生物技术制药复习材料.doc

生物技术制药复习材料（加粗内容重点掌握）一、课程要求1.通过本课程的学习达到了解和掌握现代生 物技术 制药的基本知识概念，掌握常规生物制 药的基本技术 路线和工艺过程的目的。2.了解生物药用资源的知识背景，把生物资源 的科学利用与药物研制紧密结合，培养学生 的发明创造能力。二、知识归纳第一章：概述1. 生物技术概念：以现代生命科学为基础，结合先进的工程技 术手段和其他基础学科的科学原理，按照预 先的设计改造生物体或加工生物原料，为人 类生产出所需产品或达到某种目的的技术。2. 生物技术内容包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程这四大工程，随着科技的不断发展所包含的内容在不断扩大如：蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生 物技术、生物转化等。3. 基因工程是生物技术的核 心和关键，是主导技术。细胞工程是生物技术的 基础，也是反应器。酶工程是生物技术 的条件。发酵工程是生物技术的 获得最终产品的手段。4. 基因工程：是把不同生物的基因在体外剪切组合，并 和载体（如质粒、噬菌体、病毒）DNA连接， 然后转入微生物或细胞内，进行克隆，并使 转入的基因在细胞或微生物内表达，产生所 需要的蛋白质的技术。5. 酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的 特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并 借助生物反应器和工艺过程来生产人类所 需产品的一项技术。6. 发酵工程是一门利用微生物的生长和代谢活 动来生产各种有用物质的工程技术。所采用的新技术主要应用于3个方面：工艺 改进，新药研制和菌种改造。7. 蛋白质工程是从改变基因入手制造新型蛋白质的技术。8. 过程：找到与新型蛋白质基因接近的基因， 基因修改/突变，修改后的基因导入工程菌 或细胞中生产所需蛋白。区别于基因工程：前者改变基因生成新蛋白， 后者利用基因拼接技术生产现有蛋白。9. 抗体工程：应用细胞生物学或分子生物学手段在体外进 行遗传学操作，改变抗体的遗传特性和生物 学特性，获得所需、有特定生物学特性和功 能的新抗体，或建立能稳定获得高质量和产 量抗体的技术。10. 生物药物：指包括生物制品在内的生物体的初级和 次级代谢产物或生物体的某一组成部分， 甚至整个生物体用作诊断和治疗的 医药 品。11. 生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物技术生产 的用于预防、治疗和诊断疾病的药物， 主要是蛋白质或核酸类药物。12. 生物技术药物分类13. 生物技术药物的特性：1）理化性质特性a. 相对分子量大：几千、几万，甚至几十万；b. 结构复杂：一级结构、高级结构、三维立体结构；c. 稳定性差：易受T、pH、化学试剂、机械压力、 空气氧化、光照、表面吸附等影响失活。2）药理作用特性A. 活性与作用机制明确：先明确机制，后开发药物；B. 作用针对性强：特定靶受体、靶器官；C. 毒性低：天然存在或衍生物、生物相容性好；D. 体内半衰期短：易被代谢；E. 有种属特异性：人源、鼠源、猪源等；F. 可产生免疫原性：结构或构型上与天然来源的不同3）生产制备特性a. 药物分子在原料中含量低：发酵；b. 原料液中常存在降解目标产物的杂质：酶；c. 制备工艺条件温和：目标产物稳定性差；d. 分离纯化困难：结构相近异构体e. 易污染：微生物污染、变性（热源）4）质量控制特性A. 质量标准内容：包括基本要求、制造、检定等；B. 制造项下的特殊规定：对于利用哺乳动物细胞生成 的生物技术药物，在本项下，要写出工程细胞的情 况；对于利用工程菌生产的生物技术药物，在本项 下要写出工程菌菌种的情况；本项下还要写出原液 和成品的制备方法。C. 检定项下的特殊规定：规定了对原液、半成品和成 品的检定内容和方法。14.生物技术制药概念：指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、 酶工程等生物技术的原理和方法,来研究、 开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病 的药物的一门科学。15.生物技术制药业快速发展的四十年第一个十年（19751985）：生物时代第二个十年（19851995）：技术平台时代第三个十年（19952006）：基因组时代第四个十年（2006至今）：后基因组时代第2章 基因工程制药1. 基因工程:是通过对不同来源的DNA分子，按照预 先设计，在体外构建杂种DNA分子，从而实现遗传物 质的重新组合，再借助载体，将目的基因转移到受体 细胞中，并使目的基因在受体细胞中进行复制和表达 的技术。2. 基因工程制药的基本过程3. 基因工程菌的构建与筛选的基本方法 基因工程菌株或细胞株的构建的设计思路直 接影响后续的表达和分离纯化，是决定性的环节。 基因操作中常用的工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸修饰酶 限制性内切酶：常用的是II型限制性内切酶 DNA连接酶仅能链接缺口不能连接裂口而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。 DNA连接酶大肠杆菌的DNA连接酶，需NAD+做辅助因子 T4 DNA连接酶，需ATP做辅助因子 DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I 、 Klenow大片断酶、Taq DNA 聚合酶、反转录酶等。 核酸修饰酶末端转移酶、碱性磷酸酶、T4多核苷酸激酶4.目的基因的制备问题：为什么不能直接将分离真核细胞的目的基 因，用于产生基因工程药物？答案：目的基因仅占染色体的很小一部分，从染色 体直接分离纯化目的基因极为困难；原核细胞无RNA加工剪切系统，含有内含子 的基因组无法在原核细胞中表达。5.目的基因获取的方法：化学合成法、PCR法、基因文库法（鸟枪法）、cDNA文库法6.载体克隆载体：是指能使外源目的基因在宿主细胞中大量繁殖 的功能性载体常见的载体有质 粒、噬菌体、柯 斯质粒等。代表：pBR322表达载体：是指能使外源目的基因在宿主细胞中转录和表 达的功能性载体。常用：质粒、噬菌体、cosmid质粒特点：带表达元件转录和翻译所需的 DNA序列7. 载体与目的基因的连接a. DNA分子体外重组：连接酶催化载体DNA与目的基因DNA片段连接。 形成重组子（recombinant)的过程。b. 连接方式：粘性末端的连接、平头末端的连接8. 重组DNA导入宿主细胞宿主细胞：原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、链 球菌真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动 物细胞、 植物细胞9.常用的基因工程药物表达系统1） 原核细胞A. 大肠杆菌：胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达（原核细胞工程菌外源基因表达的形式）B. 枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体；不能使蛋白质糖基化；有很强的胞外蛋白酶，对产物进行不同程度的降解。C. 链霉菌：不致病、使用安全；分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中；具有糖基化能力。v 原核细胞工程菌的目的基因类型：CDNA，非基因组DNA，2） 真核细胞a. 酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养；表达产物直接分泌到细胞外；表达产物糖基化。酿酒酵母、毕赤酵母应用最多。b. 丝状真菌：分泌能力强；翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；成熟的发酵和后处理工艺。 c. 哺乳动物细胞：外源基因表达产物分泌到培养液中，产物易纯化；产物糖基化，接近或类似于天然产物；生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。3） 昆虫表达系统杆状病毒作为载体，具有高度宿主专 一性（节肢动物），操作安全10.提高外源基因表达效率的有效途径：1）优化表达载体的构建：启动子的强弱，SD序列和AUG的间距等。A. 启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加基因的表达。lac、trp、 tac。B. 核糖体结合位点的有效性。C. SD与AUG的间距：影响非融合蛋白的合成水平。 2）提高稀有密码子的表达频率。设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码子。3）提高表达产物的稳定性：组建融合蛋白；利用信号肽；特异性突变；位点特异突变改变二硫键位置；宿主 蛋白酶缺陷。4）工程菌发酵过程的优化：细胞的代谢负荷： 细胞生长和外源基因表达分为两 个阶段，即宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开。优化培养条件。11.重组DNA导入细菌方法：化学转化法：氯化钙电转化法：高压电脉冲感染法：病毒（噬菌体或包装病毒）12.重组DNA导入酵母：化学转化法：PEG、DMSO电转化法：山梨醇、电击原生质体转化法：酶消化除壁，PEG/CaCl213.重组子的筛选载体遗传标记法：抗生素抗性筛选法互补筛选法营养缺陷型筛选法噬菌斑筛选法14.重组子的筛选与鉴定A.核酸分子杂交法：既可筛选重组子，也可鉴定目的基因，利用放射性核素或生物素标记的探针与目的 DNA互补杂交，从基因组文库、cDNA文库或者 重组质粒中直接筛选和鉴定探针序列可由已知的目的产物序列进行设计特点：高度特异、灵敏度高14.重组子的筛选与鉴定方法A.核酸分子杂交法： 菌落(或噬菌斑)原位杂交DNA印迹分析（Southern blotting)Northern Blotting（Northern印迹）B.限制性酶谱分析法C.DNA序列测定D.目的基因表达产物测定法：酶联免疫吸附实验(ELISA) ，western blotting15.各种产物表达形式采用的分离纯 化方法基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物 都是多肽或蛋白质 。具有以下特点：表达产物在初始料中含量较低；含有大量细胞及代谢产物；表达产物稳定性差，易失活变性；表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；应用面广，对其质量要求纯度高、无菌、无热原。16.基因工程药物分离纯化的一般流程A. 细胞分离方法a. 离心:利用固体及液体间的 密度差来实现分离；b. 膜分离:常规过滤、微滤、超滤（微粒与大分子的分离）、反渗透（脱溶剂）、透析（脱盐）、电渗透（脱盐）B. 细胞破碎方法离心沉淀、膜过滤、双水相萃取C. 固液分离D. 目的产物的分离纯化根据产物表达形式来选择a. 细胞外分泌蛋白纯化前需浓缩b. 周质表达溶菌酶+渗透裂解c. 细胞内可溶性表达首选亲和层析d. 包涵体表达洗涤变性复性E.表达产物考察 基因工程药物质量控制要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、 稳定性、一致性。 生物学活性测定：效价测定、免疫学活性测定、体内生物学活性测定、 体外生物学活性测定、 蛋白质的比活。 蛋白质含量测定：Folin-酚试剂法、染色法、双缩脲法、紫 外吸收法等。 蛋白质纯度分析：SDS-PAGE、等电聚焦、HPLC等第三章：动物细胞工程制药1.学习要求掌握细胞工程制药、动物以及植物细胞工 程制药的含义、基本技术；动、植物工程细 胞的体外培养方法；熟悉动物工程细胞的大规模培养及生物反 应器；转基因动物的构建方法2. 细胞工程制药的基本技术：细胞或原生质体的分离、 培养技术；细胞或原生质体融合技术； 细胞核移植技术；转基因技术等。3. 体外培养动物细胞类型：贴壁依赖性细胞、悬浮细胞、兼性贴壁细胞4. 动物细胞的培养基：天然培养基、合成细胞培养基、无血清培养基5. 动物培养基采用膜过滤法灭菌6. 动物细胞培养常用的其他溶液：平衡盐溶液（BSS）、培养基pH调整液、细胞消化液7. 生产用动物细胞的获得：原代细胞、传代细胞系、转化细胞系、工程细胞系（融合细胞系，如杂交细胞，如骨髓瘤细胞系、基因工程细胞系，如CHO细胞，生产INF、IL、EPO等）8. 动物细胞培养的基本技术：细胞的原代培养、细胞的传代培养、细胞的克隆培养、动物细胞的冻存与复苏9. 动物细胞的大规模培养方法：悬浮培养法、微载体培养法、多孔载体培养法、微囊培养、中空纤维培养法10. 动物细胞生物反应器类型：搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维式生物反应器、透析袋或膜式生物反应器、固定床或流化床式生物反应器、一次性摇袋式细胞培养生物反应器11.细胞工程制药的基本过程12.外源目的基因转入动物的早期胚胎方法显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法、基因打靶、精子载体导入法、人工酵母染色体法(YAC)（转入较大基因）13.基因打靶：根据同源重组原理实现外源基因的定点整合技术，包括基因敲除(Knock-out)、基因敲入(Knock-in)、基因替代。14. 基因打靶必备条件：打靶载体、胚胎干细胞（ES细胞）15. 转基因动物反应器动物生物反应器（bioreactor）:目的片段在器官 或组织中表达的转基因动物优点：表达产物充分修饰，活性稳定，成本低，可大规模 生产，产品质量高且易纯化类型：动物乳腺反应器、转基因动物血液生物反应器、转基因动物尿液生物反应器、转基因鸡蛋生物反应器16.细胞工程制药尚待解决的问题转基因动物的转入基因存在随机整合、调节 失控、遗传不稳定、表达率不高等；目的基因异位表达或表达产物泄露问题；产物的分离纯化问题；产物的结构和生物性与人体蛋白相似性不够第三章：植物细胞工程制药1.学习重点：掌握植物细胞工程及植物细胞工程制药的概念、内容、优势；植物细胞体外 培养方法；熟悉植物工程细胞及转基因植物生产 药物的应用2.植物细胞工程制药基本概念 植物细胞工程利用植物细胞为基本单位，按照人们的设计，在细胞水平上进行遗传操作，以 及在体外条件下进行培养、繁殖，改变 细胞某些生物学特性，从而改良品种加 速繁育植物个体或获得有用物质的技术。 植物细胞全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核（染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。 脱分化：已分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又分化成未分化的细胞和组织的过程。 再分化：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化为胚状体或直接分化出器官。 愈伤组织培养：从植物体的各种组织、器官等外植体，经脱分化而形成的细胞聚集体的培养。 分生组织培养：又称生长锥培养，指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。 外植体：用于植物细胞（组织）培养的器官或组织。 无性繁殖系：使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。从同一无性系分离形成两个或多个不同系列，称无性系变异体。 突变体：经过确定已发生遗传变异，或新的培养物至少通过一种诱变处理发生变异所得的新细胞。 继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代时间称为第一代培养，连续多代的培养为继代培养或连续培养。 次级代谢：由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。次级代谢产物：生物碱、黄酮、萜类、有机酸等。3.植物细胞工程药物包括：植物工程细胞生产药物、转基因植物生产药物4.植物细胞工程制药流程4. 植物细胞全能性 植物体中任何一个具有完整细胞核（染 色体组）的细胞在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体的能力。5. 植物细胞的培养 培养基：MS培养基 生长调节剂/植物生长激素：生长素，细胞分裂素赤霉素，脱落酸，乙烯。 诱导子：刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质, 可以通过改变次生代谢途径中催化酶的 酶活力引起代谢通量和反应速率的改变, 提高次 生代谢产物的产量。 非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重 金属盐类 生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体真菌培养物滤液等6.植物细胞的获得：外植体直接分离法、愈伤组织分离法、原生质体再生法7.植物细胞的培养方法：单细胞的培养、单倍体细胞的培养（花药培养）、愈伤组织培养、毛状根诱导和培养8.植物细胞的大规模培养：大规模悬浮培养、细胞或原生质体的固定化培养9. 植物细胞生物反应器：改进的搅拌式生物反应器和气升式反应器10. 植物细胞培养工业化存在的问题a. 生长缓慢,通常完成一次生产周期需4-5周b. 次级代谢物含量低c. 培养细胞不稳定等，不耐受剪切力，易聚集化d. 多数次生代谢产物积累于胞内，提取困难e. 下游产物分离纯化成本较高f. 一般的说，只有当次级代谢产物的价格非常昂贵 时，才考虑采用植物细胞培养方法。g. 生物反应器技术还有待发展11.转基因植物生产药物优点：基因工程改造的植物细胞全能性、大田种植成本更低，易于管理、运输应用：转基因植物生产重组抗体、转基因植物疫苗、利用转基因植物生产其他药物、极具药用潜力的转基因植物（转基因胰岛素大米、转基因莴苣胰岛素胶囊）12.转基因植物目前仍存在的问题1 产量偏低（至少需要达到1%）：目的基因沉默或不稳定表达的现象2 糖基化问题：抑制或消除植物糖基化；3 生物安全性和公众接受性以及工业化技术问题4 药用植物资源问题：野生资源匮乏，品质退化，受地区气候影响，不 利于质量控制、标准化、规范化第四章酶工程制药1. 学习要求：掌握酶和细胞的固定化的概念、方法、 优缺点；抗体酶、核酶、模拟酶的概念 及应用；非水相催化；熟悉酶的化学修饰；酶在医药领域的 应用；2. 1953年，德国人提出了酶固定化技术 。3. 1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：1酶的生产、2酶的分离纯化、3酶和细胞的固定化、4酶的修饰及其分子改造、5非水相催化、6酶的传感器、7酶的反应器、8抗体酶，人工酶和模拟酶、9酶和固定化酶技术的应用。4.5. 固定化所采用的酶可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或者使细胞碎片上的酶或酶系。6. 现代酶工程的主要内容a. 酶的分离、提纯、大批量生产以及应用开发；b. 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c. 酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d. 酶的分子改造和化学修饰，酶的结构与功能的研究；e. 有机相中酶反应的研究；f. 酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g. 抗体酶、核酸酶的研究；h. 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。7. 酶的来源：提取分离法、化学合成法（固相合成技术）、生物合成法8. 筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分离初筛、 纯化、复筛、生产性能检定9. 菌种改良的途径：基因突变、基因转移和基因克隆10. 常用的产酶微生物：.E.coli 、枯草杆菌、啤酒酵母、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）11. 酶的分离纯化酶的纯化方法过滤、膜分离、电泳、凝胶色谱、离子交换层 析、疏水层析、反相层析、亲和层析等12. 酶制备的基本原则：防止酶的变性失活、建立有效的目的酶跟踪监测方法13. 酶和细胞的固定化（1）固定化酶的定义: 指被固定在载体或被束缚在一定空间范围内进 行催化反应的酶制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化 所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合 在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。（2） 固定化酶的优点1 可多次使用，酶的稳定性提高；2 酶与底物和产物易于分开，易于纯化；3 反应条件易于控制，可实现转化反应的连 续化和自动控制；4 酶的利用率高，用酶量少；5 比水溶性酶更适合于多酶反应；6 一般不能长期保存。添加底物、产物、抑 制剂和防腐剂，并于低温保存。（3） 固定化酶的缺点1 固定化时，酶活性有所损失；2 成本增加；3 只适用于可溶性底物；4 与完整菌体相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅酶因子的反应；5 胞内酶经常需要经过酶的纯化过程14. 酶的固定化方法（1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上（物理吸附法，离子结合法，共价结合法）（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与 酶或细胞与细胞之间形成共价 键，交叉连接，形成网格结构。（3）包埋法：酶和载体混合后，借助引发剂 进行聚合反应（4）新型的酶固定化方法：耦合固定化、无载体固定化、定向固定化15.固定化细胞：将具有一定生理功能的生物细胞限制或定位在 特定空间区域。15. 固定化酶（细胞）的应用：用固定化酶生产各种产物、制备酶传感器16. 制备酶传感器：将活性酶覆盖在电极表面,酶与被测物反应,形成 一种能被电极响应的物质。17. 酶电极：固定化酶一般用凝胶包埋成薄膜，与电 极相连。18. 酶传感器可以简便快速测定特异性强的物质：糖类、醇类、有 机酸、氨基酸、激素等物质浓度的测定，在临床分析、工业检测等应用。19. 常见的酶反应器类型固定化酶（细胞）的反应器：用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。 按结构区分搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR )填充床式反应器(packed column reactor, PCR )是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反应器(Membrane Reactor, MR)常用的是中空纤维反应器。 按操作方式区分分批式反应(batch )连续式反应(continuous )流加分批式反应(feeding batch ) 按混合形式连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR）分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, BSTR）20. 模拟酶根据酶的作用原理，人为制造的具有酶 性质的催化剂。利用有机化学合成的比 酶结构简单得多的具有催化功能的蛋白 或非蛋白质分子。特点：高效，高适应性，结构简单。21. 模拟酶的分类（按照模拟酶的属性）1 主-客体酶模型：代表-环糊精模拟酶2 胶束酶模型：胶束在水溶液中提供 疏水微环境,可对底物 束缚将催化基团（如咪唑, 巯基,羟基）和辅酶共 价或非共价连接或吸 附在胶束上,可提供 “活性部位”3 肽酶：肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合 成的具有催化活性的多肽，这是多肽合 成的一大热点。4 抗体酶5 分子印迹酶模型6 半合成酶抗体酶或称催化抗体是一类免疫系统产生的、 具有催化活性的抗体。是一种新型人 工酶制剂特点：更高的专一性和更好的稳定性：精细 识别分子印迹是指制备对某一特定化合物具有 选择性的聚合物的过程。这个特定化合物 叫印迹分子（print-molecule, P）或模板 分子(template-molecule, T)。分子印迹酶一种分子为模版,周围 用聚合物交联,模版分 子除去后,聚合物留下 一空穴产生类似酶活性中心 的空腔.在结合部位的空腔诱 导产生催化基团,并与 底物定向排列.22. 酶的化学修饰 目的：提高酶的稳定性,解除酶的抗原 性,改变酶学性质,扩大酶的应用范围 概念：通过主链切割,剪切和侧链的化学修饰对酶 蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物 活性。 酶的化学修饰方法：A.酶的表面化学修饰（1）大分子修饰：可溶性大分子如PEG通过共价键连接于酶分子的表面形成 一层覆盖层。（2）小分子修饰：侧链基团（3）交联修饰：双功能基团，加固结构（4）固定化修饰（PEG是线性分子具有良好的生物相容性和 水溶性，在体内无毒性、无残留、无免 疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末 端活化后可以与酶产生交联，因而，它 被广泛用于酶的修饰。获FDA认证）B.酶分子内部的修饰1) 非催化活性基团的修饰：空间构象、 酶动力学2) 蛋白主链的修饰：水解3) 催化活性基团的修饰：4) 与辅因子有关的修饰：辅因子共价结 合，金属取代等C.定点突变和化学修饰结合技术化学修饰成本高，难度大非天然AA，关键部位修饰23. 突变酶：采用基因工程技术对天然酶基因 进行剪切、修饰或突变，通过表达修改的 基因获得的酶突变酶的应用：提高酶活性及稳定性、研究酶的功能基团定点突变的方法：寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变或片段取代突变、循环延伸突变。24. 酶的分子定向进化，定向进化随机突变选择25. 酶的分子定向进化的突变策略：1 随机突变：易错PCR技术、连续易错PCR2 同源改组3 非同源改组4 结构域改组26.核酶（RNase）：具有催化功能的小分子RNA 属于生物催化剂可降解特异的mRNA序列。核酶在医学上的应用：核酶抗肝炎病毒的研究、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV-)核酶抗肿瘤治疗（核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细 胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达。）27.非水相催化：酶在水活度受控制的非单一水相(有机溶 剂、气体、超临界流体、离子液等)中进 行的催化反应称为非水相催化。 特点：酶构象比水溶液中更具“刚性”。通过选 择不同性质的溶剂来调控酶的某些特性。 例如，诱导改变酶分子的构象，调控酶 的底物专一性, 立体选择性和手性选择 性等。28. 酶非水相催化的应用：手性药物的拆分、功能高分子聚合物的合成、精细化工产品的生产29. 酶工程主要研究内容是什么？30. 固定化酶和固定化细胞的特点和优点各是 什么？怎样制备？31. 为什么要对酶进行化学修饰？32. 何为分子印迹？分子印迹的应用范围有哪 些？33. 有机相酶反应的定义及其优点是什么？34. 何为人工模拟酶？第六章 蛋白质工程制药1、掌握蛋白质工程的概念、研究内容、基 本原理；蛋白质分子设计的层次、内容、 流程和策略；蛋白质药物的化学修饰；熟悉蛋白质工程的基本思路与基因工程 的差异；2.蛋白质工程：以蛋白质分子的结构功能的关系研 究为基础，利用基因工程技术，按照人类自 身的需要，定向改造天然蛋白质，甚至创造新 的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白 质分子的现代生物技术。3.蛋白质工程的理论依据：基因指导蛋白质合成。4.5.蛋白质工程的主要研究内容1）从DNA水平改变基因，改造蛋白质2）从一个或多个氨基酸残基、结构域、全新蛋白质，从不同尺度改造蛋白3）有目的地改造，获得期望功能，强调分子设计4）结合DNA重组技术改造蛋白质6.蛋白质分子设计（Protein Design）：依赖于 蛋白质结构测定和分子模型的建立，按照蛋白 质构效关系的理论基础，设计出比天然蛋白质 性能优越的新型蛋白质。7. 蛋白质分子设计的层次定点突变或化学修饰法（小改）、拼接组装设计法（中改）、全新蛋白质从头设计（大改）8.蛋白质工程的操作方法12 合理化的分子设计：活性、结构、专一性3 基因的定向突变和定向进化4 突变体的大规模筛选5 突变体的表达及其分析检测蛋 白 质 分 子 设 计 流 程9.突变策略定点突变(寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变)、随机 突变（易错PCR）、同源改组、非同源改 组、结构域改组10.筛选策略荧光标记、平板分析（遗传互补筛选法）、噬菌体展示和细胞表面展示、高通量筛选11. 蛋白质药物的修饰：指在分子水平上对蛋白质药物进 行化学改造，通过对主链的切割、剪接 及化学基团的引入，实现对蛋白质药物 理化性质和生物活性的改变12. PEG修饰修饰靶点：多为蛋白质氨基，赖氨酸氨 基和末端氨基缺点：修饰产物同分异构体多而难以分 离，难获得单一的PEG化产物思考题1、蛋白质工程的含义及其主要内容2、蛋白质工程的主要步骤3、蛋白质分子设计的原理与流程4、蛋白质工程的基本思路与基因工程的差异第七章 核酸类药物如何分清核酸、核酸药物、珍奥核酸三者之间的区别？1) 珍奥核酸：是从动植物组织中提取的核酸类物质2) 核酸类药物：是天然的代谢激活剂，有助改善机 体的物质代谢和能量代谢，加速受损组织的 修复。3) 核酸：是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。1. 学习要求：掌握翻反义核酸药物的作用机制、设计 策略；RNAi的作用机制、特点；熟悉反义核酸药物的作用特点；miRNA的基本特征；siRNA和miRNA的异同；2. 核酸类药物（广义）：腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、 双丁酰环腺苷酸、胞二磷胆碱等核酸组分及 衍生物，是天然的代谢激活剂，有助改善机 体的物质代谢和能量代谢，加速受损组织的 修复。临床广泛用于放射病、血小板减少、 急慢性肝炎、血细胞减少、心血管疾病等。3. 核酸类药物（狭义）：又称核苷酸类药物，寡聚核糖核苷酸(RNA)或寡聚脱氧核糖 核苷酸(DNA)，可以在基因水平上发挥作用：特异性针对致 病基因，具有特定的靶点和作用机制的药物。分类：反义核酸、RNA干扰药物4. 核酸类似物：主要有叠氮胸苷、阿糖腺苷、 阿糖胞苷、聚肌胞苷酸等。干扰病毒DNA的合 成，治疗病毒性疾病、肿瘤、艾滋病等。5. 反义技术（antisense technology）：人工或生物合成的特定DNA或 RNA片段抑制或封闭基因表达的技术；6. 反义核酸药物（反义药物）：包括：反义DNA、反义RNA、核酶； 通常指反义脱氧寡核苷酸（antisense oligodeoxy-nucleotide，ASODN）。7. 反义RNA：指能和mRNA完全互补的 一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段8. 反义DNA：指能与基因DNA双链中的 有义链互补结合的短小DNA分子9. 核酶：一类具催化活性和自我催化剪切的核酸分 子，可精确地自我切除某些片段并重新连接。10.反义核酸作用机理反义核酸可在转录、剪接、转运和 翻译等各个环节上发挥调控作用。1 抑制转录：与DNA调控区或编码区结合，终止正在转录的mRNA链延长；抑制mRNA剪切和成熟；2 抑制翻译：与 mRNA形成 dsRNA，诱导 RNase H对其 降解；3 糖环修饰：包括构型、1位取代、2位取代、3 - 3 连 接、5 -5 连接等。使核酸酶不能有效识别磷酸 二酯键。4 肽骨架：ASODN的磷酸-糖骨架以肽键取代，即多 肽核酸（PNA），PNA与DNA以及RNA与PNA 之间均可形成碱基配对。10. 反义核酸药物设计策略（3个S）1 选择性（selectivity）：5端帽结构区、mRNA编码区、核前体mRNA拼接区、反转录病毒的引物区等；2 稳定性（stability）：核酶酶解化学 修饰反义核酸；C-G序列未被甲基化 免疫原性避免C-G序列；磷的修饰；3 溶解性（solubility）：透过细胞膜 分子大小（15-20）、电荷、脂溶性； 化学修饰，合适的药物递送系统；11. 硫代磷酸寡核苷酸(phosphoroth- ioteoligonucletide,PS-ODN)最为常 用,称为“第一代反义药物”。12. 反义核酸药物的应用用于治疗恶性肿瘤、感染性疾病、炎症 等。已有一个FDA批准上市的反义核酸药物 福米韦生（fomivirsen）13.RNA干扰（RNA interference，RNAi） ：指 进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同 源mRNA高效特异性降解的现象。14.RNAi作用机制（右图）1 启动阶段2 RNA诱导的沉默复合物形成阶段RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）3 效应阶段15. miRNA（micro RNA，微小RNA）长度约为2125nt小分子单链RNA调控基因表达的小分子，具有阶段特异性、组织特异性16.RNAi的作用特点1) 高度特异性、高效性2) 可传播性和可遗传性3) 高稳定性4) dsRNA长度限制性5) RNAi效应的依赖性6) ATP依赖思考题1、什么是核酸药物2、反义核酸药物的作用机制；3、RNAi的作用机制；4、siRNA和miRNA的异同；5、反义核酸药物的设计策略；第八章 多肽类药物1.学习要求掌握多肽类药物的定义、分子 组成、优点；熟悉人工合成多肽的方法；多 肽类药物的剂型与给药途径2. 多肽类药物的优势1) 活性高，特异性强；2) 分子量小，易吸收，生物利用度高；3) 易合成，合成效率高，过程自动化，易 于控制；方便结构改造；4) 副作用小。序列同源，不易引起免疫反 应；5) 信使作用（神经递质），载体作用；3. 多肽：由氨基酸缩合而成的化合物；一般10- 50个氨基酸；多数无特定空间构象4. 活性多肽：体内含量低，但生理功能强，在 神经、内分泌、生殖、消化、生长等系统中 发挥着不可或缺的生理调节作用。多肽类药物（多肽类激素）是机体的特定腺体合成并释放的一种物质，通过与远程敏感细胞内或细胞表面的受体相互作用而使靶细胞发生变化。主要包括垂体多肽激素、下丘脑多肽激素、甲状腺多肽激素、胰岛多肽激素、肠胃道多肽激素和胸腺多肽激素等。5. 多肽类药物的作用靶点：主要为 G 蛋白偶联受体（GPCRs）6. 多肽药物的制备方法化学合成（液相合成法、固相多肽合成法SPPS）、酶解法、基因工程法8.多肽类药物的剂型与 给药途径l 多肽类药物的稳定性：稳定性差，半衰期短；原因：脱酰胺、氧化、水解、错误二硫 键、消旋、变性、吸附、聚集或沉淀如何提高：定点突变、化学修饰、基因 融合、添加剂、冻干l 多肽类药物的剂型：大部分为注射剂，静脉注射或静脉滴注 为主，冻干粉l 目前上市的多肽药物制剂有微球、埋植 剂、脂质体、微乳纳米粒等9. 研发上市的多肽药物 齐考诺肽：具有镇痛作用的芋螺毒素Ziconotide（齐考诺 肽）,为 N-型电压门控钙通道阻滞剂,于2004年12 月被美国FDA正式批准为鞘内注射治疗疼痛的新 药，商品名为Prialt。 艾塞那肽：细胞因子模拟肽，大毒蜥的唾液中提取出十多种蛋白和毒素。其中， 一种名为exendin-4（39 aa）的蛋白被发现同人体 消化管中的胰高血糖素类多肽-1有50%的同源性治疗II型糖尿 病。 恩夫韦肽：在美国上市（罗 氏）。新一代抗HIV新 药，病毒的融合阻止剂 类药物（36aa）。10. 多肽类药物的应用1 抗糖尿病或低血糖症多肽2 抗肿瘤多肽3 抗感染多肽：与传统的抗菌药不同，抗菌肽作用于细菌的细胞膜，使细胞膜穿孔，细胞质外溢而达到杀菌的目的。4 抗心血管与泌尿系统疾病治疗多肽5 多肽疫苗：价格低廉、安全性高、特 异性强（HIV-I病毒多肽疫苗；丙肝病毒(HCV)多肽疫 苗）6 其他药用多肽、诊断用多肽思考题1、 多肽药物特点1） 调节各种各样的生理活动和生化反应；2） 生物活性高；3） 分子小，结构易于改造；4） 许多活性多肽都是由无活性的蛋白质前体经酶加工剪切转化而来；5） 安全性高2、多肽药物制备方法；3、多肽类药物的剂型和给药途径；4、多肽类药物的应用第九章 治疗性抗体1.学习要求掌握基因工程抗体的分类、结构 和特点；单克隆抗体制备的过程；熟悉噬菌体表面展示技术建立抗 体库；抗体的功能和基本结构；2. 抗体分类：IgG、 IgM、 IgD、 IgA、 IgE3. 抗体的结构：1) 基本结构：四肽链结构，两条轻链（L） 两条重链（H）2) 可变区（V 区）L 链 N 端 1/2 处（ VL ）H 链 N 端 1/5处（ VH ）3) 恒定区（C 区）L 链 C 端 1/2 处（ CL ）H 链 C 端 3/4处（ CH ）（在同一种属动物中比较 恒定）4)超变区&骨架区都在可变区超变区（HVR）/互补决定区（CDR）： 某些特定位置的氨基酸残基显示更大的 变异性；骨架区（FR）：维持HVR的空间结构5)铰链区：位于CH1与CH2之间，含有 丰富的脯氨酸，易伸展弯曲4. 抗体的结构与功能：VL和 VH是抗原结合的部位（ FV 区）。CL1和 CH1 上具有同种 异型的遗传标记。CH2 具有补体结合点。 IgG可通过胎盘屏障。CH3 具有与单核细胞巨噬细胞粒细胞，B 细 胞，NK 细胞的 Fc段受体 结合的功能。5 .单克隆抗体的制备过程6.细胞融合：骨髓瘤细胞：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移 酶 (HGPRT)缺陷型，确保其对HAT培养基的 敏感性；融和率高，自身不分泌抗体，所产 生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳 定等特点细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤 细胞（2*107-3*107）进行混合，在PEG作用下 诱导融合。为提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO。严格 限制接触时间。其他融合方法:电融合等。7.单抗的鉴定和检测：ELISA、免疫荧光技术等8.治疗用抗体的发展多克隆抗血清（第一代抗体）单克隆抗体（第二代抗体）基因工程抗体（第三代抗体）9.基因工程抗体：包括小型化抗体、嵌合抗体、人 源化抗体、抗体融合蛋白。10. 小型化抗体：包括Fab抗体片段、Fv抗体片段、单链抗 体（scFv）、双价抗体、双特异性抗体（bsFv）等。11. Fv抗体片段是一种具有抗原结合能力的最小抗体片段12. 单链抗体：由抗体的重、轻链的可变区基因(VH、VL)通 过一段短肽连接后表达出来的抗体片段。13. 噬菌体展示技术：抗体分子片段基因与噬菌 体外壳蛋白基因融合，使抗体 分子片段表达到噬菌体颗粒表面。14.抗体药物及其应用a. 抗体或抗体片段：嵌合单抗、人 源化单抗、人抗体等；b. 抗体偶联物（免疫偶联物）：抗 体与放射性核素、化疗药物、毒素等 偶联；c. 抗体融合蛋白：抗体片段与活性 蛋白（如免疫毒素）结合。15.抗体药物发展前景1、降低免疫原性：嵌合单抗、人 源化单抗；2、提高对实体瘤的穿透性：小型 化抗体；3、提高对肿瘤细胞的作用强度： 高效价、免疫偶联物。第十章 治疗性细胞株1. 学习要求掌握干细胞疗法、免疫细胞疗法的主 要特点；熟悉干细胞疗法、免疫疗法的主要过 程及其的应用；2.干细胞(stem cells）:是体内保存的处于未分化 状态的细胞群体，一旦机体需要，可按照发育途 径，通过分裂而产生分化细胞，并可进一步发育 成组