（预防兽医学专业论文）泰乐菌素单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论泰乐菌素单克隆抗体的制备及免疫学快 学位 文题目速检测方法的建立 级别 硕士 学生学科 导师j 。k 中教授 姓名 赵东预防兽医 专业姓名 张改平研究员 学位论文 是否保密 是 如需保密，解密时间2 0 0 9 年1 1 月3 0 同 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致诩 的地方外，文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研姓躲例，聊繇梦r 日期：刁年- 月呷日日期：矽毋，月刁r 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。? i r ：i ； 研究生签名：勿飞，导师签名：雪荔中学院领导签名：善 r 期：卿t 1 月讲同同期：7 石乐”月卵同同期：砷年f 猬多同 。 致谢 本论文是在河南农业大学导师宁长申教授和河南省农业科学院导师张改平研究 员的共同指导下完成的。攻读在职硕士三年来，两位恩师给予了无微不至的关怀。 恩师渊博的知识、敏锐的思路和洞察力令我折服，勇于创新的精神和忘我的工作作 风将使我终生受益。至论文完成之际，谨向二位恩师表达由衷的感谢! 特别感谢张改平研究员提供的进修机会! 衷心感谢张改平研究员、杨艳艳研究员、邓瑞广副研究员、李学伍副研究员、 肖治军副研究员、王选年教授、王自良教授、郭军庆副教授、李青梅副研究员多年 以来在学习、工作和生活上孜孜不倦的指导和帮助，特别感谢邢广旭硕士、杨继飞 硕士、柴书军硕士、刘庆堂先生、王建中先生等诸位同事、良师、益友多年的督促、 指导、支持和帮助，感谢周玲书记、郅玉宝副研究员、罗俊博士、郝慧芳博士、王 丽硕士、杨苏珍硕士、藤蔓女士、程娜女士等的大力支持和热情帮助。感谢你们! 感谢张红教授、范国英博士、乔松林博士、席俊博士提供的支持和帮助! 感谢父母的养育之恩! 感谢王凡女士多年的理解和支持! i t 一 目录 摘要3 文献综述4 1 泰乐菌素简介4 1 1 泰乐菌素物理化学性质4 1 2 泰乐菌素药物作用特点5 1 3 泰乐菌素药物作刖特点5 2 泰乐菌素耐药性6 3 泰乐菌素的m r l 6 4 泰乐菌素残留的检测方法概况7 4 1 物理化学测定法7 4 2 微生物学检测法8 4 3 免疫化学测定法8 4 3 目前存在的问题1 0 5 本研究的目的和内容1 0 试验一泰乐菌素单克隆抗体的制备与鉴定1 1 弓i 言1 1 1 材料与方法1l 1 1 仪器11 1 2 试剂1 l 1 3 细胞。1 2 1 4 实验动物12 1 5 主要试剂配制1 2 1 6 全抗原的制备13 1 7 动物免疫1 4 1 8 细胞融合14 1 9 刚性杂交瘤细胞的筛选及克隆1 5 1 1 0 单克隆抗体的生产1 5 1 1 l 单克隆抗体的鉴定1 5 2 结果与分析1 6 2 1 全抗原的鉴定1 6 2 2 单克隆抗体的鉴定。1 8 3 结论与讨论1 9 3 1 人l 抗原合成。19 k l 3 2 动物免疫。2 0 3 3 单抗制各。2 0 3 4 单克隆抗体特性2 l 试验二泰乐菌素免疫学快速检测方法的建立2 3 引言2 3 1 材料与方法2 3 1 1 仪器2 3 1 2 式剂2 3 1 3 主要试剂的配制2 4 1 4 t l 间接e l i s a 检测试剂盒的建立2 4 1 5 胶体金快速检测试纸条的制备。2 5 2 结果与分析2 9 2 1 试剂盒的组装2 9 2 2t l k i t 的标准曲线2 9 2 3t l - k i t 的交叉反应性2 9 2 4 试纸条的组装。3 0 2 5 试纸条的敏感性3 0 3 讨论3 l 3 1 试剂盒的交叉反应性。3 l 3 2 胶体金技术的优势3 l 3 3 试纸条的组装3 2 3 4 有待完成的 作3 2 参考文献3 3 a b s t r a c t 3 6 2 摘要 泰乐菌素是虽常见的饲料添加剂成分之一，同时该药也作为畜禽瘦病和蜜蜂关洲幼虫腐臭病 的防治约物，无论作为饲料添加剂或是治病的药物，效果良好。所以该药研发不久，迅速在全球 j 泛应用，但其耐约菌株急速增加，欧盟首先禁l ：了泰乐菌素作为饲料添加剂，各国也相继制定 了一系列的残留控制体系。在其残留检测方法中，免疫分析法冈其敏感、特异、简单易操作，作 为一种泰乐菌素残留的筛选方法，有独特优势。 本研究在分析泰乐菌素免疫特性的基础上，运用单克隆抗体技术生产其单抗，并组装了快速 检测试荆盒和试纸条。 l 、试验一把? 卜抗原t l 和载体蛋白b s a 、o v a 偶连制备了全抗原，并利用s d s - p a g e 和紫外扫描做了相应的鉴定；用t l b s a 抗原免疫b a l b c 小鼠，将免疫小鼠脾细胞与n s 0 瘤细 胞用5 0 的p e g 4 0 0 0 进行细胞融合，用h a t 培养基筛选培养，以t l o v a 抗原检测杂交瘤细胞 培养上清，获得了1 5 株产生泰乐菌素抗体的杂交瘤细胞株。对强附陛克隆以有限稀释法连续克 隆三次，建立l 株分泌高亲和力抗t l 单克隆抗体杂交瘤细胞株t l 6 e 9 ，培养上清的e l i s a 效价 分别为1 ：3 0 0 。以t l 6 e 9 杂交瘤细胞，腹腔注射b a l b c 小鼠诱生腹水，其e l i s a 效价为2 5 x 1 0 由， 免疫球蛋白哑类为i g g 2 a 。单抗与其他药品的交义反应率非常低。 3 、试验二利用基于试验一制各的抗泰乐菌素的单克隆抗体，依据酶联免疫吸附实验和胶体金 技术原理，分别组装了间接抑制e l i s a 检测试剂盒和免疫检测试纸条，并用于检测蜂蜜、牛奶、 眚禽的饲料、组织或是代谢物中泰乐菌素的残留。试剂检测盒泰乐菌素残留可以在一个小时内完 成；试纸条则可以在8 剑1 0 分钟内完成。试剂盒和试纸条的最低检测限在1 0 n g m l ，半量抑制浓 度( i c 5 0 ) 在3 0 n g m l ；试剂盒和试纸条可以广泛的用丁对泰乐菌素残留的定性、半定量和定量 检测。 关键词：泰乐菌素单克隆抗体e l i s a 试剂盒胶体金试纸条快速检测 3 文献综述 食品安全是人们生命安全的初级保障，事关人民的健康和社会稳定，是关系国计民生的大问 题。目前我国食品安全监管一i ：作已进入“攻坚破难”的关键阶段，需要建立和完善我国的检测方 法标准体系，对有些违禁药物残留检测目前还没有国家标准或行业标准，有时难以对食品中的这 些残留实施有效监控，所以有时会出现国内备禽产品及水产品不能出口，国外残留超标的产品我 们挡不住。在食品安全管理中最主要的还是要依靠系列技术手段，食品质量剑底合不合格，必 须要借助技术手段，没有技术手段做支撑，执法手段就不完善。目前亟待解决的问题是，对每犬 都在集贸市场、批发市场卖的菜和肉进行快速检测，要j 珥j 简单的技术方法及时发现利处理问题。 快速检测技术是我们执法的一个最基础的手段。 兽用抗生素泰乐菌素在备禽养殖和疫病防治中已经广泛使用，在蜜蜂养殖中防治美洲幼虫腐臭病 的药物，作为治疗畜禽疾病用是一种“谱抗生素，作为家禽、猪、牛的饲料添加剂的成分具有促生长 作用，良好的使用效果导致全球广泛应用，耐药菌株迅速增加，为了预防和控制泰乐菌素的泛滥，欧 盟于1 9 9 9 年首先禁i 卜泰乐菌素作为饲料添加剂成分使用，随后各国相继制定了一系列关于泰乐菌素在 各种禽畜产品和蜂蜜中的最高残留限量标准。但是目前检测泰乐菌素的手段却相对昂贵、耗时、落后， 所以研制快速、简便、廉价的检测产品成为必需。 1 泰乐菌素简介 1 1 泰乐菌素物理化学性质 泰乐菌素( t y l o s i n ，简写为t l ) ，亦称泰农、泰乐霉素，是美国于1 9 5 9 年从弗氏链霉菌 f s t r e p t o m y c e s f r a d i a e ) 的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素，该菌发酵过程中会产生a 、b 、c 、 d 四个组分，经化学提纯后，a 组分占9 5 以上，抗茵活性最高，原料药泰乐菌素通常指泰乐菌素 a 。( a 组分化学结构式见图1 ) 。t l 为一种白色扳状结晶，微溶于水，呈碱性。产品有酒彳i 酸盐、 磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐及乳酸盐，易溶于水。其水溶液在2 5 。c 、p h 5 5 7 5 时可保存3 个月， 但是若水溶液中含有铁、铜等金属离子时，会使本品火效。 o c h 3 图1泰乐菌素化学结构式 4 - 1 2 泰乐菌素药物作用特点 泰乐菌素在发挥药物作用时具有以f 特点：1 显著的抗支原体( 霉形体) 作用，对胸膜肺炎类 支原体及其他多种支原体有很强的抑制作用，为备禽支原体感染性疾病的首选药物。2 抗菌谱较 广，主要对多种革兰氏附陛( g + ) 菌有很强的抑制作j h j ，还对部分革兰氏阴性( g 一) 菌、弯杆菌 ( 过去门属弧菌) 、螺旋体有抑制作用，以及抗球虫作用。3 吸收和排泄迅速，无论e l 服或注射， 均能在很短时间内( 数1 0 分钟) 达剑有效抑菌浓度并保持一定时间，停约后迅速排出体外，在组 织内几乎无残留。4 具有良好的扩散能力，可渗透入所有器官、组织和体液，尤其是能通过浆性 膜、血脑、血眼和j 血睾屏障，这就使得泰乐菌素的临床应用范同很广。5 显著的促生长作用，给 生长期的畜禽连续低剂量饲用泰乐菌素，不仅能预防疾病，而且能显著促进动物生长，缩短生长 周期，提高饲料报酬。6 使用的专一性，泰乐菌素是笛禽专川抗生素，避免了人眚共用抗生素易 发生的交叉耐药性问题。 1 3 泰乐菌素药物作用特点 近年来，随着国产泰乐菌素产量的不断增多，该抗生素在我国兽医临床上的应用也越来越普 遍，主要用于防治以。卜备禽疾病：1 支原体性疾病，对支原体有特效是泰乐菌素的一个显著特点， 泰乐菌素已成为防治畜禽支原体性疾病的首选药物。主要用于防治猪支原体肺炎( 也称猪地方流行 性肺炎，习惯称猪气喘病) ，鸡毒支原体感染( 也称鸡慢性呼吸道病) ，羊传染性胸膜肺炎( 又称羊支 原体性肺炎) ，牛支原体性乳房炎和关节炎，羊支原体性无乳症和关节炎，猪支原体性浆膜炎、关 节炎，禽支原体性滑膜炎等。2 细菌性疾病，泰乐菌素对多种革兰氏附l 生菌引起的疾病有很好疗 效，对某些革兰阴性菌引起的疾病也有较好疗效。在兽医临床上主要用丁防治：( 1 ) 金黄色葡萄 球菌引起的各种化脓性疾病，如牛和羊的急性与慢性乳房炎，羊的皮炎和羔羊的败血病，猪的皮 炎及流产，马的创伤性感染、脓肿、蜂窝织炎，鸡的坏疽性皮炎、败血病、齐炎及关节炎。( 2 ) 链球菌引起的牛、羊乳房炎，猪败血症、关节炎、小猪脑膜炎，马腺疫、创伤性感染及子宫颈炎。 ( 3 ) 棒状杆菌引起的羊化脓性一干酪性淋巴结炎( 伪结核) ，马溃疡性淋巴管炎、皮- 卜脓肿，牛的 肾孟肾炎、乳房炎，猪的泌尿系统感染、c 型魏氏梭菌引起的猪梭菌性肠炎。 ( 4 ) 猪丹毒杆菌引 起的猪丹毒。( 5 ) 巴氏杆菌引起的猪肺疫、牛出血性败血病、禽霍乱以及羊、马、兔的巴氏杆菌 病。( 6 ) 沙门氏菌引起的各种笛禽的沙fj 氏凶病。( 7 ) 致病性火肠杆菌引起的各种备禽的人肠 杆菌病。( 8 ) 支气管败血博代氏菌引起的猪慢性萎缩性鼻炎。 ( 9 ) 分支杆菌引起的牛、猪、鸡 的结核病。( 1 0 ) 布鲁氏菌引起的牛、羊、猪流产和不孕。( 1 1 ) 胎儿弯杆菌( 曾称胎儿弧菌) 引 起的牛、羊流产和不孕。( 1 2 ) 结肠弯杆菌( 曾称人肠弧菌) 引起的猪和鸡的肠炎等。3 螺旋体类 疾病，猪痢疾蛇形螺旋体引起的猪痢疾，鹅疏螺旋体引起的禽类螺旋体病。4 抗球虫，将泰乐菌 素添加于饲料中，可防治鸡艾美耳球虫病。 泰乐菌素除了其广谱抗菌作川以外，同时具有良好的促生长作用，作为饲料添加剂合理地使 用泰乐曲素，不仅能预防备禽疾病，保障宙禽健康，而且能明显地促进备禽生长发育，特别对幼 气 龄畜禽和生长期畜禽效果显著，可以起剑提高饲料利用率、缩短饲养周期、增加养殖经济效益的 作用。 2 泰乐菌素耐药性 近些年来，由丁抗菌药物的j “泛使用，细菌耐约性不断加强，而且很多细菌已由单药耐药发 展剑多重耐约。饲料中添加抗菌约物，实际上等丁持续低剂量用药。动物机体长期与药物接触， 造成耐药菌不断增多，耐药性也不断增强。抗菌药物残留丁：动物性食品中，同样使人也长期与药 物接触，导致人体内耐药菌的增加。如今，不管是在动物体内，还是在人体内，细菌的耐药性已 经达到了较严重的程度。 各国、各地区由于医疗水平及用药背景的不同，细菌对抗生素的耐药性呈现出著异，但总的 趋势是：细菌几乎对所有临床应用的抗生素都产生了耐药，而且耐药程度日趋严重，多重耐药不 断增加，细菌耐药性已成为当今医药界的一个世界性难题。世界各国都十分关注细菌耐约性不断 增加的严峻形势，世界卫生组织还设立了专门机构来协调各国对细菌耐药性的研究与监测，众多 学者亦倾注极大的热情米研究细菌耐药性问题。国9 , j ； t - 学者利用分子生物学技术对细菌耐药机制 进行了深入的研究，针对某些耐约机制，亦相继开发了一些结构新颖的抗生素应川丁：临床。但随 着新型抗生素的使用，病原菌新的耐药性也随之产生，开发研制新药的速度总是跟不上细菌变异 耐药的速度。无论多新多好的抗生素，临床广泛应用后，细菌均可很快产生耐药性，令科研人员十 分头痛。 细菌增殖非常迅速，以及细菌在人、动物体内以及环境中，“泛存在，并且相互间在不停地交 换。这为极端环境条件下细菌发生突变所获得的耐药基因，通过上述各种可动遗传冈子以适当方 式转移给其它环境中的细菌而表现耐约提供了前提。药物选择压力应是诱导耐约菌及造成耐约基 因转移的主要动力。广泛使用抗生素所造成的选择压力是细菌耐药性产生和维持的主要驱动力。 抗生素选择压力对细菌耐药性的形成很重要，没人怀疑实验室内低浓度抗生素胁迫连续培养可诱 导出稳定的耐约菌。 农业生产上使刚抗生素亦可从多方面影响细菌耐药性，其中最重要的就是备禽、水产养殖中 使用哑治疗水平的抗生素作为生长促进剂可给动物肠道细菌带来选择压力，诱导出抗生素耐药性。 泰乐菌素作为生长促进剂“泛应用于各种饲料添加荆，其耐药菌株的发展速度可想而知。 3 泰乐菌素的m r l 我国规定牛、猪、鸡等泰乐菌素的日允许摄入量( a d i ) 为0 - 6 1 j g k g ，同时制定了牛、猪、鸡 的奶肉等备产品的最人残留量( m r l ) ，见下表：( 单位：ug k g ) 6 - 表1泰乐菌素的m r l 泰乐菌素作为防治蜜蜂美洲幼虫腐臭病的药物疗效非常好，但是因为却很容易在蜂蜜中残留， 而且蜂蜜中残留的泰乐菌素及其一级分解产物，到进一步衰减需要i 3 年；而糖浆中泰乐菌素的 半衰期为7 5 天左右，所以目前各国检测蜂蜜中残留的泰乐菌素相对严格。 4 泰乐菌素残留的检测方法概况 检测泰乐菌素残留的方法有高效液相色谱法、气相色谱法、联用技术、薄层色谱法、毛细管 电泳法、超临界流体色谱分析法、微生物学检测法、免疫化学测定法等。其中免疫化学测定法因 为逐渐脱离昂贵的仪器和繁琐的操作，所以发展非常迅速。 4 1 物理化学测定法 常用的物理化学测定法基本上为色谱分析。色谱分析法主要有高效液相色谱( h p l c ) 、气相 色谱( g c ) 、联州技术如气质联用( g c m s ) 、液相色谱质谱联用( l c m s ) 、薄层色谱( t l c ) 等。其他还有毛细管电泳法( c e ) 、超临界流体色谱分析( s f c ) 。 高效液相色谱法是2 0 世纪7 0 年代急剧发展起来的一项高效、快速的分析分离技术，现在使用 仍很广泛，对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的药物原则上都可用高效液相色谱法进行 分离、分析。由于其只能检测对紫外有吸收和本身能发射荧光的约物，限制了高效液相色谱法的 应用。 气相色谱法是一种经典的分析方法。它具有操作简单、分析速度快、分离效能高、灵敏度高 以及应用范同广等特点。使用气相色谱法，多种药物可以一次进样，得到完全的分离、定性和定 量测定，再配置高性能的检测器，使分析速度更快，结果更可靠。但冈其技术含量高，操作程序 相对复杂，且需要特定的试验条件和具有一定专业技术人员进行操作，一般不适用现场检测。另 外，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难以应用气相色谱法进行分析。 联川技术包括气相色谱质谱联心、液相色谱质谱联_ j 等。气相色谱仪是质谱法的理想“进 样器”，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪，就可充分发挥质谱法的特长。质谱仪是气 相色谱法的理想“检测器”，色谱法所用的检测器都有其局限性，而质谱仪能检出儿乎全部化合 物，灵敏度又高。由y - g c m s 所具有的独特优点，目前己得剑j 泛的廊用。一般来说，凡能川气 7 相色谱法进行分析的样品，人部分都能用g o m s 进行定性及定量测定。对于高极性、热不稳定性、 难挥发的火分子有机化合物，使用g c m s 有困难，而液相色谱的应用不受沸点的限制，并能对热 稳定性著的试样进行分离、分析。然而液相色谱的定性能力更弱，冈此液相色谱与质谱的联川， 其意义是显而易见的。液相色谱质谱联用对分析技术和仪器的要求高，但它是一种很有利用价值 的高效率、高可靠性分析技术。 薄层色谱法是以i 刊体吸附剂( 如硅胶、氧化铝等) 为载体，水为同定相溶剂，流动相一般为 有机溶剂所组合的分配型层析分离的分析方法。薄层色谱法不需要特殊设备和试剂，方法简单、 快速、直观、灵活，但是灵敏度不高。薄层色谱法经常作为样品筛选的方法。 毛细管电泳非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。其分 离效率可达数百万理论塔板数，操作简便，具有很人灵活性。许多分离参数，如缓冲液的组成和 p h 值、毛细管的类型以及所使用电场的波形等都可以调节。但毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检 测器，可利用的紫外检测器能检测儿个p g ，但冈样品量只用几个n l 体积，故所用样品浓度限制 在m g l 级。因此，只有研究开发灵敏度更高的检测系统，毛细管区带电泳的优势才能充分发挥出 来。 超临界流体色谱法就是以超临界流体作为流动相的色谱分析技术。其可在较低温度下分析分 子量较火、对热不稳定的化合物和极性较强的化合物，可与各种气相、液相色谱检测匹配；还可 与红外、质谱联用。它可以通过调二侮压力、温度、流动相等组成多重梯度，选择最佳色谱条件。 超临界流体色谱法综合利用了气相色谱法和高效液相色谱法的优点，克服了各自的缺点，成为一 种强有力的分离和检测手段。 4 2 微生物学检测法 微生物学检测法的主要原理是根据泰乐菌素可对特定微生物有抑制作h j 米定性或、| ，定量确定 受检样品中的泰乐菌素残留。如四平皿试验方法( f o r u m - - p l a t et e s t ，f p t ) 、拭子( 义称棉签) 试 验( s w a bt e s t ) 方法、纸片法、c h a r m 检测法等。 4 3 免疫化学测定法 免疫化学测定法( i m m u n o a s s a y ，i a ) 不仅能定量检测出动物体内微量的内源性或外源性化合 物，并且能广泛地用于残留分析的某些领域。本法具有快速、方便、特异性好和灵敏度高等特点。 常用的免疫化学测定法有放射免疫测定( r i a ) 、酶免疫测定( e i a ) 、荧光免疫测定( f i a ) 以 及胶体金免疫层析技术( g i c a ) 。放射免疫测定是将抗血清与待测约物在试管中孵育一定的时间 后，加入同位素标记的待测药物，该同位素标记药物即和待测药物竞争与抗体发生反应，采j = f j 适 当的方法将被抗体结合的和朱被抗体结合的标记药物分离，未被抗体结合放射性标记药物留在溶 液中。荧光免疫测定是将抗血清、待测约物、荧光标记的待测药物混合在聚苯乙烯管中、经孵育 后加入y 球蛋白和分子量6 0 0 0 的聚乙二醇，使与之结合的待测药物利荧光标记的药物留在上清液 8 中。当抗血清与荧光标记药物的避一定时，含待测约物多的试管中，抗体结合的荧光标记药物少， 上清液中游离的荧光标记的药物就多。即待测物含量与游离的荧光标记物含量成正比，测定上清 液的荧光强度，即可算出待测物含量。 4 3 1 酶免疫测定法 酶免疫测定是h j 酶标记抗原、半抗原或抗体而建立的方法。酶免疫测定可分为均相 ( h o m o g e n o u s ) + lj t t 均相( h e t e r o g e n o u s ) 两种类型。在均相e i a 中可不需进彳了游离的和结合的标 记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗体反应后形成的酶标记抗原抗体复合 物中的酶失去其对底物作用的活力，因而测出的酶活力直接反映游离的酶标记物。均相e i a 在临 床检验中较少应用。非均相e i a 需先进行游离的和结合的标记物的分离。这种同相酶免疫测定方 法在1 9 7 1 年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) ，简称 e l i s a 。e l i s a 的基础是抗原或抗体的同相化及抗原或抗体的酶标记。结合在同相载体表面的抗 原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，义保留酶的活性。在 测定时，受检标本( 测定其中的抗体或抗原) 与同相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方 法使同相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体， 也通过反应而结合在同相载体上。此时| 矧相上的酶量与标本中受检物质的量早一定的比例。加入 酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可 根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果， 使测定方法达到很高的敏感度。e l i s a 具有特异性强、灵敏度高、方便快速、分析容量大、分析 成本低、安全可靠等优点，故在国内外得到了快速发展，药物残留的e l i s a 检测更是成为一个研 究的热点。但e l i s a 也有其局限性和不足之处，如开发需要投入较多的资金和时间，得到一个好 的抗原并不容易，对试剂的选择性高，很难同时分离多种成分，对结构类似的化合物有一定的交 叉反应等。 4 3 2 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜卜对抗原或抗 体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。自1 9 6 2 年f e l d h e r r 和m a r s h a l l 首次用胶体金作 为电子显微镜示踪标志物【l l ，1 9 7 4 年以胶体金标记第二抗体建立了间接免疫金染色技术【2 】。 g e o g h e g a n t 3 】应用免疫金技术检测b 淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金技术( i g s ) 。 d a n s c h e r 在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法( i g s s ) 。 h o l g a t e l 4 l 也对此法进行了改进。近年来，胶体金免疫层析技术亦被引入免疫化学检验领域，胶体 金免疫层析技术是以微孔膜为i 司相载体，其原理是将已知的特异性抗原( 或抗体) 固定丁膜上作为 检测带，胶体金标记物干燥在玻璃纤维的结合释放垫上，其一端与膜相连，另一端与样品垫相连， 膜的另一端迮有吸水垫。当加入液体样品( 全血、血清、尿或其他体液) 后，样品通过毛细管的扩散 作用向前移动，并通过含标记物的玻璃纤维，使标记物重新水化，并与胶体金标记物相互反应， 然后起向前泳动，至检测线( | 司定有特异性抗原或抗体) ，这样标记物与待测物的复合物会被检测 线截获，而出现明显而直观的红色结果。如果样品中不含待测物，则会和游离标记物一起越过检 - 9 测线，到达控制线或试验终【 ：线( 来判定试验的终j 卜时间) 。多采州夹心法检测抗原或间接法检测抗 体5 t6 1 ，也有采用双孔间接法或反流免疫层析法检测l g g 和i g m l 7 引，对于小分子抗原来说则宜采 用竞争抑制法【9 1 。 4 3 目前存在的问题 我国规定川e l i s a 方法作为蜂蜜中泰乐菌素残留检测的标准方法，但猪、禽、牛产品或组织 的测定方法为h p l c l c m s m s 。h p l c l c m s m s 繁琐费时、仪器设备昂贵、需要专业人员操作， 免疫化学测定法冈其快速、灵敏、高效止越米越受剑欢迎。国外对t l 酶免疫方法报道很多，有少 数国外的e l i s a 试剂盒进入中国，但是价格昂贵，冈此，亟待研究建立更为准确、灵敏、快速、 简便、实用的检测方法。 5 本研究的目的和内容 本研究目的在于制备t l 人丁抗原，利用单克隆抗体技术生产针对t l 的单克隆抗体，依据酶 联免疫吸附实验的原理组装e l i s a 试剂盒，并依托河南免疫学重点实验室所拥有的国家专利技术 开发的胶体金试纸条，初步建立其免疫学快速检测方法。期待提供一种准确、灵敏、快速、简便、 实用的检测方法，用于t l 残留的筛查，为有效的治理t l 的滥用、保障动物源性食品的食用安全 提供科学研究利实际应用依据。 主要内容：针对t l 结构中存在的活性基团氨基，拟采用碳化二亚胺( e d c ) 法或羧甲基羟胺 法将载体蛋白b s a 、o v a 笛与t l 交联：应用紫外扫描、s d s p a g e 等技术对合成抗原进行鉴定； 主要包括动物免疫、抗体效价的检测、细胞融合、杂交瘤细胞株的建立、筛选、克隆、单抗生产； 单抗鉴定、交叉反应性等；进一步研究e l i s a 方法的建立，待检样品的处理、定量检测、试剂盒 的交叉反应性、精确性、重复性、稳定性等的鉴定；快速检测试纸的组装，以及其精确性、重复 性、稳定性等的鉴定等。 1 0 试验一泰乐菌素单克隆抗体的制备与鉴定 引言 1 9 7 5 年k o h l e r 和m i i s t e i n 首次应用杂交瘤技术生产单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ，m c a b ) u l j 1 9 9 6 获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人誉为“免疫学中的一场革命”， 该项技术具有巨人的生命力和发展前景。目前由杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的应州范围愈来愈 7 。泛，已经深入到整个生物医学的各个领域，诸如生物化学、分子生物学、免疫学、药理学、病 毒学、细菌学、寄生虫学、肿瘤学、遗传学、药物学、血液病学、内分泌学等学科。本试验用b s a 连接的t l 免疫b a l b c 小鼠，利用杂交瘤技术制备t l 单克隆抗体，并进一步作了一系列鉴定。 1 材料与方法 1 1 仪器 倒置生物显微镜，德国l e i c a 公司； c 0 2 培养箱，英国g a l a x y 公司； 超净工作台( 美国f o r m a s c i e n t i f i c 公司) ； 5 5 0 - 犁酶标仪，美国b i o r a d 公司； n d 一1 0 0 0 紫外连续扫描可见分光光度计、高速冷冻离心机，美国b k m a n 公司； j y 6 0 0 c 电泳仪，北京君意仪器有限公司； d z y 6 0 9 0 真空干燥机，上海恒河有限公司； s z 9 3 自动双重水蒸馏器，上海荣生化仪器厂； 9 0 3 定时恒温双向磁力搅拌器，上海亚荣生化仪器厂； a e 2 6 0 电子天平，德国m e t t l e r 公司； h 1 9 3 2 1 精密酸度计，意人利h a n n a 公司： s y n g e n e 凝胶成像系统。 1 2 试剂 酒彳i 酸泰乐菌素( t y l o s i nt a r t r a t e ) ，s i g m a 产晶； 牛血清白蛋白( b s a ) 、卵清白蛋白( o v a ) ，a m r e s c o 产品； 碳化二二胺( e d c ) ，s i g m a 产晶： - 1 1 羧甲基羟胺，s i g m a 产品； 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂为g i b c o 产品； 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠i g g 抗体( g a m i g c h r p ) ，购白华关生物：j ：程公司； 1 3 细胞 n s 0 ( p l a s m a c y t o m a c e l ll i n e ) 浆细胞瘤细胞由英国国家动物健康研究院惠赠。 1 4 实验动物 b a l b c 小鼠购白郑州大学医学院实验动物中心，昆明鼠为本研究室繁育。 1 5 主要试剂配制 1 5 1p b s a 缓冲液 n a c l l o g ，k c l0 2 5 9 ，n a 2 h p 0 41 4 4 9 ( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 5 6 9 ) ，k h 2 p 0 40 2 5 9 ，溶于 d d w 定溶至1 0 0 0 m l 。 1 5 2p b s t 洗涤缓冲液 p b s a + 0 0 5 t w e e n 2 0 。 1 5 3 包被液 0 1 m o l l n a h c 0 3 n a 2 c 0 3 缓冲液，p h9 6 ：n a 2 c 0 3 ( 无水) 1 5 9 9 ，n a h c 0 3 2 9 3 9 ，加d d w 定容至1 0 0 0 m l 。 1 5 4 封闭液 p b s t + 5 猪血清。 1 5 5t m d 底物缓冲液 a 液：用0 1 m o l lp h 5 0 醋酸钠柠檬酸缓冲液加热溶解0 5 9 过氧化脲再与0 0 8 91 f 那西酊( 预 先加热溶于d d w ) 混合定溶于1 0 0 0 m l 。 b 液：t m b1 2 7 9 溶于5 0 0 m l 甲醇再与5 0 0 m l 甘油混合。 1 5 6 终止液 2 m o l lh 2 s 0 4 ：9 8 浓硫酸( 18 m o l l ) 2 0 m l 稀释至18 0 m l 。 1 5 6g n k 溶液 n a c l 8 9 ，k c l 0 4 9 ，n a 2 h p 0 4 2 h 2 01 7 7 9 ( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 5 6 9 ) ，n a h 2 p 0 4 。h 2 00 6 9 9 ( n a i l 2 p 0 4 2 h 2 00 7 8 9 ) ，葡萄糖2 9 ，酚红0 0 1 9 ，加d d w 定溶至1 0 0 0 m l 。调p h 值7 2 。1 1 5 ，高压1 5 r a i n ，4 c 保存备用。 1 5 70 2 台盼蓝溶液 o 2 9 台盼蓝溶于10 0 m lp b s a 。 - 1 2 一 1 5 8 青链霉素溶液( 1 0 0 x ) 取青霉素( 钠盐) 1 0 0 万单位和链霉素1 0 0 万单位，溶于1 0 0 m l 灭菌超纯水中，小鼙分装， 2 0 。c 保存，用于细胞培养基的抗菌添加剂。 1 5 98 一氮鸟嘌呤储存液( 1 0 0 x ) 取2 0 0 m g8 氮鸟嘌呤加入4 m o l ln a o hl m l ，待其溶解后加超纯水至1 0 0 m l ，以0 2 2 9 m 滤 膜过滤除菌，小量分装，一2 0 保存。用y - h g p r t 骨髓瘤细胞的选择和维持。 1 5 1 07 5 n a h c 0 3 溶液 取7 5 9 n a h c 0 3 溶丁超纯水中至1 0 0 m l ，0 2 2 9 m 膜过滤除菌，小量分装，2 0 。c 保存，用丁调 培养基和5 0 p e g 的p h 值。 1 5 1 1 5 0 聚乙二醇( p e g ) 取分子量4 0 0 0 的p e g0 5 9 装，丁小玻璃瓶中，11 5 。c1 5 m i n 高压灭菌，4 。c 保存，临用前加等量 基础培养基，用少许7 5 n a h c 0 3 调p h 值至8 0 。 1 5 1 2 基础培养基r p m i - 1 6 4 0 按生产厂家规定的程序配制，0 2 2 9 m 滤膜过滤除菌，4 。c 保存。 1 5 1 3 完全培养基r p m i - 1 6 4 0 1 0 在基础培养基中加1 0 新生牛血清。 1 5 1 4h t 培养基 在完全培养基中加1 的1 0 0 x h t 溶液。 1 5 1 5h a t 培养基 在完全培养基中加1 的1 0 0 x h a t 溶液。 1 6 全抗原的制备 1 6 1b s a 、o v a 与t l 的连接 采h j 碳化二亚胺( e d c ) 法或羧甲基羟胺法，将t l 与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原。将 5 m g 泰乐菌素溶解于磷酸盐缓冲液中( p h 7 0 ) 中，加入1 0 m g e d c ，室温避光搅拌6 小时。将载 体b s a 、o v a 溶y - p b s 缓冲液中，按摩尔比2 5 ：1 加入上反应中，温室搅拌过夜。将反应液用 p b s 缓冲液透析即可。 1 6 2 紫外扫描b s a 、o v a 与t l 的连接物 用p b s 精确配制t l 、b s a 和o v a 的标准溶液，然后称取一定量的t l b s a 连接物和 t l o v a 连接物溶丁生理盐水中，川紫外吸收法测定蛋白质浓度，川n d 1 0 0 0 紫外扫描仪 测得t l 、b s a 、o v a 、t l b s a 、t l o v a 的紫外吸收曲线。 1 6 3s d s - p a g e 凝胶电泳鉴定 参照郭尧君【1 2 1 介绍的方法配制各种电泳溶液，安装电泳板斤分别灌制分离胶和积层 胶，分离胶浓度1 2 ，积层胶浓度5 ，待完全凝i i i i l 后安装电泳槽，加注电泳缓冲液。样品 1 0 l 力n 上样缓冲液1 0 9 l 后沸水加热5 r a i n ，州微昔上样器上样。打开电泳仪，调整积层胶 1 3 电压到9 8 v ，大约一个小时后，观察蓝线进入分离胶后调整电压至4 8 v ，考马斯亮监染色 3 4 h ，置脱色液中脱色过夜。 1 7 动物免疫 以t l b s a 为免疫原，选择8 周龄b a l b c 小鼠5 只进行免疫。首免，t l b s ap b s 溶液与 等体积的f c a 混合成乳剂，背部皮下多点注射，剂量为每只0 2 m l ( 蛋白含量5 0 9 9 ) ；每隔2 周以同剂量t l b s ap b s 溶液与等体积的f i a 混合成乳剂，加强免疫1 次。第3 次加强免疫后l o 天，尾静脉采血检测血清抗体水平。间接e l i s a 检测抗体的产生情况，具体操作步骤是：用t l o v a 为包被抗原( 7 9 9 m l ) 包板，s 0 9 l 孑l ，3 7 。c ，2 h ，洗极；用5 猪血清( 含o v a5 m g m l ) 封闭， 2 0 0 r t l 孑l ，3 7 * ( 2 l h ，洗板；第1 孔先加入l ：5 0 多抗血清5 0 9 l ，倍比至第7 孔，第8 空留空白。 3 7 。c ，2 0 m i n ，洗板；加入羊抗鼠酶标二抗( 1 ：1 0 0 0 ) s 0 9 l 孑l ，3 7 0 5 h ，洗板；加入t m b 底 物溶液8 0 9 l ，显色5 m i n ，记录结果；加入s 0 r t l 孑l 终i l c 液终止反应后读o d 4 5 0 。小鼠血清效价， 效价达l ：3 2 0 0 以上即可用于细胞融合。融合前3 - 5 d 小鼠尾静脉和腹腔各注射5 0 9 9b s a t l 加强 免疫【1 3 】。 1 8 细胞融合 1 8 1 骨髓瘤细胞的生长 从液氮中取出n s 0 冻存细胞，立即放入3 7 。c 水浴融化，1 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，弃上清，打 散细胞团，加少量完全培养基r p m i 1 6 4 0 1 0 于冻存管中吹打混匀，全部吸出转至培养瓶中，置3 7 5 c 0 2 培养箱中培养。融合前一周使瘤细胞保持对数生长，融合时取n s 0 离心沉淀，并用o 2 台盼监染色计数，取2 5 1 07 个细胞作融合。 1 8 2 饲养细胞的制备 融合前一天制备饲养细胞，取昆明鼠2 只，经眶卜窦放血，颈脱位致p e , j , 鼠，7 5 酒精消毒 体表，以无菌手术掀开腹部皮肤，暴露腹膜，然后用5 m l 注射器和1 6 号针头将5 m l 预冷的h a t 培养基打入小鼠腹腔，轻轻挤压腹部，重新吸出注入的液体，用h a t 选择培养基稀释，以1 0 0 9 l 孔加剑4 块9 6 孔细胞培养板中，置3 7 。c5 c 0 2 培养箱中培养。 1 8 3 脾细胞的制备 取超强免疫4 d 的小鼠，眶下窦采血，分离附眭血清。脱颈致死小鼠，7 5 酒精消毒体表。无 菌手术取出脾脏，用预热至3 7 的g n k 溶液洗1 次：然后，将脾脏置丁包裹1 2 0 目尼龙纱布的 小烧杯上，加少许基础培养基，用眼科剪刀剪碎并研磨脾脏，使脾细胞早单个状态滤至小烧杯中， 加