（农业昆虫与害虫防治专业论文）杆状病毒AcMNPV体内、体外复制时基因组的变化.pdf

中i j l 大学硕士学位论文 杆状病毒a c m n p v 体内、体外复制时基因组的变化 严启滔 导师：陈其津高级工程师 专业：农业昆虫与害虫防治 答辩委员会( 签名) ： 主席：扮 委员：构杉刘0 酸 一多p ；、c 马 生物防治国家重点实验室，广州5 1 0 2 7 5 二零零五年六月 本研究获国家自然科学基金项目( n o ：3 0 4 7 0 0 6 9 ) 和_ 尔省自然科学基金项目( n o ：0 3 16 2 7 ) 资助 杆状病毒a c m n p v 体内，体外复制时基凼组的变化 i 病毒 a c m n p v b m n p v c m l 6 v p f m n p v s e m n p v s f n p v s p h n p v t n m n p v 缩略词 a “幻g t 砰 oc 口l 和h l i m u m p l en u c l e o p o l y h e d r 。v i r u s 苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒 日d 用扣垮m d n u c l c o p o b h e d v i r u s 家蚕桉多角体病毒 o p l o p h i e b i al e u c o t r e 【dg r a n u l o v i 八】s 苹果异形小卷蛾颗粒体病毒 p a n o l i sn a m m e am u l l i p l en u c i e o p o i y h e d m v l m s 小眼夜蛾核多角体病毒 印。却膳m 蹦姆“口m u 工【i p i en u c l e o p o i y h e d r o v i r u s 甜菜伎蛾核多角体病毒 印优如p 招m 厂，“g 咖e ，也lu u c k 叩o 【y l e d r 。v i n 【s 草地夜蛾核多角体病毒 s p o d o p t e r al i 【u r am u n i p l en u c i e o p o i y h e d r 。v i r l i s 斜纹夜蛾核多角体病毒 计i c 托p m s 幻n fm u l c i p i en u c 【e o p o i y h e d r o v i r u s 粉纹瘦蛾核多角体病毒 2 昆虫 s c 印。却m “喈“ 甜菜夜蛾 s f 印d 却m m 加g 驴p ，出草地夜蛾 t n n f c d p ，“s 妇n f粉纹夜蛾 3 其它 a ”pa m p l c l l i l n 氨苄青霉素 b a c b a c t er aa r t l n c l a lc h r o m o s o m c b vb u d d e dv i m s 芽生型病毒 e he s c h e r i c h mc n “大醌轩菌 e d r r ae c h y i e n ed i a n l j l l e t e t r a a 嘴l i ca c i d g e n g e n t a m i c i n庆大霉素 细菌人工染色体 乙二胺四乙酸 严启滔中山大学硕士学位论文 g v i c v l p t g i n k b l d 5 0 m m o i n p v o d 0 d v o v p b s p c r p i b p k 口d m r p m s d s t c t d 5 0 1 h 1 y i s g r a n u l 。v i m s 颗粒体病毒 h o u r 小时 h o u r sp o s t i n f e c t i o n 感染后小时数 e x t r a c e l l u i a rv l m s 胞内病毒 i s o p r o p h y it h i o pdg a l a c 【o s i d e 异丙基硫代- b - d 一半乳糖苷 k a n a m y c i n 卡那霉素 k i l o b a s e 干碱基对 l e d i u ml c t h a ld o s e半致死剂量 r n o i e c u l a rw e i g h tm a r k e r 分子量标准参照物 m a pu n i t 图谱单位 m l n u t e 分钟 m u l t l p l i c i t yo fi n f e c t j o n 感染复数 n u c i e 【1 p ( ) l y h e d r o v i m s 核型多角体病毒 o p t i c 州d e n s i t y光密度值 o c c l u s i o n d e r i v c dv i m s包涵体源犁病毒 o r i g i no fr c p l i c a 【i o n 复制原点 o c c l u d e dv l m s 包埋犁病毒 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t l 。n 多聚酶链式反应 p o l y h e d r a i i n c l u s l o nb o d y 多角体 p r o t e i n a s ek 蛋白酶k p o l y h e d n n 多角体蛋白基吲 r e v o l u n o np e rm i n u t e 每分钟转数 s e c o n d秒 s o d i u md o d e c y ls u l p a t e 十二烷基硫酸钠 5 0 t i s s u cc u l t u r ei n 话c tl o nd o s e 使半数组织培养物发生感染的病毒 剂_ ! 齄 t e r a c u c i n e 网环霉素 t r i s ( h y d m x y n 忙 h y i ) 一a m j n o r n e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 竺! ! 生主生坚! 型笪! ：堡堑塞型堕苎里塑塑皇些 x g a l 5 b m m o 4 c h l o m 3 一i n d o l y l b d g a l a c t o s e 5 - 溴一4 一氯- 3 一吲哚一口一d 一半 乳糖苷 严启滔中山大学硕士学位论文 杆状病毒a c m n p v 体内、体外复制时基因组的变化 严启滔 摘要 传代效应是杆状病毒在离体细胞中连续传代后病毒产量和毒力下降的现象， 是杆状病毒应用的瓶颈问题。传代效应的产生主要与病毒基因组的变化，特别与 缺损干扰型病毒粒子( d i p s ) 的产生与积累有关。深入研究杆状病毒体内、体外 复制时基因组变化的模式和速度以及d i p s 产生和作用机制是分析传代效应的关 键。 本研究以杆状病毒模式种苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒( a c m n p v ) 的细菌人 工染色体( a c b a c ) 为研究对象。a c b a c 既能感染宿主，电可以象质粒一样在 e ，c d “中复制，因此可简单、快速获得基因型均一的予代病毒。但a c b a c 的多 角体基因己被插入失活，为了使其具有口服感染性，本研究通过位点特异性重组， 构建了能够产生多角体的重组病毒a c b a c p h 作为本研究的实验材料。a c b a c p h 在体外( h i 一5 细胞和s f - 9 细胞) 、体内( 四龄粉纹夜蛾幼虫) 中进行连续传代时 产生了多种子代病毒突变株。利用b a c a c m n p v _ e c d z f 研究平台和r f l p 技术 对体内、体外的第1 ，5 ，l o 代子代病毒进行r e n 分析：a c b a c p h 在h i 5 细胞 中和四龄粉纹夜蛾幼虫中连续传代后，所产生的子代病毒共有的基因组区域、基 因组的平均大小、完整基因型所占比例都很相似；它们的第l 代子代病毒包含较 多病毒突变株，基因组序列完整的病毒株仅占6 ( h 1 5 ) 和2 ( t n 幼虫) ，第5 代的完整病毒株占5 2 ( h i 5 ) 和8 7 ( t n 幼虫) ，第1 0 代的完整病毒株占8 2 ( h i 一5 ) 和8 3 ( t n 幼虫) 。a c b a c p h 在s f - 9 细胞中连续传代后，病毒基因组的 变化模式却有所不同，第一代、第五代、第十代完整病毒株所占比例分别是：3 、 2 、3 。无论在体外还是体内传代时，p s f i d l 、尸s f 【d 2 、d 5 儿n 均存在于子代 病毒基因组中。某些突变株具有超摩尔带，例如：风f i d 2 、风f i i ，、瓜f i j ，并且 这些超摩尔带均具有复制原点。应用t c i d 5 0 技术检测了病毒感染细胞所产生的 芽生型病毒的毒力，活体生测技术检测了病毒感染t n 幼虫产生的多角体的毒力， 发现病毒群体中完整病毒的比例与病毒的毒力不呈正相关。 关键词：苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒：传代效应；基因组变化；宿主特异性 笪鉴堕童坐坚盟坠! 堡堕：堡苎里型堕墨鬯望堕兰丝一 g e n o m i c v h r i a t i o no fb a c u l o v i r u sa c m n p v r e p l i c a t i n g 伽 ，f p oa n d f 咒v 豇r d q i t a o y a n a b s 。l - 【a c l p a s s a g e e f f e c ti s山ep h e n o m e n at h a tt h ep r o d u c t i v i t y a n dv i r u l e n c eo f b a c u l o v i r u s e sd e c r e a s e dw h e nb a c u l o v i r u s e sp a s s a g e 胁v f v da n d 加v 打r 0 p a s s a g e e f f e c tw a sc a u s e db yt h ev a r i a t i o no fb a c u l o v i r u sg e n o m e ， e s p e c i a l l yb y t h e e m e 唱e n c ea n da c c u m u l a t i o no fd e f e c t i v ei n t e r f e r i n gp a n i c l e s ( d i p s ) t h eg e n o r l l i c v a r i a t i o nm o d ea n dt e m p oi ss t i l lu n k n o w nw h e nt h eb a c u l o v i r u s e sr e p l i c a t emv f m a n d 觑v i f r o b u tt h i si so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r sw h e nr e s e a r c h i n gt h e p a s s a g ee f f e c t d i p sp r o d u c t i o na n di n t e m ：r e n c em e c h a n i s ma l s op l a y sak e yr o i ei n r e s e a r c h i n gt h ep a s s a g ee f 佗c t p r e s e n tr e s e a r c hw a sb a s e do nt h ea c m n pv w h i c hw a st y p ev i r u so f b a c u i o v i r u s a c b a ci st h eb a c t e r i a ia n i f i c i a lc h r o m o s o m eo fa c m n pv i tc a nn o to n l y i n f e c th o s t ，b u ta l s or e p i i c a t ei nt h ee c d “l i k ep l a s m i d s ow ec a ng e th o m o g e n e o u s p r o g e n yv i r u si nt h i sw a yv e r ye a s i l ya n dq u i c k ly b e c a u s et h ep o l y h e d r i ng e n ei n a c b a cw a si n a c t i v a t e db yi n s e r t i o n ，w ec o n s t r u c t e dt h ea c b a c p hb ys i t e s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o nt or e s c u ei t so r a li n t e c t i v i t y v a r i o u sv i r u sm u t a n t sw e r eg e n e r a t e d w h e na c b a c p hp a s s a g e d s e r i a l l y i nh i 一5c e l l s ，s f _ 9c e i l sa n df b r t hi n s t a r 7 ，i c d _ p f “s f 以凡fl a r v e t h ef i r s t ，f i f t ha n dt e n t hp a s s a g ev i r u s e sw e r ec o n d u c t e dr e n a n a l y s i sb yr f l p ：t h ev i r u s e sw e r en a m e da c c o r d i n g 【ot h ep a s s a g en u m b e ra n dt h e o r i g i n ( e g i c v - 2 p h i 一5m e a n st h a tt h i si st h es e c o n dp a s s a g ev i r u so r i g i n a t e dt r o m h i 一5c e l li n f e c t e db yi c v l p h i 一5 ) ，w h e na c b a c p hp a s s a g es e r i a l l yi nh i 一5c e l ia n d f o r t hi n s t a r 盯把 o p f “s 胁凡ii a r v e i tc a nb ed i s c o v e r e d 【h a tt h ec o n s e r v a t i v eg e n o m e r e g i o ni nt h e i ri c v jt h em e a ns i z eo ft h e i ri c va n dp e r c e n t a g eo fi n t a c tg e n o m ei n t h e i r 【c vw e r es i i m l a lt h e i rn r s tp m g e n yv i r u s e sm o s t l yc o n s i s to fv a r i o u sv i r u s m u t a n t s ，t h ep e r c e n t a g eo fi n t a c tg e n o n l ei ni c v l p h i 一5a n di c l v 一1 p t n lw e r e6 a n d2 s t r i k i n g l yt h ep e r c e n t a g eo fi n t a c tg e n o i n ei ni c v 一5 p h i 一5a n di c v 一5 p t n l 2 兰塑塑主些丕兰堕圭兰坚堡茎 w e r e 5 2 a i l d8 7 ， t h e p e r c e n t a g e o fi n t a c tg e n o n l ei ni c v1 0 p h i l 5 a n d 【c v _ 1 0 p t n lw e r e8 2 a n d8 3 b u tt h ep e r c e n t a g eo f i n t a c ti ni c v _ 1 p s f _ 9 ， i c v _ 5 p 。s f 9a n di c v _ 1 0 p s f _ 9w a s3 ，2 a r i d3 i tc a nb ec o n c l u d et h a tg e n o r n i c v a r i a t i o na sa c b a c p hp a s s a g ei nh i - 5c e l lw a sd i 矗- e r e n tw i t hg e n o i n i cv a r i a t i o na s a c b a c p hp a s s a g ei ns f - 9c e l lo rt nl a r v et h ef r a g m e n t so fp 5 d d l ，p s 儿一d 2a n d 风f i - nd r e s e n t e di nm o s tv i r u sm u t a n t s s o m em u l a n t sh 越s u p e n o l a rf r a g m 跚t s ， s u c ha sp j d d 2 ，尸s 赶i ，p s j ，w h i c hm a ya c ta s 口r 妇a c c o r d i n gt op r e c i o u ss t u d i e s t h ev i r u i e n c eo fe v e r yp a s s a g eb v sw a sa s s a y e db yt c i d 5 0 ，a n dt h ev i r u i e n c eo f e e v e r yp a s s a g ep o l y h e d r aw a sm e a s u r e db yb i o a s s a y t h ev i r u l e n c eo fv i r u s e sh a dn o c o r r e l a t i o nw “ht h ep e r c e n c a g eo fi n t a c tv i r u s k e yw o r d ：a “如g ，卯妇c 。f 如m j c 。m u l t i p l en u c l e o p o i y h e d r o v i m s ；p a s s a g ee f f e c k g e n o 嘶cv a r i a t i o n ；h o s ts p e c i f i c i t y 3 严启滔中山大学硕士学位论文 第一章前言 杆状病毒( b a c u l o v i m s e s ) 是一类昆虫病毒，作为病毒杀虫剂已广泛应用于农 业害虫和森林害虫的防治，另外杆状病毒可作为外源基因表达载体在昆虫细胞中 表达异源蛋白( k i n g “d f ，1 9 9 2 ：o r e i l l y 甜f ，1 9 9 2 ) 。近来的研究还主要包括利 用基因工程技术改造杆状病毒来改善其杀虫效果( 杀虫速度和杀虫谱) ( b l a c k “ d ，1 9 9 7 ：i n c e o g l u “z ，2 0 0 1 ) 以及将杆状病毒应用于基因治疗运输载体和真核 蛋白表面展示( h o f m a n n 以n ，1 9 9 5 ：m e r r i h e w 甜 ，2 0 0 l ；l o op fn f ，2 0 0 1 ) 。苜 蓿丫纹夜蛾核多角体病毒( a “姗9 r 印 c 口f 扣f m u l t i p l en u c l e o p o l y h e d r o v i r u s ， a c m n p v ) 作为杆状病毒的模式种被广泛研究，并首先被构建成病毒表达载体。 当大规模增殖杆状病毒来生产病毒杀虫剂或表达外源蛋白时，产生了传代效 应，传代效应是杆状病毒应用的瓶颈问题。传代效应最突出的特征是：随着病毒 在昆虫细胞中复制次数的增加，病毒产量和毒力明显降低( 鼬e i l ，1 9 9 6 ) 。其原因 是缺损干扰型病毒粒子( d e f e c t i v ei n t e r f e r ep a r t i c i e s ，d i p s ) 的积累，病毒在离体 细胞中增殖数代后，d i p s 在整个病毒群体中占大多数并且干扰正常病毒的复制 ( k o o lp f 日 ，1 9 9 1 ) 。d i p s 的产生机制并不清楚，但可能与复制原点有关：它丢 失了病毒基因组的大部分遗传信息，但保留了杆状病毒复制所必需的顺式作用元 件复制原点( o 魄i no f d n ar e p l 沁a l ；o n ，p “) ( 蕊l l ，1 9 9 6 ) 。抒状瘸毒的同源 区域( 阳) ( k o o l 甜她，1 9 9 3 a ，1 9 9 3 b ；l e i s ye f 以，1 9 9 3 ；p e a r s o n 甜以，1 9 9 2 ) 和 部分早期窟囊予( 飘e ta ，1 9 9 6 ) 序列爨有笺制器点功疑。另外些实验证实抒 状病毒基因组中与真核生物的o r i 在结构上具有相似性的n o n ，h m 同样具有o 翡功麓( 珏e l 如n s 耵蔬，1 9 9 7 醢a n 叠鲋矗，1 9 9 9 ； 两o l 拼碱，1 9 9 4 ：p c a r s o n 酹 z 1 9 9 3 ) 。 a c m n p v 的d f p s 富含n o n 琅rt l e e 甜d z ，1 9 9 2 1 9 9 4 ) 这一实验结果暗示 n o n 一如对于d i p s 的产生及积累关系密切。甜菜夜蛾核多角体病毒( 勋。c 矗咿龆耀 “堙槲m u l t i p l en u c l e o p o l y h e d r o v i m s ，s e m n p v ) 在其宿主细胞s e 3 0 l 中连续传代 时，s e m n p v 的n 。# 壕琳多拷贝串联躯形式存在 鞠l m a n 雠疗。，2 2 ：y a n 譬甜 d f ，2 0 0 2 ) 。剐l m a n 等( 2 0 0 2 ) 在两个n o n 打单元之间发现一然可能参与了重组 过程懿短疼别。竣失了n 囊r 麓s e 嚣a e ( s o m n p v 基因缝静缁菡人工染色髂) 杆状病毒a c m n p v 体内、体外复制时基因组的变化 可维持病毒基因组的稳定性和多角体的产量( 剐l m a n 甜d f ，2 0 0 2 ) ，但以缺失了 n o n 一 m 的a c b a c 为基础( a c m n p v 基因组的细菌人工染色体) 所构建的外源 基因表达载体尽管可以提高病毒基因组稳定性，却不能阻止外源基因的缺失，从 而不能维持外源蛋白的表达量( p i i l m a n 甜n f ，2 0 0 3 ) 。j e h l e ( 2 0 0 2 ) 发现苹果异形小 卷蛾颗粒体病毒( c 叫p 鲫， f 幻缸如“c o f m 衄g r a n u i o v i r u s ，c r l e g v ) 在活体( i nv f v d ) 宿主昆虫内复制时，其基因组的n o n 飕可在病毒基因组中通过重组机制而扩展 自身。这一发现表明n o n 加在病毒基因组中拷贝数的增加并不限于病毒在离体 ( i nv i f m ) 培养细胞中所产生的d i p s 中。 本研究以杆状病毒模式种苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒( a c m n p v ) 的细菌人 工染色体( a c b a c ) 为研究对象。a c b a c 既能感染宿主，也可以象质粒一样在 e c o “中复制，因此可简单、快速获得基因型均一的子代病毒。但a c b a c 的多 角体基因己被插入失活，为了使其具有口服感染性，本研究通过位点特异性重组， 构建了能够产生多角体的重组病毒a c b a c p h 作为本研究的实验材料，并将 其在粉纹夜蛾细胞株( h i ，5 ) 、草地贪食夜蛾细胞株( s f - 9 ) 和四龄粉纹夜蛾幼虫 中进行连续传代，利用b a c a c m n p v e “研究平台和r f l p 技术对体内、体 外的第l ，5 ，1 0 代子代病毒进行r e n 分析。研究结果可为构建高效稳定的杆状 病毒表达载体提供理论依据，为重组杆状病毒杀虫剂的合理使用提供科学指导， 为病毒的微生态学的研究提供新的认识。 8 严启滔 中山大学硕士学位论文 第二章可产生多角体的重组病毒a c b a c p h 的构建 2 1 材料与方法 2 1 1 细胞系 草地贪夜蛾( 印谢印f p m 加g 咖地m ，s f ) 细胞系s f - 9 ，粉纹夜蛾( 丹f c 印f m 5 妇所) 细胞系h i 5 由荷兰w a g e n i n g e n 大学j u s tmv l a k 教授赠送。细胞维持于添加1 0 胎牛血清( g i b c ob r l ) 的g r a c e s ( g i b c ob r l ) 培养基中，培养温度为2 8 ， 每3 4 天传代一次。 2 1 2 病毒 a c m n p v ：为本室保藏； a c b a c ：为g i b c ob r l 公司的商品化产品。a c b a c 是a c m n p v 的细菌人工 染色体，通过同源重组在a c m n p v 基因组多角体基因所在区域引入了 m i n i f 一1 a c z 电t t t n 7 一k a n 片段。故a c b a c 既象a c m n p v 一样感染宿主，又像质粒 一样在e f f 中复制和进行分子生物学操作。 2 1 3 质粒 p f a s t b a c p h ：为本室保存，在p f a s t b a c l ( 为b a c - t o b a c 杆状病毒表达载 体系统中带有a c m n p v 多角体启动子的转移载体) 插入了苜蓿丫纹夜蛾核多角 体病毒的多角体基因构建成。 2 1 4 菌株 大肠杆菌( 西c 抛r f c 面c d “) d h l 0 日( 含有a c b a c 和h e l p e rp l a s m i d 的 d h l 0 b ) 为本实验室保存，基因型为：f m c r a ( n l m h s dr m s m c r b c 】。 大肠杆菌( e 缸 p r i f 矗妇“) t g l 为本实验室保存，基因型为：s 印e j d 5 砌 化4 c p m a 口jf f 棚d 3 6 p 阳a b + f a c ，qf a c z m 1 5 。 9 杆状病毒a c m n p v 体内、体外复制时基因组的变化 2 1 5 细菌培养基 l b 液体培养基 菌，4 保存； l b 固体培养基 菌，4 保存； 0 5 y e a s te x t r a c t ，l 1 b p t o n e ，1 n a c i ，p h 7 o 。高压灭 l b 液体培养基中加入1 5 a g a rp o w d e r ，p h 7 o 。高压灭 s o b 液体培养基：o 5 y e a s te x t r a c t ，2 t 巧p t o n e ，0 0 5 n a c l ，0 2 5 n 1 mk c l ， 2 0 m mm g c l 2 p h 7 o 。高压灭菌，灭菌前加入k c l ，灭菌后加入m g c l 2 ( 经高压灭 菌) ； s o c 液体培养基：含2 0 t n m 葡萄糖的s o b 。 2 1 6 引物( 见表2 1 ) 表2 一l 引物序列及特征 t a b l e2 一ls e q u e n c e sa n dc h a r a c t e r i s t i c so fp r i m e r s 2 1 7 昆虫细胞培养基 添加l o 胎牛血清的g r a c e s 昆虫细胞培养基( 用于培养昆虫细胞) 不含血清和抗生素g r a c e s 昆虫细胞培养基( 细胞转染所需) 2 1 8 限制性内切酶及其它酶 限制性核酸内切酶为t a k a r a 公司产品；蛋白酶k ( pk ) 购自b o e h r i n g e r m a n n h e i m 公司：r n a s e a 为s i g m a 公司产品。 2 1 9 试剂盒 质粒小量制备试剂盒e z n ap l a s 嘶dm i n i p r e pk i t i 为o r n e g a 公司产品 o 严启滔巾山大学硕士学位论文 b a c 大量制备试剂盒( q i a g e nl a 喀e c o n s t r u c tk i t ) 为q i a g e n 公司产品。 2 1 1 0 溶液 2 1 1 0 1 提取b a cd n a 所用溶液 1 ) 溶液i ：1 5m mt r i s c i ( p h 8 o ) ，1 0m me d t a ( p h 8 o ) ，1o o m lr n a s e 2 ) 溶液i i ：o 2 m n a o h ，1 s d s 3 ) 溶液i i i ：3 mp o t a s s i u ma c e t a t e ( p h 5 5 ) 2 1 1 0 2d n a 琼脂糖凝胶电泳缓冲液 5 0 t a e ( 1 0 0 0 m i ) ：2 4 2 9 t r i s ，5 7 l m l 冰乙酸，l o o m l o 5 m e d t a ( p h 8 o ) 2 1 1 0 3 提取包埋型病毒d n a 所用溶液 1 ) 3 d a s 溶液：0 3 mn a 2c 0 3 ，0 5mn a c l ，o 0 3me d t a ，p h l o 5 。 2 ) t r i s 饱和酚 3 ) t r i s 饱和酚，氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 2 i 1 0 4 其它溶液 1 ) 氨苄青霉素贮存液：三蒸水配成t o om m l 后用0 2 2 “m 滤膜过滤除菌， 分装，一2 0 保存。使用时每毫升培养基加入l m ，终浓度为l o o “g ，m l 。 2 ) 庆大霉素贮存液：三蒸水配成7m m l 后用o 2 2 “m 滤膜过滤除菌，分装， 一2 0 保存。使用时每毫升培养基加入l “l ，终浓度为7 “m l 。 3 ) 那霉素贮存液：三蒸水配成5 0m m l 后用0 2 2 “m 滤膜过滤除菌，分装， 一2 0 保存。使用时每毫升培养基加入l 肛l ，终浓度为5 0 g m l 。 4 ) 四环霉素贮存液：三蒸水配成l 0m g m i 后用0 2 2 m 滤膜过滤除菌，分装， 一2 0 保存。使用时每毫升培养基加入l l ，终浓度为1 0 m l 。 5 ) x g a l 贮存溶液：用二甲基甲酰胺溶解x g a l ( 5 一溴4 一氯一3 吲哚一p d - 6 ) 半 乳糖苷，5 _ b m m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y ，p d g a l a c t o p y r a n o s i d e ，x g a l ，( s 喳m a 公司产品) 配成2 0 m g ，m l 溶液，分装，2 0 保存备用。 6 ) 【p t g 贮存溶液：将8gi p t g ( i s o p r o p h y l 【h i o d g a l a c t o s i d e ，异丙基硫代 轩状病毒a c m n p v 体内、体外复制时基因组的变化 d 一半乳糖苷，s i g m a 产品) 溶于1 0m 1 三蒸水中，后用o 2 2 “m 滤膜过滤除菌 分装，2 0 贮存备用。 7 ) l o s d s 8 ) l o m n a o h 9 ) 7 5 乙醇 1 0 ) 9 5 乙醇 u ) 异丙醇 1 2 ) 1 0 甘油( 高压灭菌1 2 1 ，2 0 m i n ) 1 3 ) 蛋白酶k ( 2 0 m “m 1 ) 1 4 ) o ，l mm g c l 2 ( 高压灭菌1 2 l ，2 0 m i n ) 1 5 ) 三蒸水( 高压灭菌1 2 l ，2 0 m j n ) 1 6 ) 2 mm g c l 2 ( 高压灭菌1 2 l ，2 0 m i n ) 1 7 ) l m 葡萄糖( 过滤除菌，o 2 2 u m ) 2 1 n 菌种的保存 将单菌落接种于5 一l om ll b 液体培养基，在3 7 下培养1 6 1 8 小时，取o 8 5 m l 培养物置于盛有o 1 5m i 无菌甘油的e p p e n d o r f 管中，振荡摇匀，将其置于 一7 0 长期贮存，使用时用无菌接种环来刮取冻结构表面便可获得活菌。 2 1 1 2c a c l 2 法制备大肠杆菌感受态细胞和热击转化 i ) c a c l 2 法：d h l o b 接种于l b ( 含5 0 g ，m l 的卡那霉素和l o i l m i 的四环霉 素) 液体培养基中，3 7 ，2 0 0r p m 振荡培养过夜。次日按l ：1 0 0 体积比接种，3 7 ， 2 0 0r p m 振荡培养至o d 6 0 0 值为o 6 左右( 需2 3 小时) 。将培养物冰浴1 5 3 0 m i n 4 下，1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n 以收取菌体，并弃尽上清，加入l 体积( 培养物的体 积) 预冷的o 1 mc a c l 2 并重悬沉淀，重复一次。4 下，1 0 0 0 0 r p m 离心i m i n ，弃 尽上清，再以l 1 0 体积的预冷的0 1mc 1 2 重悬沉淀，分装成若干管，冰浴保 存，4 8 h 之内使用。 2 ) 热击转化方法：取两管制备好的感受态细胞，一管加入2 0 0 u g 质粒d n a ( p f a s 【b a c p h ) ，冰浴3 0 m i n ，4 2 下热击4 5 9 0 秒后，冰浴2 m i n 。3 7 ，2 ( ) or p m 2 严启滔中山大学硕士学位论文 振荡培养i h 。然后取5 0 一2 0 0 l 菌液涂布于l b 固体培养基平板上( 含5 0 “g m l 的卡那霉素、1 0 岵r n l 的四环霉素和7 ”i t l l 的庆大霉素，4 p 1 1 0 0 m m l 的i p t g ， 4 0 n l 的2 0 m m 1 的x g a l ) 。另一管作阴性对照，除不加d n a 外，其它处理相同。 3 7 倒置培养1 2 一1 6 小时，观察菌落生长情况，2 4 小时后，把平板放置于4 2 4 h ， 以使蓝白斑更明显，然后挑取1 0 个白色单菌落( 发生位点特异性重组时，半乳 糖苷酶的n 片断被插入失活，菌落显白色) 进行第二次监白斑筛选。 2 1 1 3 质粒d n a 的提取 用e z n f a p l a s 面dm i n i p r e pk i ti 提取，按说明书操作。 2 l 1 4a c b a c p hd n a 的制备 1 ) 参照 i n v i t m g e n 公司的b a c t o - b a c b a c u l o v i r u se x p r e s s i o ns y s t e m i n s t 九i c t i o nm a n u a l ( 小量提取) 将单菌落接种于3m il b 培养基( 含5 0 肚g m l 的 胃那霉素和7 肚m 1 的庆大霉素，如含有h e l p e rp l a s m i d 另含1 0 “g m l 的四环霉 素) 中，3 7 振荡培养过夜，然后按l ：l o o 体积将菌液接种至适量的l b 培养基 中，3 7 培养约1 6 2 4 h ，1 2 ，0 0 0r p m 离心收取菌体，充分弃上清，加入3 0 0 山 溶液i 把菌体吹打混匀，然后加入3 0 0 l 溶液i i ，颠倒混匀后室温下放置5 分钟， 然后加入3 0 0 l 溶液i i i ，颠倒混匀并冰浴1 0 分钟，1 4 0 0 0r p m 离心1 5 分钟，取 上清，加人8 0 0 u l 异戊醇沉淀，1 4 0 0 0r p m 离心1 5 分钟，再用7 0 乙醇洗一次， 1 2 ，0 0 0 r p m 离心5 m i n ，自然干燥后溶解于4 0 ”l 三蒸水，4 保存备用或一2 0 长期 保存。 2 ) 用q i a g e nl a r g e c o n t r u c tk i t 制备超纯b a cd n a ，按说明书操作。 2 1 1 5 病毒d n a 的制备 将约1 0 9 个含有包埋型病毒的多角体悬于4 0 0 h l 三蒸水中，加入2 0 0 “l3 d a s 溶液，3 7 碱解1 5 3 0 m i n ，每隔5 分钟摇匀一次，使其充分裂解。8 ，0 0 0 广p m 离 心5 m i n 以去除未裂解的多角体，将含有病毒粒子的上清转移至新离心管中。加 蛋白酶k 至终浓度为2 0 0 “g r n l ，置于5 0 水浴中酶解2 5 h 或过夜，然后加s d s 至终浓度为l ，5 0 下作用o 5 h 。用等体积t r i s 饱和酚抽提一次，再用等体积 杆状病毒a c m n p v 体内、体外复制时基固组的变化 的t r i s 饱和酚，氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提一次，加入2 5 倍体积的9 5 乙醇， 混匀后在7 0 放置5 i n i n 或在一2 0 放置3 0 m i n 。1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，用7 0 乙醇洗涤，l 2 ，o o o r p m 离心5 m i n ，自然干燥后溶解6 0 l 三蒸水，4 保存备用或 2 0 长期保存。 2 1 1 6b a cd n a 的酶切与电泳检测 取约1 雌的b a cd n a 在5 0 ”l 的酶切体系下，3 7 水浴中反应1 6 h 左右。 酶切产物在o 6 0 8 琼脂糖凝胶中，4 0 v 的电压、l o 下电泳1 2 3 6 h ，利用 凝胶成像系统记录电泳结果。因b a cd n a 较大，切点多，为使酶解完全，在实 验中对常规的酶解反应条件作一些变更：( 1 ) 扩大酶切反应体积至5 0 u i ；( 2 ) 加 大限制性内切酶的用量，每l g b a c d n a 使用3 0 u 的酶；( 3 ) 延长反应时间至 1 6h ；( 4 ) 使用0 6 o 8 琼脂糖凝胶进行低电压( 3 0 5 0v ) 、长时间( 1 2 3 6h ) 电泳。 2 1 1 7p c r 反应体系 i o b u f f 色r p r i m e r i ( 1 0 p m o i “1 ) p r i r r l e r 2 ( 1 0 p m o l p 1 ) d n t p ( 1 0 m m ) t e m p l a t e 普通t a q a s e h 2 0 u l 1 2 5 u l 2 5 u l l u l l “1 0 5 l l l 4 0 “ t b t a l 、b l u m e 反应条件： i 3 0 3 5 i 5 0 “ 9 4 5 m i n 9 4 4 5s e c ，5 0 - 5 5 ( 根据引物的7 r m 值而确定) 4 5s e c 7 2 延伸( 延伸时间按照1 k b m i n 进行设定) ， 7 2 i o m i n 1 4 严启滔中山大学硕士学位论文 反应完成后在4 下保存。 2 1 1 8 细胞的培养与传代 h i 一5 、s f - 9 细胞在2 5c m 2 一次性细胞培养瓶( g r e i n e r b i o o n e ) 中进行培养， 每瓶加入3 4 r n l 添加1 0 胎牛血清的g r a c e s 培养基，2 7 下培养。 当细胞连接率超过8 0 时即可进行传代。传代时，先吸去旧培养基然后加 入适量添加1 0 胎牛血清的g r a c e s 培养基，然后用吸管将细胞轻轻吹打，将细 胞悬液接种于新的培养瓶中，轻轻晃动使细胞分布均匀，置于2 7 培养箱中静 置培养。 2 1 1 9 病毒d n a 转染昆虫细胞 将l 1 0 6 个处在对数生长期的s f - 9 、h i 5 细胞分别接种于2 5 c r n 2 培养皿中 培养过夜使其贴壁形成单层。1 嵋a c b a c p h ( 能够产生多角体的b a c a c m n p v ) d n a 稀释于不含皿清和抗生素的g r a c e s 培养基中至1 0 0 u l 并混匀之，再将8 u l c e l l f e c “n 稀释于不含血清和抗生素的g r a c e s 培养基中至l o o u l 并混匀之，轻轻 混匀上述两种溶液，在2 7 下放置4 5 m i n 。加入8 0