（内科学专业论文）糖耐量减低人群血小板活化与bapwv相关研究.pdf

糖耐驯啪w v 卡_ 嗍嬲 研究生：李娟 导师：亓文波教授 中文摘要 目的 血小板活化与动脉弹性降低均与动脉粥样硬化关系密切，本实验联合血小 板活化指标( c d 6 2 p 与p a c 1 ) 及臂踝脉搏波传导速度( b r a c h i a l a n k l e p u l s e w a v e v e l o c i t y ，b a p w v ) 评价糖耐量减低( i m p a i r e dg l u e o s et o l e r a n e e ，i g t ) 人 群中动脉粥样硬化的发生及其影响因素，并探讨血小板活化与动脉弹性减低之 间的关系。 方法 根据19 9 9 年w h o 诊断标准，分别选取糖尿病患者3 5 例、糖耐量减低患者 3 5 例、健康对照者4 0 例为研究对象。应用科林v p 1 0 0 0 对其进行臂踩脉搏波传 导速度检测。同时采用流式细胞术( f l o w c y t o m e t r y ，f c w ) 检测血小板膜蛋白 c d 6 2 p 以及血小板激活复合物( p l a t e l e ta c t i v a t e dc o m p l e x l ，p a c 一1 ) 的阳性率和 平均荧光强度。并检测血小板参数：血小板数目( c o u n t ) 、血小板平均体积( m e a n p l a t e l e tv o l u m e ，m p v ) 、血小板分布宽度( p l a t e l e td i s t r i b u t i o nw i d t h ，p d w ) 及 大血小板比率( p l a t e l e t l a r g ec e l lr a t i o ，p - l r c ) ；生化指标：总胆固醇( t c ) 、甘 油三酯( t g ) 、高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 、低密度脂蛋白胆固醇( l d l c ) 、极 低密度脂蛋白胆固醇( v l d l c ) 、空腹血糖( f p g ) 。分析血小板活化与动脉弹性降 低的关系以及血小板参数与生化指标对血小板活化与动脉弹性降低的影响。 结果 1 血小板参数在三组间的比较：与正常对照组相比，糖耐量减低组与糖尿 病组的m p v ( n c 9 4 5 + 0 9 2 、i g t ：l o 4 5 + 0 7 8 、d m ：1 0 5 9 士0 8 9 ，p 0 0 5 1 ，p d w ( n c ： 1 1 2 3 4 - 1 5 4 、i g t ：1 2 7 6 4 - 1 3 6 、d m ：1 2 9 1 4 - 1 7 8 ，p o 0 5 ) ，p - l c r ( n c ：0 2 6 4 - 0 0 5 1 、 i g t ：0 3 0 4 - 0 0 6 3 、d m ：0 31 + 0 0 6 ，p 0 0 5 ) 水平明显增高，差异有统计学意义： 糖耐量减低组与糖尿病组之间差异无统计学意义。 2 血小板活化指标于各组问的比较：糖耐量减低组与糖尿病组 c d 6 2 p ( ) ( n c ：2 3 4 4 - 0 9 l 、 i g t ：4 0 2 4 - 1 3 5 、 d m ：5 2 5 4 - 2 8 6 ，p o 0 1 ) 、 i c d 6 2 p m f i ( n c ：l 3 8 6 士5 2 3 、i g t ：2 0 19 士5 0 7 、- d m ：21 01 土6 5 8 ，p 0 0 5 ) 、 p a c - 1 ( ) ( n c ：9 4 5 士6 2 1 、i g t ：2 4 8 0 4 - 1 0 8 3 、d m ：2 5 3 0 士1 4 4 2 ，p o 0 5 ) 于三 组间无差异。 3 臂踝脉搏波传导速度在三组间的比较：臂踝脉搏波传导速度b a p w v ( n c ： 1 3 0 7 6 3 士1 6 0 8 9 、i g t ：1 4 7 0 0 5 士3 1 2 0 4 、d m ：1 6 0 4 0 4 土2 3 0 3 9 ) 于三组间差异均有 统计学意义。 4 糖耐量减低组血小板活化指标与各指标间的相关分析结果：c d 6 2 p 与 d b p ( r = 0 3 9 7 ，p = 0 0 1 8 ) 、s b p ( r = 0 4 8 7 ，p = 0 0 0 3 ) 、b m i ( r = 0 4 3 7 ，p = 0 0 1 5 ) 呈f 相关： c d 6 2 p m f i与 m p v ( r = o 3 8 5 ，p = o 0 2 3 ) 、p d w ( ，- = o 3 7 6 ，p = o 0 2 6 ) 、p l c r ( r = 0 4 8 3 ，p = 0 0 0 3 ) 呈正相关：p a c l 与l d l c ( r = 0 3 7 l ，p = 0 0 2 8 ) 、 m p v ( r = 0 4 0 6 ，p = 0 0 16 ) 、p l c r ( r = 0 3 4 6 ，p = 0 0 4 2 6 ) 呈正相关；p a c lm f i 与 m p v ( r = 0 4 0 0 ，p = 0 0 l7 ) 、p l c r ( r = 0 3 5 5 ，p = 0 0 3 6 ) 呈正相关。 5 臂踝脉搏波传导速度与各指标于糖耐量减低组的相关分析结果：b a p w v 分别与s b p ( r = 0 6 7 8 , p = 0 o o o ) 、f b g ( r = 0 3 4 9 ，p = 0 0 l7 ) 、c d 6 2 p ( r = 0 3 9 4 , p = o 019 ) 呈正相关。 6 糖耐量减低组以血小板活化指标为因变量的多元逐步回归分析表明：与 c d 6 2 p 密切相关的因素依次为：p l c r ( b = 3 4 15 8 、p = 0 0 0 8 ) 、l d l c ( b = 4 5 37 、 p = 0 0 13 ) 、t c ( b = 2 4 7 9 、p = 0 0 5 8 ) 和b m i ( b = 0 2 7 6 、p = 0 0 2 6 ) ；与p a c 1 密 切相关的因素依次为：p l c r ( b = 2 0 10 2 、p = 0 0 6 7 ) 、m p v ( b = 4 7 6 2 、p = 0 0 31 ) 及d b p ( b = 0 4 4 7 、p = 0 0 7 2 ) 。 7 糖耐量减低人群以臂踝脉搏波传导速度为因变量的多元逐步回归分析显 示与b a p w v 密切相关的因素依次为：f b g ( b = l0 2 0 16 、p = 0 0 4 6 ) 与s b p ( b = 8 0 7 8 、 p = 0 0 0 0 ) 。 + 结论 1 糖耐量减低人群具有与糖尿病人群相似的血小板活化程度。 2 血小板参数m p v ( f 1 ) 、p d w ( ) 及p l c r ( ) 同样可反映血小板活化状态。 3 动脉弹性随血糖的升高而降低。 4 糖耐量减低人群中血小板活化与动脉弹性降低可能存在联系，血小板活 化是否参与动脉僵硬度升高的形成还需进一步研究。 5 l d l c 、t c 、d b p 及b m i 均是影响糖耐量减低人群血小板活化的因素。 关键词糖耐量减低：血小板活化；b a p w v ；动脉硬化 t h es t u d yo fp l a t e l e ta c t i v i t ya n db a p w vi n s u b j e c t sw i t hi m p a i r e dg l u e o s et o l e r a n c e p o s t g r a d u a t e ：l i j u a n s p e c i a l t y ： m e d i c i n e t u t o r ：p r o f q i w e n b o a bs t r a c t o b j e c t t v e p l a t e l e ta c t i v i t ya n di n c r e a s e da r t e r i a ls t i f f n e s sa r es t r o n g l ya s s o c i a t e dw i t h a t h e r o s c l e r o s i s t oe v a l u a t ea t h e r o s c l e r o s i sa n dr i s kf a c t o r si n s u b j e c t s w i t h i m p a i r e d g l u c o s et o l e r a n c e ( i g t ) b ym e a s u r i n g o f p l a t e l e t a c t i v i t y m a r k e r s ( c d 6 2 p , p a c 一1 ) a n db r a c h i a l a n k l ep u l s ew a v ev e l o c i t y ( b a p w v ) t oi n v e s t i g a t et h e a s s o c i a t i o nb e t w e e np l a t e l e ta c t i v i t ya n da r t e r i a ls t i f f n e s s m e t h o d 3 5s h b j e c t sw i t hi g t ( g r o u pa ) ，3 5s u b j e c t sw i t ht y p e2d i a b e t e sm e l l i t u s ( g r o u p b ) ，4 0n o r m a lc o n t r o l ( g r o u pc ) a r ei n c u l d e di nt h es t u d y t om e a s u r eb a p w vb y v p 一10 0 0 f l o wc y t o m e t r i ca n a l y s e si sp e r f o r m e dt om e a s u r ep e r c e n t a g ea n dm e a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y o fc d 6 2 pa n d p a c 一1 c h a n g e so f c o u n to fb l o o d p l a t e l e t ，m e a np l a t e l e tv o l u m e ( m p v ) ，p l a t e l e t d i s t r i b u t i o n w i d t h ( p d w ) a n d p l a t e l e t - l a r g e c e l l r a t i o ( p l c r ) a r ea n a l y z e d t g ，t c ，h d l c ，l d l c ，v l d l c ， f b ga r em e a s u r e ds i m u l t a n e o u s l y t oe v a l u a t et h er i s kf a c t o r so fa t h e r o s c l e r o s i s i ns u b je c t sw i t hi g t r e s t l i t s 1 m p v ( n c ：9 4 5 + 0 9 2 、i g t ：1 0 4 5 + 0 7 8 、d m ：1 0 5 9 + 0 8 9 ，p 0 0 5 ) ，p d w ( n c ： l1 2 3 4 - 1 5 4 、i g t ：1 2 7 6 + 1 3 6 、d m ：1 2 9 1 4 - 1 7 8 ，p 0 0 5 ) ，p l c r ( n c 0 2 6 4 - 0 0 5 1 、 i g t ：0 3 0 + 0 0 6 3 、d m ：0 31 4 - 0 0 6 ，p o 0 5 ) a r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di ng r o u paa n d g r o u pb t h e r ea r en oc h a n g e sb e t w e e ng r o u paa n dg r o u pb 2 c o m p a r e dw i t hg r o u pc c d 6 2 p ( ) ( n c ：2 3 4 4 - 0 91 、i g t ：4 0 2 4 - 1 3 5 、d m ： 5 2 5 4 - 2 8 6 ，p 0 01 ) 、c d 6 2 p m f i ( n c ：13 8 6 4 - 5 2 3 、i g t ：2 0 19 4 - 5 0 7 、d m ： 2 1 0 1 士6 5 8 ，p o 0 5 ) 、p a c i ( ) ( n c ：9 4 5 4 - 6 2 1 、i g t ：2 4 8 0 4 - 1 0 8 3 、d m ：2 5 3 0 + 1 4 4 2 ，p o 0 5 ) i sn os i g n i f i c a n ti nt h r e eg r o u p s 3 b a p w v ( n c ：1 3 0 7 6 3 士1 6 0 8 9 、i g t ：1 4 7 0 0 5 4 - 3 1 2 0 4 、d m ：1 6 0 4 0 4 4 - 4 2 3 0 3 9 ) i ss i g n i f i c a n ti n c r e a s e di nt h r e eg r o u p s 4 i ng r o u pa ，p e r e e n t a g eo fc d 6 2 pi s p o s i t i v e l yc o r r e l a t i o n sw i t hd b p ( ，_ 。0 3 9 7 ，p = 0 018 ) 、s b p ( r = 0 4 8 7 ，p = 0 0 0 3 ) 、b m i ( r = 0 4 37 ，p = 0 015 ) ；c d 6 2p m f ii s p o s i t i v e l yc o r r e l a t i o n sw i t hm p v ( r = 0 3 8 5 ，p = 0 0 2 3 ) 、p d w ( r = 0 3 7 6 ，p = o 0 2 6 ) 、 p l c r ( ，1 2 0 4 8 3 p = 0 0 0 3 ) ；p e r c e n t a g eo fp a c 一1 i s p o s i t i v e l yc o r r e l a t i o n sw i t h l d l - c ( r 2 0 3 7 1 ，p = 0 0 2 8 ) 、 m p v ( r = o 4 0 6 ，p = 0 0 1 6 ) 、 p l c r ( r = o 3 4 6 ， p = 0 0 4 2 6 ) ；p a c 一1m f ii sp o s i t i v e l yc o r r e l a t i o n sw i t hm p v ( r = o 4 0 0 ，p = 0 017 ) 、 p l c r ( r = 0 3 5 5 ，p = 0 0 3 6 ) 5 i ng r o u pa ，b a p w vi sp o s i t i v e l yc o r r e l a t i o n sw i t hs b p ( r = 0 6 7 8 ，p = 0 0 0 0 ) 、 f b g ( r 2 0 3 4 9 ，p = 0 0 1 7 ) 、c d 6 2 p ( 0 3 9 4 ，p = 0 0 1 9 ) 6 b ys t e p w i s er e g r e s s i o na n a l y s i si ng r o u pa ，p l c r ( b = 3 4 15 8 、p = 0 0 0 8 ) 、 l d l c ( b = 4 5 3 7 、p = 0 013 ) 、t c ( b = 2 4 7 9 、p = 0 0 5 8 ) 和b m i ( b = 0 2 7 6 、p = 0 0 2 6 ) a r ec o n t r i b u t o r st oc d 6 2 p ；p l c r ( b = 2 0 10 2 、p = 0 0 6 7 ) 、m p v ( b = 4 7 6 2 、p = 0 0 31 ) 及d b p ( b = 0 4 4 7 、p = o 0 7 2 ) a r ec o n t r i b u t o r st op a c 一1 。 7 b ys t e p w i s er e g r e s s i o na n a l y s i si ng r o u pa ，f b g ( 6 = 1 0 2 0 1 6 、p = 0 0 4 6 ) a n d s b p ( b = 8 0 7 8 、p = 0 0 0 0 ) a r ec o n t r i b u t o r st op a c 一1 c o n c l u s i o n s 1 t h e r ei ss a m ed e g r e eo fp l a t e l e t sa c t i v i t i o nb e t w e e no b j e c t sw i t hd i a b e t e s m e l l i t u sa n di m p a i r e dg l u e o s et o l e r a n c e 2 m p v ( f 1 ) 、p d w ( ) a n dp l c r ( ) c a na l s or e f l e c tp l a t e l e t sa c t i v i t i o ni n g r o u pa 3 b a p w vi n c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s e dl e v e lo fg l u e o s e ，w h i c hd e m o n s t r a t e s t h a ta r t e r i a ls t i f f n e s si n c r e a s e sw i t ht h ei n c r e a s e dl e v e lo fg l u e o s e 4 i n c r e a s e d p l a t e l e t sm a y b ec o n t a c tw i t ht h e i n c r e a s e da r t e r i a ls t i f f n e s s f u r t h e rs t u d yw h i t h e rp l a t e l e t sa c t i v i t i o nc o n t r i b u t et o t h e i n c r e a s e do fa r t e r i a l s t i f f n e s ss h o u l db ec o n t i n u e d 5 i ng r o u pa ，l d l c 、t c 、d b pa n db m ia r er i s kf a c t o r so f p l a t e l e t sa c t i v i t i o n k e y w o r di m p a i r e dg l u e o s e t o l e r a n c e ( i g t ) ；p l a t e l e t sa c t i v i t i o n ；b a p w v ； a t h e r o s c i e r o s i s 英文缩写英文全称 a s i g t d m c h d b a p w v p a c l m p v a t h e r o s c l e r o s i s 符号说明 i m p a i r e dg l u c o s et o l e r a n c e d i a b e t e s c o r o n a r yh e a r td i s e a s e 中文全称 动脉粥样硬化 糖蜊量减低 糖尿病 冠心病 b r a c h i a l a n k l e p u l s e w a v e v e l o c i t y 臂踝脉搏波传导速度 p l a t e l e ta c t i v a t e dc o m p l e x 一1 m e a np l a t e l e tv o l u m e p d w p l a t e l e td i s t r i b u t i o nw i d t h p l r c f p g t c p l a t e l e t l a r g ec e l lr a t i o f a s t i n gp l a s m ag l u c o s e t o t a ic h o l e s t e r o l t g t r i g l y c e r i d e h d l c h i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l l d l c v l d l c i f g f c m m f i p e rc p p f a f i t c 血小板激活复合物 血小板平均体积 血小板分布宽度 大血小板比率 空腹血糖 总胆固醇 甘油三酯 高密度脂蛋白胆固醇 l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l低密度脂蛋白胆固醇 v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l 极低密度脂蛋白胆固醇 i m p a i r e df a s t i n gg l u c o s e f l o wc y t o m e t r y m e a nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y p e r i d i n i nc h l o r o p h y l lp r o t e i n p a r a f o r m a l d e h y d e f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e 6 空腹血糖受损 流式细胞术 平均荧光强度 多甲藻素一叶绿素蛋白 多聚甲醛 异硫氰酸荧光素 前言 糖耐量减低( i m p a i r e dg l u c o s et o l e r a n c e ，i g t ) 是一种介于正常糖代谢与糖 尿病( d m ) 之间的血糖异常代谢状态，是d m 病程中从糖代谢正常发展至d m 的 一个重要阶段。i g t 人群逐年上升，国际糖尿病联盟会议( i d f ) 数据显示，至 2 0 0 7 年全球2 0 7 9 岁成人中约有3 0 8 亿人患有i g t 占总人数的7 5 ，而8 0 的i g t 患者属于发展中国家。y a n gw 等于2 0 0 7 年7 月至2 0 0 8 年5 月对中国 4 6 2 3 9 位成年入进行糖尿病筛查发现中国目前糖尿病患病率9 7 ，1 4 8 2 亿即 15 5 人群处于糖尿病前期，其中i g t 人群多于空腹血糖受损( i f g ) 人群( 男 1 1 o v s 3 2 ，女1o 9 v s 2 2 ) ，目前中国已成为糖尿病第一大国。由于种族和 地区不同，i g t 的转归有较大差异，每年约有1 5 7 3 的i g t 患者进展为 d m 2 1 。长期以来血糖代谢异常与动脉粥样硬化性血管病变存在密切联系。2 0 0 4 年欧洲心脏病学会( e s c ) 上报道对冠心病患者的糖尿病筛查发现，31 的冠心 病患者有d m ，同时对无d m 史的患者进行o g t t 筛查，其中5 8 存在糖代谢异 常。研究显示冠心病患者中糖调节异常者多于糖调节正常者，对高血糖的急性 冠脉综合征患者预后更差1 3 】。因此加强血糖监控对冠心病患者预后有重要意义。 而糖尿病患者大血管疾病的危险性较一般人群高2 4 倍，甚至i g t 阶段大血管 病的风险已经明显增加并接近糖尿病患者。e s c h w e g e 经过3 年随访显示【4 1 ，i g t 人群c v d 的危险性是一般人群的2 倍。目前已公认，心血管疾病或大血管病变 在糖尿病发病前期即i g t 阶段就已经启动或者已经有明显表现，i g t 是心血管 疾病的独立危险因素。 动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 是众多大血管疾病的共同病理基础，也是 心脑血管疾病中最常见的病变，已对人类健康构成严重威胁限6 1 。而血小板在a s 的发生发展中具有重要的作用，因此研究i g t 患者的血小板功能变化有一定的 临床意义。 。 近年研究发现血小板参数：血小板计数、血小板平均体积、血小板分布宽度、 大血小板比率的高低能说明血小板活化程度及体内凝血活性的高低t t , s 】。但作为 反映血小板活化的指标，m p v 等血小板的参数虽简单易得，却不够敏感。血小板 活化后，其发生变化的膜糖蛋白便可成为活化血小板的特异性标志物。其中 p a c 1 ( g pi ib i i i a 复合物抗原决定簇) 是血小板活化的早期表现引。c d 6 2 p 即p 选择素( p s e l e c t i o n ，g m p 14 0 ) 被誉为血小板功能检测的金标准，2 1 。应 7 用流式细胞术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 检测这些膜糖蛋白来评价血小板活化程度 较电泳分离法及放射免疫分析法有较大的优越性【l 引。 a s 发生早期血管壁纤维组织不断增生，相邻纤维层之间的粘连增多，血管 僵硬度增加，弹性变小【1 4 1 。因此检测反映血管弹性的脉搏波传导速度( p u l s ew a v e v e l o c i t y ，p w v ) 可以了解a s 的情况。目前多用臂动脉踝动脉( b r a c h i a l a n k l e ， b a p w v ) 传导速度作为早期a s 的检测指标。同时研究证明【”1b a p w v 是冠心病 的独立危险因素。 血小板活化以及动脉弹性降低均与a s 密切相关，但二者之间是否存在联系 昵? 本实验采用横断面研究方法，应用流式细胞术( f c w ) 通过对糖耐量减低、 糖尿病及正常对照三组人群血小板c d 6 2 p ( ) 、c d 6 2 p 平均荧光强度( m e a n f l u o r e s c e n c ei n t e n s e ，m f i ) 、p a c 1 ( ) 及p a c 1m f i 测定，并对受试者的臂踝脉 搏波传导速度( b a p w v ) 进行检测，同时检测血小板四项参数以及生活指标，探讨 糖耐量减低人群血小板活化指标与b a p w v 的变化及其相互关系，为加强糖耐量 减低人群心血管并发症的防治提供一定的理论依据。 8 材料与方法 1 研究对象 1 1 研究对象来源 本实验于2 0 0 9 年1 月2 0 0 9 年l2 月在山东省泰安市中心医院内分泌科及查 体中心共纳入研究对象l lo 例，其中糖耐量减低组( i g t ) 3 5 例，糖尿病组( d m ) 3 5 例，正常人组( n c ) 4 0 例。 1 2 诊断标准 d m 及i g t 诊断标准均参照19 9 9 年w h o 标准。 1 3 糖尿病组 选择住院及门诊己确诊的d m 患者3 5 例( 男l6 例，女l8 例) ，年龄3 0 7 0 岁，平均年龄4 9 4 士9 3 岁。 排除标准：排除合并感染，发热，出血，急性心肌梗死，脑梗死，脑出血， 血液系统疾病，肿瘤，结缔组织病，糖尿病急性并发症以及正在服用抗血小板 聚集或抗凝药物的患者。 1 4 糖耐量减低组 选择既往单位查体或门诊检查发现空腹血糖或餐后2 小时血糖升高并未达 到d m 诊断标准者以及糖尿病家族史阳性查体人群，通过口服葡萄糖耐量试验 ( o g t t ) 筛查出i g t 患者3 5 例( 男l7 例，女l8 例) ，年龄3 5 7 0 岁，平均4 8 5 士8 9 年龄。 筛查过程：嘱参试者试验前2 4 小时正常家庭饮食，避免过度劳累；试验前 一天晚上睡眠充足；过夜禁食8 一l o 小时。参试者于早晨8 ：0 0 之前到达门诊后 休息半小时，进行o g t t 试验，分别采集空腹、l 、2 、3 小时血糖。期间参试人 员在室内休息，同时进行病史采集和体检。 排除标准：曾有糖尿病明确诊断的患者；进行过任何方式的血糖干预： 继发性血糖升高；进行筛查前一个月内存在影响血糖的因素；筛查前一年 内使用过全身糖皮质激素；有慢性自身免疫性疾病长期服用抗血小板聚集或 抗凝药物。 1 5 正常对照组 正常对照组4 0 例( 男18 例，女2 2 例) ，年龄3 5 6 8 岁，平均年龄4 7 7 士7 4 岁，来源于本院健康查体中心，年龄、性别与其他两组相匹配。均身体健康， 9 无糖尿病家族史，无高血压、冠心病、肝肾疾病及内分泌代谢疾病，未服用抗 血小板聚集或抗凝药物。 2 实验材料 2 1 主要设备仪器 f a c s c a l i b u r 型流式细胞仪，美国b e c t o n d i c k i n s o n 公司 动脉硬化测定仪b p 2 0 3 r p ei i ，日本欧姆龙科林公司生产 f a l0 0 4 n 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司 p h b 一4 型p h 计，上海精密科学仪器有限公司 d n m 9 6 0 2 酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司 2 5 1 0 0 0 u l 微量加样器 3 2 柠檬酸钠抗凝管，批号：0 91l2 1 ，沧州永康医药用品有限公司 一次性1 2 m m 7 5 m mf a l c o m 聚苯乙烯试管，b d 公司提供 s y s m e xx t o l8 0 0 i 多项目血球自动分析仪，日本生产 海尔低温冰箱，青岛海尔集团 2 2 主要试剂 p a c - 1f i t c ：异硫氰酸荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，f i t c ) 标记的 抗血小板活化g pi ib i i i a ，即纤维蛋白原受体( f i b r ) 的单克隆抗体( m c a b ) 。 批号：4 6 3 8 7 ，购于b d 公司。 c d 6 1p e rc p ：多甲藻素一叶绿素蛋白( p e r i d i n i nc h l o r o p h y l lp r o t e i np e rc p ) 标记的血小板糖蛋白i i i a 的m c a b 。批号：4 9 9 0 2 ，购于b d 公司。 c d 6 2 pp e ：藻红蛋白( p h y c o e r y t h r i n ) 标记的抗p 一选择素的m c a b 。批号： 4 8 5 5 0 ，购于b d 公司。 小鼠i g g lp e ：藻红蛋白( p h y c o e r y t h r i n ) 标记的鼠i g g l 。批号：4 9 9 0 6 ，购于 b d 公司。 人工合成的精氨酰一甘氨酰一门冬氨酰- 丝氨酰多肽( a r g g l y - a s p - s e r ，r o d s ) ： 以p b s 配制浓度为i o m g m l ，小量分装，一2 0 低温保存，用时解冻。批号： a 9 0 4 1 ，购于s i g m a 公司。 l 多聚甲醛( p a r a f o r m a l d e h y d e ，p f a ) ：于通风橱内称量多聚甲醛4 0 9 ，加 入o 1m p b sl0 0 m l ，恒温水浴加热至6 0 。c ，边加热边搅拌，至溶液清亮，配制 4 的多聚甲醛。4 c 保存。，用前以p b s 稀释成l ，用于血小板的固定，购于 l o 北京益利精细化学品有限公司。 p b s 缓冲液：盐酸调整p h 值为7 2 + 0 2 ，0 2 u m 滤纸过滤，购于博士德生物有 限公司。 人血清胰岛素诊断试剂盒( 酶联免疫法) ：批内变异 8 ，批间变异 l0 ， 批号：2 0 0 0 9 0 2 0 5 ，购于北京北方生物技术研究所。 3 研究方法 3 1 流式细胞术三色分析血小板 3 1 1 全血法流式细胞术检测血小板的原理：活化血小板与静息血小板相 比，其质膜糖蛋白发生显著变化，而血小板活化程度可由质其膜糖蛋白表达水 平的高低来判断。本实验通过检测活化血小板表面特异的标记物p a c l 和 c d 6 2 p 的阳性率及荧光强度，判断血小板的活化状态及程度。p a c lf i t c ：i g m 型抗体，是血小板活化的早期标志。r g d s 多肽可与纤维蛋白原受体特异性结合， 从而完全阻断p a c 1 与纤维蛋白原受体结合，用做p a c 1f i t c 的阴性对照。 c d 6 2 pp e ： i g g l 型抗体，是血小板活化后期标志物，特异地与活化血小板质 膜表面的c d 6 2 p 结合。小鼠i g g lp e 为其阴性对照。使用p e r c p 标记的泛血小 板抗体c d 6 l ，即与活化血小板结合，也与非活化血小板结合，避免细胞碎片等 的非特异干扰，可从全血中鉴别出血小板。 3 1 2 操作步骤 ( 1 ) 样本采集：受试对象均休息3 0 分钟后抽取肘前静脉血，前2 m l 可能混有 组织液的血液用作生化检查，将样本通过负压直接吸入含3 2 柠檬酸钠抗凝剂 的抗凝管中，轻轻混匀，避免剧烈的摇动而影响对血小板的检测。即刻取5 u l 全血加入于已备好的对照管和测试管中，以最大限度减少血小板的体外活化。 ( 2 ) 样本制备： 将试管标号区分对照管和实验管。 在对照管中加入m i g g lp e 、c d 6 1p e r c p 、p a c 1f i t c 各2 0 u l ，r g d s10 u l ； 在测试管中加入c d 6 2 pp e 、c d 6 1p e r c p 、p a c 1f i t c 各2 0 u l 。见表l 。 表1对照管和测试管加入试剂种类 在对照管和测试管中各加入全血标本5 u l ，轻轻混匀，室温避光孵育 2 0 m i n 。 各试管中均加入4 预冷的1 多聚甲醛固定液l m l 并充分混匀，避光放 置3 0 m i n 。 ( 3 ) 上机检测 按正常程序开机。 开启流式细胞仪数据获取与分析软件c e l l q u e s t ，调整参数，调出获取条 件为f l 3 c d 6 1 p e r c p s s c 阳性，避免细胞碎片和仪器背景噪音的影响。 分别获取对照管及测试管数据，在f l 3 c d 6 1p e r c p s s c 散点图中设门， 找出血小板群( 图1 ) 。 以p a c 1f i t c 与c d 6 2 pp e 做双参数散点图，分析p a c - 1 阳性、c d 6 2 p 阳性血小板百分率( 如图3 ) 。 分析测试管散点图获取p a c 1 与c d 6 2 p 的荧光直方图，统计分析荧光直 方图p a c 1 和c d 6 2 p 的平均荧光强度( m f i ) ( 见图2 ) 。 图1 1 对照管散点图 图1 2 测试管散点图 r 1 、r 4 单个血小板；r 2 、r 5 血小板与白细胞的聚集体；r 3 红细胞 1 2 ( 1 ) 确定受试者基础状态下的身高、体重；受试者仰卧，头部位置较低，平 稳呼吸。 ( 2 ) 按正常操作开机，确认受试者编号，输入受试者姓名、年龄、性别、身 高、体重等信息。 ( 3 ) 按正确方式固定上下肢袖带，并将r c g ( 心音) 及e c g ( 心电) 传感器放置在 正确位置。 ( 4 ) 准备完毕后按确认键丌始检测，记录5m i n 的动脉脉搏波形，仪器自动分 析并打印输出b a p w v 值双侧b a p w v 值取较高值。 3 2 2 注意事项 检查室内温度2 5 ，室内环境整洁，安静，尽量减少噪音和震动。 检查床采用较硬的固定好的床，以减少其对检查结果的影响。 受试者检测前至少休息l0 m i n ，检测时要求受试者及操作者心情平稳，放 松。 检测前除去戒指、耳环、手表等金属饰品； 放置上袖带时，受试者如果穿着薄衣服，勿将衣服重叠至上臂内侧，以 便准确测量血压。 检测中保持安静平躺的固定姿势5 分钟，避免身体移动。 检测前一天及当天禁止饮酒、咖啡及浓茶，避免劳累。 整个检测由专人操作，减少误差。 3 3 其他指标检测 3 3 1 血小板参数的测定：空腹静脉血2 m l ，e d t a k 2 抗凝，1h 内在s y s m e x x t - l8 0 0 i 型多项目血球自动分析仪上测定。 3 3 2 血清胰岛素测定：采用酶联免疫法( e l i s a ) 狈, 9 定血清胰岛素。 3 3 3 其他生化指标的检测：日立( h i t a c h i ) 7 6 0 0 - - 0 2 0 型全自动生化分析仪 测定血糖、甘油三酯( t g ) 、总胆固醇( t c ) 、高密度脂蛋白胆固醇( h d l c ) 、低密 度脂蛋白胆固醇( l d l c ) 及极低密度脂蛋白胆固醇( v l d l c ) 。血糖检测采用己糖 激酶法。 3 3 4 记录临床其他观察指标，包括年龄、性别、身高、体重、血压( b p ) 竺 寸o 4 统计学处理 1 4 所有数据均用i s 表示，进行正态和方差齐性检验。两组间计量资料比较用 t 检验，多组间的计量资料比较用方差分析。相关分析用p e a r s o n 相关分析，一个 因变量与多个自变量之间的线形依存关系用多元逐步回归分析。p 值 0 0 5 认为 差异有统计学意义。所有数据均输入s p s sl2 0 软件上计算。 结果 1 一般情况和代谢指标比较 如表2 示，三组间年龄、性别比例、体重指数( b m i ) 以及吸烟、饮酒比例差 异均无统计学意义：i g t 组与n c 组相比，s b p 、d b p 、l d l c 、f b g 显著高于 f 常对照组，差异有统计学意义。d m 组较n c 组s b p 、d b p 、t g 、l d l c 、 v l d l c 、f b g 均明显增高，差异有统计学意义。d m 组与i g t 组比较，f b g 显 著升高，差异有统计学意义。其余差异均无统计学意义。 2 血小板参数的比较 i g t 组、d m 组的血小板三项参数m p v 、p d w 及p l c r 均高于n c 组， 差异有统计学意义；与i g t 组相比，d m 组的m p v 、p d w 及p l c r 较高，但 差异无统计学意义。血小板数目在三组间差异无统计学意义( 见表3 ) 。图4 6 示三组m p v ( f 1 ) 、p d w ( ) 及p l c r ( ) 均数的直方图比较。 3 血小板活化指标及b a p w v 的比较： 由表4 可知，反映血小板活化的指标c d 6 2 p ( ) 、c d 6 2 pm f i 和p a c 1 ( ) 在i g t 组及d m 组均显著高于正常对照组，差异有统计学意义；d m 组较i g t 组高，差异无统计学意义。p a c 1m f i 在i g t 组及d m 组均高于n c 组，但差 异无统计学意义。臂踝脉搏波传导速度( b a p w v ) 于三组间差异均有统计学意 义。如图7 1 l 。血小板活化指标的流式细胞仪分析见图1 2 l7 。 4 i g t 人群血小板活化指标与各变量的p e a r s o n 相关分析结果 i g t 人群中血小板活化指标与d b p 、s b p 、b m i 、t c 、t g 、h d l c 、l d l c 、 v l d l c 、f p g 、m p v 、p d w 、p l c r 的p e a r s o n 相关分析结果( 表5 ) 表明：c d 6 2 p 与d b p ( r = 0 3 9 7 ，p = 0 0 1 8 ) 、s b p ( r = 0 4 8 7 ，p = 0 0 0 3 ) 、b m i ( r = 0 4 3 7 ，p = 0 0 1 5 ) 呈正相 关，图l8 2 0 ；c d 6 2 p m f i