（森林培育专业论文）岷江百合植株再生技术研究.pdf

摘要 良好的植物再生体系是进行遗传转化改良的基础，本试验对岷江百合( l i l i u mr e g a l e ) 的 组织培养技术进行了研究，其结果如下 l 鳞片在1 2 m s + b a 2 0m gl “十na a1 0m g 一诱导愈伤组织效果最佳，分化率达9 3 3 3 。 在培养基1 2 m s + 2 ，4 一d 3m g l + b a l0m g l 。+ g a 0 ，1m g l 。中分化率虽然较低，但是也同 样有利于继代培养。以花丝为外植体进行愈伤组织诱导，愈伤组织诱导培养基为m s + b a 0 ，5 m g 。l + n a a l 0m gl - t , 分化培养基也是m s + b a 0 5m g l 一+ n a a l 0m g l 。 2 继代培养：将能诱导出不定芽的鳞片切成带芽小块，接入不同的增殖培养基中，培养2 5 3 0 d 后，便形成芽丛，结果以1 2 m s + b a l 0m g l + n a a 0 1m g l 一1 效果最佳，增殖率为6 8 0 。 3 生根培养：1 2 m s + n a a 0 0 1m g l + i b a o 1m g l 1 生根率和平均根数分别为8 5 2 和 55 条，1 2 m s + n a a 0 5 m g l 一+ i b a 0 0 1m g l 。1 的生根率和平均根数分别为8 7 2 和6 7 条。1 2 m s + n a a 0 1n a g l + i b a 0 1m g l 。为生根最佳配方。 4 鳞片不定芽直接诱导：一定浓度的b a 可以直接诱导百合鳞片不定芽。 5 炼苗：河砂：珍珠岩( 1 ：1 ) 组合芽苗成活率较高。 关键词：岷江百合( l i l i u mr e g a l e ) ，组织培养 前言 再合属多年生宿根草本植物，夏季开花，花色淡雅，可供观赏，栽培品种繁多，花色丰 富，百合索有“百年好合”之意，是一种优良的切花品种。百合科植物的地下鳞茎可供食 用或药用。岷江百合( l i t i u mm g d k ) 别名干叶百合、王百合，原产我国四川，现世界广泛栽培a 花丌放时浓香，喇叭形，白色，喉部为黄色，外部略带红紫色，花期6 7 月，果期9 1 0 月。 岷江百合极蒯寒，办刑碱性石狄土，是非常难得的杂交亲本。百合常规繁殖以分割小鳞茎法， 繁殖率低，由小鳞茎长到能够上市的百合大鳞茎也需要4 年左右。目前对百合的研究主要 集中在其药用价值上面，在国外更是如此。国内对百合属植物组织培养也研究得较多，但 对岷江百合的组织培养的研究较少。试验计划在岷江百合的组织培养技术的建立和优化上 进行探讨。 l 百合属植物组织培养研究概况 百合是百合科百合属( l i l i u m ) 的多年生草本植物。生产上百合常采用鳞茎繁殖法，但繁 殖系数低、速度馒，不能满足市场需求并且百合易感染病毒，百合的病虫害日益严重。用 组织培养的方法进行规模化繁殖，能在较短的时间内获得大量的优质种苗“3 。近年来，百合 的基础研究己取得重大进展。岷江百合( l i l i u m r e g a l e w i l s o n ) 在分类上属于百合科百 合属钟花组( 花瓣基部合生外形如钟) ，由英国人w i l s o n 于1 9 0 3 年8 月在四川岷江流域草丛 中发现，原产于云南和四川，性耐寒，在华北可过冬，花喇叭形，2 n = 2 4 ，多分布于海拔7 6 0 2 2 0 0 米的山谷岩缝中。 1 1 百合的花药离体培养研究 花药离体培养是研究器官发育的较好材料和手段。并已在几种主要农作物上得到广泛应 用。百合的花药离体培养始于上个世纪8 0 年代中期。郑国铝最先开展了兰州百合的花药离体 培养以及细胞穿孔行为。褚云霞等“对百合花药培养的影响因素研究显示：小孢子最适培养时 期为单核期；愈伤组织诱导率最高可达4 2 1 6 ，最佳激素组合2 ，4 - - d 3 o m g l + k t 3 ，o m g l ： 低温预处理作用不大；早分化出的花蕾中的小孢子在改良m s + n a a ( 2 0 m g l “和4o m g l 。) 易诱导产生愈伤组织；花粉植株中单倍体( n = 1 2 ) 约2 5 ，二倍体( 2 n = 2 4 ) 约7 5 。王新宇。1 对百合小孢子母细胞发育过程中细胞间形态变化研究发现：在超显微结构水平下观察到造孢 叫期细胞的壁较厚，由中膪：j 层初生和次生壁组成，细胞间的连接为典型的细胞间连丝，减 数分裂前问期的细胞壁主要由中间和初生壁组成，典型的胞间连丝消失，但局部位置上的中 问层和初生壁组分缺失，构成约2 0 0 8 0 0nm ，宽的“豁口”。此结合荧光蛋白还可以研究自 交不亲合性。 在百合的花药离体培养过程中添加一些化学物质可以研究花粉管生长过程中的一些现 象。j a n s o ne ，d ，”在研究麝香百合雌蕊分泌物对花粉管生长的试验中发现：雌蕊分泌物在开 花蓟就已在柱头和花柱中积累，并首先在胎座顶端细胞中合成。授粉后，花粉管穿过柱头进入 花桩道，并被雌蕊分泌物所包围。花粉管生长只局限在分泌细胞周围，而且在胚珠带有珠孔道 的一侧聚集成一簇。并发现受精后花粉管的生长速度变缓，花粉管的生长主要受雌蕊分泌物 的特性影响。杨中汉”。在初步研究了光对兰州百合花粉体外萌发及花粉管生长的影响后， 发现预先照光3 0 分钟促进花粉萌发也促进了花粉管的生长，并激活酸性磷酸酯酶l ，花粉中 酸性磷酸酯酶1 的出现与花粉萌发时花粉管的出现直接关联。f r i c k e re t a l “1 使用p h 敏感的 荧光技术研究麝香白合的伸长期花粉管时发现，在花粉管顶端的中空区内p h 为7 1l 并没有 稳定的p h 梯度。 1 2 细胞遗传学研究 为了揭示东北百合属( l i l i u ml ) 植物在细胞( 染色体) 水平上的遗传多样性，杨利 平”。利用常规压片方法，对东北产8 个种2 变种的百合种内不同个体及不同居群间进行了遗 传多样性研究。指出百合属种内个体及不同居群间的染色体数目变化为非整倍性，染色体 的出现频率、数量与无性繁殖的方式及能力相关。其中大花百合、朝鲜百合和垂花百合的 染色体核型公式为首次报道。三倍体卷丹的结实现象及所得种子中染色体数目也为第一次 观察汜录。 植物在细胞( 染色体) 水平上的遗传多样性需要有大量的营养细胞和精细胞，制各这两 种细胞就成了一项技术。朱广廉州把新鲜的或低温贮存的兰州百合伍i 池d 鲫i d i i d “c h ) 花 粉，在b k s l 5 中萌发，分别收集萌发5h 和3 0 h 的花粉管，采用低渗冲击胀破和密度梯度纯 化等方法，获得批量纯化的生埴细胞和精细胞。用1 0 三氯乙酸和丙酮沉淀制备生殖细胞 和精细胞的蛋白质，用s d s p a g e 对两种细胞蛋白质进行比较。结果表明，二者在蛋白质 组成成分上没有明显差异；但在蛋白质的含量上有两种成分差异显著。近年来结合分子生 物学手段和显微操作技术，挑取单条染色体进行体外p c r 扩增，来判断染色体上基因分布 和功能。这一技术经过改进已在百合发育生物学上取得较大的应用。 1 3 叶片离体培养研究 由于百合叶片量大，所以丌展这方面的研究也就很有必要，l i u 和b a o 采用3 种百合基 因型的叶片，在m s + 1 7 ，7 6 u m o l l b a + 4 9 2 u m o l l i b a 上，其中一个基因型获得9 0 以上的 再生率以及4 个芽每个外植体以上的增值率。袁芳亭对麇香百合( l i l i “m 肠p 枷脚 7 h u n b ) 叶片进行离体培养，并成功获得无菌苗，试验结果表明：培养基m s + b a 0 1 m g l 一1 + n a a 】，0 m g “。适于初代培养，有助于根和芽的分化；m s + b a 05 m g l 1 + n a a i5m g l 1 适于 增殖培养，利于愈伤组织的产生，并促进芽的分化；生根培养基为1 2 m s + n a a l 0m g - l “+ 多效哗1 0 m g l ；当试管苗根长t c m 时移栽易成活。 刘选明、在百合鳞叶细胞形态发生中对胚性细胞进行电镜观察发现：当百合鳞叶细胞 培养在| j f i j 加1 2 m g - l - b a 的m s 培养基上进行直接器官型形态发生，在附加2 m g l - 2 ，4 d 的s 培养基上进行愈伤组织器官发生型形态发生。电镜观察发现：两种不同途径中胚 性细胞的超微结构有明显差异。器官型中胚性细胞形态相似，排列整齐规则，核大，叶绿 体结构完整，线粒体与淀粉粒在胞质中分布有规律，但在器官发生型中胚性细胞之间形态 有差异，排列不整齐，细胞器在胞质中无明显分布规律，在数量上除淀粉粒外比器官型丰 6 甫o 1 4 百合鳞片愈伤组织诱导及离体培养研究 百合鳞片愈伤组织可以为体细胞胚研究提供分析用材料并扩大繁殖系数孙君社”采 用单因子试验，分析比较了细胞分裂素b a ，生长素2 ，4 一d ，生长素n a a 等3 种植物激素 对百合鳞茎愈伤组织生长的影响。试验结果表明，诱导愈伤组织的最佳培养基为m s + b a 0 0 5 r a g l 。+ 2 ，4 一d 1 o m g l + n a a 0 1 m g l 一，b a 的质量浓度为1 0 m g 一时有利于 芽的形成，n a a 质量浓度为0 0 5 r a g l 。时有利于形成小鳞茎。傅玉兰“。以麝香百合r o c c o 品种的试管鳞茎为试材，研究低温、植物激素、糖以及培养期间的光照强度等因素对鳞茎 繁埴的影响。结果表明，预先使培养材料接受8 为期2 0 d 的低温过程，采用m s + 0 5 m g l - l b a + o 1 m g l - 1 n a a 的培养基，并添加2 的糖，对试管鳞茎增殖有明显的促进 作用。并发现，在培养期唰5 0 0 2 3 0 0 l u x 的光照强度范围内，试管鳞茎的增殖与光照强弱 无明显的相关性。唐蓉川利用气培技术对百合鳞片进行培养。结果表明：气培1 4 1 6 天， 鳞片基部形成愈伤组织，1 6 1 8 天小鳞茎开始分化形成，2 0 2 7 天，鳞茎分化率在9 0 以 上，7 0 天时，每片鳞片上小鳞茎数目为2 4 个，最多的达7 个；小鳞茎分化一周后，鳞茎 基部丌始生根，以后出现根毛，根分化率在9 0 以上；4 0 天时，小鳞茎顶部开始抽生叶片。 刘选明。，对龙牙百合鳞片直接形成不定芽和体细胞胚的培养及不定芽直接发生的生理生化 特性测定结果表明；在m s 培养基中添加一定浓度的b a 可以诱导外植体直接分化不定芽。 2 试验目的与意义 百合的组织培养快速繁殖研究早已受到重视，国内有黄敏玲”、井忠平“、马惠“”等关 于百合组织培养的报道。目前这些研究都未涉及到百合小鳞茎的培养复壮以及影响小鳞茎 今后提i h 丌花的因素。以岷江百合的鳞片，花丝为外植体，探索影响百合小鳞茎培养复壮的 因素，寻找其最适宜的培养基配方，及提高繁殖系数的方法。为岷江百合组培苗进入工厂化 生产提供依据”。在查阅有关文献的基础上，本试验重点研究这种百合的快速繁殖的技术环 节，最优的外植体类型以及离体培养条件的优化。通过再生植株并且观察离体再生过程中所 发生的一些形态学变化。 3 材料与方法 3 1 试验材料 取材于四川农业大学林学系植物园内种植的岷江百合植株和球茎，外植体类型有鳞茎内 铡鳞片，花丝。于2 0 0 1 年秋收集百合的球茎于荫凉处保存，在2 0 0 2 年4 月取出开始剥取鳞 片培养。各种外植体用自来水冲洗2 个小时后，酒精浸泡3 0 s ，随后用升汞( 0 1 ) 消毒5 m ， 然后用无菌水洗涤3 5 次。培养条件：温度为2 5 。c ，每天光照1 4h ，光照强度2 0 0 0 l u x 。 3 2 技术路线 根据试验目的和计划确定技术路线，重点研究这种百合的快速繁殖的技术环节，最佳外 植体类型以及离体培养条件的优化，选出较优技术参数组合，建立离体再生系统。 外植体卜芽( 单芽或丛芽) 小芽丛p 丛枝+ 壮苗枝 壮苗一出圃苗+ 一营养袋苗一完整小植 3 3 试验方案 3 3 1 岷江百合鳞片、幼叶、珠芽愈伤组织诱导及不定芽分化试验 3 3 1 1 初代培养 把鳞片、幼叶、珠芽几种外植体接种于1 2 m s + 2 ，4 - d 1 0 m g l - i + b a 0 5 m g l - j n a a i m g 。l 。培养基上，进行不同外植体类型的分化比较后选取较好的外植体类型( 表1 ) 。接 种于表2 所示的培养基后观察愈伤组织诱导及其分化率。培养基盐浓度为1 2 m s ，培养4 5 d 后统计结果，不定芽分化率= 产生不定的鳞片数接种数。 表l 不同外植体类型的分化比较 外植体类型夕 植体数 珠芽 幼叶 鳞片 5 0 5 0 5 0 4 表2 不同外源激素组合对岷江百合鳞片愈伤组织诱导及其分化率的影响 编号外源激素m g l + 3 31 2 继代培养 经过初代培养后获得的鳞片愈伤组织。采用二因素三水平全组合试验设计( 表3 ，表4 ) ， 每次接种3 0 个外植体，重复2 次。在选出较优增殖激素组合后，采用m s 、改良m s 、b | 、n 。 培养基( 大量元素及用量见表5 ) ，在表6 上观察鳞片外植体愈伤组织在不同基本培养基上 的增殖效果，3 0 天后观察。( 如无特殊说明，琼脂均为7 9 一，糖为2 0 9 l 1 ) 表3b a ，n a a 水平表 表4 岷江百合继代增殖培养全组合设计表 试验号b a m g 一 n a a m g l 9 l ( 1 o )1 ( 0 0 1 ) 】01 2 ( 0 1 1 1 1l 3 ( 05 ) 2 2 ( 20 ) i 1 32 2 1 42 3 1 5 3 ( 3 0 ) 1 1 63 2 l73 3 湍燃黼 群豢黑一 ( 十 ， o + 2 一眺舢一删 朋 一 m 表5m s 、改良m s 、b 5 、n 6 培养基大量元素及用量一览 成份m gl 7 m s改良m sb 5n 6 表6 鳞片外植体愈伤组织在不同基本培养基上的增殖效果 激素m g l 1 8m s + b a l0 + n a a 0 1 1 9 改良m s + b a l 0 + n a a 01 2 0b ；+ b a i 0 + n a a 0 1 2 1n “+ b a l0 + n a a 0 1 3 3 1 3 瓶内生根 表7 瓶内生根培养基配方一览 编号基本培养基 n a a ( m g l “)i b a ( m g l 。)空列( 对照) 2 21 ( m s )1 ( 0 0 1 ) 1 ( 0 0 1 )1 2 312 ( 0 + 1 )2 ( 0 1 )2 2 413 ( 05 )3 ( i 0 )3 2 52 ( 1 2 m s )121 2 62232 2 72 313 2 83 ( 3 4m s )l 3l 2 932 12 3 0332 3 6 壮苗后的无根试管苗，处理激素：n a a ( m g l “) 、i b a ( m g l “) ，基本培养基：1 2 m s 、 3 qm s 、吣。进行瓶内生根培养基配方的筛选( 见表7 ) ，每个处理接种外植体3 0 个，2 次 重复，观察生根率、平均根数、平均根长。( 如无特殊浇明琼脂均为7g l ，糖为2 0g l 。) 3 ，3 1 q 瓶外生根 选择经继代后的优质苗，a b t 处理浓度见表8 ，i b 、n a a 处理浓度见表9 ，处理生根方 式及时问：外植体基部浸泡约j 秒，每次处理3 0 根。在纯砂珍珠岩= 1 ：l 上观察生根率、 平均根数、平均根长。 表8 瓶外生根中a b t 处理浓度 3 3 15 炼茁 在四川农业大学林木遗传育种试验场对瓶内生根获得的试管苗进行炼苗试验，见表l o 。 在炼苗前，把培养瓶放在温室中星期或把菌膜戳几个孔后置于温室内一周。随后取出试管 苗并用自来水洗净根上附着的培养基，栽入无菌基质中，并进行遮荫处理。基质：河砂、珍 珠岩、蛭石。基质处理：用0 1 高锰酸钾处理后再高压灭菌，在3 0 天内观察生长情况。 表l o 不同基质对炼茁成活率的影响 基质 河砂 河砂：珍珠岩i ：l 珍珠岩：蛭_ ii ：l 3 3 2 岷江百合花丝外植体不定芽诱导试验 3 ，3 2 1 不同激素组合对花丝愈伤组织诱导的影响 岷江百合花丝接种于表ii 的培养基上，观察不同激素组合对花丝愈伤组织诱导的影响 接种莳处理和鳞片外植体相同。 表l l 岷江百合花丝愈伤组织诱导 3 3 2 2 不同激素组合对花丝愈伤组织分化不定芽的影响 挑选致密的花丝愈伤组织接种于表1 2 培养基上观察分化情况。 表1 2 不同激素组合对花丝愈伤组织分化为不定芽的影响 激素绸合m g - l 1愈伤组织接种数 b a io + n a a o 5 b a t o + n a a o2 b a 2o 十n a a o5 k t 2 o + n a a o5 5 0 5 0 5 0 5 0 k t lo + n a a o 2 5 0 3 3 3 岷江百合鳞片直接形成不定芽试验研究 将消毒后的鳞片，切成1cm 2 方块，接种到附加不同激素种类与浓度组合的表1 3 所示i 2 m s 培养基上，重复两次。在l 2 m s 培养基上培养2 0 天后统计，分化率= 分化为不定芽的 外植体数总外植体数，其中接种到培养基( 5 1 2 号) 培养基前，进行2 ，4 - d 稀溶液预培养 3 0 m 。培养基中蔗糖3 ，琼脂0 7 ，p h 5 8 。器官发生采取一步培养法，光照强度为2 0 0 0 l 1 】x 。 表1 3不同激素浓度组合对百合鳞片细胞脱分化与分化的影响 3 3 4 试验结果观测与数据统计方法 愈伤组织分化率= 产生愈伤组织开始有不定芽出现的鳞片数外植体总数。 愈伤组织发生率= 产生愈伤组织数外植体总数。 平均外植体分化芽数= 不定芽总数分化不定芽的外植体总数。 生根率= 生根株数栽植的总株数。 炼苗成活率= 成活苗株数炼苗总株数。 采用e x c e l 。软件分析数据。 4 结果分析 4 1 岷江百合鳞片、幼叶、珠芽愈伤组织诱导及不定芽分化的结果分析 4 1 1 外植体的选择 珠芽、幼叶、鳞茎内侧鳞片接种在1 2 m s + 2 ，4 - d 10 m g - l 。十b a 0 5 m g - l n a a im g l 1 上观察愈伤组织诱导及其分化情况，结果如表1 4 所示。 表1 4 不同外植体类型的分化比较 出表1 4 可知：采用不同的外植体最后得分化率差异很大，外植体的平均分化芽数不尽相 同。鳞茎内侧鳞片是较好的外植体类型，愈伤组织分化率达到4 2 ，平均外植体分化芽数可 达23 个。 4 1 3 鳞片外植体愈伤组织不定芽的诱导 试验结果如表i 5 所示。鳞片在培养基上l o 1 5 d 后开始膨大增厚，继而周围出现浅绿 色颗粒状的愈伤组织( 图版1 ) ，约1 个月后，从愈伤组织上分化出淡绿色的芽丛，并逐渐长高 ( 图版2 ) 芽丛生长约半个月绿色叶片展开后，随后将外植体切成带3 4 个芽的小鳞片，仍旧 转接到2 号和7 号培养基上进行增殖培养。1 0 1 5d 后每块小鳞片又可分化形成丛芽，增值 系数3 4 ，1 个月后可继代培养1 次。结果以2 号1 2 m s + b a 2 0m g l 1 + na a 1 0 m g l 。 增殖效果最佳，分化率达7 3 3 3 ，其愈伤组织较致密呈浅绿色粒状，分化出的不定芽色泽鲜 艳。在7 号1 2 m s + 2 ，4 一d 3 0m g l - , + i b a l 0m g l - + g a o 1m g l “中分化率也较高，但是愈 伤组织呈松软浅绿色粒状，分化出的不定芽质量比2 号培养基好一些。可见愈伤组织诱导培 养基同时也是分化培养基，由于各种培养基中均添加了细胞分裂素，随着生长素浓度的下降， 细胞分裂素作用就显现出来。可以看出，在b a 和n a a 浓度相同的情况下，随着2 ，4 - d 浓度的 升高，鳞片的分化率在不断升高，但当2 ，4 一d 的浓度达到3m g 时( 7 号培养基) ，鳞片的分 化率达到最高，再继续提高2 ，4 一d 的浓度时，鳞片的分化率逐渐降低，低浓度b a 的诱导培养 基，对鳞片诱导出芽都有一定效果，随着b a 浓度的升高，诱导效果反而有下降的趋势，其中以 7 号培养基诱导出芽效果最好。使用2 ，4 一d 30n a g 一+ b a l 0m g l 。分化率较高，添加g a o 1 m g 一有利于其鳞片的分化。说明添加适当浓度的g a 能促进植物器官的分化。 1 0 表1 5 不同外源激素组合对岷江百合鳞片愈伤组织诱导及其分化率的影响 编号外源激素m g l “ 愈伤鲔织质量脱分化鳞片数 不定芽分化率 一一一一1一一一q一 l2 ，4 - d i + b a o5 + n a a i疏松浅黄色颗粒8 5 3 3 2b a 2o n a a l0较致密浅绿色粒i l 7 3 3 2 4 - d 5 + b a o5 + n a a l 24 一d 7 + b a o ，5 十n a a i 2 4 - d i o + b a o 5 + n a a i 2 ，4 - d 5 + b a o8 + n a a o 5 24 - d 3b a l0 十g a o 1 2 4 一d 0 2 5 + b a 2 o + g a o1 蓬松，褐色 松软，褐色 松软，褐色，水浸 松软黄褐色水浸 松软浅绿色粒状 松软水浸状 5 3 3 3 33 2 0 0 0 6 6 6 9 3 ，3 4 66 4 1 4 鳞片愈伤组织的继代培养结果分析 41 4 i 不同b a 和n a a 组合对愈伤组织的不定芽增殖的影响 就b a 和n a a 组合通过全组合设计筛选出最佳增殖培养基，试验结果见表1 6 ，1 7 。 表1 6 岷江百合鳞片外植体继代增殖培养试验结果及极差分析 编号b am g l 1n a am g l 1 增殖系数芽丛生氏状况 l ( 10 ) i 1 2 ( 20 ) 2 2 3 ( 3 0 ) ：j 3 68 1 04 1 28 1 ( 0 0 i ) 2 ( 0 1 ) 3 ( 05 ) i 2 3 l 2 3 87 1 0 6 1 07 l2 22 3 4 2 8 4 4 3 2 4 7 4 0 4 1 矮苗，量少 粗壮 徒长苗，纤细 芽多，且短 高度中等壮苗 纤细苗 生长旺 纤细苗 纤细苗 盛壮苗 芽少 极差6 02 0 注：每个处理接种3 0 个外植体 8 5 3 m m 7 3 4 一b 6 n ， 8 9 m u 他 h 坫 m n l ， 表1 7 增殖系数方差分析表 可以看出，b a 浓度在20 r a g 【，“和3 0m g l 。这两个水平上增殖效果明显，芽苗生长 较好。当b a 浓度由10m g l _ l 逐步增加2 , 0m g l 。时，月增殖系数明显增加，并且在9 1 1 号和】2 】4 号中，当b a 浓度不变时，增殖系数随n a a 增加而增加，且n a a 在0 1 m g l 1 水平上芽苗生长良好。当b a 浓度为2 0m g l 。1 时增殖系数明显增加，可见芽的增殖与较高 的b a 浓度有关。b a 浓度在0 0 5 水平上显著，是影响增殖的主要因子。n a a 对不定芽的增 殖作用不显著。b a 为3 0m g l 1 时增殖系数增加不明显，但也保持较高水平。因此1 5 号 培养基1 2 m s + b a 3 0m g l + n a a 0 o lm g l 。为最佳培养基。b a 为3 0m g l “时随n a a 增加反而呈下降趋势。可见细胞分裂素对百台不定芽的增殖效果明显，促进细胞数目的增加。 b a 和 x a a 组合取得较好的增殖效果。 4 1 4 2 鳞片外植体不定芽在不同基本培养基上的增殖效果分析 在选出较优增殖激素组合1 2 m s + b a 3 0m g l - + n a a 0 0 1m g 一为最佳不定芽培养基后， m s 、改良m s 、b 5 、n 6 基本培养基对愈伤组织的增殖及其分化的影响，3 0 天后统计，结果见 表1 8 ，侧芽和增殖系数均为平均数。 表1 8 鳞片外植体愈伤组织在不同基本培养基上的增殖效果 由表1 8 可知鳞片外植体不定芽在不同基本培养基上的增殖效果。1 8 号培养基增值系数 较高可达到43 ，并产生较多芽丛且有侧芽发生。其余三种增殖培养基的效果也还可以。说 明在继代次数较多的情况下，对花卉植物来讲，不剧的基本培养基对增殖效果影响不大。特 别是改良m s 在降低了钱态氮，相应地增加了硝态氮后，其增殖效果和1 2 m s 差别很小。 4 1 。5 生根培养 41 j ，l 瓶内生根：经过继代培养的无根苗接种在的生根培养基上，生根结果见表1 9 ，表2 0 。 表1 9瓶内生根结果 编号生根率 平均根数平均根长m m 1 54 4 2 5 3 35 8 52 7 65 8 7 2 8 6 13 2 42 43 5 3 5 5 5 1 67 】8 1 5 08 1 2 12 1 3 1 7 13 0 4 06 3 08 3 1 91 2 表2 0 瓶内生根结果极差分析表 观测值总和 基本培养基 n a a i b a 一一_ _ _ h _ _ - _ 一 t i9 l4 1 0 92 1 1 5 8 生根率 平均根数 平均根【女 2 4 8 9 3 0 ，】 2 1 8 8 1 3 8 1 73 37 1 5 135 8 5 3 2 4 3 2 2 5 】4 7 】2 9 4 0 55 l l5 1 09 1 3 9 30 2 5 3 5 37 1 3 6 1 1 86 2 0 2 1 2 4 1 1 7 1 2 2 07 2 7 3 7 33 极蒡1i i2 l0 可以看出：2 5 号l 2 m s - i - n a a o o l m g 一+ i b a o 1 m g 一生根率和平均根数分别为8 52 和5 5 条，2 7 号l 2 m s + n a a o 5 m g r + i b a o o l m g 一的生根率和平均根数分别为8 7 2 1 3 勉 孙 孔 撕 拍 凹 勰 凹 他 他 赡 n 他 鸭 媾 他 他 和67 条均达到较大值( 图版7 ) 。n a a 和i b a 同时使用比单独使用一种激素生根效果要好， 这可能是不同的激素之矧存在互相促进作用。对生根影响最大的因素是基本培养基，1 2 m s 基本培养基和m s 及3 4 m s 相比适合生根培养，n a a 在0 1 水平和i b a 在0 1 水平的生根率 取得最大值，在平均根数和平均根长上对生根的影响也较为显著。l 2 m s + n a a 0 1 m g l 1 + i b a ( l m g 一是生根最佳激素组合( 图版8 ) 。 4 1 52 瓶外生根 a r t 处理浓度对瓶外生根的影晌见表2 1 。i b a 和n a a 处理瓶外生根结果见表2 2 。 表2 l 不同a b t 处理浓度瓶外生根结果分析表 注：每次处理3 0 株，基质：纯砂：珍珠岩( 1 ：i ) 表2 2 不同t b a 和n a a 处理瓶外生根结果分析表 可以看出5 0 0m g l “的a b t 处理，生根率较高可达2 6 ，而激素组合i b a 2 0m g 屯1 + n a a 2 0 m g l ，“处理后生根率也不到2 0 。虽然瓶外生根效果不佳，但由于瓶外生根有着较大的经济 效益，可以较大降低组培成本，对此有待于进一步研究。 4 1 6 炼苗结果 不同基质对炼苗成活率的影响见表2 3 所示。 表2 3 不同基质对炼苗成活率的影响 基质 5 d1 0 d1 5 d 2 0 d2 5 d 3 0 d 河砂 1 0 0 河砂：珍球岩 1 0 0 l ：l 珍珠岩蛭_ i ：l 3 0 6 0 可以看到，随着时间的推移成活率在下降，但是以河砂：珍珠岩( 1 ：1 ) 的成活率较高，在 一个月后统计可达3 0 ，河砂和珍珠岩：蛭石( 1 ：1 ) 效果都不好，可能是基质透水透气性较 差，水分和氧气难以持久保持。河砂：珍珠岩( 1 ：1 ) 组合中透水透气，保水能力有所提高， 所以大大提高了炼苗的成活率。此外，在开始炼苗的两周内，应当细心照看苗子生长状况，及 时喷水和遮荫。 4 2 岷江百合花丝外植体不定芽诱导试验结果及分析 4 2 1 花丝愈伤组织诱导 表2 4 岷江百合花丝愈伤组织诱导一览 不同激素组合对愈伤组织诱导见表2 4 。愈伤组织诱导培养基m s + b a o 5 m g r + n a a l o m g l ，分化培养基也是m s + b a o 5 m g l - + n a a l 0m g l 。在接种1 5 天后， 花丝丌始膨大，2 0 天后陆续出现白色和浅黄色愈伤组织，取出致密初始愈伤组织转接于同 一培养基中增殖，2 周后继代一一次，花丝愈伤组织大都颜色浅黄和黄色，质地较密，表面有颗 粒状突起表现为胚性状态，且不易脱落；有的已经开始不定芽分化。所以b a o 5m g r ， b a l0m g l “时不定芽的分化率较高。 植物组织培养形成再生植株途径有两种：- g e 先形成愈伤组织，再分化形成植株；另一 8 鲫 他 嬲 懈 蛎 毖 弛 种是直接分化出不定芽和不定根形成再生植株。为避免愈伤组织阶段的细胞突变，有人提 出“。应以第二条途径为主，但若用来分子育种和种质改良则不同，大量试验已经证实胚性 愈伤组织是基因转化的良好材料，有利于外源基因转入基因组中。诱导出愈伤组织并保持 胚性状态对丁基因转化具有重要意义。贾敬芬等在兰州百合花丝诱导愈伤组织的试验中只 有在蔗糖浓度达到8 1 0 且有花药存在的条件下，花丝末端才能膨大并生成愈伤组织，并在 2 ，4 一d 1 0m g 一中分化出小鳞茎。“。试验中以岷江百合花丝为外植体可以大量诱导出愈伤 组织并可长期保持其胚性状态，且能进一步分化。 4 2 2 岷江百合花丝外植体愈伤组织不定芽分化的结果分析 表2 5 不同激素组合对花丝愈伤组织分化为不定芽的影响 花丝愈伤组织分化结果见表2 5 。可看出1 2 m s + k t l 0 m g l + n a a 0 2 m g l 。浓度组 合不定芽分化数达到3 2 ，不定芽分化率达到6 4 取得较高的分化效果。可见岷江百合花丝外 植体诱导出愈伤组织后在同一种培养基中就可以发生再分化，再次继代进行不定芽分化。 4 3 岷江百合鳞片直接形成不定芽试验结果分析 岷江百合鳞片直接形成不定芽的结果如表2 6 所示。b a 对直接分化产生不定芽有明显 促进作用( 图版1 0 ，1 1 ) 。在】8 号培养基上，b a 浓度由0 增加到3 0m g l ，分化率不 断上升，由5 增加到8 6 9 6 ，超过2m g r 则开始下降，在培养约一周后观察到鳞片外植体背 对培养基的表面产生一些绿色小芽点，表明这些部位的细胞已经开始分化，观察发现有的 地方表皮细胞处于分裂活跃：状态甚至产生小突起，但有的地方表皮细胞不分裂，这可能是 同一外植体上不同部位的细胞处于不同的发育阶段。几天后小突起呈圆锥形有一些排列紧 密细小的分生组织细胞构成，到1 5 天左右时，突起进一步发育，呈现出芽的形态并且变长， 没有形成簇芽( 图版1 0 ，1 1 ) 。2 ，4 - 1 3 、ia a 、n a a 有强烈抑制不定芽分化的作用，添加 它们酬其分化率均低于3 0 ，添加2 ，4 - d 后对不定芽分化的抑制作用更为明显( 培养基1 4 号) 。在仅加ba 时，不定芽均从外植体上直接分化，并且来源于表皮细胞属于外起源；无激 素或细胞分裂素浓度高于生长素浓度时，其不定芽以直接分化为主( 培养基l 4 号，6 7 号) ， ：步数是通过愈伤组织间接分化形成，只有生长素或生长素浓度高于细胞分裂素时，不定芽均 以f j u 接分化产生( 培养基8 l2 号) 。分析结果得出，添加b a o ，5 2 0m g 一的1 2 m s 培养 基剥诱导百合鳞片细胞器官直接发生不定芽的效果最为理想。将不定芽转移到添加b a 0 2 n l g - 一和ia a1 0 m g 一的生根培养基培养1 5 d 可见根产生。 表2 6 不同激素浓度组合对百合鳞片细胞脱分化与分化的影响 饪：+ 甜冒哥搓分化广生不定舅，。器官间棱分化，十一器官赢接分化为主 5 讨论 5 1 岷江百合植株再生过程中的形态变化 5 1 1 初代培养中不同外植体的分化差异 植物细胞的分化及脱分化是目前细胞生物学的重要研究课题之一。分化就是细胞通过 分裂而产生结构和功能上的稳定性差异的过程，即细胞的功能的特性化。其结果是产生了由 不同的组织组成的器官2 甜。脱分化被认为是已有特定结构和功能的植物组织，在一定的条件 1 卜- 其细胞被诱导改变原来的发育途径，进而失去原来的分化状态，转变为具有分生能力的胚 性细胞的过程2 3 1 。分化的实质就是基因的有序化表达的问题，而脱分化的实质上是使己分 化的基幽重新打丌的近程。形态上形成一簇恢复分裂能力的细胞团：愈伤组织在各种类型 的细胞中，最具脱分化潜能的细胞是薄壁细胞。因此在植物组织培养中，常用植物幼嫩部 i7 虚的组织为外植体。对百合而言，组织培养就采用肥厚鳞茎内部的薄而嫩的鳞片为外植体接 种。以岷江百合鳞片为外植体进行愈伤组织诱导培养时，用鳞茎的内部鳞片作为外植体时，其 分化率较高，分化的不定芽较大，最后的分化效果较好，比其它外植体类型的分化效果显著。 试验系统的建立为进步研究细胞的分化和脱分化提供了一些保证。 5 1 2 激素类型对分化不定芽的影响 常用生长素和细胞分裂素诱导已分化的细胞脱分化。并且发现2 , 4 一d 和b a 有利于发生 不定芽，n a a 有利于发生不定根，z t 利于发生花芽。现在认为生长素影响细胞壁的强度， 促进细胞伸长和分裂，细胞分裂素则促进细胞分裂并影响分化方向，二者的配比是影响脱分 化和分化的关键【2 ”。生长素对形成层活动的恢复及其后的分化中起重要作用，s u n d b e r g 等在 有关p i n u ss y l v e s t r i s 茎干中内源i a a 浓度的变化的研究中发现，当形成层开始恢复活动时， 形成层区域内的i a a 水平开始稳定升高，整个i a a 水平的变化与形成层的活动变化一致f 2 鄂。 而形成层部位的细胞大多是由薄壁细胞构成，分生能力强。对鳞叶愈伤组织诱导过程中的可能 发生的染色体变异需要进行核型分析，以进一步确认。试验中鳞片在2 号培养基1 2 m s + b a 2 0i n g l - 】+ na a1 0 m g l 1 诱导愈伤组织效果最佳，分化率达9 3 3 3 ，其愈伤组织较致密 呈浅绿色粒状，分化出的不定芽色泽鲜艳。在7 号1 2 m s + 2 , 4 d 3n a g l + b a l 0m g l - i + g a 0 1 m g 一中分化率虽然较低，但是愈伤组织呈松软浅绿色颗粒状，也同样有利于继代培养，1 5 号培养基1 2 m $ + b a 3 o m g l 一+ n h a 0 0 1m g l 1 是最佳增殖培养基，8 a 对百合不定芽分化和 增殖作用显著。 5 1 3 不同培养基类型对生根的影响 1 2 m s 基本培养基和m s 及3 4 m s 相比适合生根培养，n a b 在0 1 水平和i b a 在0 1 水 平的生根率取得最大值，在平均根数和平均根长上对生根的影响也较为显著。由此i 2 m s - k n a a o 1 m g l _ l + i b a o 1m g l 。1 是生根最佳配方( 图版8 ) 。而在炼苗上，经过比较后河砂： 珍珠岩( 1 ：1 ) 的成活率较高，这与其较好的透气有关。 5 1 4 直接诱导不定芽发生过程中的形态变化 形态发生是发育生物学中一项十分重要的研究课题种形态发生方式指外植体细胞脱分 化后不形成愈伤组织而直接发育成不定芽等器官，另一种形态发生则指外植体细胞脱分化后 先后形成愈伤组织，然后在胚性愈伤组织上进行器官分化。上述形态发生途径的不同是由内、 外两方面因素确定的，外部因素最为关键的是激素调控，内部因素主要是材料基因型或不 同外植体之削的差异”“”1 。形态发生与激素调节有关，王莉等在藏红花花瓣直接诱导柱头类 似物的试验中，花瓣先在l 2 m s + n a a 8 0m g 一+ k t 4 o m g l 。暗培养诱导出白色瓣状体后， 在1 2 m s - - n a a 4m g l 。| * k t 4m g 中继代培养大量的柱头状类似物发生。在植物器官定向 诱导时位于耳义材部位下方和外侧的外植体在一定条件下可以诱导分化成它内侧的器官原基。 这种现象称为位置效应。在百合的鳞片不定芽诱导试验中也发现类似现象，只是一时难以 判断，还有待于进一步确定。 影响植物组织培养成功的关键因素是激素的使用。各种植物激素与器官发生有着密切的 联系。添加2 ，4 - i ) 后，可能会促进细胞内源i a a 含量上升。在早期，较高水平的内源生长素 对其发生是必需的，内源a b a 则有利于体细胞胚的发育成熟。器官发生型形态发生中胚性细 胞在体细胞胚发生过程还伴随着系列生理生化变化，这些变化在形态转变以前就已发生， 胚性细胞内的各种细胞器代谢旺盛，a t p 酶活性升高，游离氨基酸及可溶性蛋白含量也发生 了变化。”“”。赤霉素，乙烯，多胺等对体细胞胚发生也有重要作用。低水平的乙烯有利于其 发生，反之则抑制其发生。较高水平的多胺促进体胚发生 ar - ：i 2 ) o 在试验中也观察到b a 在一 定浓度内可以促进不定芽的直接发生，这与刘选明“”的结果较为一致。这可能是b a 促进了 表皮的已形成芽原基的薄壁细胞的分裂，加快了芽的生长。过去在百合组织培养中应用的激 素主要是b a 、ia a 、n a a 和ib a ，而2 , 4 d 应用很少。在试验中添加一定的ia a 、 2 ，4 一d 可以诱导愈伤组织发生，添加一定浓度的2 ，4 一d 可以诱导产生胚性愈伤组织。植物 离体培养过程中植株再生一方面受基因调控，另一方面也受外界环境因素的影响。基因型、 外植体类型和取材部位及其生理状态以及生长调节物质等是影响植物离体再生的重要因素。 许多学者在草莓的植株再生研究中发现，外植体类型、激素组合、基因型等影响不定芽的诱 导，其中基因型是个重要因子，不同的品种差异较大。”。生长调节物质在植物组织培养中 也起着较大调控作用，近年来在组培中使用的一种新型细胞分裂素类激素t d z ，其活性较高。 t d z 与不同生长素配合使用，其再生效果差异很大。对于草莓品种m 1 4 ，在t d z 2 5m g l 1 + i a a o 1m g 。r 中再生频率最高，几乎1 0 0 而在t d z 2 0 m g l - + 2 ，4 一d o 5m g l 。上则 没有芽的再生”1 。金丝桃在t d z 与i a a 组合中比在t d z 与n a a 组合中的不定芽多；在蔷薇再 生时发现：t d z 与n a a 组合再生频率高。尹淑萍等在研究t d z 与生长素不同组合对草莓再生 不定芽的的影响中发现，草莓的再生效果既与t d z 不同生长素组合使用有关，也与t d z 浓度 有关，对于再生能力差的品种可以考虑使用较高的浓度。”。在百合下一步的组织培养研究 中可以考虑使用t d z 与生长素不同组合来研究西合不定芽诱导和体细胞胚，进一步优化试验 方案。 6 结论 ( 1 ) 鳞片在i 2 m s + b a 2 0m g l1 十naa 1 0m g l 1 上诱导愈伤组织效果最佳，分化率 达9 3 3 3 。在培养基1 2 m s + 2 ，4 - d 3m g l _ l + b a l 0i l l g 一+ g a 0 1m g l 。1 中分化率虽然较低， 但是也同样有利于继代培养。岷江百合花丝为外植体进行愈伤组织诱导，愈伤组织诱导培养 基为m s + b a 0 5m g l 叫+ n a a l 0m g l 。，分化培养基也是m s + b a 0 5m g l - + n a a l 0m g l 。 ( 2 ) 将诱导出不定芽的鳞片切成带芽小块，接入不同的增殖培养基中，培养2 5 3 0 d 后， 便形成芽丛，结果以1 2 m s + b a l 0m g l + n a a 0 1m g r 效果最佳，增殖率为6 8 0 。 ( 3 ) 芽苗在l 2 m s + n a a 0 0 1m g l - 1 + i b a 0 1m g l 1 1 上的生根率和平均根数分别为 8 5 2 和5 5 条；l 2