（内科学专业论文）flt3itd与npm1基因突变在血液肿瘤中的表达及意义.pdf

目录 要1 要4 文f l t 3 i t d 与n p m l 基因突变在血液肿瘤中的表达及意义 前言8日l 舌8 材料与方法8 结果1 3 附图1 6 附表2 2 讨论2 5 结论3 0 参考文献3 2 综述n p m 基因突变在血液肿瘤中的作用3 5 致谢4 4 个人简历4 5 土塞垫兰 f l t 3 i t d 与n p m l 基因突变在血液肿瘤中的表达及意义 摘要 目的：探讨正常核型的急性髓细胞白血病( n k a ) 和骨髓增生 异常综合征( m d s ) 中f l t 3 i t d 和n p m l 基因突变的发生率及各亚型 之间的差别，同时观察伴有上述两种基因突变的初诊急性髓细胞白血病患 者的完全缓解( c r ) 率及临床特点。 方法：回顾性分析2 0 0 8 年1 月至2 0 1 0 年l o 月期间河北省人民医 院收治的初诊2 0 1 例a m l 和m d s 患者的临床资料，其中初诊的1 2 5 例 a m l 为正常核型患者( 包括存在t ( 1 5 ，1 7 ) 和t ( 8 ，2 1 ) 的m 2 和m 3 患者) ( 男6 4 例，女6 1 例) ，m d s7 6 例( 男4 2 例，女3 4 例) ，提取上 述患者骨髓单个核细胞d n a ，采用基因组d n a p c r 及基因直接测序方 法检测所有患者f l t 3 基因外显子1 4 、1 5 中i t d 突变及n p m l 基因第 1 2 号外显子突变。融合基因检测包括p m l r a ra 和a m l l e t o 。 结果： l 在初诊1 2 5 例n k 。a m l 中，n p m l 基因突变例数为5 7 例，分别为： m 12 例( 2 8 6 ) ，m 21 2 例( 3 8 7 ) ，m 41 2 例( 6 0 ) ，m 5 a1 4 例( 6 6 7 ) ， m 5 b1 7 例( 7 3 9 ) ，m 32 0 例、m 4 e o3 例中未见n p m l 基因突变的表达， n p m l 基因突变在初诊的1 2 5 例n k - a m l 患者中的总表达率为4 5 6 ； f l t 3 i t d 基因突变例数为5 0 例，分别为：m 1 1 例( 1 4 3 ) ，m 26 例 ( 1 9 4 ) ，m 31 6 例( 8 0 ) ，m 48 例( 4 0 ) ，m 5 a9 例( 4 2 9 ) ，m 5 b 1 0 例( 4 3 5 ) ，m 4 e o 中未见f l t 3 i t d 基因突变的表达，f l t 3 i t d 基 因突变在初诊的1 2 5 例n k a m l 患者中的总表达率为4 0 ；1 2 5 例患者 中n p m l 十f l t 3 i t d 一占2 3 例( 18 4 ) ，n p m l _ f l t 3 i t d 一占3 9 例 ( 3 1 2 ) ，n p m l 十f l t 3 i t d 十占4 5 例( 3 6 o ) ，n p m l 一f l t 3 i t d + 占 l8 例( 1 4 4 ) ；有8 5 例a m l 患者经l 疗程化疗后达c r ，c r 率为6 8 ， 其余4 0 例患者经1 个疗程化疗后未达c r ，未达c r 的患者有4 5 例，其 中8 例为n p m l + f l t 3 i t d + ，1 5 例为n p m l 一f l t 3 i t d ，1 7 例为n p m l 一f l t 3 i t d + 的患者，继续进行第2 疗程化疗后，4 5 例中有2 9 例达c r ， 余l l 例仍未达c r ，此1 l 例为n p m l 一f l t 3 i t d + 的患者，第2 疗程化疗 士圣垫墨 后的总c r 率为9 1 2 。2 3 例n p m l + f l t 3 i t d 一的患者经1 疗程后均达 c r ，其达c r 所需时间为1 5 4 5 天，3 9 例n p m l 一f l t 3 i t d 一达c r 所需 时间2 1 4 1 0 天，4 5 例n p m l + f l t 3 i t d + 达c r 所需时间2 3 4 - 9 天，7 例 n p m l 一f l t 3 i t d + 达c r 所需时间4 0 士1 8 天；5 7 例n p m l 突变阳性的患 者女性占3 4 例( 5 9 6 ) ，男性占2 3 例( 4 0 4 ) ，且均表现为骨髓原始 细胞比例、外周血白细胞及血小板计数较高，无一例全血细胞减少，骨髓 通常为有核细胞增生明显活跃，5 0 例f l t 3 i t d 突变阳性的患者女性占 2 7 例( 5 4 o ) ，男性占2 3 例( 4 6 o ) ，普遍表现为骨髓原始细胞比例、 外周血白细胞计数及血小板计数较高，其中3 例为全血细胞减少，骨髓通 常为有核细胞增生明显活跃。 2 7 6 例m d s 患者中大部分存在染色体的改变，其中7 例为d e l ( 5 q ) ， 1 5 例为+ 7 ，1 3 例为d e l ( 8 ) ，1 0 例为d e l ( 2 0 q ) ，8 例为核型正常患者， 其余2 3 例为复杂核型患者。n p m l 基因突变均累及5 号染色体，其n p m l 突变情况为：r a r s1 例( 1 3 ) ，r a e b 15 例( 6 6 ) ，r a e b 一21 例( 1 3 ) ， 其他亚型中未见n p m l 基因突变的表达，n p m l 基因突变在m d s 总的表 达率为9 2 ；f l t 3 i t d 基因突变的表达情况为：r a e b 12 例( 2 6 ) ， r a e b 24 例( 5 3 ) ，其他亚型中未见f l t 3 i t d 基因突变的表达， f l t 3 一i t d 基因突变在m d s 总的表达率为7 9 ；其中有5 例r a e b l 为 n p m l + f l t 3 i t d 一，2 例r a e b 1 和1 例r a e b 2 为n p m l 十f l t 3 - i t d 十， 4 例r a e b 2 为n p m l 一f l t 3 i t d + ，1 5 例r a e b 1 和1 8 例r a e b 2 为 n p m r f l t 3 一i t d 一；n p m l + f l t 3 i t d + 的1 例r a e b 1 和1 例r a e b 一2 均在1 月内转化成a m l 。 31 0 例免疫性血小板减少症、1 0 例再生障碍性贫血、1 0 例多发性骨髓 瘤、1 0 例非霍奇金淋巴瘤、1 0 例急性淋巴细胞白血病、1 0 例巨幼细胞贫 血中均未检测到f l t 3 i t d 及n p m l 突变； 41 6 例f l t 3 i t d 突变阳性的m 3 患者中均检测到p m l r a ra 表达，6 例f l t 3 i t d 突变阳性的m 2 患者中有5 例检测到e t o 表达，而5 7 例 n p m l 突变阳性的患者中未检测到特异性融合基因表达。 结论： 1n p m l 突变的发生率在初诊的a m l 各亚型中具有异质性，各亚型由 低到高为m 1 m 2 m 4 m 5 a m 5 b ，但各亚型之间无统计学意义。f l t 3 i t d 士耋垫黑 突变的发生率在初诊的a m l 各亚型中也具有异质性，可见除m 4 e o 外的 所有亚型中，各型突变率由低到高为m 1 m 2 m 4 m 5 a m 5 b m 3 ，其中 m 3 组f l t 3 一i t d 基因突变的发生率高于其它类型组。 2 在m d s 各亚型中n p m l 突变多见于r a e b 1 ，f l t 3 i t d 突变多见于 r a e b 2 。 3 n p m l 突变及f l t 3 i t d 突变在女性患者多见，骨髓原始细胞比例、 外周血白细胞及血小板计数均较高。 4 n p m l + f l t 3 i t d 一组达到c r 时间最短，缓解率最高，n p m l 一 f l t 3 i t d + 组达到c r 时间最长，缓解率最低。 关键词：急性髓细胞白血病；骨髓增生异常综合征：f l t 3 i t d ； n p m l ；基因突变；临床预后 差童i 蜜璺 t h e p r e s e n c ea n dc l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo ff l t 3 - - i t da n dn p m 1 m u t a t i o n si nt h eb l o o dt u m o r s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ef l t 3 - i t da n dn p m1 g e n em u t a t i o nr a t ei n a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ( a m l ) a n dm y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e ( m d s ) w i t h n o r m a lk a r y o t y p e ，a sw e l la st h ed i f f e r e n tm u t a t i o nr a t ei nt h e i rs u b t y p e s ， m e a n w h i l e ，t h ec l i n i c a lf e a t u r e sa n dc o m p l e t er e m i s s i o nr a t ew e r eo b s e r v e di n p r i m a r ya c u t em y e l o i dl e u k e m i ap a t i e n t sw i t ht h et w ok i n d so fm u t a t i o n s m e t h o d s ：ar e t r o s p e c t i v ea n a l y s i sf r o mj a n u a r y2 0 0 8t oo c t o b e r2 010 ， h e b e ip r o v i n c ep e o p l e 。sh o s p i t a lo fu n t r e a t e d2 01c a s e so fa m la n dm d s p a t i e n t sc l i n i c a ld a t a ，i n c l u d i n gu n t r e a t e dn e w l yd i a g n o s e da ，12 5 ( i n c l u d e t ( 1 5 ，1 7 ) a n dt ( 8 ，2 1 ) m 3a n dm 2p a t i e n t s ) ( m a l e6 4c a s e s ，f e m a l e6 1c a s e s ) ， m d s7 6p a t i e n t s ( 4 2m a l e sa n d3 4f e m a l e s ) e x t r a c t i o no ft h eb o n em a r r o w m o n o n u c l e a rc e l l si np a t i e n t sw i t hd n a ，u s i n gg e n o m i cd n a p c ra n dd n a d i r e c ts e q u e n c et od e t e c ta l lp a t i e n t sw i t hf l t 3e x o n14 - 15i nt h ei t da n d n p m lg e n em u t a t i o ni ne x o n 1 2 d e t e c t i o no ff u s i o ng e n e s ，i n c l u d i n g p m l ra r aa n da 池1 e t l o r e s u l t s ： 112 5p a t i e n t sw i t hn o r m a lk a r y o t y p ei nu n t r e a t e dn e w l yd i a g n o s e da c u t e m y e l o i dl e u k e m i ap a t i e n t s ，n p m 1 g e n em u t a t i o n s57c a s e s ，t h en u m b e ro f c a s e sw e r e ：m 12c a s e s ( 2 8 6 ) ，m 21 2c a s e s ( 3 8 7 ) ，m 41 2c a s e s ( 6 0 ) ， m 5 a1 4c a s e s ( 6 6 7 ) ，m 5 b17c a s e s ( 7 3 9 ) ，m 32 0c a s e s ，m 4 e o3c a s e s n on p m1 g e n em u t a t i o ni nt h ee x p r e s s i o n ，n p m 1 g e n em u t a t i o n si n12 5 c a s e su n t r e a t e do fn o r m a l k a r y o t y p ea c u t em y e l o i dl e u k e m i at h e t o t a l e x p r e s s i o nw a s4 5 6 ；f l t 3 一i t dm u t a t i o n5 0c a s e s s ，t h en u m b e ro fc a s e s w e r e ：m 1lc a s e ( 1 4 3 ) ，m 26c a s e s ( 1 9 4 ) ，m 31 6c a s e s ( 8 0 ) m 48 c a s e s ( 4 0 ) ，m s a9c a s e s ( 4 2 9 ) ，m 5 b1 0 c a s e s ( 4 3 5 ) ，m 4 e oi nf l t 3 i t d m u t a t i o nw a sn oe x p r e s s i o n ，f l t 3 一i t dm u t a t i o n si n12 5 p a t i e n t sw i t h u n t r e a t e da c u t e m y e l o i dl e u k e m i an o r m a lk a r y o t y p et h et o t a lc e l l u l a r 4 u n d e r w e n tac o u r s eo fl e s st h a nc o m p l e t er e m i s s i o na f t e rc h e m o t h e r a p y ( c r ) ， n or e a c h c o m p l e t e r e m i s s i o n4 5 c a s e s ，8c a s e sw e r et e s t e d n p m l 卯l ，t 3 i t d + ，1 5c a s e sn p m i f l t 3 i t d 。，1 7c a s e sn p m i f l t 3 i t d + p a t i e n t st oc o n t i n u ea f t e r2c y c l e so fc h e m o t h e r a p y ，i n c l u d i n g2 9c a s e so fc r ， m o r et h a n1 1c a s e sd i dn o tr e a c hc r ，t h e1 lc a s e sn p m1 许l t 3 i t d + p a t i e n t s ；a f t e rt h es e c o n dc o u r s eo fc h e m o t h e r a p yc rr a t e91 2 ：2 3c a s e s n p m r f i t 3 一i t d p a t i e n t sa f t e rt r e a t m e n tr e a c h e dc r ，t h et i m eo fr e a c h e d c rw a s1 5 土5d a y s ，3 9c a s e sn p m l 卯i j 3 i t d r e a c h e dc rt i m ew a s2 1 士1 0 d a y s ，4 5p a t i e n t sw i t l ln p m 1 l t 3 一i ，m + r e a c h e dc rt i m ew a s2 3 + 9d a y s ， 7p a t i e n t sw i t hn p m l 。f i t 3 i t d + r e a c h e dc rt i m ew a s4 04 - 18d a y s ；5 7 p a t i e n t sw i t hn 咿m 1m u t a t i o np o s i t i v ef e m a l ep a t i e n t sa c c o u n t e df o r34c a s e s ( 5 9 6 ) ，m a l e sa c c o u n t e df o r2 3c a s e s ( 4 0 4 ) ，a n da r ee x p r e s s e da s p e r c e n t a g eo fb o n em a r r o wb l a s tc e i l s ，p e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t ea n dh i g h e r p l a t e l e tc o u n t ，n o n eo fp a n c y t o p e n i a ，b o n em a r r o wn u c l e a t e dc e l lp r o l i f e r a t i o n i su s u a l l ys i g n i f i c a n t l ya c t i v e ；5 0p a t i e n t sw i t hf l t 3 - i t dm u t a t i o np o s i t i v e f e m a l ep a t i e n t sa c c o u n t e df o r2 7c a s e s ( 5 4 o l ，m a l e sa c c o u n t e df o r2 3c a s e s ( 4 6 o ) ，g e n e r a le x p r e s s e da sp e r c e n t a g eo fb o n em a r r o wb l a s tc e l l s ， p e r i p h e r a lw h i t eb l o o dc e l l sh i g h ，i n c l u d i n g3c a s e so fp a n c y t o p e n i a ，b o n e m a r r o wn u c l e a t e dc e l lp r o l i f e r a t i o ng e n e r a l l yw a s a c t i v e 27 6c a s e so fm d sp a t i e n t s ，t h e r ew e r eal o to fc h a n g e si nd i f f e r e n t c h r o m o s o m e s ，i n c l u d e7c a s e sd e l ( 5 q ) ，1 5c a s e s + 7 ，1 3c a s e sd e l ( 8 ) ， 10c a s e sd e l ( 2 0 q ) ，8c a s e sn o r m a lk a r y o t y p ep a t i e n t s ，t h eo t h e2 3c a s e s c o m p l e xk a r y o t y p e ；n p m 1 g e n em u t m i o ni n v o l v e do nc h r o m o s o m e5 ，t h e n p m lm u t a t i o ni s ：r a r slc a s e ( 1 3 ) ，r a e b 15c a s e s ( 6 6 ) ，r a e b 一2 1c a s e ( 1 3 ) ，o t h e rs u b t y p e sw e r en oe x p r e s s i o no fn p m 1 g e n em u t a t i o n s ， n p m1m u t a t i o n si nt h ee x p r e s s i o no ft h et o t a lm d sw a s9 2 ：f 【t 3 1 1 1 d 5 墓塞i 壹若 m u t a t i o ne x p r e s s i o na s ：r a e b 一12c a s e s ( 2 6 ) ，r a e b 一24c a s e s ( 5 3 ) ， o t h e rs u b t y p e s ，f i j 3 一i t dm u t a t i o nw a sn oe x p r e s s i o n ，f l t 3 - i t dm u t a t i o n e x p r e s s i o ni nm d sw a s7 9 o v e r a l l ；o fw h i c h5c a s e sr a e b 1f o rt h e n p m l 卯l t 3 i t d 。，2c a s e sr a e b 1a n dlc a s er a e b 2f o rt h e n p m l i t 3 一i t d 十，4c a s e sr a e b 2i sn p m l 订i j 3 i t d 十，1 5c a s e sr a e b 1 a n d1 8c a s e sr a e b 2f o rt h en p m l 作i j 3 i t d 。：n p m l 十f i j 3 i t d 十i n1 c a s er a e b 1a n d1c a s er a e b 2a t1m o n t hw e r ec o n v e r t e dt oam ， 310c a s e so fi m m u n et h r o m b o c y t o p e n i a ，10c a s e so fa p l a s t i ca n e m i a ，10 p a t i e n t sw i t hm u l t i p l em y e l o m a ，10c a s e so fn o nh o d # i nl y m p h o m a ，1 0 c a s e so fa c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a ，10c a s e so f m e g a l o b l a s t i ca n e m i aw e r e n o te x p r e s s i o ni nd e t e c tf l t 3 。i t da n dn p m1m u t a t i o n 416c a s e sf i j 3 i t dm u t a t i o np o s i t i v eo ft h em 3w a sd e t e c t e di np a t i e n t s w i t hp m 巴瓜a r ae x p r e s s i o n ，f i t 3 i t dm u t a t i o ni n6c a s e so fm 2p o s i t i v e p a t i e n t si n c l u d ef i v ec a s e sd e t e c t e de t oe x p r e s s i o n ；a n d57c a s e so fn p m 1 m u t a t i o np o s i t i v ep a t i e n t sw a sn o td e t e c t e ds p e c i f i cf u s i o ng e n ee x p r e s s i o n c o n c l u s i o n ： 1t h em u t a t i o nr a t e so fn p m1w e r ed i f f e r e n ti nt h es u b t y p e so fu n t r e a t e d a m l i tw a sm1 m 2 m 4 m 5 a m 5 b ，t h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w e e nt h e s u b t y p e s f l t 3 - i t d m u t a t i o nr a t e si nu n t r e a t e da m l h e t e r o g e n e i t yo f t h es u b t y p e s , i ta p p e a r si na l ls u b t y p e se x c e p tm 4 e oo u t s i d e ， t h eo t h e rl o wt oh i g hm u t a t i o nr a t ew a sml m 2 m 4 m 5 a m 5 b m 3 ，b u t t h em 3 g r o u po ff 1 月3 - i t dm u t a t i o nw a sh i g h e rt h a ni no t h e rt y p e so fg r o u p 2i n d ss u b t y p e s ，n 限mlm u t a t i o nm o r ec o m m o ne x p r e s s i o ni nr a e b 1 ， f i j 3 i t dm u t a t i o nm o r ec o m m o ne x p r e s s i o ni 1 1r a e b 2 3n p mlm u t a t i o na n df l t 3 i t dm u t a t i o nw e r em o r ec o m m o ni nf e m a l e ， t h ep r o p o r t i o no fb o n em a r r o wb l a s tc e l l s ，p e r i p h e r a lb l o o dl e u k o c y t ea n d p l a t e l e tc o u n t sw e r eh i g h e r 4n p m i + f l t 3 一i t d g r o u pr e s p o n s et i m e o ft h es h o r t e s t ，t h eh i g h e s t r e s p o n s er a t e ，n p m1 作l t 3 - i t d 十g r o u pr e m i s s i o nl o n g e r ，t h el o w e s tr e s p o n s e r a t e 6 k e yw o r d s ：a c m em y e l o i dl e u k e m i a ：m y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e ； f l t 3 - i t d ；n p m1 ；g e n em u t a t i o n ；c l i n i c a lp r o g n o s i s 7 叠塞迨塞 f l t 3 i t d 与n p m l 基因突变在血液肿瘤中的表达及意义 -jl- 刖葺 f l t 3 基因突变是急性髓细胞白血病( a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，a m l ) 最常见的基因突变之一，在a m l 患者中发生突变率约3 0 3 5 ，在骨 髓增生异常综合征( m y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e ，m d s ) 患者中发生突变 率约3 6 ，主要包括跨膜结构域的内部串联重复突变及第二酪氨酸激 酶结构域的点突变；f l t 3 i t d 突变是一不利的预后因素，主要影响 a m l 患者的长期生存，具体表现为缓解时间短，无事件生存( e f s ) 率、 总体缓解( o s )率较低。n p m l 基因突变是正常核型a m l ( n o r m a l k a r y o t y p ea c u t em y e l o i dl e u k e m i a ，n k a m l ) 中最常见的突变类型，在 n k a m l 中发生率约为4 6 至6 2 ，在m d s 中的突变率约为2 5 ， 远低于在a m l 中的表达，且大多见于异常核型的患者，尤其高表达于5 q 综合征，最常见的突变形式为突变a ，占所有突变的7 5 - - 8 0 。在野 生型n p m 核苷酸序列的9 5 6 - - 9 5 9 位置上，插入t c t g 四核苷酸重复构 成。 基于以上研究背景，本实验选取临床a m l 及m d s 病例标本，检测 患者f l t 3 基因突变及n p m l 基因突变情况，探讨f l t 3 基因及n p m l 基因突变与a m l 和m d s 缓解率间的关系，以期在a m l 及m d s 患者中 找到一新的缓解影响因素以及新的分子治疗靶向，以进一步提高a m l 及 m d s 的疗效率；同时由于f l t 3 基因突变及n p m l 基因突变在a m l 中 突变率较高，因此通过本实验以将其检测方法进一步推广到临床。 材料及方法 l实验材料 1 1 研究对象 1 1 1收集我院自2 0 0 8 年1 月至2 0 1 0 年1 0 月期间收治的初诊a m l 和 m d s 患者2 0 1 例，a m l l 2 5 例( 男6 4 例，女6 1 例) ，其中m 17 例，m 23l 例，m 42 0 例，m 32 0 例，m 4 e o3 例，m 5 a2 1 例，m s b2 3 例，中位年龄3 1 塑塞迨查 ( 1 3 - 7 6 ) 岁；m d s7 6 例( 男4 2 例，女3 4 例) ，其中r a r s8 v 4 ，r c u d1 0 例，r c m d1 6 例，r a e b 12 0 例，r a e b 22 2 例，中位年龄4 2 ( 2 5 - 8 0 ) 岁。a m l 和m d s 的诊断与疗效标准均符合张之南主编血液病诊断与疗 效标准。 1 1 2 对照组6 0 例( 免疫性血小板减少症1 0 歹t j 、巨幼细胞性贫血1 0 例、再 生障碍性贫血1 0 歹t j 、急性淋巴细胞白血病1 0 歹t j 、多发性骨髓瘤1 0 例、非霍 奇金淋巴瘤1 0 例) 。 1 2 实验试剂 ( 1 ) 淋巴细胞分离液( 比重1 0 7 7 + 0 0 0 2 ) ，购自上海第二试剂厂。 ( 2 ) 抽提d n a 试剂：基因组d n a 抽提试剂盒( 包含b u f f e rr b l 、 b u f f e rg r 、b u 艉rg l 、b u f r e rg w l 、b u f r e rg w 2 、b u f r e rg e 、p r o t e a s e 、 s p i nc o l u m nd m 、c o l l e c t i o nt u b e 和p r o t o c o ) 购自北京康为世纪生物科 技有限公司；无水乙醇购自中国上海试剂总厂。 ( 3 ) p c rm a s t e rm i x 反应试剂：购自上海生工生物工程有限公司 f e r m e n t a s 产品。 ( 4 ) 琼脂糖( a g a r o s e ) 均购自美国p r o m e g a 公司。 ( 5 ) d l 2 0 0 0 ( 购自上海生工生物工程技术服务有限公司f e r m e n t a s 产品) ( 6 ) 基因直接测序由g e n o l a b 生物技术有限公司完成，相关试剂略。 ( 7 ) 染色体检查由我院染色体研究室完成，相关试剂略。 1 3 主要设备仪器 g e n e a m p9 6 0 0 型p c r 仪 美国p e 公司 r s 一2 8 高速低温离心机德国贺利氏公司 超低温冰箱德国贺利氏公司 u v p 凝胶扫描系统美国u v p 公司 微量移液器德国g i l s o n d y y - i i i 桥式电泳仪北京市六一仪器厂 光学显微镜( c x 一4 0 )o l y m p u s 遗传分析仪( a b ip r i s m 3 10 0 a v a n t )美国a b 公司 电泳槽( d y y - i i i3i o )北京市六一仪器厂 电热恒温培养箱( h g 3 0 3 4 )南京实验仪器厂 2 实验方法 2 1 标本收集 2 1 1骨髓单个核细胞提取：留取初诊时抗凝骨髓抽吸液5 m l ，用p b s 稀释3 倍，另取无菌干燥试管数根，每根先加入f i c o l l 液5 m l ；然后在 f i c o l l 液上层沿管壁缓慢加入稀释后的骨髓液4 5 m l ，2 0 0 0 转2 0 分钟 进行离心。将试管中间白膜层转移至另一干燥无菌试管中，p b s 洗涤一 遍，进行细胞计数，将细胞分装成每管5 1 0 6 1 1 0 7 个，置于- - 8 0 冰 箱中保存备用。 2 1 2 对照组标本为实验进行过程中收集的患者初诊骨髓液1 2 m l ，标 本即刻用于d n a 抽提。 2 2 骨髓单个核细胞的d n a 抽提 ( 1 ) 将标本取出，取2 0 0 u l 样本，当骨髓样本小于2 0 0 u l 时可加入b u f f e r g r 补足至2 0 0 u l 后进行后续试验。 ( 2 ) 向以上溶液中加入2 0 0 u lp r o t e a s e ，混匀。 ( 3 ) i n 样品中加入2 0 0 u lb u f f e rg l ，颠倒混匀1 5 次，剧烈震荡至少1 分 钟。 ( 4 ) 5 6 孵育1 0 分钟，期间颠倒混匀数次。 ( 5 ) 加入2 0 0 u l 无水乙醇，颠倒混匀1 0 次，随后剧烈震荡。 ( 6 ) 将步骤( 5 ) 得到的溶液转移至t j s p i nc o l u m nd m 中( s p i nc o l u m nd m 放入c o l l e c t i o nt u b e 中) ，8 0 0 0 x g 离心1 分钟，弃掉收集管中废液，将s p i n c o l u m nd m 放回c o l l e c t i o nt u b e 中。 ( 7 ) 向s p i nc o l u m nd m 中加入5 0 0 u l b u f f e rg w l ( 使用前检查是否加入 乙醇) ，8 0 0 0 x g 离心1 分钟，弃掉收集管中废液，将s p i nc o l u m nd m 放回 c o l l e c t i o nt u b e 中。 ( 8 ) i 句s p i nc o l u m nd m 中加入7 0 0 u l b u f f e rg w 2 ( 使用前检查是否加入 乙醇) ，8 0 0 0 x g 离心1 分钟，弃掉收集管中废液，将s p i nc o l u m nd m 放回 c o l l e c t i o nt u b e 中。 ( 9 ) 将s p i nc o l u m nd m 放回c o l l e c t i o nt u b e 中，最大转速离心3 分钟， 将s p i nc o l u m nd m 室温放置数分钟，彻底晾干。 ( 1 0 ) 将s p i nc o l u m nd m 转入新的1 5 m l 离心管中。向吸附膜中央位置 悬空滴加1 0 0 u l b u f f e rg e ，室温放置5 分钟，8 0 0 0 x g 离心2 分钟，收集d n a 1百一一 溶液，为提高回收d n a 的浓度，将此收集的d n a 溶液再次移到s p i n c o l u m nd m 中，向吸附膜中央位置悬空滴加l o o u l b u f f e rg e ，室温放置5 分钟，8 0 0 0 x g 离心2 分钟，收集d n a 溶液。d n a 产物置于一2 0 。c 保存。 2 3新鲜骨髓抽吸液标本的d n a 抽提 2 3 1 加3 0 0 p 1 骨髓液于一个含9 0 0 p 1 坌细胞裂解液的1 5 m le p 管中，颠 倒混匀，室温放置1 0 m i n ，期间至少颠倒一次。 2 3 2 取2 0 0 u l 样本，按照( 二) 中所述的( 2 ) 以后的步骤进行d n a 抽 提。 2 4d n a 抽提物的半定量检测 取d n a 抽提物4 山，加上样缓冲液1 山，在2 琼脂糖凝胶( 含e b ) 上电泳，1 l o v ，4 5 m i n ，用u v p 凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果， 用凝胶图像分析系统( g e l p r o a n a l y z e rv e r s i o n3 0 ) 分析提取结果。 2 5f l t 3 i t d 突变检测 2 5 1 引物：引物有上海生物工程公司合成，产物片段大小约3 2 9 b p ： 上游引物：5 g c a a l t r a g g t a t g a a a g c c a g c 3 下游引物：5 - c t t t c a g c 棚t g a c g g c a a c c 3 2 5 2 p c r 总反应体系2 0 1 a l ，+ 如下： d n a 模板 p c rm i x 上游引物 下游引物 8 肛l 1o 肛l 1p l 1 “l 总体积 2 0 p l 2 5 3p c r 反应条件：9 5 预变性5m i n ，9 4 3 0 s ，5 8 3 0 s ， 7 2 3 0 s ，循环4 0 次，7 2 延伸5 m i n 。 2 5 4 琼脂糖凝胶电泳：取其中4 肛lp c r 产物与8 1 x ll o a d i n g 缓冲液相互 混匀，在4 o 的琼脂糖凝胶上( 含l t g m l 溴化乙锭) 进行电泳，1 1 0 v ， 4 5m i n ，紫外灯下观察，野生型f l t 3 基因扩增片断为3 2 9 b p ，若出现大 于3 2 9 b p 的条带即为f l t 3 i t d 突变阳性。 2 6n p m l 突变检测 2 6 1引物如下： 上游引物：5 t t a a c t c t c t g g t g g t a g a a t g a a 3 壁霾迨耋 下游引物：5 - t g t t a c a g a a a t g a a a t a a g a c g g 一3 2 6 2 p c r 总反应体系2 0 山，如下：一 dna模板8 l x l p c rm i x1 0 山 上游引物 1p l 下游引物 1p l 总体积2 0 t l 2 6 3p c r 反应条件：9 5 预变性5m i n ，9 4 3 0 s ，5 8 3 0 s ，7 2 3 0 s ，循环4 0 次，7 2 延伸5 m i n 。 2 6 4 取其中8 1 x lp c r 产物与4 1 x ll o a d i n gb u f f e r 相互混匀，在4 o 的琼脂 糖凝胶上进行电泳，1 0 0 v ，4 5 m i