（植物病理学专业论文）原子力显微镜在细菌研究中的应用.pdf

英文缩写及中文对照表 y9 0 6 0 0 9 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：盘l 戳， 导师签名：翟笠左己 日期：2 竺互7 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 在生物学中的应 用发展迅猛，主要在于a f m 在研究生物学材料时有几个优于普通显微镜技 术的好处。例如，a f m 可直接对大多数生理状态的生物学分子和细胞进行 成像，并且不需要样品的繁琐处理，以分子分辨率可获得样品表面形貌结 构的三维图像。 许多学者使用a f m 已在微生物学方面进行了广泛研究，包括形貌观 察、药物机制的探讨、如弹性等表面性质的研究、纳米机械运动的实时检 测等。a f m 尤其在细菌样品上研究得较多，这是因为细菌的通常尺寸( 岫) 也正适合于用a f m 进行研究。据文献资料，细菌a f m 制样还存在问题，富勒 醇对细菌的作用效果还未见报道，等等。鉴于此，本文使用新技术a f m 就 细菌制样、戊二醛在细菌上的固定作用效果、富勒醇等物质对细菌的作用 机制、枯草杆菌的自溶等内容进行了初步研究。本论文的主要研究结果如 f 下： 1 本文首先选择了在烟草植株上普遍发生并引起毁灭性病害的烟 草野火病菌，系统研究了该菌在不同衬底上的粘附固定效果，寻找到更为 简便有效的制样衬底a p t e s 一云母：并验证了a p t e s 一云母衬底对另一种g 一 细菌棉花角斑病菌和一种g + 细菌枯草杆菌亦获得较好的结果。 2 使用a f m 评价了戊二醛在不同细菌上的固定效果。研究结果表 明，戊二醛固定后，a f m 观察结果发生了明显改变，包括细菌高度增加、 表面皱褶的出现和更清晰图像的获得。 3 具有潜在应用价值的富勒醇对烟草野火病菌和枯草杆菌的个体 大小和表面形貌未发生明显的影响，但可显著促进两种细菌的繁殖。通过 a f m 所获得这些直观结果，结合前人对富勒烯衍生物的研究结果，推测 富勒醇的作用机制可能与其自由基清除能力和胞间信号转导作用有关。 4 对自溶的过程系统观察结果表明，枯草杆菌不论是否存在于含 有c 源和n 源培养环境中，在冷激和单价阳离子存在的情况下总能发生自 细菌的原子力显微镜研究 溶。低温条件下枯草杆菌新陈代谢的不正常引起了细胞壁上自溶酶的改 变，从而暴露出来，高浓度n a + 激活细胞壁上的自溶酶，引起细胞壁裂解， 随之导致细胞壁抗膨压能力明显降低；细胞吸水膨胀，细胞膜被胀破，内 容物释放出来，最终发生细菌的完全裂解。 5 以农用硫酸链霉素和福美双为对照试剂，观察了低分子量壳聚 糖对不同细菌的作用效果。与硫酸链霉素和福美双相比，壳聚糖的抑菌效 果稍低一些，可能与其本身的结构、大小和实际作用机制有关。 关键词：原子力显微镜，细菌，制样，自溶，富勒醇 2 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ( a f m ) ，a l s ok n o w na s s c a n n i l l gf o r c e r n i c r o s c o p y ，w a sd e v c l o p e d m i t i a l l ya s a ni n s t m m e n tt o s t u d yt h es l 】r f h c e t o p o g r a p h yo f m a t e r i a l b e c a u s eo fi t sp o w e r f h lf h c t i o n sd e v e l o p e d ，t l l ea f m h a sb e e n 、i d e l yl l s e di i lt l l ef i e l do fb i o l o g ya n db i o m e d i c i n e ，a n ds u b s t a i l t i a l a c l l i e v e m e n t sh a v eb e e no b t a i n e di nr e c e n ty e a r s s u c hr a p i de x p a n s i o no f a f ma p p l i c a t i o n si nb i o l o g yi sd u et ot h ef a c tt h a ta f mh a ss e v e r a lu 1 1 i q u e a d v a n t a g e sc o m p a r e d 诚t hc o n v e n t i o n a lm i c r o s c o p i ct e c l l l l i q u e su s e df o r s t u d y i n gb i o l o g i c a ls a i n p l e s f o ri n s t a n c e ，m o s tn a t i v eb i o l o g i c a lm o l e c u l e s a n dc e l l sc a l lb e i m a g e dd i r e c t l yu s i n ga f m ， w i t l l o u tt h es 锄p l e p r e p r e p a r a t i o no fs t a i 工l i n s h a d o w i n go rl a b e l i n g t h e e - d i m e n s i o n a i ( 3 d ) r e c o n s 锄j c t i o no f t h es a i n p l es u 血c ea tm o l e c u l a rr e s o l u t i o ni sa l s oa c h i e v a b l e p a n i c u l a r ly ，w i t ht h ev a r i o u s 印p l i c a t i o n so 虢r e db ya f m ，m u c h a t t e m i o nh a sb e e na t t r a c t e dt os t u d yt h em i c m b i a lc e l lj u r f a c e sa th i g hs p a t i a l r e s o l u t i o n ：( i ) v i s u a i i z a 廿o no fs l l r f a c eu l t r a s t m c t u r e ，( i i ) m e a s u r e m e n to f s u a c ef o r c e a n d ( i i i ) c h a r a c t e r i z a t i o no f m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，e s p e c i a l l yo f b a c t e r i at h a th a st y p i c a ld i m e n s i o n ss u i t a b l ef o ra f m a c c o r d i n gt ot h e s t u d i e si nr e c e n t y e a r s ， s o m ed i f f i c u i t i e sa s s o c i a t e dw i t h 也e s 姗p l e p r 印a r a t i o nh a v ee x i s t e d t h u s ，w ec a r r i e do u ts o m ep r e m i a r yp i l o ts t l l d i e sb y a f m ，i n c l u d i n gb a c t e r i a ls a r l l p l ep r e p a r a t i o n ，e a e c t so fg l u t a r a l d e h y d eo n s e v e r a lb a c t e r i a ，a u t o l y s i so f 三k c 讲姗j “6 f 脓，e t c t h em a i nr e s e a r c hr e s u l t s a r ea sf o l 】o w s ： 1 am o r ee 饪毫c t i v es u b s t r a t e a p t e s - m i c aw a sf o u n d i nt h e e x p e r i m e n t a p t e s - m i c ai ss u i t a b l es u b s t r a t ef o ra f mi m a g i i l zn g “如研。以黜 町觇 船p v m 6 叩fw h i c hc o u l dc a u s e 、v i d e s p r e a da n dd e v a s t a t i n gt o b a c c o 们l d f i r ed i s e a s e a p t e s - m i c ai sa l s oad e s i r a b l es u b s t r a t ef o rm es 锄d 1 e p f e p a r a t i o n o fa n o m e rg 。b a c t e r i 眦肋刚俺d m o n 础r c 日，印船护括p v 埘日 硷c g 口，“厅za n dg b a c t e r i 吼跏f z ，o 盯j “6 打z 括 2 o n eo ft h ea i r n so ft 址sm e s i si st o i n v e s t i g a t et h ea c t i v i t yo f g l u t a r a l d e h y d eo nd i 位r e n tb a c t e r i a lc e l l su s i l l g 删n l eo b s e e ds u 血c e 3 细菌的原子力显微镜研究 c o r r u g a t i o l l s 疆e rg l u t a r a l d e h y d ef i x a t i o ni n i g h tb et h e 协t r i n s i cf e a t u r eo f t h e c e uo rt h ef ea _ h l r eo fs h m t l kc e i lc a u s e db yg l u t a r a l d e h y d e 讹c hw a sl l s e dt o n xt h ec e l l m o r e o v e r ，c e l lf i x a t i o nr e s u l t e di nh e i g h tm c r e a s ea n dc l e a r e r i r n a g e s ，b u tt h em e a l lh e i g h ti n c r e m e mo ff i x e dg b a c t e r i ac e l l sw a s1 a 娼e r t h a nt 1 1 a to f 血e dg 十b a c t e r i ac e l i s ，p r o b a b i yd u et os t m c t u r a ld i 仃e r e n c e s b e t w e e ng a n dg + b a c t e r i a 3 f u l i e r e n o l ，o n en e ws u b s t a l l c e 晰t hg r e a tp o t e n t i a l 印p l i c a t i o n ，d i d n t i n n u e n c em ei n d i v i d u a ls i z e 蛆ds u r f a c et o p o g r a p h ya sr e p o r t e di np r e v i o u s s m d i e s ，b u tc o u l ds i 朗i f i c a l l t l yf 缸i l i t a t eb a c t e r i a lp m p a g a t i o n ，m i 曲td u et oi t s a b i i i t yt oe l i m i n a t ef r e er a d i c a l sa n dr e g u i a t ei n t c r c e l l u l a rs i g n a lt r a n s d u c t i o n 4 i n d 印e n d e n to ft 1 1 ec s o u r c ea i l dn s o u r c e ，丑们珊螂j “6 f 胁a l w a y s c a nb ea u t o m a t i c a l l yt r 追g e r e db yc o l ds h o c ki nm es o l u t i o nc o m a i n i n g n l o n o v a l e mc a t i o n 5 c o m p a r e dt os t r e p t o m y c i ns u l f a t ea n dt h i r a m ，t 1 el o wm 0 1 e c u l a r w e i g h tc h i t o s a np 盯c h a s e d 矗o ms 培m ap r e s e n t e dl o w e ri n h i b i t i o ne 髓c to n b a c t e r i ap r o b a b l yd u et o “ss t n l c t u r e ，m o l e c u l es i z ea n dr e a lm e c h a n j s mo f a c t i o n k e yw o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e i b a c t e r i a ：s a n l p i ep r e p a r a t i o n ：a u t o l y s i s ； 如l l e r e n o l 4 第一部分文献综述 l i t e r a t u r er e v i e w 山东农业大学硕士学位论文 第一章微生物的原子力显微镜研究进展 l 前言 微生物表面构成了外部环境和细胞间的界线，具有维持细胞形状、 控制细胞生长和分裂、抗膨压、作为分子筛和介导分子识别细胞间的相互 作用等许多重要的功能。因而，对微生物表面的结构、性质和功能的研究 是微生物学的研究熟点之一。 对微生物表面的了解可归功于过去3 0 年间电子显微镜的巨大发展。 研究者使用透射电子显微镜( t e m ) 和扫描电子显微镜( s e m ) 获得了 大量有关微生物细胞表面结构的信息。但是由于常规的电镜技术必须在一 系列样品处理后( 如干化、染色及其它特殊的处理) 和真空条件下进行， 所以不能直接观察生理状态下的活微生物细胞。近年来，尽管低温技术的 使用可使得电镜对接近生理状态的细胞结构进行高分辨率成像，但是直接 观察水溶液或培养液中的微生物细胞仍是不可能的。同样，其它细胞表面 分析方法( 如x 射线光电子波谱学、红外光谱学、电泳率等) 也往往需 要对细胞进行染色和干化等处理，同样存在有可能导致所观察结果失真的 问题。此外，这些分析一般需要大量细胞样品，因此获得的信息是平均化 的。因此，我们需要一个能以高分辨率探测单个细胞的表面和单个分子并 且不破坏其结构的新工具。 基于“近场显微镜”概念的扫描探针显微镜( s c a l l n i n 叠p m b e m i c r o s c o 口e ，s p m ) 满足了以上的要求，是对电子显微镜等技术和方法的 重要补充。s p m 记录的信息是强度信号而不是干涉信号，大大改善了仪 器设备的分辨率。作为s p m 成员之一的原子力显微镜( a t o m i cf o r c e m i c r o s c o d e ，a f m ) 由于可以应用于非导电性表面，为分析生物样品表面 的结构和性质提供了前所未有的机会。本文主要叙述近几年a f m 在微生 物学方面的应用。 7 细菌的原子力显微镜研究 2a f m 及其研究微生物的优势 典型微生物细胞的直径一般在l 微米左右( 真核细胞可超过l o o p m ) ，而大分子的尺寸在l 到几十个纳米的范围内变化。因此需要仪器设 备具有l n j n 至1 0 1 n 1 范围内的成像能力。另一方面，要确定结构与功能 的关系和观察细胞动态过程就必须在近生理条件下进行成像。由b i 皿i g 等于1 9 8 6 年发明的原予力显微镜( a f m ) 完全满足了这些要求，为研究 微生物表面结构和性质提供了重要的技术手段。 与传统的光学显微镜通常依赖于入射光束的成像原理不同，a f m 是 通过感受尖细探针与样品表面间的力获得图像，因此不受光衍射的限制， 从而大大提高了分辨率。a f m 可以高分辨率、实时地、在生理状态下和 以最小量的样品制各等优点提供样品表面超微结构的三维图像。用a f m 获得的信息主要是个体水平上的，而大多数其它技术和方法获得的结果是 大量生物样品的平均信息。在与微生物相容的液态环境下原位获得的图像 和力曲线可提供定量的形态信息，尤其是高的垂直分辨率。a f m 不仅仅 是一个获得表面结构的成像工具，而且可利用悬臂的高灵敏性测得微生物 样品的物理性质( 如表面亲疏水性、表面电荷性质和弹性等) 和分子间 的相互作用( 如分子键联作用) 。这些性质的获得能够让人们更清楚地了 解微生物表面结构与功能的关系。 3 a f m 样品制备技术 与其它显微镜技术一样，制样同样也是a f m 技术的关键所在，直接 关系到所得结果的真实性。尽管较早地认识到a f m 在研究动物细胞方面 的潜力( h 苴b e r l e we t a l ，1 9 9 1 ) ，但是由于样品制备方面的困难，早期a f m 在微生物细胞方面尝试是很有限的。与动物细胞不同的是，微生物细胞具 有一定的刚性以及不具有在衬底上铺展的性质，造成了细胞和衬底间的接 触面积较小，从而导致在探针扫描过程中细胞被移动，产生假像。迄今， 不同学者因研究对象不同，采取的固定方法各有差异。 8 山东农业大学硕士学位论文 3 1 微生物样品的预处理 用a f m 观察样品获得高质量的图像及其性质需要高纯度( 或洁净) 的微生物样品，故要去除培养基成分及微生物向胞外分泌的物质。对于在 液态培养基中培养的细菌，多采用反复离心和冲洗的方法进行预处理。对 于固态培养的细菌，报道得较少。l i s t e r 等( 2 0 0 1 ) 直接刮取d p f 月d c c 瑚 ，砌d 幽r 日胆s 菌苔，置于衬底不锈钢上，依次在丙酮、乙醇和d i 水中利用 超声波对样品进行了预处理，最后加一滴水使细菌在衬底上均匀地铺散 开，然后风干镜检。 3 2 衬底的选择和修饰 制样中最为关键的步骤是如何把生物样品固定在衬底上，以保证在 成像过程中不发生移动。由于研究对象不同，固定的最适条件差别很大， 现在研究者选用的衬底及衬底修饰剂等各有不同，但还没有更为广谱的制 样方法。迄今，选用的衬底有云母、玻璃、不锈钢片( l i s t e rt ee ta 1 ， 2 0 0 1 ) 、聚苯乙烯塑料( b m n oc v a nd e r a ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 等。其中，云母 多被多聚赖氨酸( p 0 1 y l 1 y s i n e ) 或凝胶所修饰，不同学者操作的具体步 骤也不甚一致( d o k t y c zm je ta 1 ，2 0 0 3 ；b o l s h a k o va ve ta 1 ，2 0 0 1 ；a m a l d o d a s i l v aj r e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。对于玻璃衬底，直接使用( 山l d e r s o n r ce ta 1 ， 2 0 0 4 ；b r a g a p ce ta 1 ，1 9 9 8 ) ，也可用聚醚酰亚胺( p o l y ( e m e r i m i d e ) ，p e i ) ( v 毫1 e g o lsbe ta 1 ，2 0 0 2 ；v e l e g o lsbe ta 1 ，2 0 0 3 ：b u r k sga e ta l j ，2 0 0 3 ； r a z a t o s ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 、硅烷化试剂( a b u l a i l n ie t a l ，2 0 0 2 ) 等进行修 饰后使用。 3 3 细胞在衬底上的固定 迄今为止，不同的研究者对于微生物细胞进行固定采取了不同的方 法。最为简单的方法是，用移液器吸取5 - 1 0ul 的细胞悬浮液滴加到新剥 离的云母或者玻璃衬底( a n d e r s o nr ce ta 1 ，2 0 0 4 ；b r a g apce ta 1 ，1 9 9 8 ) 上并在空气中干燥或者用氮气吹干。较为优化的方法是对玻璃、云母等衬 9 细菌的原子力显微镜研究 底进行修饰以提高其粘附细胞的能力。d o k 时c z 等( d o k t ) r c zm je ta 1 ， 2 0 0 3 ) 对固定在被多聚赖氨酸或凝胶修饰云母上的细菌进行成像，结果表 明凝胶覆层的云母表面优于多聚赖氨酸覆层的表面，并且可允许在溶液或 气体中对细菌细胞反复地进行成像观察。 用a f m 对微生物细胞进行成像的第二个问题是样品( 或探针) 的垂 直运动距离一般局限于几个微米，对于大的样品表面( 如真菌孢子) 难于 成像。最为简便的固定方法是把细胞诱捕在多孔膜( y a oxe ta 1 ，2 0 0 2 ； b 0 0 n a e r t cj pe ta 1 ，2 0 0 2 ；b n l n o c v a l l d e r a a e ta 1 ，2 0 0 1 ；p e l l i n g a ee t a 1 ，2 0 0 4 ) 中。同时也避免了风干和化学处理引起表面分子的变性作用。 该固定方法简述如下，使浓缩的细胞悬浮液穿过多孔膜，细胞被温和地诱 捕在同i l 多聚膜上。然后把滤膜剪切成适当的大小，用小块双面胶将其粘 到铁片上。该方法的缺点是不适合对杆状细胞的固定，而大多数植物病原 细菌为杆状细菌。这就需要在将来的研究中建立起非破坏性的固定方法， 以对杆状微生物细胞进行固定，并力求得到更广谱的固定技术。 3 4 细胞的固定与成像模式，参数对结果的影响 细菌表面比较柔软，如细菌三日c f d c c 螂肠c 凰表面具有均匀分布的 柔软海绵网状结构，故a f m 在细菌中应用的另一主要挑战是在针尖扫描 力的作用下细菌发生一定的变形，从而导致针尖和样品间的接触点无法确 定。现在有两种方法来解决接触点的问题。一是忽略表面的长程力，即假 设针尖和细菌之间的相互作用纯粹是由细菌表面变形引起的；二是假设细 菌具有线性的弹性性质，而所有力曲线的非线性部分皆被认为是静电和空 间表面力作用的结果。有些学者对针尖可影响细菌的表面结构进行了研 究。b o o n a e n 等( 2 0 0 2 ) 改变成像参数( 如成像力、扫描速率、扫描方向 等) 研究了三邪向c c “5 肠c 廊表面的纳米形貌结构随着a f m 探针扫描条 件的改变而发生变化的情况。沟槽产生的方向与扫描方向一致，其深度随 着成像力的增加而加深。但是，沟槽的多少不随成像力的改变而变化。尽 管这些沟槽揭示了a f m 探针影响着细胞表面，但是它们也提供了有关细 胞表面纳米机械性质的信息。b 0 1 s h a k o v a 等( 2 0 0 1 ) 在多种环境( 空气， l o 山东农业大学硕士学位论文 水和细菌培养基) 中用不同的a f m 操作模式( c o m a c t 、t a p p i i l g 和m a c ) 对西葫p r f 拍抽，f 进行观察研究，结果表明在不同的成像条件下细菌大小 和表面形貌有较大差别。 4a f m 在微生物研究中的应用 起初，学者主要使用a f m 检测了包含不同二维( 2 d ) 蛋白晶体的表 面层。但早期尝试用a f m 研究微生物活细胞是失败的，这是由于微生物 细胞的a f m 固定技术未建立和细胞表面易破坏的性质所造成的。随着 a f m 设备、成像技术、制样技术等方面的发展，利用a f m 对微生物活细 胞的研究越来越多。 4 1 细胞表面细微结构的检测及表面成分的操纵 之所以细菌表面层的蛋白晶体成为高分辨率成像的完美体系，是因为 它们具有较高的稳定性和结构的规律性。a f m 可以0 5 一l n m 的侧向分辨 率和o 1 o 2 n m 的垂直分辨率对单个蛋白成像并可检测其构象变化。这些 蛋白主要包括六角组装中间体层( h p i ) ( m n l l e r dje ta 1 ，1 9 9 6 ；s t a r k m e ta 1 ，2 0 0 1 ) 、膜孔蛋白o m p f 和水孔蛋白晶体( s c h e u r m gse ta i ，2 0 0 2 ) 等。m u l l e r 等( 1 9 9 6 ) 在缓冲液中观察了吸附在新剥离云母上d e j h o c d c c 淞 r 口d 如出r 口”j 的h p i 层，分析了该层内外表面的性质，测得单层h p i 的高 度以及以不同方式形成的双层h p i 的高度，并观察到了单个h p i 的构象 变化。s l e y t r 等( 2 0 0 1 ) 综述了晶质状细菌细胞表面层的性质和a f m 在 纳米生物技术中的应用潜力。s c h e u r i n g 等( 2 0 0 2 ) 获得了膜孔蛋白o m 】) f 、 水孔蛋白一z 和噬菌调理素的构像，并从大量单分子形貌中计算出了结构 域的运动幅度。同时，一些学者在活生物样品上也观察到了其表面层的细 微结构。l i s t e r 等( 2 0 0 1 ) 原位观察到了d p f d f o c “淞阳击。出r 舰yh p i 的 晶格。因此，可以说a f m 的出现为在生理状态下直接观察微生物表面结 构提供了可能性。 另外，一些学者对蛋白质分子之间的相互作用力进行了研究。m 1 1 l e r 细菌的原子力显微镜研究 等( 1 9 9 9 ) 结合成像和操纵技术研究了d 曲加坩m d z d 幽m 埘h p i 层单 个原体间的相互作用。对h p i 层成像后，通过增加针尖样品之间的接触 力使得针尖粘附到单个原体上，结果证明拉出单体的力约为3 0 0 讧n 。而 0 e s t e r h e l t 等( 2 0 0 0 ) 对删d 6 口c r e r f “卅s 讲加甜”m 紫膜上的细菌视紫红质 进行了成像和操纵，对单个细菌视紫红质的展开过程进行了研究，发现不 同的螺旋与紫膜之间具有1 0 0 到2 0 0p _ n 范围内的结合力。 4 2 揭示细胞的动态发育过程 以低分辨率使用a f m 的显著特征是可实时地观察细胞生长和出芽等 动态过程。最近，一些学者记录了真菌孢子、酵母和细菌细胞表面的高分 辨率形貌图像，分析了结构变化与其功能之间的关系。 孢子在真菌生活史中起着至关重要的作用，这是因为孢子是真菌的 营养繁殖体，可大范围地进行传播和度过不良环境。许多休眠的真菌孢子 表面覆盖着一层规则排列的蛋白质小棒，多年来仅在干态下用电镜进行研 究。然而，最近，b r u i l oc v a nd e ra a 等( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 用a f m 研究了 爿印8 增f d f 弦盯p 孢子表面。结果表明，休眠孢子表面覆盖着一层不受扫 描探针影响的晶质状小棒层：而萌发孢子表面变得很粗糙，主要由软的粒 状物质覆盖，并受扫描探针的影响。d u 丘e n e 等( 1 9 9 9 ) 在尸 n ”p ，0 c 口p 阳 c 自叫如垆d ，f “卅休眠孢子上观察到了与彳印8 憎，盯螂o ，弦卯休眠孢子同样的 小棒层，这与早期的冰冻蚀刻实验结果相一致。然而，大部分的萌发孢予 表面是光滑的，并存在粘附力，仅局部由粗糙的颗粒状结构所覆盖着，作 者认为这些颗粒状结构是小棒层的残留物并且不具有粘附力。可看出，细 胞表面大分子的变化对孢子表面的性质及与界面间的相互作用起着重要 作用，小棒层与休眠孢子的保护和传播功能相关，而萌发孢子表面粘附力 的增加利于孢子粘附在物体表面以及利于孢子聚集，从而发生侵染。但上 边所报道的这两种真菌萌发孢子表面性质的不同反映了不同真菌间具有 一定的差异性。 酵母为单细胞真核生物，其主要的繁殖方式为芽殖，以该种方式繁 殖后在母细胞上留下芽痕。a 1 1 i m o u 等( 2 0 0 3 ) 。使用多孔膜固定酵母 山东农业大学硕士学位论文 龇c 啪，删c 8 jc p 阳v 扭曲p 细胞进行了研究，在酵母细胞表面上明显观察到 芽殖后留下的芽痕，而其它表面区域表现得均一光滑。 4 3 单细胞药物筛选及其作用机理的研究 a f m 在微生物中的另一个应用是可在单个细胞水平上研究变性剂、 抗生素、抗菌肽等药剂以及酶的作用效果，为研究它们的作用机制提供了 强有力的手段。 脂多糖( l p s ) 在g 一细菌表面形成表面层，起着选择性渗透的作用。 早在1 9 5 8 年e d t a 就被用来破坏l p s 层从而增加了细菌细胞的渗透性。从 早期的观察可以推断出渗透性主要依赖于l p s 分子和脂蛋白的密度以及 其组织结构。然而，由于缺乏描述生理状态下细微结构的高分辨率技术， 很难获得其内在机制或直接把分子甚至纳米水平的结构与所观察到的渗 透性变化联系起来。a f m 满足了这一要求。a m r o 等( 2 0 0 0 ) 获得了 西c p r f c 向c d ，f 外膜上l p s 层的图像，成千上万个l p s 分子形成l p s 束， 相邻的l p s 束紧密地组装在一起，这可在一定程度上说明l p s 层为g 一细菌 提供了有效的渗透作用。作者用a f m 观察e d t a 处理后的西c e r f c a 如c d f j ， 发现表面上的l p s 分子从l p s 束中释放出来，并导致细胞的渗透性增加。 e d t a 破坏l p s 层的机制是由于它螯合了稳定l p s 层的金属离子。也有报 道，稀土金属可改变微生物细胞的渗透性。l i u 等( 2 0 0 4 ) 使用a f m 研究 了稀土金属l a 3 + 对西拍p r f 曲衙盱的影响。结果显示，l a ”可替代稳定l p s 层的二价金属离子( c a “、m g ”) ，从而影响了l p s 层的稳定性，改变了 该层的形貌，影响了外膜的渗透性及其它功能。作者同时用s e m 和感应耦 合电浆质谱仪证实了用a f m 观察到的结果。 b 内酰胺抗菌素通过特异地干扰与肽聚糖代谢有关的酶类，改变微 生物的形貌而呈现抗微生物活性。b r a g a 等( 1 9 9 8 ) 用a f m 研究了被不同 浓度的抗生素头孢地嗪处理厨c p ，f c 自蛔f d ，垢的形态变化。s u p m m i c s 的 头孢地嗪导致了ec d 矗的死亡；而s u b m i c s 的头孢地嗪导致了e c d ，丝状 化。 在系统发生树中，包括动物在内的生物体皆产生抵抗微生物的物质 细菌的原子力显微镜研究 ( 如肽) 。自然抗菌肽参与大多数多细胞生物体的天然免疫作用，是抵抗 微生物侵染的第一道防线。现在，研究者致力于提高抗菌肽的药效及其特 异性以致于它们对微生物而不是对哺乳动物具有毒性。为了实现这个目 标，在微观水平上理解这些药剂的作用机制是至关重要的。a f m 也开始 应用于研究抗菌肽对微生物的作用效果。a m a l d od as i l v aj r 等( 2 0 0 3 ) 使 用a f m 对从蛙皮血细胞中分离出的抗菌肽p g l a 处理后的大肠杆菌 西曲州c 胁c o ，f 进行了成像并测定其细胞硬度。处理5 m i n 后，细胞壁硬度 丧失，随之而来的是形态特征的变化以及由于外膜破解造成胶囊的形成和 菌毛的脱落；3 0 m i n 的处理导致整个细胞的破裂，仅剩最下边的细胞成分 粘附在衬底上。m g ”的添加可在一定程度上抑制p g l a 的作用效果，这意 味着p g l a 是通过把m ，+ 从l p s 中替换出来而与外膜发生相互作用的。 a n d e r s o n 等( 2 0 0 4 ) 结合! m 和a f m 研究了两种抗菌肽s m a p 2 9 和 o a b a c 5 m i n i 对& 印砂7 0 c d c c 淞口“阳淞的作用效果，s m a p 2 9 引起细胞的裂解 和死亡，而0 a b a c 5 m i n i 通过干扰细胞内部的组分起到抑制细胞分裂的作 用，结果与以前其它技术和方法报道的相一致。 溶菌酶是一种自然存在于蛋白、人的唾液、眼泪或其它体液之中的 酶，能毁坏某些细菌的细胞壁，从而可用作温和的抗菌剂。b o l s h a k o v a 等 ( 2 0 0 1 ) 用溶菌酶处理西c 五p ，七触? c o ，f 后，在液态下直接观察到了该酶对 表面的降解效果以及表面刚性的丧失，并最终导致细菌形状的显著变化。 a h i m o u 等( 2 0 0 3 ) 用蛋白酶和淀粉葡萄苷酶溶液处理勋c 幽舢卅y c p j c p 旭v 括胁p 后，用a f m 间隔一定时间记录了单细胞的形貌图像。蛋白酶的 处理增加了细胞表面的粗糙度，形成了具有突出边缘的凹坑，这是因为蛋 白酶降解了甘露糖蛋白；然而对于淀粉葡糖苷酶溶液处理过的酵母细胞， 未见表面形貌的改变，这与细胞壁的生化组分有关。 4 4 细胞在固体表面的粘附作用 微生物的粘附和聚集在自然环境和生产过程中扮演着重要的角色。要 深入了解固体界面上这些微生物细胞的行为，有必要研究细胞表面的结 构、化学组分和物理化学性质。所有这些因素不同程度地影响着微生物的 1 4 山东农业大学硕士学位论文 粘附和聚集。a f m 可以高的分辨率提供有关微生物细胞表面的结构、弹 性以及分子间相互作用的详细信息。 细胞表面大分子在确定孢子表面性质和孢子界面间相互作用中起着 核心作用。因此，测定真菌孢子表面上的分子内和分子间力有助于深刻理 解其生物功能以及在生物工程流程中有效地应用微生物。如前所述，萌发 前后孢子表面性质的变化能反应出其功能的转变( b r u n oc v a nd e ra ae t a 1 ，2 0 0 2 ；d u f r e n e y fe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。b m o c v a l ld e r a a 等( 2 0 0 2 ) 在 一印昭肌姻d ，y 幽e 孢子表面与探针间获得的a p p r o a c h 曲线中，当针尖和样 品接触时，对于休眠孢子，曲线不呈现明显的长程排斥力；但对于萌发的 孢子，一直能够观察到长程排斥力。 在生产过程中细菌粘附是必须考虑的，是因为细菌粘附直接影响到细 菌生物膜的形成。同时，生物膜的形成也是牢固细胞粘附的关键环节。细 菌以生物膜的形式存在要比游离状态的细菌具有更强的抗性。细菌粘附分 为两步，一是细菌直接附着到衬底上，是可逆、非特异性的过程：二是细 菌与物体表面发生的特异性结合使得细菌粘附成为不可逆的事件，即细菌 牢固地粘附在衬底表面上。正是因为细菌表面大分子和胞外聚合物影响着 粘附和生物膜的性质和动力学，故引起了学者用a f m 对胞外聚合物( e p s ) 和细菌表面大分子进行研究的兴趣。 基于胞外聚合物在生物膜研究中的重要性，现已将其独立为生物膜基 础理论研究的一个重要的分支。现在，a f m 的研究也涉及了胞外聚合物。 k o l a r i 等( 2 0 0 2 ) 对无鞭毛和无菌毛的肌加d c d c c 船邪。抽p 删d 凰在不锈钢 和盖玻片上的粘附机制进行了研究，在液态环境下随着扫描，细胞发生移 动，但是扫描不能使细菌从表面上分离出来，并表明该细菌粘附主要依赖 于蛋白质状的e p s 。b n m oc v a d e ra a 等( 2 0 0 2 ) 在细菌生长适宜的条 件下，研究了吸附在聚苯乙烯上的e p s ，e p s 改变了衬底表面的性质，使 得衬底表面粘附力发生明显的改变；在不适于细菌生长的环境条件下，在 衬底上未发现明显的e p s ，也未发现衬底表面性质的改变。这些结果为蛋 白质状e p s 可增加细菌粘附提供了直接证据。 表面大分子覆盖在微生物细胞的表面，影响着细菌与夕 界环境间的相 细菌的原子力显微镜研究 互作用。d u 丘e n e 等( 2 0 0 1 ) 利用a f m 对细菌的表面层、真菌孢子和几 种细菌进行对比研究获得了大量的a p p r o a c h 和r e t r a c t i o n 曲线，这些依赖 于微生物种类、生理状态和环境条件的曲线反应了不同微生物的长程力、 粘附力和机械性质等物理性质有所不同。b e e c h 等( 2 0 0 2 ) 综述了利用 a f m 对微生物在金属表面上形成生物膜的研究概况。h a n n a 等( 2 0 0 3 ) 用a f m 并结合其它技术研究了西曲e ，缸 蛔c o “的包被多糖c o l a i l i ca c i d 在 粘附过程中所起的作用，结果表明c o l a n i ca c i d 不提高细菌的粘附作用， 而是阻碍了e ，f 和惰性衬底之间的特异性结合作用。s c h a e r - z 猢a r e t t i 等对不同乳酸细菌的弹性和粘附性获得了f o r c e v o l 啪e 图像，对于具有表 面层的细菌，呈现较大的硬度和较小的粘附作用，这与具有蛋白小棒层的 孢子性质有相似之处：而对于无表面层的乳酸菌，呈现明显的粘着峰，这 与表面具有多糖和蛋白质成分相一致。 多数g 一细菌表面覆盖着一层起着选择性渗透的l p s 层，该层在细菌 粘附中是否起着作用得到了较多的研究。v e l e g o l 等( 2 0 0 2 ) 研究了可能 影响a f m 力曲线的因素，发现l p s 对力曲线的形状不起作用，戊二醛只 影响曲线的线性部分，静电性质对曲线非线性部分不起作用。这就意味着 非线性部分主要由于细菌表面层的变形造成的。a b u l a i l 等( 2 0 0 3 ) 研究 了l p s 在西c 8 r f 拍抽c d ，fj m l 0 9 的粘附、保持和转移等生命过程中所起 的作用，用e d t a 部分地去除表面l p s 后细胞与针尖间的粘附性能发了 生改变，并且处理后的细菌与针尖间的排斥力减小。b u r k s 等( 2 0 0 3 ) 用 a f m 在不同长度的l p s 的血c e ，f c 厅胁川f ( 1 2 细胞上获得的力曲线基本 上相同。同时，结合其它技术研究表明，l p s 的分子长度并不是该菌在多 孔基质中粘附的唯一决定因素。 4 5 细胞的弹性等机械性质的测定 a f m 可以测量整个或局部微生物细胞的纳米机械性质。机械性质直 接体现了微生物细胞的表面结构与性质功能间的关系。h e n n yc v a i ld e r m e i 等( 2 0 0 0 ) 通过a f m 研究了原纤维和无原纤维链状球菌的表面柔性， 从力曲线中可得出无原纤维菌株比原纤维菌株的硬度大得多。t o u h a m i 等 1 6 山东农业大学硕士学位论文 ( 2 0 0 3 ) 测得了酵母曲 口，d 例坩e s 卯旭v 括曲p 芽痕处硬度为周围细胞表面 的1 0 倍，分别为6 1 2 ，4 m p a 和o 6 o 4 m p a ，这与芽痕处壳多糖的积聚 有关联。 有一种使用a f m 测定细胞壁弹性的方法，即用a f m 针尖向固体表 面的凹槽内压生物样品，从而获得细菌细胞壁的弹性。x u 等( 1 9 9 6 ) 测 定产甲烷细菌胁历口肘唧驴f 盹坍 “，强口f 口f g p l 鞘的弹性模量为2 1 0 1 0 至4 1 0 1 0 n m 2 。在一定压力作用下鞘才可延伸。其渗透性也随之增加，这说 明只有当细胞内的压力达到一定量值时细胞才释放出甲烷气体( 在生理状 态下) 。y a o 等( 1 9 9 9 ) 使用a f m 测得了风矗c 盯f c 矗胁，fk 1 2 和 a p “如朋d n 珊o g ，咏加础dp a 0 1 胞壁质的厚度和弹性。风干的ec o ，珂p 卯，躲加。阳引孢壁质的厚度分别为3 0 m 和1 5 m ，水化的胞壁质的厚度是 风干的二倍。水化的e “胞壁质弹性模量为2 5 1 0 7n m 2 ，在移去针 尖后胞壁质恢复到原来状态：而干化的ec o ，f 胞壁质弹性模量在3 1 0 8 至4 1 0 8 范围内，并且针尖时常会破坏胞壁质。当胞壁质的长轴与凹槽 平行时，不易发生变形，这与肽聚糖在细胞壁上的走向相一致。 另外，a f m 的高灵敏性可以被用来测定局部的纳米机械运动，p e l i i n g 等( 2 0 0 4 ) 在勋c c 向伽m y c e sc p 撑v 捃抽p 细胞壁上测得了依赖于温度并具有 特征频率的局部纳米机械运动，根