（预防兽医学专业论文）牛冠状病毒的分离鉴定和N蛋白的表达.pdf

中文摘要 从腹泻犊牛粪样中分离出一株冠状病毒，该病毒可在h r t - 1 8 细胞上形成有规律的病变， 对氯仿、乙醚敏感；经1 胰酶处理的病毒仍然能够在h r t - 1 8 细胞上生长，毒力保持不变； 病毒分别在p h 5 0 和p l 1 3 0 经3 7 3 2 作用2 小时，p h 5 0 处理组毒力下降1 个滴度，p h 3 0 处理 组毒力下降2 个滴度；该病毒在5 0 时，毒力随时间变化而有不同程度下降，其中，5 0 作用 1 5 分钟，病毒下降3 个滴度；5 0 作用3 0 分钟，c p e 消失；恒定时间l 小时，设定5 0 ( 2 、6 0 、 7 0 和8 0 不同温度处理后的病毒失去增殖能力。病毒仅对h r t - 1 8 细胞敏感。提取病毒r n a 后，用b c v 引物r t - p c r 扩增出14 2 0 b p 和3 2 2 b p 片断，基因测序结果与u s a ( a f 0 5 8 9 4 2 ) 株的同源性为1 0 0 , 4 ，确定分离的病毒为牛冠状病毒( 命名为b c v - d q ) 。将r t - p c r 扩增出的 b c vn 蛋白基因与1 k i e m te a s y 载体连接构建b c vn 蛋白克隆质粒( p g e m - t - n ) ，将阳性 克隆质粒经b a m hi 与8 a li 双酶切后，回收目的片段并插入到p e t - 3 2 a ( + ) 表达载体中，构建 成重组质粒( p e t - 3 2 a - n ) ，转化到e c o l ib l - 2 1 后，在3 7 下，经i p t g 诱导表达。用表达的 重组n 蛋白和分离的b c v 分别免疫小鼠，用它们的抗血清分别与重组n 蛋白进行w e s t e r n b l o t 。 结果重组蛋白能够与重组蛋白抗血清和分离的b c v 抗血清结合，表明重组蛋白能够刺激小鼠 产生抗体，具有与天然b c v n 蛋白相同的抗原性。 关键词：犊牛；冠状病毒；分离；鉴定：n 蛋白；表达 1 1 1 a b s t r a c t a $ l r a l l le o r o n a v i r u sw s si s o l a t e df r o mt h ef e c a ls u s p e n s i o no fad i a r r h e i cc a l f , a n di tc o u l d m u i t i p l yo i lt h eh r t - 1 8 c e l l sa n di n d u c er e g u l a re y t o p a t h i ce f f e c t ( c p e ) t h i sv i r u sw a ss e n s i t i v e t oc h l o r o f o r ma n de t h e ra n dc o u l dr 韶碗t o1 t r y p s i n 砒3 7 f o r h o u r i na c i dt o l e r a n c ea s s a y , t h i sv i r u sw a sr e s i s t a n tt op h 3 0a n dp h 5 0m3 7 ( 2f o r2h o u r s , a n dt h ea v e r a g ei n f e c t i o nt i t e ro f t h ev i r u sd e c r e a s e d1 i t t l e i nh e a ta s s a y , a t5 0 t h ev i r u sw a sp r o c e s s e dd i f f e r e n tt i m ea n dt h ev i r a l v i r u l e n c ed e c r e a s e dt od i f f e r e n td e g r e e a m o n gt h e s ec o n d i t i o n s , t h ev i r a lv i r u l e n c ed e c r e a s e d2 t i t e r sa l5 0 1 5m i n u t e sa n dt h ec p ed i s a p p e a r e da t5 0 f o r3 0m i n u t e s 1 1 v i r u s1 0 s tt h e r e p r o d u c t i v e c a p a c i t y c o m p l e t e l y w h e n t r e a t e d w i t h d i f f e r e n t t e m p e r a t u r ea s5 0 、6 0 ，7 0 、 8 0 f o r h o u r b c vw a s0 1 1 l vs e n s i t i v et oh r t _ 1 8e e l l l i n e mv i r u sr n aw a se x t r a c t e df r o m c e l lc u l t u r ef l u i da n dt w og e n ef i a g m e o t sw i t ht h el e n g t ho fl4 2 0 b pa n d3 2 2 b pw e r ea m p l i f i e db y r t p c r u s i n g t w o p a i r s o f p r i m e r s o f b c v d n as e q u e n c i n g s h o w e d t h a t t h e h o m o l o g y i s l 0 0 c o m p a r e dw i t hr e p o r t e du s a ( a f 0 5 8 9 4 2 ) s w a i n 朋1 er e s u l ti n d i c a t e st h a tt h ev i r u si s o l a t e df r o m d i a r r h e i cf e c e so fan e w b o r nc a l fw a sb c v ( n a m e db c v - d q ) n 艟g e me n c o d i n gnp r o t e i no f b c vw a sa m p l i f i e db yr e v e r s et r a n s c d p t i o np l o y m e r a s ec h 疵r lr c 撒t i o n ( r t - p c r ) a n dw i i sl i n k e d t ot h ep g e m - te a s yv e c t o rt oe o n s m _ l e tt h ep l a s m i dp g e m - t - n t h e nt h ep l a s m i dp g e m - t - n w a sd i g e s t e dw i t hb a m hia n ds mi ，a n df r a g m e n t s o f ng e n ei n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o r p e t - 3 2 a ( 。嚏1 飞er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si n d u c e dw i t hi p t ga t3 7 1 2 t w og r o u pm i c ew e l e i m m u n i z e dw i t ht h ee x p r e s s e dr e c o m b i n a n tnp r o t e i na n db o v i n ee o r o n a v i r u sr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t so f w e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tn p r o t e i nc a nb i n dt ob o t ha n t i s e r u m so f t h e r e c o m b i n a n tn p r o t e i na n db o v i n ec o r o n a v i r u s ，t h er e c o m b i n a n tnp r o t e i nc a l lp r o d u c ea n t i b o d y a n dh a st h es a m ea n t i g e n i c i t ya snp r o t e i no f b o v i n ee o r o n a v i r u s i 【e yw o r d s ：b o v i n e ：c o r o n a v r i u s ；i s o l a t i o n ：i d e n t i f i c a t i o n ：np r o t e i n ：e x p r e s s i o n 英文缩略词表 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 关薪 时间5 西7 年月，7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：关害f r 导师签名： 仍张 n 时间：7 2 叼年月，7 日 时间：0 邗7 年6 月f 莎日 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章综述 1 1 前言 第一章综述 我国大力发展畜牧业，养牛业已成为畜牧业的支柱产业，而牛的各种疾病却严重阻碍着畜 牧业的发展。新生犊牛的腹泻是临床上常见的疾病1 1 j ，其发病率在7 0 1 0 0 ，死亡率在2 0 左右。腹泻犊牛治疗的费用和犊牛的死亡可给生产者造成经济上的巨大损失。】。据1 9 7 0 1 9 7 6 年间的调查统计，美国4 8 个州因b c v 导致犊牛腹泻，造成的经济损失每年达16 7 0 28 4 0 万 美元f 4 j 。腹泻的综合症状的发病枧理是很复杂的，因为病原很多，单独或混合感染都可造成大 规模的爆发。环境、管理还有营养因素都会对疾病的严重程度和愈后有影响。牛遣状病毒、牛 轮状病毒、产肠毒素大肠杆菌和小球隐孢子虫是引起新生犊牛腹泻的四大主要病原体。在世界 范围内，这些病原引起的感染约占新生犊牛肠道感染的7 5 9 5 p j ，其中6 0 左右为病毒感染， 近年来混合感染引起牛腹泻的情况更加普遍【6 l ，特别是牛冠状病毒与牛轮状病毒成为导致犊牛 腹泻的两大主要病原牛冠状病毒( b o v i n ec o r o n a v i r u s ，b c v ) 于1 9 7 2 年由美国m e b u s 和s t a i r 等在犊牛和成年牛的腹泻病料中检出1 7 】，它被认为是引起新生犊牛腹泻最重要的病原体之一嗍。 1 9 8 5 年宋广林等首次报道了我国牛冠状病毒感染的临床病例例，但其病毒分离未见报道。b c v 的分离培养要求复杂l 聊，病毒分离培养困难，国内对b c v 的详细研究尚未见报道。冠状病毒 引起的犊牛腹泻多发于冬春季节，而黑龙江省冬季漫长，牛群多以集约化饲养，痊愈牛虽然可 以产生长达1 5 年的免疫力，但其鼻分泌物和粪便仍然可排毒，捧毒的牛可以造成牛群再次爆 发该病。 1 2 牛冠状病毒性腹泻的研究进展 1 2 1 流行病学 肉用或奶用犊牛的感染日龄为l 9 0 日龄，而腹泻常发生在l 2 周龄，在冬季流行更为严 重。腹泻通常在同一牛场连年发生，当牛群被转移到干净场时，仍会发病。可能是临床健康的 带毒母牛起到了传染源的作用| i l l 。 m e b u s 等i s l ( 1 9 7 3 ) 首次报道了美国发生的牛冠状病毒感染，接着在联邦德国、加拿大、 日本、韩国、巴西等国也报道了此病，目前，牛冠状病毒感染分布于世界许多国家。建立血清 学方法检测b c v 抗体，可以了解牛冠状病毒感染的分布情况及其感染率。s t o r z 与r o u i j 4 检查 联邦德国的牛，发现6 0 6 7 具有b c v 抗体，h a j e r 与s t o r 1 3 1 用同祥方法检查了美国的牛群 亦获相似的结果。r o d a k 等i l4 j ( 1 9 8 2 ) 检查了1 2 个农场的11 0 头牛，具b c v 中和抗体的有1 0 9 例，姚火春( 1 9 9 0 ) 应用h a h i 实验方法，对我国部分地区b c v 血清学阳性分布情况进行 了流行病学调查，结果证实了b c v 阳性率为4 4 3 8 0 2 。由此可见b c v 分布广泛，感染率 很高。 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章综述 1 2 2 临床症状 以犊牛大量出血性腹泻为特点，伴有血样腹泻的犊牛在产生i 临床症状后几小时内，终因脱 水和酸中毒而死亡。耐过的犊牛，腹泻可持续2 6 天。 犊牛：以l o 日龄以内犊牛多发，b c v 引起肠炎的严重程度，随犊牛的日龄，免疫状况， 病毒毒株和感染剂量的不同而不同。日龄越小和没吃初乳的犊牛，腹泻发生的越快也越严重。 感染4 8 小时后出现黄色稀便，并持续3 6 天。体温升高或稍高，腹泻症状明显，捧黄色或黄 绿色稀粪，后期粪中常带有肠黏膜和血液，严重者表现为排喷射状水样便，重症牛常在7 天内 因急性脱水而衰竭死亡。慢性型2 6 周龄犊牛多见，多由急性型转化而来，常表现为持续性或 间歇性腹泻，常有腹痛表现。 成牛：肉牛、奶牛冬季都可发生。特征为突然发病，黑血样腹泻便。随之产奶量急骤下降， 患牛可出现鼻涕、咳嗽、精神沉郁和食欲不振。发病率高( 5 0 1 0 0 ) ，死亡率低u “。 此外，b c v 能使各种年龄的犊牛发生呼吸道感染。通常是亚临床的，常见于2 1 6 周龄的 犊牛。可出现轻度的上呼吸道症状，如鼻炎、喷嚏和咳嗽，也可侵害下呼吸道，逢成肺轻度损 害，通常不表现临床症状。 1 2 3 发病机理和病理变化 病毒可经1 3 或呼吸道感染犊牛。病毒首先感染小肠近侧端，然后向下扩散至整个小肠和大 肠。在肠道表面上皮细胞和小肠远端肠绒毛上皮细胞中复制。感染细胞发生死亡、脱落，被未 成熟细胞代替。小肠的这些变化导致肠绒毛生长受阻，相邻的肠绒毛融合。在大肠致使结肠嵴 萎缩。组织学检查，衬在小肠绒毛和结肠嵴上柱状上皮细胞被立方上皮和鳞状上皮细胞代替， 感染严重的细胞可完全脱落，随之杯状细胞数量减少。扫描电镜发现细胞上的微绒毛的长度和 大小差别显著。肠表面积的减少和未成熟细胞的存在，使肠道吸收能力大大降低，阻碍了能使 肠腔肠液容量增加的某些分泌能力，同时未成熟的细胞不能分泌正常消化酶，致使肠道消化能 力降低。未披消化的乳糖积聚，导致微生物活动增加，渗透作用失衡，致使更多的水分进人肠 腔。消化吸收能力降低而致腹泻，水分和电解质丢失j 。 剖检病死牛可见口腔、食道和胃黏膜出血、水肿。肠内容物稀薄，大小肠黏膜出血，肠黏 膜易脱落，肠绒毛萎缩，肠淋巴结水肿。部分病例可见肺部有成片出血病灶，肾脏包膜下、肾 皮质有出血斑。 1 2 4 诊断 l 工4 1 病毒分离 牛冠状病毒对营养要求极为复杂，初代分离亦极为困难，常需要特殊处理。病毒的分离是 艰苦方法，它需要很长的时间才能获得结论性的结果。m e b u s l 7 1 等从一只腹泻犊牛体内分离的一 种冠状病毒样因子能适应在胎牛原代和次代细胞上增殖并产生细胞病变( c p e ) 。国内杨盛华i j ” 等( 1 9 9 5 ) 从猝死症黄牛的心脏中分离出一株病毒，通过电镜观察，认为该病毒具有典型冠状 病形态，但并来进行进一步研究。s t o r l t 2 1 等( 1 9 8 1 ) 研究证实胰酶在细胞培养适应k 株b c v 2 黑龙江八一农垦大学硕七学位论文 第一章综述 i i i i 增殖和产生c p e 中的重要作用。 在使用胰酶的情况下，b c v 细胞培养适应株可在牛胚肺细胞、胎牛胸腺细胞、胎牛脑细胞、 牛皮肤细胞、绵羊胎肾细胞、v e r o 细胞系、人胚肺成纤维细胞系、h r t - 1 8 细胞系、m d b k 细 胞系等细胞上增殖。这些细胞可用于诊断样品的b c v 分离和定量测定。 另外，乳鼠脑、鼠脑和仓鼠脑也可用于b c v 细胞培养适应株的增殖。可以应用电镜技术， 免疫电镜技术，免疫荧光技术检测细胞或器官培养的b c v i 。 1 2 4 2 电镜观察 取腹泻牛粪便悬液负染后进行电镜检查是有条件的实验室进行冠状病毒诊断的一种很常用 的检测b c v 的快速方法。通过电镜负染色法，t s t m e m i t s u l 2 0 1 ( 1 9 9 5 ) 、j e o l l g 2 ”( 2 0 0 4 ) ，杨盛 华等”8 1 、王继远1 2 2 1 分剐采用电镜负染技术进行了b c v 的感染的诊断和流行病学调查。但由于 粪便中存在一些与病毒形态相似的颗粒，常规电镜检查不易区分，因此，需要用免疫电镜方法 作进一步鉴定。另外，当粪便中病毒粒子含量少时，电镜检出率会降低1 2 5 l 。 1 2 4 3 血清学诊断 免疫荧光技术：此法的应用范围有限，主要用于感染犊牛的肠管切片的病毒检出。b e n f i e l d l 冽 ( 1 9 8 9 ) 采用了免疫电镜技术检查b c v 感染，提高了敏感性。但此法也经常出现非特异性反 应。 h a h 1 ：h a 是一种用于直接在粪样中检测b c v 的方法但是特异性差。初乳中的i g g 和 粪中的i g a 经常干扰h a 结果，经常出现假阳性。h l 与h a 试验并用时，可改善h a 实验的特 异性。s a t 0 1 2 4 1 ( 1 9 9 7 ) 建立h a h i 方法，k a p i l l 2 5 1 ( 1 9 9 8 ) 用此方法对美国8 个州分离的多株 b c v 进行了分析，姚火春【l 1 ( 1 9 9 0 ) 建立了h a h 1 实验方法，并应用该方法对我国部分地区 b c v 血清学阳性分布情况进行了流行病学调查。h a h i 实验的缺点是必须饲养小鼠，为这类诊 断试验提供新鲜的红细胞的来源1 2 3 。 中和试验：检出中和抗体的先决条件是b c v 在细胞上增殖并产生细胞病变。随着不同毒 株的分离和在敏感细胞上传代次数的增加，该病毒逐渐适应了某些传代细胞系如h r t - 1 8 等， 国外学者利用这些细胞系相继建立了中和试验。国内。陆承平u w ( 1 9 8 5 ) 用b c v ( m u c 2 7 0 ) 株在犊牛肺细胞上建立了中和试验。此法和h a h i 既可进行临床诊断又可进行流行病学调查。 e l i s a 方法：此方法是被用于b c v 检测的最广泛血清学方法之一，很多国家均使用此方 法作为b c v 的检测方法i ”“”“3 0 l 。徐文忠1 4 1 等1 9 9 2 年建立了以生物素标记的兔抗b c v l 9 6 和酶标亲和素介导的b a s - e l i s a ，并对b c v 标准毒株和临床犊牛腹泻粪样作了检测。1 9 9 9 年 瑞典n 垃s l u n d l 3 1 1 用此方法检测牛体内b c v 特殊的l g m 和i g a 抗体，2 0 0 4 韩国j e o n g l 2 】也用此 法检测冬痢病牛粪样中的b c v ，结果表明此法的灵敏性高于直接e l a s e 方法。 但血清学检测时，还存在一些问题，由于受到动物广泛接受特异性疫苗免疫接种的影响， 动物血清中常常含有高滴度的冠状病毒抗体，所以阳性结果常常难以说明动物是疫苗接种的结 果，还是野毒感染的结果；如果被感染，受到感染的时间也难以确定。目前针对动物冠状病毒 的血清学方法都无法区别动物机体是处于感染状态还是处于疫苗免疫状态。血清学方法用于诊 断时，则需要双份血清对照检测，即发病初期以及发病l o 天后各采集同群动物血清进行检测和 判断，后者血清滴度比前者明显升高时便可确诊。 1 2 4 4 分子生物学诊断 3 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章综述 近年来，伴随着分子生物学技术的发展，动物冠状病毒核酸的检测方法也在不断的发展。 近年来，许多学者相继建立了反转录聚合酶链式反应( r t - p c r ) 方法并迅速应用于r n a 病毒 的分子生物学研究当中。其中就包括用于检测b c v 的r t - p c r 方法i ”卅，之后又相继出现 了n e s t e d p c r 、s e m i n e s t e d p c r 等方法。c h o p 3 l ( 2 0 0 1 ) 用n e s t e d p c r 检测了呼吸道和肠型 冠状病毒的交叉保护性。t a k i u c h i l 3 5 1 ( 2 0 0 5 ) 证实s e m i - n e s t e dp c r 用于检测存样品的敏感性 高于r t - p c r 方法。 1 2 ，5 治疗与防制 对腹泻病牛采取隔离措施，并且保持圈舍温暖，垫料干净，加强饲养管理。目前尚无有效 的药物用于牛冠状病毒引起的犊牛腹泻的治疗，可采取常规方法，经口或静脉输液补充丢失的 水和电解质，防止脱水和酸中毒。 b c v 腹泻防制的关键在于体内产生特异性抗体。初生犊牛可通过吸吮初乳和常乳获得被动 免疫，通过接种母牛产生高水平抗体，使犊牛产生被动免疫的同时，也防止了亚临床感染”1 。 口服卵黄和初乳可以抵抗人工诱导的b c v 引起的新生犊牛腹泻，在同等滴度下，卵黄保护比 初乳的保护要更高，用免疫母鸡的卵黄为治疗新生犊牛提供了更加有效的方法p “。 在一些国家使用冠状病毒口服疫苗，可使牛群的发病率和死亡率明显降低，疫苗是最为有 效的预防方法。但最近的研究表明，b c v 的疫苗不能完全预防腹泻的发生l ，这些疫苗缺少临 床效果的原因，很可能是这些疫苗株和当地的分离株的抗原型不同p j 。 1 3 牛冠状病毒研究进展 在国际病毒分类委员会( i c t v ) 2 0 0 1 年公布的病毒和命名第7 次报告的病毒分类系统中， 冠状病毒的分类地位为：套式病毒目( n i d o v i r a l e s ) ，冠状病毒科( c o r o n a v i r i d a e ) ，冠状病毒属 ( c o r o n a v i r u s ) 。冠状病毒科有2 个属，另一个属为环曲病毒属( t o r o v i r u s ) 。冠状病毒根据血 清型的不同，该属病毒主要分为3 组： 第1 组主要包括犬冠状病毒( c c v ) 、人冠状病毒2 2 9 e ( h c o v 2 2 2 9 e ) 、猪传染性 胃肠炎病毒( t g e v ) 和猪流行性腹泻病毒( p e d v ) 等； 第1 i 组主要包括小鼠肝炎病毒( m h v ) 、牛冠状病毒( b c v ) 和人冠状病毒o c 4 3 ( h c o v - o c 4 3 ) 等； 第1 i i 组主要包括鸡传染性支气管炎病毒( i b v ) 和火鸡冠状病毒( t c v ) 等； 新近出现的s a r s 冠状病毒其系统发生关系不属于目前己知的冠状病毒中的任何一组。为 一独立的分支 3 9 1 。 b c v 属冠状病毒科抗原i i 群的成员，病毒粒子具有多形性，但基本呈球形。直径为8 0 1 6 0 r i m 。平均直径约1 2 0 r i m 。基因组是不分段的单股正链r n a 组成，病毒囊膜是一层电子密度 不同的外膜，在该膜上有向外辐射生长的指状纤突。纤突大致分两种，一种长约2 0 n m ，还有 一种较短的指状突起，分别由凝脂酶( h e ) 和纤突糖蛋白( s ) 构成。这两种纤突结构可在样 品的贮存和制备时丢失，所见到的病毒粒子均为不同程度地丢失了这些结构。图卜1 所示为冠 状病毒电镜图。 4 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章综述 b c v 对乙醚、氯仿、去氧胆酸盐敏感，对热敏感，易被福尔马林、紫外线等灭活，但对酸 和胰酶有较强的抵抗力i 帅j 。 牛冠状病毒粒子共有4 种主要结构蛋白：核衣壳蛋白n ，囊膜糖蛋白m ，纤突诱蛋白s ， 和血凝脂酶糖蛋白h e ，图1 _ 2 所示为冠状病毒结构模式图。病毒可在许多细胞系上生长，如 人的直肠癌细胞( h r t - 1 8 ) ，犬肾( m d c k ) 、牛肾( m - d b k ) 和v e t o 细胞系等。 田l - l 冠状病毒电镜囤 f i g 1 - i t h e p i c t u r e o f e l e c t r o n m i c r o s c o p e f o r c o r o n a v l r u g 1 3 1 基因组结构 图i - 2 冠状病毒结构模式图 f i & i - 2s u u c t m tp a t t e r no f c o r o n a v i m s 牛冠状病毒为单股正链r n a 病毒，其基因组是目前已知的r n a 病毒中最大的，大小介于 2 7 k b 3 2 k b 之间，有5 端帽子结构，其后是6 5 9 8 个核营酸的引导序列( e a d e r r n a ) 和2 0 0 4 0 0 个核苷酸的非翻译区( u t r ) 。引导序列也存在于基因之间，又称为基因间序列，或转录相 关序列( t a s ) 。3 末端有2 0 0 5 0 0 个核苷酸的非翻译区( u t r ) 和p o l y a 尾。5 ，末端和3 - 末 端的( u t r ) 对于r n a 的转录和复制是非常重要的。病毒r n a 可作为m r n a ，具有感染性。 基因组含有约7 l o 个功能基因，其中4 5 个编码结构蛋白，从5r 端到3 ，依次为5 ，一多聚酶 一h e s e m n 一3 。约占全长r n a2 3 的为o r f l a 、i b ( 2 0 k b 2 k b ) ，编码r n a 多聚 酶，在o r f i a 和l b 的重叠处有特异性核苷酸序列和一假结节结构，对于o r f ! b 的翻译是必 需的j 。基因3 端的l ，3 编码结构蛋白和非结构蛋白，非结构蛋白基因散布于结构蛋白基因 之间。病毒用依赖r n a 的r n a 聚合酶进行转录，每一基因的5 是转录信号。这些序列称为 t r s ，其中高度保守的序列称为中心序列( c s ) 。病毒在感染细胞中合成5 7 种亚基因组m r n a ， 与病毒株及宿主有关，除了最小的m r n a 外，每个m r n a 有2 3 个o r f ，但只有5 ，末端的 o r f 翻译，因此这些m r n a 为结构性多顺反子，功能性单顺反子i “。冠状病毒基因组结构的 显著变异和独特的转录策略使r n a 易于发生重组。 5 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章综述 1 3 2 主要蛋白 圈1 3b c v 基因组结构匪 f i g 1 - 3s t m c t u r ep a t t e r no f b c vg c n o m e 1 3 工1s 蛋白( 纤突蛋白) s 基因编码s 蛋白，s 蛋白( s p i k e 蛋白) 是膜蛋白，分子量为1 8 0 k d a 2 0 0 k d a ，包括4 个结构域：c 端膜内区、跨膜区、两个膜外区( s i 、s 2 ) 。主要负责细胞的粘附、血凝、膜融 合及诱导中和抗体，s 蛋白氨基酸的改变将严重影响其毒力和病毒的宿主嗜性。s 蛋白是病毒 感染宿主细胞的主要成分，结合敏感细胞的表面受体，诱导病毒包膜与细胞膜间的融合，将病 毒遗传物质r n a 导入宿主细胞内，从而引起细胞感染 4 3 1 。 一个冠状病毒粒子一般包括2 0 0 个左右的s 纤突，蛋白的突起是与受体相互作用和囊膜融 合的关键部位。s 蛋白较大，被切割成s l 、s 2 两个亚单位，s l 负责病毒、宿主细胞的识别与 结合，s l 位于n 端，构成s 蛋白的球状头部区，通过非共价键与跨膜的杆状区s 2 片段相连i 4 4 】。 在病毒感染细胞的初期，外周部分的s l 与宿主细胞上的受体作用。丽s 2 与病毒细胞问的融合 有关。s 2 包含一个融合多肽，并有两个疏水区( h r l 、h r 2 ) ，h r l ( 9 6 a a ) 在h r 2 ( 3 2 a a ) 上 游约1 7 0 个氨基酸处m j 。体外h r j 和h r 2 可形成周种或异种寡二聚体，携带位于h r 】n 端的 融合多肽和跨膜锚定肽进入邻附近细胞。s 蛋白要进入内质网中才能与其它的结构蛋白一起整 合成真正的病毒粒子，因此s 蛋白应该具有信号肽；而一些研究己表明当病毒s 蛋白独立在细 胞质中存在时，s 蛋白将会分泌到细胞外，因此s 蛋白在亚细胞定位上应该属于分泌蛋白。b c v 的s 蛋白是病毒感染必须的，h e 蛋白则不是i 叫。 1 3 j 墟m 蛋白( 膜蛋白) m 蛋白是一种糖蛋白，有三种转膜区，大部分的m 蛋白陷于膜内，但羧基末端在出芽时 整合进核心，这对于维持核心结构是必需的一”。m 蛋白分子量2 5k d a 3 0k d a ，m 蛋白横穿包 膜，有3 个结构域：膜外短的n 端、跨膜区、包膜内长的c 末端区。m 蛋白是冠状病毒外膜 最主要的成分，尽管不同病毒的m 蛋白在序列上变化很大，但在蛋白整体的化学性质上则存在 很大的保守性。其一般特征是3 个疏水域以及伴随交叉出现的亲水域。c 端大部分为两性的氨 基酸残基，但其末端为亲水氨基酸。病毒囊膜装配实验表明，任何一级结构上的变化都会影响 m 蛋白整合到被膜颗粒中，也就是说m 蛋白的一级结构域对于装配是非常重要的。m 蛋白的c 端区位于病毒内部，在感染的细胞中，这个区域可能是通过与核壳体的相互作h j 而表现出其重 要性。m 蛋白是形成病毒粒子的关键部分，其c 端是与蛋白n 相互作用的主要部分。比较各 种冠状病毒c 端的二级结构，发现它们的之间的同源性远高于序列间的相似性。 1 3 2 3e 蛋白 6 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第一章综述 e 是冠状病毒的小衣壳蛋白，e 蛋白是公认的结构蛋白，它整合在膜蛋白内部。在成熟病 毒体中e 蛋白低水平表达，但在感染细胞靠近病毒组装部位以高水平表达。e m i l y 等”用重组 痘苗病毒对e 蛋白进行表达，免疫荧光显微镜观察发现e 蛋白定位于高尔基复合体，当m 基 因与e 基因共表达时，二者均定位与高e 蛋白定位于高尔基复合体，并靠近冠状病毒出芽部位。 因此，冠状病毒e 蛋白在病毒体组装时起到关键性作用，e 和m 蛋白很可能形成病毒最小的组 装机制。 1 j 呓4n 蛋自( 孩衣壳蛋白) 。 核衣壳蛋白是一种碱性磷蛋白，分子量4 5k d a 6 0k d a ，有3 个结构域，其功能有几个 方面，参与病毒r n a 复制：病毒组装时，n 与病毒r n a 基因组的包装信号结合，形成螺旋核 农壳，通过与膜蛋白m 的c 端作用，促进病毒出芽生殖。n 蛋白与人类自身的核内蛋白十分 相似，事实上已有报导冠状病毒的蛋白n 具有定位到核内的特性，而且这种特性可能还有重要 的意义，比如抑制宿主核酸的复制、导致细胞周期延迟等。数据显示n 蛋白是多功能蛋白，和 r n a 的复制和翻译有关。在所有的功能中也有可能包括n 基因和r n a 之间的交换。这些首先 为b c v 证明了n 绑定序列，也证明了n 在体外的相互作用的顺序，表明了n 绑定的冠状病毒 r n a 比非病毒r n a 有效率。这些结果暗示了n 的多功能作用p 。 蛋白n 是与病毒基因组相互作用的蛋白，同时又是联系膜蛋白m ，并间接固定病毒基因组 的蛋白因此n 中必定存在两个区域。即与核酸的结合区及与蛋白m 的作用区。对来源于1 1 种不同宿主的3 6 株冠状病毒n 蛋白序列分析发现毒株具有宿主转移特性，在临床样品检测中 也发现了这一特点，如鼠和大鼠、鸡和火鸡，人和冠状病毒存在宿主转移现象f 捌。 病毒的出芽是通过核衣壳蛋白和外膜蛋白的相互作用完成的。通过对比，发现病毒的外膜 蛋白的集合和核衣壳蛋白的集合是相互独立的。三种病毒膜蛋白只有两种是形成立体结构必须 的，是m 和e 蛋白。当s 出现时则搀合在膜其中的，但s 蛋白是可有可无的。重要的是，n 蛋白的出现既不是必须的，也不是进入病毒表面，形成的独立的核衣壳蛋白比病毒粒子的密度 小，在蔗糖密度梯度离心中比病毒的速度慢一些，看上去更像是病毒真正的外膜p “。 r n a 病毒的复制是通过一种r n a 中间体，报告的例子m r n a 是包含重叠的开放性阅读框 架，其中一个顺反子包含了另一个负链的的或是双链的基因。b c v 的正链n 蛋白基因重叠着 另外一个编码着2 3 k d a 蛋白命名为i 蛋白，它完全处在n 的蛋白基因的内部，它的表达在病毒 的复制从一种非编码的m r n a 。j 蛋白的合成的许多特点是遵循了有漏洞的核糖体滑动模型在 常规的翻译，这是首先的细胞复制的双顺反子的m r n a 的一个例子，正链的动物r n a 病毒的 一个顺反子完全重叠了另外的一个的例子p “。 l a 2 5 腿蛋白( 血凝素酯酶) 第二组冠状病毒，如b c v 、h e v 、h c v o c 4 3 等含有h e 糖蛋白，是由6 5 k d a 7 0 k d a 的两个单体经二硫键连接形成的约1 3 k d a 1 4 k d a 二聚体。目前认为h e 蛋白可能与病毒吸附 有关。 1 3 3 病毒的复制 1 1 病毒的侵入过程 病毒感染细胞的第一个关键步骤是病毒包膜蛋白与被感染细胞表面的受体结合，吸附在细 7 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章综述 胞表面，在病毒受体的介导下，通过细胞的内吞以及病毒囊膜与细胞膜的融合便病毒颗粒进入 细胞内进行复制和繁殖不同冠状病毒侵入细胞的方式略有差异，b c v 通过囊膜与细胞膜融合 的方式侵入，病毒囊膜表面的s 糖蛋白与宿主细胞受体的相互作用。而对于第1 i 组冠状病毒， 除s 糖蛋白外，h e 蛋白也能与宿主细胞受体结合利用靶向性重组策略可对冠状病毒的嗜性可 以进行修饰。冠状病毒通过s 蛋白黏附宿主细胞，与细胞受体相互作用，s 蛋白也负责第1 i 组 冠状病毒进入细胞。 1 3 3 工病毒基因在宿主细胞内的表达，蛋白质的加工和成熟 不同冠状病毒在宿主细胞内表达，蛋白质加工和成熟的过程基本相同，如图1 4 所示，病 毒r n a 进入细胞后，主要利用宿主细胞的复制系统复制其基因组和表达不同的蛋白质。 冠状病毒一个重要的特点是其独特的转录策略，所有的冠状病毒转录模型都包括一个不连 续的转录过程。这种策略导致3 端主要编码结构蛋白亚基因组m r n a 嵌套结构的形成。转录 过程中，每个亚基因组的合成都涉及到一个不连续的步骤，即基因组3 端主体序列与5 端引 导序列的融合引导序列在转录时可以自由交换，因此引导序列和m r n a 序列可以来源于两个 不同的r n a 分子，这过程可能发生于亚基因组负链r n a 模板合成时。在感染细胞中，病毒 r n a 首先被转录成全长的负链r n a ，随后再转录成负链的基因组r n a 和一套6 个不同的 m r n a 。这些m r n a 均带有帽子结构和p o l ya 尾，特异性地排列成一套。r n a 的复制不需要 细胞核的功能。这说明先导序列与m r n a 的连接并没有利用通常的真核细胞拼接机制。成功转 录后开始翻译s 、m 、n 等结构蛋白，s 蛋白在翻译的同时糖基化，m 蛋白在进入高尔基体后 糖基化。两种糖蛋白都插入包膜，并通过s 蛋白与n 蛋白相连。在内质网内包装成病毒颗粒， 最后，充满病毒粒子的囊泡与细胞膜融合，释放出来，继续感染下一个细胞，发挥致病作用。 1 3 3 3 病毒颗粒的组装和释放 s 和m 蛋白是所有冠状病毒的主要结构蛋白，在病毒粒子中还有少许的小分子e 膜蛋白， 它们的相互作用是组装成病毒颗粒的基础。冠状病毒成熟颗粒组装在内质网和高尔基体问进 行【4 s 】。n 蛋白首先在胞浆中与病毒基因组r n a 结合，形成螺旋形的核衣壳，与病毒e 、s 、m 蛋白相互作用后进而组装成病毒颗粒。但病毒样颗粒的组装却不依赖于核衣壳，单纯的m 和e 蛋白就足以形成病毒样颗粒，而且s 蛋白在病毒样颗粒的组装过程中也是可有可无的组分，可 通过其c 端的跨膜区和膜内区与m 蛋白以非共价键连接而整合入病毒样颗粒i “。尽管病毒组 装过程中e 蛋白在病毒粒子中的表达量很少，对病毒的复制增殖也不是必需的，但如果缺乏e 蛋白，病毒组装则会受到明显影响且生长缓慢”i 。m 蛋白对病毒样颗粒的组装显得更加重要， 病毒外壳组装的驱动力主要来自于m 蛋白穿膜区的侧向相互作用，而且这种作用对同源m 蛋 白具有很高的选择性1 5 。成熟病毒粒子的释放主要依靠宿主细胞的分泌机制，以胞吐方式释放 到细胞外并进一步感染新的宿主细胞。 1 4 研究目的与意义 随着养牛业的发展和牛冠状病毒感染发病率增加，我国迫切需要分离出具有代表性的毒株， 研制出有效的疫苗，建立敏感、快速、特异的e l i s a 检测方法，以便有效防制此病。另外，牛 冠状病毒与人冠状病毒之间有抗原交叉反应【”，因此，深入研究牛冠状病毒也可为人冠状病毒 的研究提供参考。 8 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章综述 图1 - 4 病毒的复制过程示意图 f i 晷i - 4t h ep a n e r no f v i r u sm u l t i p l i c a t i o n 9 2 1 材料 2 1 1 主要试剂 第二章材料和方法 胰酶和新生犊牛血清购自h y c l o n e 公司，d m e m 干粉培养基购自g i b c o r l 公司 t r i z o lr e a g e n t 购自i n v i t r o g e n 公司，o n es t e pr n ap c rk i t ( a m v ) 和l at a qd n a 聚 合酶、d n am a r k e r d l l 50 0 0 、d l 20 0 0 、i f f g 购自大连宝生物公司。d n a 回收纯化试剂盒购 白天为时代公司，质粒小提试剂盒是上海华舜生物工程有限公司产品，p g e m - t e a s y v e c t o r 购 自p r o m e g a 公司，限制性内切酶b a m hi 、s a l i 、t 4 d n a 连接酶、低分子量标准蛋白为f e r m e n t a s ( m b l ) 公司产品，a n t i - h i s - t a g 单克隆抗体、h r p 标记的羊抗鼠l g g 为s i g m a 公司产品，其 它化学试剂为国产分析纯级，p c r 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，细菌培养用胰 蛋白胨和酵母提取物为o x o i d 公司产品。 s d s p a g e 、w e s t e r nb l o t 所用试剂均按照分子克隆配制。 2 ：t 2 细胞、宿主菌和实验动物 b c v ( 2 1 6 x f 株) 由日本农业、食品产业技术综合研究机构( 动物卫生研究所) 惠赠；h r t - 1 8 ( 人直肠癌细胞) 购自中科院上海细胞库；m d c k ( 犬肾传代细胞) 、h e l a ( 人宫颈癌细胞) ， v e t o ( 非洲绿猴肾细胞) 、e c o l ib l 一2 1 ( d e 3 ) 和p e t - 3 2 a ( + ) 表达载体均由黑龙江八一农垦大学 预防兽医学实验室保存；昆明系小白鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。 2 1 3 主要仪器 c 0 1 培养箱：美国r e v c o 倒置显微镜：o l y m p u s 生物安全柜：北京东联哈尔仪器制造有限公司 紫外凝胶成像系统：美国b i o - r a dp c r 仪 高速台式离心机：美国s i g m a 公司 高速立式离心机：日本日立公司( h i t a c h i ) 超低温冰箱：美国r e v c o 水浴振荡器：中国哈尔滨东联电子技术开发公司 空气浴振荡器：哈尔滨市东明医疗仪器厂 电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司 低温恒温器：重庆实验设备厂 微鼙振荡器：上海医疗器械五厂 电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司 精密p h 计：上海雷磁仪器厂 1 0 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 第二章材料和方法 皇量曼皇曼曼曼曼曼量曼蔓寰皇曼基曼暑皇皇i i 皇曼鲁曼鼍蔓曼喜笪! 皇皇曼曼鼍声量曼皇皇曼皇曼皇量! 曼量曼曼鼍曼曼曼量量曼曼曼毫曼! 曼置 电泳仪：北京六一仪器厂 半干转印仪：大连竟迈公司 2 2 方法 2 2 1 病料的采集和处理 无菌采集大庆市龙凤区奶牛小区送检的腹泻犊牛肠道内容物，用p b s 做成1 0 的悬液，经 40 0 0 r m i n 离心4 0 r a i n 取上清，分别通过0 4 5 j x m 和0 2 2 0 m 的滤膜过滤。储存于一7 0 ( 2 备用 2 2 2h r t - 1 8 细胞对胰酶的敏感性 用2 4 孔细胞培养板培养h r t