（发育生物学专业论文）小鼠心脏发育过程中钙循环相关调节蛋白的表达与分布.pdf

中文摘要 中文摘要 兴奋收缩耦联对心肌细胞功能的发挥有重要意义。成熟的心肌细胞有其自身的特 性，在成熟的心肌细胞中，质膜( p m ) 上的l 型钙离子通道与肌浆网( s r ) 上的 r y a n o d i n e 受体( r y r ) 并列紧密排列。当动作电位( a p s ) 引起p m 上的l 型钙离子 通道开放时，通过通道进入的c a 2 + 会促发r y r 将s r 中大量的c a 2 + 释放出来。在心 脏成熟过程中，随着心肌细胞的发育进程，上述的这些功能会发生很大变化。然而， 至目前为止，关于哺乳动物心肌细胞胚胎发育过程中c a 2 + 循环调控蛋白特性的研究还 很少，许多问题还有待澄清。本研究用免疫染色以及实时荧光定量p c r 的方法来研 究小鼠心肌细胞从胚胎发育早期( e 9 5 ) 到成年期这整个过程中c a 2 + 循环调节蛋白的 动态表达情况和亚细胞分布。实验结果如下： l 型钙离子通道的两种主要亚基a l c 和a l d 在m r n a 水平上都伴随着心脏节律 性收缩的出现( e 9 5 ) 而出现，但两者的变化趋势有所不同，a l c 亚基在e l i 5 天时 回落，而在e 1 4 5 天出现了一次瞬时性的增高，随后又回落到原先的水平。而a l d 亚基在胚胎期的表达出现了两次较大的一过性上升，一次出现在e 1 0 5 ，一次在e 1 5 5 ， 随即回落到较低的水平。在蛋白表达区域上，二者却十分相似，这二种l 型钙离子通 道始终在心室肌细胞的胞质和胞膜中清晰可见，在成年阶段的心室肌细胞中主要沿t 管和细胞核分布。l 型钙离子通道主要心肌细胞中表达，而在早期的流出道，房室管， 以及由此衍生而来的房室瓣膜、血管流出道瓣膜、尚未成熟的心室肌小梁、室间隔以 及小部分血管内皮中的内皮细胞和间充质细胞都未检测到该类蛋白的表达。 与l 型钙离子通道相似，t 型钙离子通道的两种亚基a l g 和a l h 在m r n a 水平 的出现时间同l 型钙离子通道是一致的( e 9 5 ) ，但两种亚基的表达趋势相反，a l g 亚基随着小鼠的生长发育其表达量也随之升高，并在成年期稳定在一个较高的水平； 而a l h 亚基除了在e 1 2 5 的表达出现了一个小的回落之外，其余时间均维持在较高的 水平，但出生后的a l h 亚基m r n a 的表达量却远远低于胚胎期。t 型钙离子通道的 两种亚基在小鼠胚胎心脏发育过程中的表达模式大致相似，在心室肌细胞中，两种t 型钙离子通道都主要分布在细胞膜上而在t 管中分布较少。在整个心脏结构上，其主 要分布在腔室壁、腔室间隔、以及肌小梁的心肌层，并且自始至终都稳定表达；而在 慢速传导区域的流出道和房室交界的组织( 房室瓣，主动脉瓣，肺动脉瓣) 中都没能 检测到t 型钙离子通道蛋白的阳性信号，这提示t 型钙离子通道对于心肌细胞的发 育以及心脏快速传导区域的形成有着很重要的作用。 钠钙交换器( n c x l ) 在e 1 3 5 天出现一个转录高峰，随后其成年期的转录水平低 于胚胎早期( e 1 0 5 ) ，约只有e 1 3 5 天的2 0 。n x c l 存在于心室肌细胞中，在内皮 中文摘要 细胞以及间充质细胞中并未检测到其表达。另一种重要的心肌钙循环调节蛋白r y r 2 的r n r n a 在e 9 5 天就可被检测到，并伴随着心肌细胞的成熟其表达量逐渐增加。r y r 2 稳定表达于腔室壁、肌小梁的心肌层等部位，而在房室管的间充质细胞，房室瓣以及 室间隔的内皮细胞中缺如。 综上所述，分布在心脏中的钙离子循环调节蛋白虽然在m r n a 水平的表达各有 不同，并且其表达时间亦有差异，但是其在心脏的分布区域却有共同之处：在心肌细 胞的胞膜区域高表达，而在非心肌细胞区域表达缺失，这对于进一步研究钙循环相关 调节蛋白与心肌细胞发育的相互关系提供了一定的实验依据。 关键词：钙循环相关调节蛋白，心脏发育，小鼠胚胎 a b s t r a c t a b s t r a c t e x c i t a b i l i t ya n de x c i t a t i o n - - c o n t r a c t i o n ( e c ) c o u p l i n g a r ee s s e n t i a lf u n c t i o n so f c a r d i a c m y o c y t e sa n dh a v ed i s t i n c t i v es i g n a t u r e s i nm a t u r em y o c a r d i u m i nm a t u r e m y o c y t e s ，p l a s m am e m b r a n e ( p m ) l - t y p e c a + c h a n n e l sf u n c t i o ni nc l o s ej u x t a p o s i t i o nt o r y a n o d i n er e c e p t o r s o nt h es a r c o p l a s m i cr e t i c u l u m ( s g ) m e m b r a n e a c t i o n p o t e n t i a l s ( a p s ) c a u s et h eo p e n i n go fp ml - t y p ec a z + c h a n n e l s ，w h i c hi nt u r np r o v i d e t r i g g e rc e + f o ral a r g e rr y r - m e d i a t e d s rc a 2 + r e l e a s e t h ec e l l u l a rp r o c e s s e si s r e s p o n s i b l ef o rt h er e g u l a t i o no ft h e s ef u n c t i o n su n d e r g oi m p o r t a n tc h a n g e sd u r i n gt h e m a t u r a t i o no ft h eh e a r t h o w e v e r , c o n c e r n i n g 也ec 矿h a n d l i n gp r o p e r t i e so fm a m m a l i a n c a r d i a cm y o c y t e sa tt h ev e r ye a r l ye m b r y o n i cs t a g e ，o n l yl i m i t e di n f o r m a t i o ni sa v a i l a b l e a n dm u c h r e m a i n st ob ec l a r i f i e d t h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt oi n v e s t i g a t et h ed y n a m i c c h a n g e so fe x p r e s s i o na n ds u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fc a h a n d l m gp r o t e i n si nm o u s e v e n t r i c u l a rm y o c y t e sd u r i n gd e v e l o p m e n tf r o mt h ev e r ye a r l ye m b r y o n i cs t a g er e 9 5 ) t h r o u g ha d u l t h o o db yu s i n gi m m u n o c h e m i c a ls t a i n i n ga n dr e a lt i m ep c ra s s a y s t h e r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： m r n a se s t i m a t e db yt h er e a lt i m ep c rf o rl - t y p ec a l c i u mc h a n n e l si nt h ev a l u e s n o r m a l i z e dt og a p d hm r n aw e r ed e t e c t e de m b r y o n i ch e a r tr a n g i n gf r o me 9 5t oe l8 5 ， a n dp o s t n a t a l ，a d u l t h o o da sw e l l e x p r e s s i o no fa lcs u b u n i tw a st r a n s i e n t l yr a i s e da te l4 5 ， w h e r e a s ，a ne n h a n c e de x p r e s s i o no fa l ds u b u n i tw a sf o u n di ne a r l ye m b r y o n i cs t a g e s ， p e a k e da te l0 5a n ds u b s e q u e n t l yd e c r e a s e da r o u n de l1 5a n dt h e ni n c r e a s e da g a i ni nl a t e r f e t a ls t a g e ( e 1 5 5 ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gf o re m b r y oa n dh e a r ts l i c e ss h o w e dt h a t a lca n da ldw e r ed e t e c t a b l ei na t r i a la n dv e n t r i c u l a rm y o c y t e sb u tn o ti nt h ee n d o t h e l i u m a n dm e s e n c h y m ec e h sd u r i n gt h ev a l v e sf o r m a t i o n , o u t f l o wf o r m a t i o na n dt r a b e c u l a r m o r p h o g e n e s i s t b i sp r o f i l eo fl o c a l i z a t i o nw a sm a i n t a i n e dt h r o u g h o u tt h ep o s t n a t a la n d a d u l t i m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n gd e t e c t e db y c o n f o c a lm i c r o s c o p er e v e a l e dt h a t c o m p a r a b l es u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fa lc a n da i ds u b u n i t sw e r eo b s e r v e dt h r o u g h o u t t h em e m b r a n eo fv e n t r i c u l a rm y o c y t e s s i m i l a rt ol - t y p ec a l c i u mc h a n n e l s ，b o t ha lga n dhs u b u n i t so ft - t y p ec a l c i u m c h a n n e l sc o u l db ed e t e c t e da te a r l ys t a g ee 9 5 ，b u tt h e i re x p r e s s i o nt r e n di sd i f f e r e n t t h e l e v e lo fa l gs u b u n i t st r a n s c r i p t s e x p r e s s i o nw a sg r a d u a l l y i n c r e a s e dw i t hh e a r t d e v e l o p m e n ta n dm a i n t a i n e da tar e l a t i v eh i g h e rl e v e l i na d u l t h o o d ，w h e r e a s ，o v e r a l l e x p r e s s i o no fa l hs u b u n i ti ne m b r y o n i cp e r i o dw a sh i g h e r t h a nt h a ti na d u l t h o o d i m m u n o h i s t o c h e m i c a ll o c a l i z a t i o ns h o w e dt h a te x p r e s s i o no fa l ha n da lgs u b u n i t s t h r o u g h o u tm y o c a r d i u ma n db u n d l eb r a n c h e se x c e p tf o rt h ee n d o t h e h u ma n dm e s e n c h y m e c e u si nt h et r a b e c u l a ra n de n d o c a r d i a lc u s h i o nr e g i o n s ，s u g g e s t i n gt h e yw e r ei n v o l v e di n t h em o r p h o g e n e s i so ft h es l o w c o n t r a c t i n gr e g i o n s a st ot h es u b c e n u l a rd i s t r i b u t i o n , t - t y p ec a l c i u m c h a n n e l sw e r em a i n l yo b s e r v e di nt h ev e n t r i c u l a rp l a s m a l e m m ab u tl i t t l ei n c y t o p l a s m 。 s o d i u m c a l c i u me x c h a n g e r ( n c x l ) a b u n d a n t l yt r a n s c r i b e da te m b r y o n i cs t a g e ，a n d p e a k e da tm i d d l ef e t a ls t a g e 1 3 5 ) ，t h e ni tc o n t i n u o u s l yd e c l i n e dt o e 1 0 5l e v e l sa t a d u l t h o o d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys h o w e dt h a tp o s i t i v es t a i n i n gf o rn c x lw a so n l y p r e s e n t e di nc a r d i o m y o c y t e s ，b u ta b s e n t e di ne n d o t h e h u ma n dm e s e n c h y m e c e l l s i na d d i t i o n , r y r 2m r n a s ，a n o t h e ri m p o r t a n tc a l c i u mh a n d l e rw e r ed e t e c t a b l ea te 9 5 a n dg r a d u a l l yi n c r e a s e dw i t hm a t u r a t i o no fm y o c y t e s ，r e a c h e dt oam a x i i n u n la ta d u l t h o o d s t a g e m o r e o v e r , p o s i t i v es t a i n i n gf o rr y r 2w a se v e n t l yo b s e r v e di nc a r d i o m y o c y t e so f v e n t r i c u l a r w a l la n ds e p t u mo fv e n t r i c l e ，b u ta b s e n ti ne n d o t h e l i u ma n dm e s e n c h y m ec e l l s o fv a l v e sa n do u t f l o wt r a c t i ns u m m a r y , t h ec a r d i a cc a l c i u mt a u d l 堍p r o t e i n ss h o w e dad y m m i ce x p r e s s i o np a ：t t e m d u r i n gm o u s eh e a r td e v e l o p m e n t ，i n d i c a t i n gt h e i ri m p o r t a n tr o l ei nt h ea c q u i s i t i o no fa m a t u r e p a t t e r no fm y o c a r d i u ma n dc o n d u c t i o ns y s t e md u r i n gc a r d i o g e n e s i s k e y w o r d s ：c a 2 + h a n d l e rp r o t e i n ，h e a r td e v e l o p m e n gm o u s ee m b r y o 英文缩略词表 英文缩略词表 苷 第一节背景及相关研究进展 第一节背景及相关研究进展 心脏是一个极其复杂的器官，当其发挥功能时需要大量的各种离子，在这些离子 当中，c a 2 + 被一致认为是最重要的。研究认为，c a 2 + 主要在心脏的收缩和舒张过程中 发挥着至关重要的角色。心脏的兴奋收缩耦联是一个从心肌细胞电兴奋转化为整个心 脏收缩的变化过程。c 扩普遍存在于细胞中，它在不仅在心脏的电活动中发挥了重要 作用而且是肌丝收缩的直接激活因子。在病理情况下，心脏心率失常和收缩等问题的 产生很多时候也是由于心脏中钙循环的紊乱而造成的。 在成熟心肌细胞的收缩舒张过程中，c a 2 + 通过去极化激活c a 2 + 通道进入细胞， 并形成内向c 矿电流( i 。) ，这一时期即动作电位的平台期( 如图1 ) 。进入的c 矛+ 促发肌浆网( s r ) 上的r y r 释放s r 中的ca ；抖。通过这二种途径进入胞浆的c a 2 + 促 使胞浆c a 2 + 浓度( c a 2 q i ) 升高，胞浆中游离的c a 2 + 结合于肌丝蛋白t r o p o n i nc 上进 而触发心肌细胞收缩。心肌细胞收缩后，通过多种途径细胞中的 c 神i 会迅速降低， 使得c a 2 + 从t r o p o n i nc 上解离，心肌细胞得以舒张。c a 2 + 的排出途径有很多种，可以 通过肌质网( s a r c o p l a s m i cr e t i c u l u l l l ，s r ) 上的c a 2 + a t p a s e ，将c a 2 + 回收入s r ，或 通过肌膜上的钠钙交换器( s o d i u m c a l c i u me x c h a n g e r ，n c x ) 和c a 2 + _ a t p a s e 将其 转运至胞外，还有少量通过线粒体上的c a 2 + 单向转运体进入线粒体内。至此，心肌细 胞完成了以钙循环为基础的收缩舒张。但是，在胚胎期心肌细胞发育过程中，心肌细 胞的肌浆网发育并不完善的情况下，各种c a 2 + 的转运蛋白是如何动态相互作用，如何 被调节等问题，目前尚未澄清。 图1 心室肌细胞中c a 2 + 的转运体系( f i g 1c a 2 + t r a n s p o r t i n v e n t r i c u l a rm y o c y t e s ) 引i 刍n a t u r e 。2 0 0 2 ，4 1 5 ：1 9 8 2 0 5 2 第一节背景及相关研究进展 心脏是胚胎发育第一个形成和发挥功能的器官，它的产生是一个十分复杂的多细 胞谱系协同作用过程。在原肠胚的早期，即小鼠胚胎7 5 天，来自侧板中胚层的心脏 前体细胞逐渐集中形成心脏原基；心脏原基逐渐向胚胎中线迁移并在神经褶下融合形 成原始心管。在e 8 5 - e 9 5 天，心管环化，并不对称发育。从e 1 0 天之后，心脏特化 生长、心血管系统重建，心脏逐渐成熟( 图2 ) 。 图2 胚胎期心脏的形成( f i g 2d i a g r a mo fe m b r y o n i ch e a r tf o r m a t i o n ) 引自c e l l 2 0 0 6 ，1 2 7 ：1 1 0 1 - 4 在胚胎以及成年阶段，很多钙循环的调节蛋白都发挥了功能。心肌细胞内c a 2 + 信号的形成与心肌细胞电压依赖的钙通道、钠钙交换器、肌质网r y r 受体有关【l 一。 这些蛋白在时空上的配合，使得c a 2 + 在亚细胞空间微小区域的差异分布，是保证心脏 正常发挥功能的必要因素。 1 电压依赖的钙离子通道 在大多数可兴奋细胞的胞外c a 2 + 通过电压依赖性c a 2 + 通道( v t c c ) 进入细胞， 根据其结构功能特点及对阻断药物的敏感性不同分为l 型、n 型、p q 型、r 型和 t 型5 种类型，其中l 型、n 型、p q 型和食型为电压激活c a 强道，而t 型为 低电压激活c a 2 + 通道【3 4 】。典型v t c c 一般由口1 、0 2 8 、b 以及y 这5 个亚单位中的 3 个以上亚单位构成的复合体。其中，伍1 亚单位是构成c a 2 + 通道的主要功能亚单位， 它是大多数药物的结合位点并且参与形成跨膜的亲水通道。b 亚基的表达调节了q 亚 基的某些生物物理学特性。0 , 2 5 紧挨着仅1 亚基，砣通过二硫键与跨膜的6 相连，两 种亚基是由同一种基因所编码的，该亚基的表达可以提高通道的密度、电荷的运动以 及药物结合的最大结合率，从而影响到a 1 亚基的功能【5 6 】。 3 第一节背景及相关研究进展 1 1l 型钙离子通道 高电压激活的l 型钙离子通道家族根据编码不同的a 1 亚基分为四个亚单位( a l s ， a l c ，a i d ，a l f ) ，其中分布在心脏中的主要是a l c 和a i d 亚基，a l s 到目前为止只在 骨骼肌中发现，而a l f 也只仅限于视网膜1 5 】。l 型钙离子通道的表达异常会产生多种 心脏疾病，在肥大的心脏中，研究者们发现通道的d h p ( 二氢吡啶类药物) 受体数 量较正常心脏明显增加；在舒张期异常的心脏中，9 亚基的转录本和蛋白表达量均明 显下降。在转基因小鼠中a l c 亚基在，t l , 脏过表达使l 型钙通道密度增加，动物发育 迟缓，且最终导致心力衰竭。可见，c a 2 + 流的加强影响，t l , 肌发育和修复。相反，l 钙 离子通道拮抗剂对心脏肥大和心力衰竭有修复作用。这些研究反映了在病理条件下， 通过l 型c a 2 + 通道方式流入的钙离子可能引起心脏重构，并不利于发育【7 1 。在心脏中， c 【1 亚基主要由a l c 编码，在该基因纯合缺失的小鼠中，在胚胎期1 4 5 天死亡之前， 心肌细胞仍然保留了l 型钙离子通道，这被推测是由其他伍1 亚基所代替的结果，但 是a i d 亚基却表现出了在胚胎小鼠心脏窦房结中舒张期去极化的重要作用【引。这为我 们的研究提供了线索：是否a i d 亚基在胚胎心脏发育的早期发挥了重要的作用? 在 近期的研究结果中，b 2 亚基对于小鼠心脏发育的影响也得到了进一步的阐述，通过 培养b 2 缺失的小鼠品系，l 型钙离子电流在小鼠胚胎心肌细胞中明显减弱并且进一 步影响了血管和流出道的形成，从而为我们的假设提供了进一步的依据【9 】。 1 2t 型钙离子通道 t 型钙离子通道与l 型最为明显的区别就在其各自不同的激活电压范围，l 型钙离 子通道在5 0 m v 左右发生了明显的去极化现象，而t 型钙离子通道则在8 0 m v 出现了微 弱的去极化。其基本结构与l 型钙通道相似，不同的是t 型钙通道0 【1 亚基跨膜的和 区域之间p 环的谷氨酸残基为天冬氨酸所取代。其功能主要与细胞的生长增殖，激素 的分泌，某些神经的节律性活动以及心脏起搏活动等有关【1 0 1 。在心脏中已鉴定出的t 型钙离子通道主要是a l o 和a l h 亚基，其在心脏发育时期的表达要高于成熟阶段。在 成年小鼠的心脏中，t 型钙离子通道的表达局限于窦房结和浦肯野纤维等区域快速起 搏细胞当中，其与心室的病理性肥大，心肌梗塞等病变都有一定的关系【l l ，1 2 1 。 由于t t c c 的低阈值特性，人们推测其可能提供了舒张期去极化的内向电流，进 而引起细胞自发搏动。i c a t 在所有具有自发节律性心脏组织中都有表达，其可能是提 供内向电流，并且在t t c c 和肌浆网( s r ) 的功能耦联中起重要作用。h u s c r 等【1 3 推测在舒张期去极化最后1 3 的时期里，t t c c 被激活，促发了胞浆局部钙火花，进 而使n c x 开放，n c x 的开放加速了心肌膜的去极化速度，使起搏细胞达到动作电位 阈值。这一特殊机制为研究由于自发搏动性增高而引起的房性心律不齐提供了参考。 4 第一节背景及相关研究进展 尽管如此，用n i 2 + 选择性阻断i c 盯只能降低起搏频率但不能使起搏电流消失，并且a 1 h 亚基缺陷型小鼠的窦性心律表现正常，并无心律失常的表型【1 4 1 。所有的这些研究都表 明：i 们并非心脏的主要起搏电流，但其能够调节心脏的起搏频率。 2 钠钙交换器 心脏中的n a + - c a 2 + 交换器( n c x ) 在调节心肌细胞内c a 2 + 稳态，维持正常的电节 律等活动中发挥了重要作用，心脏中的n c x 蛋白由卟跨膜结构域组成，并且包括一 个大的亲水环( 大约有5 5 0 个氨基酸) ，亲水环位于跨膜区域5 、6 之间，n 端和c 端分 别位于胞外和胞内【l 习( 图3 ) 。同时，n c x 的功能受胞外和胞内各种阳离子、信号分 子、肽等信号的调节【1 6 】。n c x 胞内环的突变以及蛋白的水解都会导致其对细胞i 为n a + 、 c a 2 + 、a t p 、p i p 2 等调节功能的丧失【1 5 1 6 1 。n c x 诱导的离子流是双向的( n r 的内流 伴随着c a 2 + 的外流) 。n c x 弓i 导的n a + ：c a 2 + 的化学计量数为3 ：1 t 1 7 】，也研究表明n 矿：c a 2 + 的化学计量数为4 ：ll 1 8 】。 n 怕n n i n u s 1 眨曩舅l 啊哪曼墨 国 e 互硒幽也矗匝区 v 汐。飞八- k i n t r a c e i l n c xi n t r a c e l l u l a rl o o p 图3n a 一c a 2 + 交换器的结构( f i g 3o v e r v i e wo f t h es t r u c t u r eo f n a + - c # + e x c h a n g e r ) 引自c e l lc a l c i u m 2 0 0 9 ，4 5 ：1 1 0 5 第一节背景及相关研究进展 在动作电位期间，n c x 最初被激活为c a 2 + 的内流模式，n c x 诱导的c a 2 + 内流能 够扩大l 型钙离子通道诱导的c a 2 + 释放引起的内质网的c a 2 + 释放效应【1 9 1 。在动作电 位复极化阶段，n c x 将c a 2 + 排出胞外，同时内质网也将c a 2 + 从胞浆回收入内质网， 通过以上这种机制所回收的c a 2 十占人，t h , 肌细胞整体胞浆c a 回收量的3 0 ，这些机 制将细胞中的c a 2 + 浓度维持在约1 0 0 r i m ，使得肌细胞舒张【1 9 】。 很多证据表明，在动物心脏疾病模型和人的心脏疾病中，n c x 会发生改变，例如：在 肥大和一t h , 衰的心肌中，n c x 的密度和活性都会明显增加，n c x 的上调会促成心肌细 胞中内质网c a 2 + 相关蛋白的变化，兴奋收缩耦联的改变以及心律失常的发生【2 0 】。另 一方面，增加的c a 2 + 内流会导致内质网的c a 2 + 超载并且会引起心肌的过度收缩【2 1 。 n c x 在病理、生理情况下都发挥了重要的功能，n c x 活性的调节会对机体产生重要 影响。 3 r y a n o d i n e 受体 内质网钙释放通道r y a n o d i n e 受体( r y r ) 是一个同源四聚体，其分子量为5 6 0 k d a ， 在哺乳动物组织中有3 种亚型，它们分别是r y r l ( 主要存在于骨骼肌中) ，r y r 2 ( 主 要存在于心肌中) ，r y r 3 ( 主要存在于脑中) 。这三种亚基在结构和功能上都是相关 联的。r y r 在位于胞浆区域有4 5 个位点都可与内源性的调节子( 如：c a 2 + ，m 9 2 + ， f k 5 0 6 结合蛋白以及钙调蛋白e a l m o d u l i n ) 结合。近来，关于e a l m o d u l i n 调节r y r 的 机制是研究的热点之一。心肌细胞r y r 2 是心肌细胞兴奋收缩耦联以及维持细胞内钙 稳态的重要蛋白【1 9 1 ，r y r 2 的突变会导致很多种心律失常的发生，包括儿茶酚胺能多 形性心动过速( c p v t ) 或双向室性心动过速( ) ，儿茶酚胺能原发性室性依赖以 及一t h , 律失常性右心室发育不良等 2 2 , 2 3 】。迄今为止，已有超过6 0 种与疾病相关的r y r 2 突变被发现【2 4 , 2 5 1 。但是关于为何r y r 2 的突变会引起室性心律失常的机制尚不清楚。 r y r 2 对于维持心肌细胞的正常生理功能有非常重要的作用，r y r 2 先于胚胎发育过程 中，t h , 脏发挥功能之前【2 6 1 ，而且胚胎期心率的增高对提高心脏的血液输出非常重要。因 此探究r y r 2 对于调节胚胎心率的作用也是研究的热点。 虽然，目前已对这几种钙离子通道有了相关研究，但是对于其在胚胎期的表达还 不十分清楚，而胚胎期是个体发育的开始，各种基因的转录、蛋白的表达都对个体发 育产生重要影响。本实验旨在从蛋白、分子等不同水平来探讨小鼠心脏发育不同阶段 钙离子通道的时空表达模式，为理解钙离子通道与心脏发育的关系提供参考数据。 6 第二节抗胚胎小鼠心肌a l d 钙离子通道抗体的制备及鉴定 第二节抗胚胎小鼠心肌a l d 钙离子通道抗体的制备及鉴定 a i d 蛋白相对分子质量大，结构复杂，而商用抗体不多并且存在滴度低、特异性较 差、价格高昂等问题，已成为本研究的瓶颈。为更好地探讨a l d 蛋白在小鼠胚胎心脏 发育过程中的时空分布特征以及研究其在胚胎发育过程中调控钙离子相关信号，我们 利用这一表达系统构建t p g e x a l d 融合载体，并进行原核诱导表达和纯化，随后将 纯化的融合蛋白免疫家兔并制备抗血清，为进一步研究a l d 蛋白在心脏中的作用提供 了条件。 1 实验材料和方法 1 1 动物：质粒和菌株 c 5 7 b l 6 j 品系小鼠8 1 6 周龄，购自南京大学模式动物中心；雌性新西兰大白兔4 5 月龄，购自南京军区总院动物中心。原核融合表达载体p g e x 4 t - 1 ，大肠杆菌菌株 d h 5 泖b l 2 1 由南京师范大学生命科学院分子医学生物技术重点实验室保存。 1 2 did n c 原核表达载体的构建及鉴定 以提取胚胎小鼠心脏r n a 后反转录得到的c d n a 为模板，p c r 扩增a i d 的n 端和c 端片段，以e c o ri 和b a m hi 进行双酶切，a l d n 上游引物为5 c g cg o a t c c c c g c c ct g tg a t g t g c c ag 3 ( b a m hi ) ，下游引物为：5 c c gg a a 1 t cg a ag a tg t gg t g g t t 丸盯g - 3 ( e c o ri ) ；a l d c 上游引物为5 一c g cg o a t c cc a cc g aa g c t c ct g gt a ca 3 ( b a m hi ) ，下游引物为：5 c c gg a a t t ca g ga c c 灿蚣g t cc t gg a g c 3 ( e c o ri ) ；反应参数：9 5 预变性2 m i n ， 9 5 变性1 5 s ，5 7 复性3 0 s ，7 2 延伸3 0 s ，循环3 5 次后，7 2 延伸1 0 m i n ，扩增 产物以2 的琼脂糖凝胶电泳分离。p c r 产物和质粒p g e x 4 t _ 1 分别经b a m hi 和 e c o ri 双酶切后，1 琼脂糖凝胶电泳切胶纯化回收。目的基因a l d 与含相应粘性末 端的p g e x 一4 t - 1 连接。反应体系1 0 山，含1 0 x t 4d n a l i g a s e b u f f e r1 出，t 4d n a l i g a s e 1 m ，目的基因片段和载体片段按摩尔比3 ：1 于1 6 c 连接反应5 h 。连接产物1 0 1 上1 转 化入1 0 0 1 d 感受态细菌d h 5 a ，经a m p 培养基筛选，重组质粒用双酶切或p c r 鉴定 后测序分析。 1 3 d1 d n c 蛋白的融合表达及纯化 1 3 1 g s t a l d n c 融合蛋白的诱导表达 将阳性重组质粒g s t - a l d n c 及对照质粒g s t 转化到b l 2 1 菌株中，挑取单克隆 置于3 m ll b a m p ( 0 1 i n g m 1 ) 培养液中，3 7 c 摇床培养过夜。按1 ：1 0 0 接种扩大培 养，3 7 * 0 培养2 3 小时至o d 6 0 0 = 1 0 时，加入i p t g ，3 0 诱导。 7 第二节抗胚胎小鼠心肌a1 d 钙离子通道抗体的制备及鉴定 1 3 2g s t a l d n c 融合蛋白的纯化和鉴定 4 ，5 0 0 0 9 离心1 5 分钟后收集菌体，置冰上加g s t 重悬液重悬沉淀，经超声 破碎后，4 ，30 0 0 9 离心3 0 分钟，加1 5m lg l u t a t h i o n es e p h a r o s e t m 4f a s tf l o w 亲 和纯化4 过夜。冰浴的p b s 充分洗涤后，加入l m lg s t 洗脱缓冲液旋转室温洗脱 2 0 分钟后收集洗脱液，重复洗脱3 4 次，收集样品，取1 0 l d 表达纯化过程中的样品 与等体积2 x s d s 上样缓冲液混匀后煮沸5 分钟，上样于1 2 s d s p a g e ，以1 3 0 v 恒压电泳1 2 小时( p o w e rp a c3 0 0 ，b i o - r a d ) ，然后进行考马斯亮蓝染色。干胶保 存。 1 4 兔抗鼠c 11 d n c 抗血清的制备 以纯化的融合蛋白免疫雌性成年新西兰白兔，大致程序如下：免疫前取耳血分离 血清，作为免疫前血清对照。初次免疫用2 0 0 斗g 的融合蛋白加等体积弗氏完全佐剂混 合，于背部皮下多点注射。初次免疫后第1 4 、2 8 、3 5 天，加等体积弗氏不完全佐剂 于腿部肌肉各加强免疫1 次。每次加强免疫前，均取耳血分离血清。末次免疫后7 d ， 颈动脉取血，置采血管中4 c 放置过夜，5 0 0 9 离心5 分钟，制备血清。含有抗体的血 清经0 2 2 1 t m 滤膜过滤后，以一倍体积p b s 溶解，离心去不溶性杂质，上清过i m lg 蛋白亲和层析柱。先以1 p b s 平衡层析柱，然后上样，再以o 1 m m g l y h c l ( p h 2 6 ) 进行洗脱，收集目的峰，以l m m t r i s - h c l ( p h 9 o ) 调p h 值至7 0 。经鉴定后加蛋白保 护剂至浓度为o 1 。 1 5 间接e l i s a 法检测抗血清效价 将抗原用包被液稀释至5 0 0 n m l ，酶联板各孔分别加1 0 0 r d ，4 c 包被过夜。p b s 洗涤3 次，每次5 分钟后。各孔分别加3 b s a p b s 封闭液1 0 0 肛1 ，置3 7 c1 小时。 抗血清用洗涤缓冲液按梯度稀释每孔加入1 0 0 p 1 ，阴性对照组( 不加抗体) 加l o o r l l 洗涤缓冲液。4 c 过夜后，p b s 洗涤3 次。每孔加入1 0 0 斗1 稀释5 0 0 0 倍的h r p 标记 羊抗兔i g g 抗体，置3 7 。c 保温1 2 小时。保温完毕后，用洗涤缓冲液洗涤3 次。分 别加入1 0 0 p 1 底物显色液四甲基联苯胺，室温暗处放置2 0 分钟左右。加入5 0 山2m o f l 硫酸终止酶促反应，用酶联仪i o - t e ki n s t r u m e n t s ，i n e w m o o s k i ，v e r m o n t , u s a ) 在 4 9 0 h m 波长下比色测定。 1 6 抗血清特异性的w e s t e r nb i o t 检测 取小鼠心肌组织裂解提取蛋白，以b s a 为阴性对照，以纯化的g s t - a l d n c 融 合蛋白为阳性对照，裂解细胞并抽提全蛋臼，定量后进行1 2 s d s p a g e 并转移至 8 第二节抗胚胎小鼠心肌1 ：11 d 钙离子通道抗体的制备及鉴定 p v d f 膜上，3 b s a 封闭1 h 后，按1 ：10 0 0 稀释比例加入兔抗血清，4 孵育过夜。 用p b s t ( 含0 0 5 t w e e n 2 0 的p b s 溶液) 洗去未结合的兔抗g s t - a l d n c 抗体 ( 3 x 1 0 m i n ) ， 滴加碱性磷酸酶( a p ) 标记的羊抗兔i g g ( 二抗) ，室温反应1 h ，再 以p b s t 洗去未结合的二抗( 3 x 1 0 m i n ) ，最后滴加n b t b c i p 显色。 2 结果 2 1 重组表达载体的构建及酶切鉴定 a l d n c 全长c d n a 以正确的读码框插入表达载体p g e x 4 t - 1 ( 图1 ) 中，获得重组 质粒p g e x a l d n c 。质粒经b a m hi 和e c o ri 双酶切，分别得到约2 1 0 b p ( a l d n ) 和 3 4 8 b p ( a l d c ) 的释放片段( 图2 ) ，同预期的结果相一致。挑取单个菌落送华大基因 公司进行序列测定，测序结果完全正确。 图1 表达质粒p g e x - 4 t - 1 图谱 口i g 1s c h e m a t i cd i a g r a mo f b a c t e r i a le x p r e s s i n gv e c t o rp g e x - 4 t - 1 ) 9 第二节抗胚胎小鼠心肌q1 d 钙离子通道抗体的制备及鉴定 1m 1m 0 o o 图2 重组表达载体p g e x - o t l d n c 的酶切鉴定 ( f i g 2r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i so f t h er e c o m b m a n tp l a s m i dp g e x c 【_ 1 d n c ) a 1 重组p g e x - a l d n 经b a m hi 和e c o ri 双酶切的鉴定，箭头所示为2 1 0 b p 处a 1 d n 片段，b 1 重 坌j l p g e x a l d c 经b a m hi 和e c o ri 双酶切的鉴定，箭头所示为3 4 8 b p 处q 1 d c 片段，m d n a 2 0 0 0 标准分子量m a r k e r 。 2 2 融合蛋白的诱导表达及纯化 以重组质粒p g e x a l d n c 转化宿主茵b l 2 1 ，用i p t g 诱导融合蛋白g s t - a l d n c 的表达。将表达融合蛋白的细菌经离心沉淀、超声破碎处理后，取上清和沉淀分别经 s d s p a g e 分析发现融合蛋白大部分表达于上