（特种经济动物饲养专业论文）家蚕先天免疫相关基因Bmimd的克隆、表达及序列分析.pdf

中文摘要 家蚕先天免疫相关基因b m 砌d 的克隆、表达 及序列分析 特种经济动物饲养专业硕士研究生：张雨丽 指导教师：夏庆友教授 摘要 家蚕是人类利用较早的经济昆虫。也是经典遗传学研究的模式生物之一家蚕对病害的 免疫力差，一直威胁着蚕业生产，所以蚕体免疫的研究不仅具有重要的产业价值，而且具有 模式研究的科学意义。研究表明，昆虫受到不同的微生物感染时能诱导不同的抗菌肽基因 表达，而这些抗菌肽基因的表达主要受两种信号转导途径的调控，即t 0 1 l 途径和h n d ( i m m u n e d e & i e n c y ) 途径。拥d 基因是i m d 途径中的一个关键基因，该基因在各个物种中的同源性很 低，对其作用知之甚少，现代分子生物学及遗传学等先进技术为其研究提供了有力的工具 本文拟在借鉴其它模式生物( 特别是果蝇) 中的先进研究成果基于家蚕全基因组信息，对 拥d 基因在家蚕中的同源体砌拥d 进行研究，为提高蚕体抗病能力打下基础，同时为研究家 蚕免疫机制提供理论依据，并可为昆虫免疫应答的分子机制研究提供极有价值的线索。 本研究的内容与结果如下： l 家蚕拥d 基因的克隆及序列分析 。利用家蚕e s t 数据电子克隆了果蝇砌d 基因在家蚕中的同源体，命名为砌砌d 。通过生物信 息学分析发现，砌l 砌砼长1 0 9 2 却，由3 个内含子和4 个外显子构成，编码2 5 0 个氨基酸，蛋白 预测分子量2 8 6 k d ，等电点是6 4 5 。s i g 眦i p 在线查找发现，廓”砌d 编码的第l 到1 9 个氨基酸为 信号肽。结构域分析表明。廓刀咖磋因在第1 5 2 个氨基酸到2 4 6 个氨基酸之间含有一个致死结构 域。蛋白质序列比对和c l u s t a l x 聚类分析表明，b m i m d 的碳末端致死结构域与哺乳动物的致死 结构域蛋白l u p 相似根据预测序列设计引物体外克隆占忉拥躔因的编码区序列。得到一条 长为7 5 0 b p 的目的片段，包含该基因完整的编码区 2 家蚕砌胁d 基因的原核表达 将8 删肌d 基因整个编码区序列亚克隆到p e t - 5 0 b ( + ) 表达载体，构建重组表达质粒，并将 该重组质粒转化到b l 2 l 表达菌株。通过i p r r g 诱导重组菌i 删| p e t - 5 0 b b l - 2 l 表达蛋白，得 到一个约9 7 l 【d 的重组蛋白。其中标签( 含两个6 h i st a g 和一个n 璐t a g ) 蛋白约6 8 k d ，目 的蛋白约2 9 k d 。与预测分子量相符合。表达条件的优化，发现最佳的诱导条件为3 7 、 o 4 锄啪l l i p t g 诱导5 h 。蛋白组分鉴定表明，诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式表达。 i 两雨人学硕f 学位论文 3 家蚕咖d 基因表达特性研究 利用家蚕全基因组芯片表达谱数据对砌l 砌d 基因的表达情况进行分析，发现其在5 龄3 天家蚕头中的表达量最高，在生殖腺、表皮和脂肪体中也有一定的表达，而在血液、马氏管 和丝腺中几乎不表达。 通过亲和层析和电洗脱的方法纯化原核表达的b i i l i m d 蛋白，制备抗体；w 宅s t e mb l o t t i n g 分析5 龄4 天家蚕i m d 蛋白在各组织中的表达情况，结果与芯片分析结果相似，表明砌咖d 基因在五龄末期家蚕各个组织中的m r n a 表达水平与蛋白表达水平一致，由此推测家蚕对砌d 基因的调控主要是转录水平的调控。 综上所述，本文成功的找到了昆虫先天免疫关键基因棚d 在家蚕中的同源体召加拥五并 对砌拥d 进行了体外克隆和序列分析，进而原核表达获得并纯化出b m i m d 蛋白，最后对该基 因在五龄末期家蚕各个组织中的表达特性进行了研究。从实验结果中可以推测出以下结论： ( 1 ) 砌砌d 可能是家蚕先天免疫信号传递i 砌途径中的一种配体，能够传递病原刺激信号。 ( 2 ) 家蚕对砌d 基因的调控主要是转录水平的调控，所以一旦受到病原刺激，机体可以在较 短的时间内表达出该蛋白，进而调节机体表达出大量的抗病效应物，以最快的速度抵御病原的 感染。( 3 ) 家蚕h n d 信号途径极有可能与果蝇一样，不仅参与全身性体液免疫还与局部免 疫有关。 关键词：家蚕先天免疫砌d 原核表达基因克隆 n 央又碉要 c l o n i n g ，e x p r e s s i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i so f b m z 聊d ，a ni n n a t ei m m l 】n i t y r e l a t e dg e n ei nt h e s i l k w o m ，b d 聊6 班聊d 力 r a i s i n go fs p e c i a le c o n o 觚ca n i m a lm a s t e r c a n d i d a t e ：z h a n g1 y u 1 i a d v i s i o r ：p i o x i aq i n g - y o u a b s t r a c t s i l l 【w 锄i sn o to m yo r 圯o ft l l ef i f s te c o n o n l i cd o m e s t i c a t e di i l c t s ，b u ta l s o eo ft h em o i d c l 优彤m i 鲫峪f b fc l 弱s i c a lg t m e t i c s 他a 比h a n di th 舔w e a ki l l m 删t ya g a 岫s td i 辩a ，w h i c ha l w a y s t l l 陀a t c n e dt l l e 刚c u l t i l 他s 0s t u d y i l l m l 眦l i t yi i l 曰d 历6 畛朋d w i l l to i i l yb r i n gi n 删c b c i l e 觚b u ta l l l a v ei m p o r t 锄t 虻i e n t i f i c l u e 伽s t i l d yo fi n s ti i i l 肌l i l i 哆s t u d i e s1 1 a ds u g g e s t e c i t l l a ti i l c t ，w i l i n f e c t e db yi i l i c m o 唱a l l i s m ，c a ns y i l t l i e s i ss e v e m i 锄t i l i l i c r o b i a lp e p t i d e sw h i c ha 他 托g l l l a t e db y 协od i s t i i k ts i g n a l l i n gp a m w a y s ：1 b l la n dh i m m 鹏d e f k i e 眦y ( i m d ) 砌dg e n ei sak c y g e n eo fi i l _ l dp 孕t 1 1 w a y t h i sg e n eh 弱l o w0 n h o l o g y 锄o n g 删。吣s p 它c i 嚣觚di t s 向n c t i w 笛 h o w nl i n l eb yp e o p l e ，b u tt i l ea d v 锄c e dt e c l l i i i q u co f 珊池m 脚l e c u l 缸b i o l o 蹦g 锄e t i c s 锄do t l l 镰 即、，i d e d 璐p o w e m i l t o o i st oi t s 咒a r c h k 锄咖g 缸帆a d 啪c c d l l i e v 踟跫n t si i iz 加i ，印i i l f j 口，t l l i s 弘i p 盯他龇d l e d l e 拥dh 0 脚l o go f 上h a 脚“口i i l 召俐6 畛m d b y 璐i i l gs i l l c w o 姗目嘶o m e t l l i s 咖d yw m 舀v es o l i db a 鼹l oi i 珥釉v i n gt l l e 鲍t i d i s e 舔懿a b i l i 够o fs i i h 叫i l 删d et h e o 他t i c a l e 、，i d 雠et 0s 伽yt l l ei 鹏c h 柚i s mo fs i l k 、o 肌i m m u l l i 饥姐da l p d e 、砌m i b l ec l u et o 咖d yt h c 啪i u t 缸m e c k 血锄o fi 璐ti i i 姗u n i t y 咒s p o 璐e t h ei i l a i n “熔e 锄hc o n 咖t s 矾dl s u l t sa f a si 0 u o w s ： lc l o n i n g 觚ds e q u 锄c e 锄a l 河so f 圆切拥d w e9 0 tah 伽_ 1 0 l o go f 历佻印i i f ，口拥d 舶m 曰d m 匆垮m d ，彳锄c c e s s f h l l y 妇伽g hs f ，f c dc l i n g 嘶嗣岫s i l k w 傩ne s td a t a ，锄dn 锄e di t 勰砌拥矗a m l y 刹b yb i o i n f o n m t i 溅t i l o d ，龇 g e 雠i s1 0 9 2b pi i l1 g t l l ，c o 瞄i s t i n go f 4e x o 腿锄d3i n 仃0 啮，锄c o d i n gap m t e i nw i m2 5 0 锄i 孔i d s ，t l l ep r o t e i i lm o l u l 酊w e i g l l tw 罄p 陀d i c 刷2 8 6k d ，如dt l l ei s l e c t r i cp o i n ti s6 4 5 u s i n g 1 i n ch k u p i i l gi i is i 萨a p ，w ef o u n d 也a tt l 圮1 0 c a t i o fl 1 9 秘i s 圮s i l l g a lp e p t i d eo fb 觚m d b f n j m dc 鲫t a i 邶ad e a t h o m a i f lw h i c hi a t e s 舶ml5 2 勰t o2 4 6 矩b l 够t 锄l i 鲫帅e n ti 1 1n c b ia n d c l 吣t 耐n g 姐a l y s i sb yt i l ep r o g 舢o fc l u s t a l xs u g g e s t e dt l l a tt i 圮d e a t l l d o r n a i no fb m i i n di l i c a r ：b o x y - t e 肌i 舱l 咒g i i ss i m i l 盯t o 他c 印t o ri n t e r 孔t i o np m t e i n ( 1 u p ) o fm 锄m a l i 锄t h e n ，w e d e s i 朗e d 两m 懿a c c o r d i n gt ot h ep 诧d i c t e ds e q u e n c e ，c l o n e dt h ec o d i n gs e q u c eo ft h i sg e n ei n 两南人学硕l ：学位论史 、r i t r 0 ，a n d 9 0 t a t a g e t f h 舯e n t o f 7 5 0 b p 2p r o k a r y o t i ce x p 陀s s i o no f b 朋拥d 1 kc o m p l e t co r fo f6 朋拥dw 淞s u b c l o n e di n t o 坞p e t - 5 似+ ) e x p 仲s s i 伽v e c t 锄dt l 圮 r e c o m b i n 枷 p l 踟i d w 鹊劬塔f 0 册e d i n t o西c e 融妇c d 疗 脱2 j ， 1 1 h e n砌u c e d i i n d p e t - 5 0 b b l - 2 lt oe x p 佗豁p r o t e i nb yi p t g ，w e9 0 ta 他c o m b i 彻n tp r o t e i nw i t l ir l e c u l 缸 w e i g h ta b o u t9 7 k d ，i i l c l u d i n gt l l et a gp m t e i n ( c t a i nt w os 政h i st a g s 孤dan 惦1 a g ) w i t l l6 8 l ( 】) 锄dt a g e tp r o t e i nw i m 灿u t2 9 l ( d ，w h i c hi sc o 璐i s t e n tw i mp r e d i c t i 1 1 1 e 叩t i 眦lc d i t i 伽o f p r o t e i i le x p 他s s i o ni s3 7 ，0 4 m m o l li p t gi i l d u c e d5h o u 璐l m u g l l0 p t i m i z a t i 伽1 kp r o t e i i ii s c x p 陀s s e d 弱i n c l u s i o nb o d i e sb ya p p m i 强i 3e x p r e s s i o nf e a t u r eo fb 聊砌谚 b 弱e d0 nt h es i l k w o 册i i l i c r o a m yd a 组b a ，t l i ee x p r e 豁i o np f i l eo f 砌咖d ( d 物o ，d a yt l l 嗽 o f f i f u li n s 叫i nd i 仃e 他n tt i s 蹦ei s 弱f o l l o w s ：h e a di sm cl l i g l l e s t ；g e 册e n ，c u t i c l ea n df a tb o d yh a v e m o r s e l ；觚dt l l e 他a 传n e a r l y i nb 1 0 0 d 。m a l p i g l l i a nt i l _ b u l ea n ds i l kg l a n d b m i m dp r o t e i nw 弱p 嘶f i e db ya m n i t yc h r o m a t o 伊a p h ya n de l e c t o r e l u “o n ，柚dt l l u dt 0 p f o d u c es p e c i f i c 锄t i b o d y p r o t e i l lw 弱e x 删舶m8 伽咖m o o f d a y 栅o f f i 胁i n 她，w h i c h 剐岣e c t c dt oi r i m m 孙d b l o t t i n gw i t l la n t i b m i n l da n t i b o d y t h c 坞跚l ti ss i m i l 盯t 0d b 0 v e m e n t i o n e d 他轴l tf b ml i l i c r 0 啪yd a t a b a a n a l y s i s ，s u g g e s t c dt l l a tt l l e 聆g u l a t i o no f 占册6 畛朋d 一砌dg e n ei s m a i n l yi i lt r a j 硌c r i p t i o n a ll e v e l c o n c l 惦i o n ：i i i “sw o d 【，w e9 0 tah o m o l o 影o f 拥dw h i c hi st l l ek c yg e 鹏o fi n s ti 1 1 i l a t e i l i 】m 岫埘丘d m 占d m 勿霄肌d 一，柚dn 锄e di t 西打砌正n 饥w ec l c d 如dc x 瞅d 口小砌di i i 啊昀， 锄dg o tt l l ep u r cp r o t c i no fi tb yp u r i f i c a t i a tl 蕊t 、cs t i l d i e dt l l ee x p r e 髓i f 醯t i l 他o f 曰m 拥di n 肋坍6 弦小d a tm e 锄l do ff i f mi 璐t 甜a nm e 佗跚l t si n d i c a t e dt l l o c o n c l 髑i o 眦：( 1 ) b m i m dm a y b eal i g 柚do fs i l k w o mi m dp a m w a y ，w h i c hc 柚p 嘲孔t i v a t i s i 印a lo fp 弛o g 饥y ( 2 ) t h e r e g u l a t i o no f 曰d m 易朋d 一拥dg e n ei sm a i l l l yi l lh 锄1 s c r i p t i o n a l l e v e l s 0o n i n f e c t c d b 册咖 刖d c 孤e x p r e 豁b m i i i l di i i m 圮d i a t e l y 他g u i a t cb o d yt 0g e 眦髓t ep l e i i t ) ，o f 他s i s t a i l tc f r e c t o 峨a n d 豫s i s ti n f e c t i o n 雒s n 舔p o s s i b l e ( 3 ) h n dp a t l l w a yo f 砌匆垮m d r f 眦yb el i k ed 脚棚f ，口s ， w h i c hi sn o to n l yi l l v o l v e di ns y s t e m i ci m m u n i t y ，b u ta l s oi i ll o c a l i m m i l n i t ) r 1 “yw o r d s ：曰彻l 龟肛肺d i n n a t ei m m u n i 哆拥口 p 阳k a r y o t i ce x p r e s s i o g e n ec l o n e i v 独创性声明 学位论文题目：家蚕先天免疫相关基因砌j 删的克隆、表达及序列分析 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者：俅角翮签字日期：沙够年月肜日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书：本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 学位论文作者签名：1 长幻朋 签字日期：沪3 年6 月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：彳峰 签字日期：厕年6 月形日 电话： 邮编： 第一章文献综述 第一章文献综述弟一早义陬碌途 1 1昆虫免疫的类型 传统上将免疫系统分为先天性免疫和适应性免疫两种，其主要区别在于免疫识别的机制 和受体不同。适应性免疫是指机体在重复接触病原体后获得的高等免疫能力，需要淋巴细胞 ( t 细胞和b 细胞) 克隆的形成和分化，由高度可变的免疫球蛋白基因超家族分子介导，只存在 于高等动物，具备特异性和记忆性。先天免疫功能则取决于身体中先天已经编好程序的、由 一些功能性细胞和抗菌肽等对病原作出的识别，不具有免疫记忆，也不具有适应性免疫那样 的特异性。 昆虫和众多微生物共存于生物圈内，其幼虫通常营腐生生活和生长发育，其成虫常常作 为带菌者导致许多的植物和动物疾病，而其自身却能有效的抵御这些疾病，所以昆虫体内一 定有一套有效的识别并抵抗病原的防御体 系。这套防御体系在其自身的免疫防御反 应中得到了体现旧1 。研究发现，昆虫没有 类似于哺乳动物的b 和t 淋巴细胞系统，无 免疫球蛋白及完整的补体系统缺乏特异 的抗原一抗体反应，因而至今几乎没有发现 其适应性免疫系统的存在。但是，昆虫能够 对微生物的感染做出快速有效的免疫应答， 以抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶 ，1 溜潆一毒、i 扯， i 一一e 厂、n c 旧m 啪一帅嘲中t c ：釜斟：辫 卜一7 、 i 、 - ： l - 一- 翩f - _ 岫o l l l 一坤坩t 删e ， 。f _ 。- - h l 删h 蜘c h l 菌酶及蛋白酶抑制剂等多种活性因 图1 1 果蝇宿主防御示毒图( 免疫组织探测微生物病原，引发一 系列相互作用和级联反应) 子，配合多种功能的血细胞，建立起 f i g 1 1s c h e m a l co v e i e wo f 伽s 印厅妇h o s td e f e n s e 一个开放的、完整的防御体系婚1 ，这个 d e t e c t i o no f m i c r o b i a ip a l h o g e n se l i c i t s a l a r g e a 啪yo f i n t e r c o n n e c t e d 防御体系就是所谓的先天免疫系统。 a n d5 ”。9 1 5 。d 。n 8 。m 。d u l 。5m1 m m u n e 吼8 p o n 5 1 v 。1 5 5 u 。5 。 研究表明，昆虫的先天免疫系统主要分为两大类：体液免疫和细胞免疫。图1 1 是果蝇宿 主防御的示意图，它代表了昆虫先天免疫的基本模式。细胞免疫是血细胞吞噬、消化外来异 物的过程，与高等动物基本相同。昆虫具有包括血细胞住内的扦放式循环系统，其免疫反应涉 及到血细胞循环，血细胞在昆虫细胞免疫中起着重要的作用。昆虫的细胞免疫反应主要包括 以下两个方面：一方面是通过蛋白酶的裂解而引起的血细胞凝集和黑色素沉积：另一方面是 通过噬菌作用和包裹作用清除入侵的病原微生物，这些功能主要由浆细胞、叶状血细胞和晶 体状细胞行使。体液免疫主要是机体在受到病原微生物侵染时产生大量抗微生物蛋白，杀灭 病原的免疫过程。从微生物侵袭到最终清除病原一般要经过4 个步骤：首先是识别外来异物， 称为感染的非己识别；随后，激活丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细胞外级联反 应被引发，从而将受到感染的信号放大为更强的“危险”信号或解除错误警报，这个过程称 为信号的调整和放人：紧接着，细胞内信号转导途径被激活，导致目的基囚的转录；最后 l 两南入学硕i 7 1 证论文 表达并分泌效应因子，产生免疫应答，排除病原。 1 2昆虫先天免疫机制 “自己”与“非己识别是免疫系统的基本功能，也是免疫学研究的最根本问题。已经基 本证实，昆虫的这种“非己”识别是依靠某些特异的、可溶的或与细胞膜结合的模式识别受 体( p a n e mr e c o g n - t i o n1 1 e c e p t 0 稻，p i 黜) ，也称为模式识别蛋白( p 撒e mr o 印i t i o np t e i n s ， p r p s ) 或模式识别分子( p a 竹e m 陀c o g n i t i o nm o l e c u l e s p r m s ) 来完成的。这些模式识别分子 虽然没有高等动物b 和t 淋巴细胞系统那样高度的特异性。但可以识别或结合那些微生物表 面保守的、而在宿主中不存在的病原相关分子模式( p a t h o g e n 笛s o c i a t e dm o l e 伽kp a n e m s ， p a m p s ) 。如脂多糖( l p s ) 、肽聚糖( p e p t i d o g f y c a n s ) 和甘露聚糖( m 踟矾s ) 等。识别后， 这些受体通过激活存在于血淋巴中的蛋白酶和利用免疫反应组织的细胞内信号转导途径引起 免疫反应【6 1 ，这些模式识别分子还可以作为促进吞噬的调理素，也可以是凝集、黑化等免疫过 程的起始因子。 1 2 1模式识别受体( p r r s ) 模式识别受体是机体识别病原的分子基础是免疫反应的第一步其种类众多，关于如 何分类。不同的作者意见不一。c 撕s l o 曲i d e s 等将在果蝇和按蚊中发现的p r r s 分为6 种类型： 肽聚糖识别蛋白，含硫酯键蛋白革兰氏阴性蘸结合蛋自。清除受体，c _ 型凝集素和硫依赖 型凝集紊。而h u l t i i l a 呔哺1 将t o l l 受体也归为p r r s 。 ( 1 ) 肽聚糖识别蛋白( p e p t i d o l y c 觚r e c o g n i t i o np r o t e i n s ，p g r p s ) 肽聚糖识别蛋白，具有p g r p 结构域，在激活免疫反应中起着重要的和多样性的作用这 些免疫反应包括黑化级联反应、吞噬作用和产生抗革兰氏阳性菌和阴性菌物质的信号转导途 径悖j 。编码p g r p s 的基因在果蝇中包括p g r p s a 、s b l 、s b 2 、s c l a 、s c l b ，和长型p g r p 基因，即 p g r p l a 到l e 。在果蝇中，分泌型p g r p 奄a 是激活介导对革兰氏阳性菌起免疫反应的t o l l 信号 途径的必须成分，但对真菌不起作用们。研究表明两种p g r p l c 异构体作为i m d 免疫信号途 径的受体，导致对革兰氏阴性菌起杀灭作用的某些抗菌肽的表达。 ( 2 ) 革兰氏i 野l 生菌结合蛋白( g r 锄n e g a t i v eb i n d i n gp r o t e i n s ，g n b p s ) g n b p 与脂多糖( l p s 和p l ，3 葡聚糖有很高的亲和性但对肽聚糖、p l ，4 葡聚糖和几 丁质没有亲和性。遗传数据表明g n b p l 作用于t 0 1l 途径上游。果蝇基因组编码三个g n b p s 和 两个免疫诱导相关基因甜。按蚊基因组包括6 个g n b p 基因，与已知的家蚕和果蝇的基因同源。 在甲壳类中也发现有b 一葡聚糖结合蛋白( b g b p ) 与p 一葡聚糖作用形成葡聚糖一b g b p 复合体。 ( 3 ) 含硫酯蛋白i s t e 卜c o n t a i n i n gp r g t e i n s ，f e p s ) 这类蛋白质作为补体系统的一部分和蝥岛憋襻彭最在灸袋反癍卒起着重要的作用。 ( 4 ) 清除受体( a v c n g e r 恕c e p 幻糟，s c r s ：) 它们识别修饰的低密度脂蛋白、多重的i 5 i j 逡子配体积纫菌胞蹙成分，可帮助机体内吞细 2 第一帚丈献综述 菌和清除凋亡细胞 ( 5 ) c 型凝集素它通过与糖蛋白或糖脂相互作用，凝集细胞或沉淀糖缀合物。 ( 6 ) 硫依赖型凝集素( g a l e c t i 璐，g 腿) 一个保守的1 3 0 残基的核心构成了该家族特异性的 球状糖识别结构域，可与b 一半乳塘甘相互作用。 ( 7 ) t 0 1 1 样受体( t b l ll i l 【er 印t o r t l r )也被认为是信号转导系统的成员。已知不同种属 的同种t l r s 分子可有不同的表现，而已知同一种属中不同的t l r s 分子有不同的识别谱。在昆 虫中，t 0 1 l 样受体被特定的配体激活。 1 2 2 昆虫抗微生物肽 昆虫抗微生物多肽是指当昆虫受到外界微生物等异物刺激时，诱发血淋巴( 脂肪体内) 快 速合成的一类小分子肽是机体分子免疫的效应物它具有热稳定性强、强碱性、抗菌谱广 的特点，既可以抗革兰氏阳性菌，也可以抗革兰氏阴性菌，尤其对耐药性菌株有明显抑杀作用， 对病毒、原虫及癌细胞也有作用引 迄今为止已报道的昆虫抗微生物肽有2 0 0 多种，涉及鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、 等翅目和膜翅目共6 个目的昆虫根据结构及功能的不同，可分为5 类：第1 类是天蚕素类 ( c e p i 粥) ，由鳞翅目和双翅目昆虫产生。第2 类是昆虫防御素( i i c td e 觚i i 恸，主要杀死革 兰氏阳性菌，但不伤害红细胞。第3 类是富含脯氨酸( p r o ) 的抗菌肽( 刚i 鹏r i c h 锄t i b a c t 耐 a l p e p t i d 懿) ，已在双翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目等8 种昆虫中分离获得2 2 种该类抗菌肽， 但尚未在鳞翅目中发现，主要抑制革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌无作用；其重要代表是果 蝇肽( d m s o c i i i ) 第4 类是分子量大于8 3 0 k d 、富含甘氨酸( g l y ) 的抗菌肽( g l y c i i lr i c h 锄t i b t 耐 a l p e p t i d c s ) ，它仅对部分革兰氏阴性菌表现出抑菌作用，也有抗革兰氏阳性细菌的，分子量较大， 难以人工合成。该类抗菌肽主要有以下几种： 、樗蚕素( a t t i n ) ，其分子量大于2 0 k d a ，有 特定的抗革兰氏阴性菌谱，能干扰抑制细菌膜外层质膜蛋白的合成：b 、麻蝇毒紊l l ( s 躺o t o x i ) ，分离自麻蝇，是现今获得的分子量最大的昆虫抗菌肽，它仅对生长期细菌产 生作用：c 、双翅肽( d i p “耐c i i i ) 。分子量为9 k d a ，拥有富含脯氨酸的n 一端功能区，以及富含 甘氨酸的c 一端功能区和中间区。第5 类是抗真菌肽，主要包括果蝇抗真菌肽( d s o m y c i n ) 和 m e t c t l i l i k 俩n 耵，它们能阻止丝状真菌生长引起菌丝形态畸形 1 2 3 细胞免疫 昆虫的细胞免疫功能都是由血细胞行使的。果蝇幼虫有许多的血细胞，这些血细胞根据 其结构和功能特征分为三个类型：浆细胞、晶体状细胞和叶状血细胞。浆细胞占9 0 - 9 5 的 所有成熟幼虫血液，行使噬菌作用以去除死细胞和微生物病原晶体状细胞组成5 的幼虫血 液，没有吞噬作用，参与黑化过程。成熟的晶体状细胞表达酚氧化酶( p m p 0 s ) ，酚氧化酶 介导黑化。叶片状细胞在胚胎和成虫期血液中找不到，在健康幼虫体内也很少观察的到，但 当机体被寄生蜂卵感染时。血液中就会出现大量的该类细胞( 图1 2 ) 。 3 两南人学硕l j 学位论文 吞噬作用和包裹作用是细胞免疫反应的两种主要方式。吞噬作用主要由浆细胞行使。果 蝇的浆细胞负责处理微生物和凋亡细胞。它们能内化大量的诸如细菌、酵母葡聚糖珠和双链 r n a 等粒子，或者几分钟内吸收粒子。吞噬的第一步是噬菌细胞接触目标粒子，紧接着吞噬小 体修整吞入目标的细胞骨架、内化和毁灭它。包裹是叶状血细胞抵抗入侵病原的反应过程。 叶片状细胞从淋巴腺释放，并形成多层囊泡包裹入侵者，它伴随着黑化过程。在囊泡内，可 能通过局部细胞毒素产物和黑化级联反应，将寄生物杀死。但此反应的精确过程还不知道。 凝结和黑化也是重要的细胞免疫反应。例技动物表皮的机械损伤立即会诱导血液凝集和 黑化。凝结对限制血细胞损失和愈合伤口是致关重要的，它能对感染迅速形成二级防护屏障、 固着细菌，促进细菌被杀灭。黑化反应是果蝇体内最快的免疫反应。在损伤表皮表面出现的 变黑反应就是黑色素合成和沉积过程的黑化反应。据推测黑化在昆虫诸如伤口愈合、包装阻 止微生物感染和产生毒素杀灭入侵微生物的防御反应中具有重要的作用【1 5 1 7 】。 、专舀矿圈毛幽广圜匮 l n 峙如c ”ee 犯，“ 图1 2 果蝇血细胞 及其功能5 】 f i g 1 2d r d s 印 池 h e m o c y t e a n di t s f u n c t i o n s 1 2 4 体液免疫 果蝇和大多数其它完全变态昆虫宿主防御的一个特点是侵袭一诱导合成和分泌有效的抗 微生物肽( a m p s ) ，这些a m p s 聚集在血液中抵抗微生物的入侵，这是昆虫体液免疫反应的 重要特征。这些抗微生物肽主要由脂肪体合成。脂肪体是合成和分泌抗菌肽到血液中的强大 器官【5 】，是昆虫主要的免疫组织，在胚胎发育时由中胚层发育而成，并在幼虫期第一次遭受微 生物侵染时获得它的免疫能力。通过研究，昆虫受到不同的微生物感染时，能诱导不同的抗 菌肽基因表达，而这些抗菌肽基因的表达主要受两种信号转导途径的调控，即t o l l d i f 途径和 i m l i s h 途径，这两种途径通过激活不同的转录因子来调控不同的抗菌肽基因表达。t o i l 途 径主要由革兰氏阳性细菌和真菌激活和控制，而i m d 途径主要应答革兰氏阴性细菌的侵染， 并调控抗革兰氏阴性菌的抗菌肽基因( 如d i p t e c i n ) 的表达【1 8 】。t o l l 和i m d 信号传递途径如 图1 3 。 4 蛋， s 第亭文献综述 1 2 4 1 t o i i 途径 图1 3t o l l 和i m d 信号传递通路激活模式图1 5 l f i g1 3m o d e lo f t o l l 卸di m dp a t h w a ya c t i v a t i o n t o l l 途径是m o r i s a t o 与a n d e r s o n 在研究果蝇的脂肪体细胞如何被诱导表达产生抗菌肽， 又如何将其组装后分泌到血淋巴中的问题时发现的1 1 9 】。t o n 途径是一个进化保守的的信号传递 途径，在果蝇胚胎背腹轴的建立和其它许多发育过程方面都具有重要作用。 t 0 l l 蛋白是参与t o l l 途径的主要基因产物。t o l l 蛋白家族最早是从果蝇中发现的一类跨膜蛋 白受体，具有膜外典犁的亮氨酸富集区和膜内t l r 结构域( t o l l i n t e r l e u k i n 1r e c e p t o rd o m a i n ) 。 到目前为止，已在果蝇的基因组中发现了9 个t 0 1 1 1 i k e 基因，即t o l l 1 ，t o l i 一3 到t 0 l i 9 及1 8 w e e l e r ( t o l l 2 ) 【2 0 】。家蚕基因组中找到1 1 个t o l l 相关受体和两个t o l l 类似物幢。果蝇的这些基因产物 都含有2 个半胱氨酸结，使其细胞外区段被第二个半胱氨酸结分隔成2 个节段1 2 2 l 。果蝇t o i l 参与 成年果蝇的免疫反应这一点已经被证实。f d j 基因“失能性”突变的果蝇对真菌感染高度敏 感。然而有趣的是，将果蝇d - ，基因灭活并不损伤果蝇对细菌感染的反应性，可能是由于果 蝇有9 个t o i 件￥蛋白，t o l l 家族的其它成员有可能行使识别不同细菌病原体j f ：启动抗凶r 反应的 功能。进一步研究发现，其中t o l l 2 与对细菌的免疫应答有关，t o l l 1 和t o l l 5 可以激活抗真菌 肽基因的表达。 研究已明这条途径的基本组成成分娃：细胞外细胞冈子s p z ( 在结构上类似1 二神经生k 因子，n g f ) 、跨膜受体t o l l 、t u b e 和m y d 8 8 受体、p e l l e 激酶、c a c t u s ( 果蝇ikb 同源物) 、d o r s a i 和d i 件睾录激活因子。根据发育阶段不同，t o l l 信号途径能激活两个n f 1 c b 样蛋白：d i f 蛋白和 d o r s a l 蛋白。d i f 蛋白在果蝇受到微生物感染时被激活。调控抗菌肽基因转录表达；而d o r s a l 蛋 白则在胚胎发育时调控胚胎背腹轴发育。住t o l l 信号途径中，循环内源蛋白s p a t z l e 是必不可少的 配体，该蛋白与哺乳动物神经营养蛋向结构相似，由两个弧基通过两个! | ，胱氨酸残r 杉成的一二 西南大学硕一i ：学位论文 硫键联接组成通过丝氨酸蛋白酶级联反应水解后产生活性1 2 引。果蝇的t 0 l l 受体不能直接被外 源微生物诱导激活，而是被t o l l 的内源性配体s p 萏t z l e 激活。家蚕相关抗菌肤的诱导表达也需要先 激活s p a t z i e l 州t o l l 受体的膜外结构域只与s p 萏t z l e 蛋白的成熟体有很高的亲和性，膜内t i r 结 构域总共有三个配体：d m y d 8 8 、p e l l e 和t u b c 。 果蝇t o l i 蛋白属于i 型跨膜受体，可以识别细菌脂多糖( l i p o p 0 i y s 勰c h 缸i d e ，l p s ) 、肽 聚糖( p e p t i d o g l y c 锄，p g n ) 等，激活p e u e 和t u b e 等细胞内信号分子1 2 s 1 ，最终激活抗菌肽基因 的表达。例如t o l i 受体受到真菌的刺激后可以引起d r o s o m y c i n 的表达量上调。当t o 嬲乏体及其 细胞内信号分子t u b e 和p e l l e 发生突变或缺失时，d r o m y c i n 的合成明显下降1 2 6 l 。t o l l 信号途径 的结果就是使i k b 样蛋白c 孔t u s 磷酸化。释放n f k b 样d i f 和d o r s a l 转录因子，调控其下游基因的 表达1 2 7 1 在微生物侵袭时，t o l l 途径中的许多组成成分能以t o i l 依赖性形式自我上调表达【1 8 2 钔 但该途径有一个负反馈调节过程，通过诱导抑制分子的表达实现四1 t o l l 的胞内区序列与l l 1 受体胞内区相似，而且。人的i l 1 受体与果蝇t o l l 介导的信号通路 均引起转录因子n f 1 c b 的活化。i l - l 受体家族成员在诱发哺乳动物的免疫和炎症反应中起关键 作用。微生物感染果蝇引发不同种类的抗微生物肽的上调表达，这些抗微生物肽基因的启动 子区域与哺乳动物炎症免疫反应的许多基因相似，均含有n f l c b 结合位点。哺乳动物的t 0 l l 样 受体( t o l l - l i k e 矛e 坤d r t l r ) 在宿主的先天免疫中也起着重要的作用，它可通过识别不同的细菌 成分，迅速激活免疫反应，可通过信号转导通路引起n f - 佃和州k 转录，从而引起促炎症因子 的转录和共刺激分子的表达上调【3 0 1 。因此对t o l l 样受体的深入研究可以增加人们对天然免疫 的发生及进化的认识。果蝇t o l l 途径与白细胞介素1 和t l 黜信号途径相似，这三个免疫信号传 递途径具有共同的祖先。 1 2 4 2i m d 途径， i m d 途径是在研究果蝇的一个隐性突变体( 1 m m 帅ed e f i c i e n c y i m d l ) 中的抗菌肽基因表 达情况时发现的【3 ，该突变体易感于革兰氏阴性菌，但能比t o l l 突变体更强的抵御革兰氏阳性 菌和真菌的侵染。通过分子检测发现，该突变体由于砌瑾因的失活，机体在微生物诱导时， 许多抗菌肽基因的表达量比非突变体下降了，由此判定它与免疫相关。但砌德因与t 0 l l 途径 并不相关它们分别对不同的微生物产生抵抗作用。后来研究证实砌d 基因介导了昆虫先天免 疫的另一条信号传递通路：i m d 途径。该途径在果蝇的体液免疫中与t 0 途径一样，也起着重 要的作用，且由革兰氏阴性菌激活，其所控制产生的抗菌肽( 如d i p t e r i c i n 、d r o s o c i n 、c e c m p i n 、 a t t a c j n s ) 抗革兰氏阴性菌。研究还发现参与l m d 信号途径的组成成分位于果蝇的第二号染色体 上1 3 2 l 。i m d 途径与哺乳动物肿瘤坏死因子受体洲f r s ，t u m o u r n e c m s i sf ；圮t o r 他c e p t o r s ) 信雩传 递途径相似，它们的组成成分相似，且最终都导致n f k b 转录因子的活化。但这两条途径也有 许多的不同点，特别是激活水平的不同( 图1 4 ) 。 6 第一章文献综述 图1 4 哺乳动物肿瘤坏死因子受体传递途径和果蝇i m d 传递途径1 4 8 1 果蝇识别革兰氏阴性菌感染，一部分是由跨膜受体p g i 冲介导，并通过信号转导途径激活n f kb ， 该信号转导途径中许多分子与肿瘤坏死因子受体传递途径下游的信号分子相似或相关。 f i g 1 4p a r a i e i sb e t w e e nt h e1 n f ra n di m dp a t h w a y s r c c o g n i t i o no fg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a ii n f c c t i o ni nd m s o p h i i ai sm e d i a t e d i np a n b