 9 6 型d v s 乳酸菌种，从中分离到1 株乳球菌和2 株乳杆菌。其中乳球菌为嗜 热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 、杆菌1 为德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i a s pb u l g a r i c u s ) ，杆菌2 为未知乳杆菌a 2 1 2 培养基 2 1 2 1 分离培养基 乳球菌用m 1 7 琼脂培养基：大豆蛋白胨5 9 ；聚蛋白胨5 9 ：酵母提取物5 9 ；抗坏血酸o 5 9 ； b 甘油磷酸二钠l l g ；l m o l lm g s 0 4 7 h 2 0 l m l ；乳糖5 9 ；调节p h 值为7 1 ，加蒸馏水至 1 l ( 其中含琼脂1 5 9 ) ，1 2 1 3 0 r a i n 灭菌备用。 乳杆菌用m r s 琼脂培养基：蛋白1 0 9 ；牛肉膏1 0 9 ；酵母提取物5 9 ：k 2 h p 0 4 2 9 ；柠檬酸 二铵2 9 ；乙酸钠5 9 ：葡萄糖2 0 9 ；吐温8 0 1 m l ；m g s 0 4 7 h 2 0o 5 8 9 ；m n s o + 4 h 2 0 0 2 5 9 ； 调p h 值6 2 6 4 加蒸馏水至i l ( 其中含琼脂1 5 9 ) ，1 2 1 c 3 0 m i n 灭菌备用。 2 1 2 2 增殖培养基 乳球菌和乳杆菌的增殖培养基均采用p y 改良培养基( 靳淼等，中国乳品工业2 0 0 3 ) ： 蛋自胨o 5 9 ；水解乳蛋白o 5 备酵母提取物1 o g ：盐溶液4 o m l ：加蒸馏水至1 0 0 m l 其中 另加质量分数为0 5 的乳糖和0 5 的葡萄糖。 2 1 2 _ 3 糖发酵培养基 采用p y 培养基：蛋白胨o 5 9 ；水解乳蛋白o 5 9 ：酵母提取物1 o g ；盐溶液4 0 m l ，加 蒸馏水至1 0 0 m l ，在此基础上加需发酵的糖各1 0 9 。 2 1 2 4 保存培养基 采用p y 改良培养基，一8 0 c 保存时加入1 5 甘油。 2 1 2 5 复壮培养基 乳球菌和乳杆菌分别采用液体m 1 7 培养基和液体m r s 培养基。 2 1 2 6 冻干保护剂 球菌用质量分数为】o 2 0 的脱脂乳，3 乳糖，3 酵母浸粉。杆菌同上，只是3 乳糖改为3 葡萄糖。 2 1 3 试剂及药品 大豆蛋白胨，聚蛋白胨，酵母提取物，抗坏血酸，b - 甘油磷酸二钠，1 m o l lm g s 0 4 7 h 2 0 ， 乳糖，蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物，k 2 h p o + ，柠檬酸二铵，乙酸钠，葡萄糖，吐温8 0 ， m g s 0 4 7 h 2 0 。m n s 0 4 4 h 2 0 ，水解乳蛋白，木糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇等均购自哈 尔滨伊世达生物有限公司。 8 耪辩等方洼 警皇量量鼍删舞曼皇蔓皇蟛篇皇皇皇i l l l 曼嘟糟鲁舅笪邕寰燃皇量皇邕曹懋| 詈量邕掌蔓舅! 曼篁燃曩牌 s d s ，溶菌酶，鬣白酶k ，n a c i ，c t a b ，筑仿，异戊醇，酚，乙醇，t e ( ir i s - h c ie d t a ) ， 氍上试荆均为分褥缝，购蠡上海华辩。 乳球菌适宜引物序列：5 - t t c g a g c c a g 。3 杆菌1 避宜引物序列：5 - g t c c c o a c g a - 3 ， 耪蓥2 透童；l 携j 葶捌：5 - t g a g t g g g t g - 3 ，溶萤酶，以上试剡均购自上海博亚生物技术公 司。d n ad l 20 0 0m a r k e r 、而q 酶等均贿自大连宝生物基囡工程公司。中分子斌鬣蛋白璇 m a r k e r 购自上海华舜生物工程有限公司。 2 1 4 实验用仪器 d h 计( s a n o r i u s p b 2 0 ) 、培养箱( 天津泰斯特) 、离心机( 上海安亭) 、恒温摇床( 哈尔 滨东联) 、紫外分光光度仪( 山东高密) 、凝胶成像系统( 上海天呈) 。p c r 仪( 杭州大台热 磁有限公司t c 1 6 - i 型) ；稳压稳流电泳仪( 北京六一d y y - 5 型) ：电泳槽( 北京六一d y c p 2 4 a 型) 。 2 2 实验方法 2 2 1 乳酸菌菌株的分离鉴定 取d v s 干粉用生理盐水稀释9 个梯度，分别接种于m 1 7 和m r s 琼脂培养基，球菌在 恒温培养箱中4 2 c 培养2 4 h 后，革兰氏染色，镜检观察；杆菌在恒温培养箱中3 7 c 培养7 2 h 后，革兰氏染色，镜检观察( m o r a ，2 0 0 2 ) 。2 株乳杆菌为混生所以需多次划线分离至完全分开 为止。 采用1 2 种糖鉴定这3 个乳酸菌菌株，即在p y 基础培养基中分别加入蔗糖、山梨醇、纤 维二糖、海藻糖、乳糖等1 2 种糖，将3 株乳酸菌分别接种入各个培养基中，每个糖做3 0 个 平行，由糖发酵结果鉴定乳酸菌菌株。 2 2 2 乳酸菌菌株的传代 2 2 2 1 乳酸菌菌株的传代 根据3 株乳酸菌进入对数生长期的时间不同，将分离出的3 株乳酸菌分别接入改良p y 培养基，乳球菌于4 2 2 培养，每1 2 h 传代一次；乳杆菌于3 7 c 培养，每2 4 h 传代一次。均按 2 接种。 2 2 2 _ 2 乳酸菌菌株传代过程中形态观察 传代培养过程中于每次传代之前观察各个菌株菌液状态及镜f 形态的变化情况。 2 2 - 3 乳酸菌菌株的保存 2 2 3 1 乳酸菌菌株4 保存 分别将3 个乳酸菌菌株增殖至1 0 8 个m l ，将菌体悬浮于与增殖培养基相同的p y 改良培 养基中，置于4 c 冰箱中保存，每个菌株取5 个平行。 2 2 3 2 乳酸菌菌株一8 0 c 保存 分别将3 个乳酸菌菌株增殖至1 0 ”，m l ，将菌体悬浮于含1 5 甘油的p y 改良培养基中， 9 末l 农娩大学农学弼，l ：学链论文 一 l l ll , i 曼置皇鲁鼍鼎蕙皇皇皇邕詈曼曼燃舞皇曼曼曼兰燃邕曼曼毫鼍囊曼量一 鹫子一8 0 c 冰箱中保存，每个麓株取5 个平行。 2 2 3 - 3 季i 鞭菌菌撩冻手僳存 分别将3 个乳酸菌菌株增猜至1 0 8 个m l ，将菌体悬浮丁各自的冻干保护剂中，冻千，千 耪爨存予一鞠臻箱审。 2 2 4 乳酸菌菌株的复壮 2 2 4 1 乳酸菌菌株4 保存过程中的复壮 在4 c 保存至i 、5 、l o 、1 5 、3 0 d 时分别复壮，其中乳球菌采用m 1 7 液体培养基，乳杆 菌采用m r s 液体培养基复壮，菌体增殖至1 0 8 个i m l 为复壮终点，记录复壮时间和形态变化。 2 2 4 2 乳酸菌菌株- 8 0 0 保存过程中的复壮 在一8 0 c 保存至1 、1 5 、3 0 d 时分别复壮，其中乳球菌采用m 1 7 液体培养基，乳杆菌采用 m r s 液体培养基复壮。 2 2 4 3 乳酸菌菌株冻干保存 在冻干保存后立即采用相应的液体培养基复壮这3 株乳酸菌，记录各个菌株的复壮时间， 以菌体增殖至1 0 8 个m l 为复壮终点，记录复壮前后的形态变化。 2 2 5r a p d 分析 2 2 5 1d n a 的提取 采用改良c t a b 法提取菌体d n a ，方法如下：菌液1 5 m l 丁4 c 50 0 0 r m 离心5 m i r a 所获沉淀加入5 6 7 p l t e ，3 0 p l l 0 s d s 和5 此溶菌酶( 1 0 m g m l ) ，3 7 c 作用1 2 h ；然后 加入3 皿蛋白酶k ( 2 0 m g m l ) ，于3 7 c 作用l h ；在所得溶液中加入1 0 0 p l5 m o l f l n a c i 溶 液和8 0 i _ t l c t a b n a c i 于6 5 水浴1 0 m i n ：加入等体积氯仿，异戊醇( 2 4 ：1 ) ，于4 c 1 2 0 0 0 r m 离心5 r a i n ，取离心后得到的上清。重复加八1 0 0 “l5 m o l l n a c l 溶液和8 0 p lc t a b n a c i 于 6 5 水浴1 0 m i n 。将得到的上清在加入等体积的酚，氯仿，异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，于4 c 1 20 0 0 r m 离心5 m i n ，最后得到的上清加入2 3 体积的冰乙醇( 一2 0 c ) 于4 120 0 0 d m 离心5 r a i n 。 得到d n a 沉淀加入1 0 0 p l t e ( p h 7 6 8 0 ) 溶解后待用。 取1pld n a 样品，稀释2 0 0 倍后，测定o d 2 6 0 和o d 2 8 0 。选取浓度1 8 一 o d 2 6 0 o d 2 8 0 2 0 的样品。然后，将d n a 浓度稀释至4 8 n g 此作为模板备并j 。 2 2 5 2r a p d 的引物和程序 从2 0 种引物中筛选出多态性良好的各个菌株的适宜引物序列。乳球菌适宜引物序列 为：5 - t t c g a g c c a g - 3 ，杆菌l 适宜引物序列为；5 - g t c c c g a c g a 3 ，杆菌2 适宜引物序 列为：5 - t g a g t g g g t g - 3 。 p c r 体系为2 5 p l ( 含t a qd n a 聚合酶2 u ，1 0 xp c rr e a c t i o nb u f f e r2 p l ，d n l 甲2 p l ， 引物l p l ，模板d n a l p l ) ，程序为：9 4 预变性5 m i n ；9 4 i r a i n ，3 8 c l m i n ，7 2 2 m i n ， 循环4 0 次；7 2 延伸1 0 r a i n 。 将扩增产物置1 琼