（作物栽培学与耕作学专业论文）植物提取液防治烟草tmv效果及作用机理研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 学位 文题目 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 硕士 级别 学生 张玉丰 学科 作物栽培学与耕作学 导师 刘华山 姓名专业姓名 学位论文 灵 如需保密，解密时间 卅ot - 玛弓lr 是否保密 黧戮麓言篓茏渺 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版 本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开河南 农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业 大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则， 承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 睡习 研究生签名：饴冲导师签名：- 啵乌学院领导签名 _ 。三：芸口 日期碥石月f 弓日嗍碡钿多日吼年月 日 2 致谢 本研究从选题、试验设计到论文的撰写都是在恩师韩锦峰教授和刘华山教授的悉 心指导下完成的。在三年硕士研究生学习期间，得到了导师无微不至的关心和照顾， 在我的学习和生活中的每一点进步都凝聚着导师的心血。能够耳濡目染两位恩师广博 的知识和开拓创新的科学思维；一丝不苟的治学态度和身体力行的工作作风；乐观、 宽容、豁达的性格和为人至诚的高尚品格以及对本学科发展的敏锐洞察力，是我收获 的最大财富，并将使我在今后的学习、生活和工作中受用无穷。 同时，有幸得到了农学院王瑞新教授、贺德先教授、汪耀富副教授、韩富根副教 授、符云鹏副教授、孟凡庭副教授、杨青华副教授、中国农业科学院青州烟草研究所 时焦老师和0 3 级烟草学博士生韦凤杰的大力支持，并给予了颇有意义和价值的指导； 实验还得到了师兄张保全、曾涛，0 3 级研究生李浩亮、王燕、王卫峰、尹永强、王豹 祥；0 4 级研究生王方、史金钟，0 5 级研究生郭传斌以及0 1 级实习生孑乙玉萍、李会涛、 徐光辉、刘瑞、郭瑞、韩瑞旭，0 2 级实习生杨兴、胡琼的大力帮助。感谢他们给予我 的热心帮助，没有上述这些人的支持，我的论文就不能呈现在你的面前，如果有人能 从这篇论文中受益，也请把功劳归于他们。 感谢农学院和研究生处领导所提供的良好的生活和学习环境。 谨以此文特献给我的家人，感谢他们在我三年的求学过程中，在经济和精神上对 我的默默理解、支持和鼓励，给予我战胜困难的信心、决心和勇气，伴我度过一个又 一个生活难关、走出一次又一次的精神低谷，使我顺利完成学业并走向新的生活。 在硕士学业完成、即将踏上工作岗位之际，让我再次感谢所有曾经关心我、帮助 我、鼓励我、教育我的老师和同学们，我会用从你们身上学到的知识、信心和工作精 神鼓励自己不断的前行。 张玉丰 2 0 0 6 年6 月于郑州 目录 摘要i 1 文献综述j 3 2 引言9 3 材料与方法l o 3 1 供试材料i 0 3 2 试验设计1 0 3 3 接毒和取样方法1 0 3 4 测定项目及方法1 1 4 结果与分析1 3 4 1 植物提取液对感染t m v 叶片苯丙氨酸裂解酶( p a l ) 活性、脂氧合酶( l o x ) 活性和总酚含量的影 响一? 1 3 4 1 1 对感染t m v 叶片p a l 活性的影响1 3 4 1 2 对感染t m v 叶片l o x 活性的影响：1 3 4 1 3 对感染t m v 叶片总酚含量的影响1 4 4 2 植物提取液对感染t m v 叶片膜脂过氧化的影响1 4 4 2 1 对感染t m v 叶片丙二醛( 皿a ) 含量的影响1 5 4 2 2 对感染t m v 叶片膜透性的影响1 5 4 3 植物提取液对感染t m v 叶片抗氧化酶类活性的影响1 6 4 3 1 对感染t m v 叶片超氧化物歧化酶( s o d ) 活性的影响1 6 4 3 2 对感染t m v d 。片过氧化物酶( p o d ) 活性的影响1 7 4 3 3 对感染t m v 叶片过氧化氢酶( c a t ) 活性的影响1 7 4 3 4 对感染t m v 叶片多酚氧化酶( p p o ) 活性的影响一1 8 4 4 植物提取液对感染t m 、，叶片碳氮代谢关键酶活性的影响1 9 4 4 1 对感染t m v 叶片硝酸还原酶( n r ) 活性的影响1 9 4 4 2 对感染t m v 叶片酸性转化酶( i n v ) 活性的影响1 9 4 5 植物提取液对感染t m v 叶片荧光动力学的影响2 0 4 5 1 植物提取液对最大光化学效率( f v f m ) 的影响2 0 4 5 2 植物提取液对感染t m v 叶片o p si i 的影响2 0 4 4 5 3 植物提取液对叶绿素光化学猝灭( q p ) 的影响2 1 4 5 4 植物提取液对感染t m v 叶片非光化学猝灭( n p q ) 的影响2 1 4 6 植物提取液对感染哪烟株叶片光合特性的影响2 2 4 6 1 对感染t m v 叶片叶绿素含量的影响2 2 4 6 2 对感染t m v 叶片光合速率( p n ) 的影响2 3 4 6 3 对感染t m v 叶片蒸腾速率( t r ) 的影响2 4 4 6 4 对感染t m v 叶片气孔导度( g s ) 的影响2 4 4 6 5 对感染t m v 叶片胞间c 0 ：浓度( c i ) 的影响2 5 4 7 植物提取液对烟株叶片内自由基的清除效应2 5 4 7 1 对感染t m v 叶片的0 ：。产生速率的影响2 5 4 7 2 纯植物提取液清除自由基效果2 6 4 7 3 清除0 z 一效果2 7 4 7 4 清除o h 效果2 7 4 7 5 提取液处理烟株后清除0 。一和o h 效果2 7 4 8 植物提取液对t m v 的防治效果和抑制t m v 增殖的效应2 9 4 8 1 对t m v 的防治效果2 9 4 8 2 抑制t m v 增殖的效应2 9 4 9 植物提取液对烟株农艺性状的影响3 0 4 1 0 植物提取液对根系活力的影响3 0 4 1 1 植物提取液对感染t m v 叶片病程相关蛋白( p r ) 的影响3 l 4 1 2 制剂处理对烤后烟叶品质的影响3 6 5 结论与讨论3 7 5 1 植物提取液对烟草t m v 的防治效果、抑制t i v 增殖效应和植物学性状的影响3 7 5 2 植物提取液在不同体系内对自由基的清除效果3 7 5 3 植物提取液对感染t m v 烟株叶片l o x 活性、p a l 活性和总酚含量变化的影响3 7 5 4 植物提取液对感染t m ，烟株叶片抗氧化酶类活性的影响3 8 5 5 植物提取液对感染t m v 烟株叶片膜脂过氧化及碳氮代谢的影响3 8 5 6 植物提取液对感染t m v 烟株叶片光合特性和叶绿素荧光参数的影响3 9 5 7 植物提取液对感染t m v 烟株叶片病程相关蛋白变化的影响3 9 参考文献4 1 气 - l _ _ 英文摘要4 7 附蜀专1 5 0 附蜀电2 5 2 6 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 摘要 本研究通过盆栽试验，针对烟草普通花叶病毒( t m v ) 的不同寄主( 烤烟k 3 2 6 和心叶烟) ， 采用人工对健康烟株接种t m v 诱导其发病，然后用不同种类的植物提取液，采用不同方法对烟 株进行处理，测定烟株叶片各种生理生化指标变化( 叶片抗氧化酶活性女i i p o d 、s o d 、c a t 、 p p o 等：c 、n 代谢、m d a 含量等) 、叶片光合特性、叶绿素荧光动力学参数、烟株根系活力、 病程相关蛋白( p r ) 的产生、烟株的体外防治效果以及烤后烟叶的品质等，研究了不同植物提 取液的不同处理方法防治烟草t m v 的防治效果及作用机理。试验结果如下： 1 、植物提取液具有较好的清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的效果，不同清除体系的效 果明显不同，其中以纯提取液清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的效果最好。处理感染t m v 烟株后的清除效果明显弱予纯植物提取液、健康叶和病叶体系。不同提取液清除超氧阴离子自由 基的能力为：制剂 商陆 落葵 毛叶子花；清除羟基自由基的能力为：制剂 落葵 毛叶子花 商陆。 2 、感染t m v 烟株叶片经提取液处理后，均不同程度的提高了叶片抗氧化酶活性，降低了膜 脂过氧化程度，叶片总酚含量明显增多。与健康株相比，提取液处理后的烟株叶片生理生化指标 均达到或接近健康株，甚至超过健康株，进而促进了烟株生长、增强了烟株抗病力。其中以先喷 施提取液后接毒液的烟株抗t m v 效果好。各种提取液的效果为：制剂 商陆 落葵 毛叶子花。 3 、经提取液处理的烟株叶片的光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间c 0 2 浓度均非常接近 健康烟株。采用先喷施提取液再接毒液的处理方法，在处理后第1 2 d 达到最人值，用落葵、毛叶 子花、商陆和制剂处理的烟株净光合速率分别相当于健康j 烟株的9 5 0 7 、9 2 2 2 、9 4 9 0 幂n 9 8 3 3 ：叶绿素含量明显增多；叶片p s i i 潜在的最大光化学活性f v 伊m 比值均有所增加，从而增强了 叶片光能转化，促进了叶片光合作用。其效果为：n n 落葵 商陆 毛叶子花。 4 、提取液处理明显提高了烟株根系活力，增强了叶片硝酸还原酶和转化酶活性。其中先喷 施制剂处理效果最为明显，硝酸还原酶和转化酶活性分别达到了健康烟株的1 0 7 和1 0 4 。 5 、电泳实验结果表明，经提取液处理的烟株叶片，产生新的病程相关蛋白量有差异。除了 一些共有的蛋白相继产生和消失外，还产生一些各自特有的新蛋白，其中在处理后的第3 d ，制剂 就诱导产生一条分子量为1 5 9 k d a 的特有蛋白，又分别在处理后的第6 d 、1 8 d ：手1 1 2 4 d ，诱导出三条 分子量分别为4 9 1 k d a 、5 4 1 l a 和1 6 9 k d a 的新病程相关蛋白；落葵在处理后的第9 d 诱导出所特 有的2 7 5k d a 和2 6 9k d a 新蛋白；毛叶子花分别在处理后的第6 d 、1 2 d 、1 5 d 、2 1 d 和2 4 d ，诱导出 分子量分别为5 4 2 k d a 、6 7 6 k d a 、8 4 5 k d a 、8 8 3 k d a 和6 9 4 k d a 的特有新蛋白；商陆则在处理 后的第1 5 d 诱导出1 9 5k d a 的特有蛋白。随着病程的延长，新产生的条带明显减少，诱导抗性减 弱；制剂和毛叶子花防治t m v 效果持续时间长可能与这些新蛋白的产生有关。 6 、提取液在防治普通烟草花叶病和抑制t m v 增殖方面均具有较好的作用，且预防效果明显 好于治疗效果。无论是先喷施提取液后接病毒还是先接种病毒后喷施提取液，其中制剂的防治效 果明显好于单一植物提取液处理，其防效分别达至t j 8 2 3 和7 7 3 ；抑制t m v 增殖效果分别达到 r _ 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 了5 8 0 3 和4 9 2 9 。各种提取液综合效果为：制剂 落葵 商陆 毛叶子花。 7 、烟叶化学成分检测结果表明，制剂处理能协调烟叶的化学成分，改善烟叶品质，烟叶可 用性明显提高。其中先喷施提取液再接毒液的烟叶中，钾、烟碱、总氮、总糖和还原糖含量分别 相当于健康烟株的1 0 3 4 、1 2 5 2 、1 3 6 0 1 、1 0 3 6 、1 0 2 2 和9 7 2 ，比毒液株的烟叶分 别提高了2 1 1 、4 2 8 、5 1 8 、1 2 9 、2 5 4 $ h 1 8 8 ，其中还原糖总糖、总糖烟碱、总 氮烟碱的比值分别为0 9 3 8 、7 5 0 和0 9 8 5 ，均处于比较适宜的范围。 作为天然植物提取液，对烟草花叶病毒的防治具有明显的效果。其作用机理主要表现在钝化 病毒、诱导植物产生病程相关蛋白、提高植物自身的代谢能力等方面：这种提取液对动植物无毒、 安全无公害、环保，应用前景可观。 关键词：提取液；烟草花叶病毒：效果；酶活性；膜脂过氧化；病程相关蛋白 2 f - 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 1 文献综述 烟草普通花叶病主要是由烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i cv i r u s ，t m v ) 引起的。该病是一种 普遍发生、危害严重的病毒病害，不仅严重影响产量，而且明显降低烟叶质量，降低上中等烟的 比例，由于对烟叶的外观质量和内在成份影响较大，从而降低烟叶的可用性n 1 。自从俄国学者伊 凡诺夫斯基发现t m v1 0 0 多年以来，各国学者对t m v 病原学、病害流行规律、烟草的抗性机理以 及病害的防治都作了大量研究。但由于病毒本身的特殊性，即病毒粒子侵入寄土后脱去衣壳蛋白 的同时，其核酸即与寄主核糖体相结合，开始复制病毒的初期蛋白质，病毒的增殖与寄主的代谢 融为一体，使得抑制病毒增殖的药剂很难不伤害寄主，这样就限制了抑制病毒增殖药物的应用。 近年来，国内外已有大量关于植物提取物预防和防治烟草普通花叶病方面的研究报道，从而为烟 草普通花叶病的研究开辟了新的途径，而且取得了初步成效。因此，以探索抗烟草普通花叶病的 新植物源及其抗病机理为中心的研究历来倍受重视。 1 1 植物提取物防治烟草普通花叶病效果研究进展 1 1 1 具有抗烟草普通花叶病的植物 研究发现，许多植物的提取物具有抗病毒活性心一1 。这些抗植物病毒物质主要有蛋白质类、 蛋白多糖类、糖蛋白类、多糖类和有机酸类等类型。目前已经发现商陆科、黎科和石竹科等许多 植物提取物具有抗病毒活性。紫茉莉、夏弗塔雪轮( s i l e n es c h a f t a ) 、麝香石竹( b i a n t h u s c a r y o p h y l l u s ) 、苋色藜( c h e n o p o d i u ma m a r a n t i c o l o r ) 和美洲商陆( 册t o a c c aa m e r i c a n a ) 中都含有抑制病毒蛋白。而且美洲商陆中的抗病毒蛋白( p a p ) 已被应用于不同的植物叶片，以 抵抗t m v 等机械传播病毒的侵染。此外，向本春1 等以心叶烟为指示植物，测定了菠菜提取物对 烟草花叶病毒( t m v ) 的抑制作用，结果表明，菠菜提取物对t m v 具有明显的抑制作用，但会受到 其他如温度、浓度、寄主等环境的影响：侯玉霞幅1 等研究表明，紫草、月季的抽提物具有高效选 择性的抗病毒作用。它们既抑制t m v 的增殖，又抑制t m v 对叶绿体的破坏并促进寄主植物光合作用； 喻大昭哺等研究结果表明，香菇的水提物和商陆的乙醇提取物对t m v 具有一定的预防或治疗效果； 姚宇澄从牛心朴子草中提取了抗病毒活性物质吲哚里西啶生物碱，包括7 一脱甲基娃儿藤碱与 n 一7 一脱甲基娃儿藤碱，采用浓度为1 0 一g m l 、半叶法测定枯斑抑制率达6 0 。截至目前，含有植物 病毒抑制物质的植物有商陆属植物、黎属植物、接骨本、百日红、槭属、七叶树、羌活、刺槐、 朝鲜牵牛花、红三叶草、石竹花、黄瓜、菠菜、水稻、菜豆、甜莱、柑桔、天竺葵、树莓、牦牛 儿苗、山茶、茶、蚊母林、石榴、台湾油梧桐属、黄细心、紫菜莉、弯叶细兰、水茄、马铃薯、 三叶鬼针草、大黄、连翘、板兰根、泥炭鲜、莲、榕树、柿子、杨梅、水蜈蚣、叶下珠、羊蹄甲、 菊花、心叶落葵薯、核桃、合欢、侧柏、女贞、乌头、印楝、印度萝芙夫、雪轮、雪松、阿拉伯 相思树、茉莉花、紫杉、臭牡丹、庭荠、草莓等，还有苋科的莲子草、蓼科的酸模、戟叶酸模、 虎丈、大黄等，石竹科的麝香石竹、须苞石竹、羽裂石竹：菊科的红花、向日葵、蒲公英、茵陈 蒿、翠菊；豆科的象耳豆、扁豆、干草等；百合科的弯叶丝兰、玉簪、芦荟；棕榈科的棕榈树、 3 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 槟榔：马齿苋科的红花马齿苋、马齿苋等一一0 一毛1 引。 1 1 2 抗烟草普通花叶病病毒的植物提取物的有效成分 抗病毒植物提取物成分大致包括以下几种，即：生物碱类、萜类、黄酮类、多酚类和鞣质、 香豆素类和木脂素类、苷类、多糖以及萘醌类化合物等n4 1 。目前，提取物对植物病毒病有效成分 的研究大多集中在蛋白质方面，自d u g g a r 等首次报道商陆抗病毒蛋自( p v p ) 能减轻t m v 的侵染 以来，先后有k a s s a n i s 等“引和w y a t t 、s h e r p e r d 等n 6 1 报道从商陆中分别分离出了抑制t m v 活性 的糖蛋白和1 3 k d a 大小的蛋白。截止目前，已经发现的有抑制病毒活性功效的活性物质主要有以 下几种( 表1 ) ： 表1 ： 有效成分来源有效成分类型 美洲商陆 菠菜 油菜 黄细心 零陵香等 紫茉莉 石 竹 藜科 弯叶丝兰 水仙 鼠尾草 紫草 柑 橘 叶子花 叶子花 牛心朴子草 榆黄蘑 三叶鬼针草 蛋白质( b a r b i e r i 等，1 9 8 2 ；k u n g 等，1 9 9 0 ：郭明，1 9 9 2 ) 蛋白质( b a r b i e r i 等，1 9 8 2 ) 脂肪酸( 雷新云等，1 9 8 4 ) 糖蛋白( a w a s h i ，1 9 8 5 ) 精油( b o i s h o p ，1 9 9 5 ：s h u k l a 等，1 9 8 9 ) 蛋白质( k u b o 等，1 9 9 0 ；h a b u k a 等，1 9 9 1 ：j o r g e 等，1 9 9 9 ) 蛋白质( f r o t s c h l 等，1 9 9 0 ：刘学瑞等，1 9 9 4 ) 蛋白质( s a d a s i v a m 等，1 9 9 1 ) 蛋白质( 郭明，1 9 9 2 ) 生物碱( a d a l l a h 等，1 9 9 3 ) 萜类( t a d a 等，1 9 9 4 ) 萘醌类( 李重九等，1 9 9 7 ) 类黄酮( b e n a v e n t e 等，1 9 9 7 ) 蛋白质( b a l a s a r a s w a t h i 等，1 9 9 8 ) 糖营酶( b o l o g n e s i 等，1 9 9 9 ) 吲哚里西啶生物碱( 姚宇澄，2 0 0 1 ) 蛋白质( 付呜佳，2 0 0 2 ) 黄酮甙( 陈启建，2 0 0 3 ) 1 1 3 植物提取物抗烟草普通花叶病抑制效果 国内外已有很多针对植物提取物对烟草普通花叶病具有良好抑制效果的报道，朱水方“7 1 证 明，烟草在接种t m v 病毒前7 2 h 和接种后2 4 h 喷施连翘、大黄、板兰根提取液，抑制效果均在9 0 以 上，病毒浓度下降6 0 - - - 7 0 ；林存銮n8 1 从3 7 个科9 0 种植物中筛选出小藜和玉簪，其提取物对病毒 t m v 有抑制复制和体外钝化作用；王启燕等n 训证明，板兰根水浸液能使由t m v 侵染的心叶烟枯斑减 4 r 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 少8 0 以上；翟梅枝n 3 1 等的实验结果表明，在2 6 种植物中有1 0 种植物对t m v 的抑制效果均在8 0 以 上，其中莲、榕树、柿子、杨梅、水蜈蚣、叶下珠、羊蹄甲、心叶落葵薯等抑制率在9 0 以上。陈 启建| 2 0 l 等测试了从三叶鬼针草中提取的黄酮甙对烟草花叶病毒t m v 的抑制效果，发现黄酮甙对t m v 具有明显的体外钝化作用，其质量浓度为1 0 0ug m l 时，对t m v 的抑制率可达9 1 3 ，但对烟草体内 病毒复制无显著的抑制效果。刘国坤幅等测定了1 5 种植物的单宁粗提物对t m v 的体外抑制作用， 其中1 1 种有明显的效果，从杠板归、假槟榔种子中提取的总单宁对t m v 有抑制作用，表现为与t m v 外壳蛋白结合而引起病毒侵染力下降。 1 2 植物提取物抗烟草普通花叶病作用机制研究进展 植物提取物对病毒的抑制作用机制已经有了初步认识，研究结果表明，作用机制主要表现在 以下几个方面：抑制病毒对寄主的侵染：抑制病毒增殖和叶片症状表达；诱导植物产生抗病性； 干扰病毒的装配与释放；促进烟株生长等制。 1 2 1 抑制病毒对寄主的侵染 植物提取物抑制病毒的作用原理是在病毒进入寄主体内之前，通过与病毒外壳蛋白或核酸作 用，或占据病毒在寄主上的结合位点等方式，有效的阻止病毒进入寄主细胞。对来自石竹花的抑 制物以及在美国等地普遍使用脱脂牛奶试验表明，它们可在植物叶子表面形成一层薄膜，覆盖于 植物表面的伤口上，减少病毒感受点，对由于机械摩擦传染和蚜虫传染的植物病毒，有一定的抑 制作用瞳刳：其次是钝化病毒的侵染性，k u b o 瞻3 等发现的抗病毒农药海藻酸多聚体及m a e d a 提取的 香菇素都具有使t m v 聚集的能力，它们的抑制作用是通过使病毒粒子聚集而失去侵染力来实现的； 从商陆汁液中提取出的蛋白质p a p 可与t m v 结合，降低t m v 侵染活性；某些五羟基黄酮类似物则可 以与病毒粒子形成稳定的复合物，减弱病毒亚基间的结合，使r n a 暴露，破坏病毒粒子的完整性， 从而降低病毒的侵染性。另外，邱德文等幢钔报道硫脲基磷酰胺酯类化合物对t m v 病毒颗粒有很强 的吸附作用，能与病毒粒子结合使其失去侵染能力。 1 2 2 抑制病毒增殖 抑制病毒增殖的植物提取液和其它化学制剂多为碱基类似物或碱基前体类似物，它们通过对 病毒r n a 复制过程和病毒蛋白表达过程的抑制或干扰，发挥抗病毒能力。候玉霞曙副等从紫草中提 取出的p z i 成分，可抑制t 州增殖。其作用方式主要是抑制t m v r n a 与核糖体结合，并抑制t m v r n a 合成，从而抑制了病毒蛋白的合成。病毒唑是种应用广泛的植物抗病毒剂，无论对d n a 病毒还 是对r n a 病毒都具有定的防治效果，通过多种途径实现对植物病毒增殖过程的干扰和抑制作用； 还有一些试验证明病毒唑的作用对象是r n a 聚合酶和m r n a 。此外病毒唑还具有遗恨子核糖核蛋白 体生物合成的功能，干扰植物体内g m p 的生物合成、消耗植物细胞内g t p 及干扰植物体激素平衡的 作用；由德国人s c h u s t e r 汹首次研究开发出的植物病毒治疗齐l j d h t ，其作用于病毒复制前期阶段， 作为尿嘧啶的类似物，可能是通过干扰u m p 的形成来抑制病毒r n a 的复制。3 2 p 标记试验证明，d h t 5 l 一 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 可抑制病毒r n a 的合成，而对植物r n a 的合成没有影响。 1 2 3 诱导植物产生抗病性 诱导抗性现象最早l 扫r a r w o o d 发现，是指利用物理的、化学的以及生物的方法预先处理植 物后，再进行挑战性接种( 第二次接种) ，将会导致病害反应的改变，使原来的感病反应产生局 部或系统的抗性。由于诱导抗病性具有多抗、高抗和卫生安全等优点，因而成为烟草花叶病防治 的理想途径。自r a r w o o d 署h r o s s 瞳引首先报道烟草对t m v 的诱导抗性以来，研究者不断发现许多能够 具有抗性诱导作用的化学物质，并认为“植物的诱导抗病性是植物王国中的普遍现象”。诱导植 物抗性的机制比较复杂，它是一系列代谢活动的综合表达。研究结果表现为以下几个方面，即体 内植保素类、木质素类物质积累、防御性酶活性变化和新的蛋白质的出现他9 1 。 1 2 3 1 植保素类、木质素类、活性氧等物质的产生 植物在与病原相互作用的长期进化过程中，通过各种代谢途径形成了与抗病原有关的物质， 有些是原来植物体本身存在的，而有些是病原感染后诱导而成，主要有以+ f j l 种：木质素、植保 素、活性氧等。章玉苹啪1 等研究发现，壳聚糖作为植物体内的诱导物，能诱导作物一系列的防御 反应，提高寄主自身的抗病能力，产生具有抗病毒的活性物质如植保素或抗毒素等，同时也能调 节作物生长、发育及在逆境中的生存能力，而且已经证实壳聚糖的抗病毒能力与其聚合度有关。 木质素是构成植物细胞壁的主要物质，与植物的抗病性密切相关，主要表现为随着小质化程 度的加强，即木质素含量的增加，从而为阻止病原对寄主的进一步侵染提供了有效的保护屏障。 骆桂芬m 1 等的研究结果表明，叶片中木质素的含量，随诱导抗性程度的增强而增加。 植保素是植物受生物或非生物冈素侵袭后在体内合成并积累的低分子量的抗菌性物质，由丁 植保素具有侵染可诱导性和体外抗菌活性，它的合成与积累且产生的速度和积累量与植物抗病性 有关，因而被认为是植物的一种重要抗病机制。病原菌侵入后以侵染点为中心形成坏死斑，使病 原菌的生长受抑制，从而阻止病斑扩大，在未侵染的细胞中形成植保素阻碍病原菌继续扩展【3 纠。 活性氧( a c t i v e o x y g e n ，简称a o ) 是分子态氧( 0 2 ) 还原以后产生的活性态氧的总称，包括 超氧阴离子自由基( s u p e r o x i d ea n i o n ) 、羟基自由基( h y d r o x y lr a d i c a l ) 、过氧羟基自由基 ( h y d r o p e r x y lr a d i c a l ) 和单线态氧( s i n g l e to x y g e n ) 等。植物的正常生长发育总是伴随着 a 0 代谢的发生，一般来讲，植物体内a 0 的产生与清除处于动态平衡。如果植物受到了逆境的胁迫 导致a 0 大量积累时，植物会出现伤害，甚至死亡。近几年来研究表明，a 0 代谢与植物的抗病性有 关，即a 0 参与了植物与病原物互作体系中的许多关键过程，包括抗病信号转导( s i g n a l t r a n s d u c t o n ) 、抗菌作用( a n t i m i c r o b i a le f f e c t ) 、抗膜脂氧化( m e m b r a n el i p o x i d a t i o n ) 、 细胞壁强化( c e l l w a l lm o d i f i c a t i o n ) 、植保素合成( p h y t o a l e x i ns y n t h e s i s ) 和过敏性细胞死 亡( h y p e r s e n s i t i v ec e l ld e a t h ) 等。 1 2 3 2 叶片中某些与抗病相关的酶 6 r ， 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 诱导抗性过程中包含着许多酶活性的变化。杨献营1 证明，用c l a d o s p o r al a g e n a r i u m 接种 黄瓜，叶片内过氧化物酶活性提高了近三倍，而且这种增长是整体性的。张晓燕口5 | 等的研究表明， v a ( 生物制剂) 可以显著的诱导感染t m v 的烟草植株产生抗性，同时可以明显提高与抗病相关的 酶如p a l ( 苯丙氨酸解氨酶) 、s o d ( 超氧化物歧化酶) 、p o d ( 过氧化物酶) 、l o x ( 脂氧合酶) 等 的活性。与诱导抗性有关的另外两种酶是几丁质酶和b - 1 ，3 一葡聚糖酶，它们不但能够催化病原 物细胞壁的降解，而且能够产生诱发保卫机制的糖苷类物质m 3 。 1 2 3 3 病程相关蛋白( 限) 的诱导 诱导抗性是非专化性的，一些病原物甚至一些化学药物均具有抗性诱导能力，通过诱导激活 作物的潜在抗病性，甚至可能在后代连续诱导形成诱抗品种。许多化学冈子和生物因子能够诱导 心叶烟产生抗病毒蛋白因子( i v f ) 7 1 。江山等【3 引和孙风成等旧9 1 分别用几种抗病毒制剂和耐病毒 诱导剂8 8 咖作诱导因子，结果发现可以诱导植物产生抗性并伴随p r 蛋白的产生：然而，k a s s a n i s 等h 0 | 研究提出，p r 蛋白在寄主体内虽然积累，但对病毒无作用。v e r m a 等n 发现c l e o d e n d r u m a c u l e a t u m 这种植物的提取液可以系统诱导植物产生抗性，其机制是提取液中的一种碱性蛋白可 以诱导寄主产生一种抗病毒的蛋白阻止病毒的侵入。一些化学药物也能够诱导获得性免疫和p r 蛋白( 病程相关蛋白) 的产生，p r 蛋白自身没有抗病毒活性，却总伴随着获得性免疫的产生。 1 2 3 4 抗病反应的信号物质 诱导抗病性不仅与过氧化物酶( p o d ) 、多酚氧化酶( p p o ) 、苯丙氨酸解氮酶( p a l ) 、几 丁质酶等酶活性有关，更依赖于信号等分子水平上的机制h 引。在植物抗病反应过程中，抗病信号 必须由内源信号分子从受侵染部位传导至整株植物，引起相应的系统性抗性，因而内源信号分子 在植物抗病信号传导途径中起重要作用。目前研究较多的植物内源信号分子是水杨酸( s a l i c y l i c a c i d ，s a ) ，荣莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 。 1 9 7 9 年w h i t e 首先发现施用阿司匹林和水杨酸( s a ) 可以诱导烟草对t m v 产生抗病作用， 后来许多证据都表明水杨酸在植物抗病中确实起重要作用h 引：作为激发因子，s a 可以诱导许多 植物的病程相关蛋白( p r ) 及其m r n a 的积累，除此之外，还可诱导多种植物产生对真菌、细菌、 病毒等多种病原菌的抗性和系统获得抗性( s a r ) h 引；另外，s a 还可以通过调节保护酶系及活性 氧的水平和抑制病原分泌的植物细胞壁降解酶活性以增强植物的抗病性h 引。 据报道，j a ( 或m e j a ) 在受伤或经抗病原菌激发子处理后的植物及细胞培养物中大量累积。 以不同水平的m e j a 处理后的马铃薯抗植物病原侵染的能力有所提高。j a m e j a 可在植株间传递 抗性信息，诱导许多参与植物防御反应的物质合成。如植物蛋白酶抑制剂中有些属于诱导型抑制 剂，能被j a m e j a 诱导m 1 。这种物质不仅可以调节蛋白酶的合成，而且可以保护植物细胞免受自 身蛋白酶破坏而维持细胞正常的生理生化代谢，防止植物被真菌、细菌等病原微生物侵染。m e j a 也能诱导其它抗性物质如硫素蛋白、植物抗毒素等合成。一般认为j a m e j a 可在植物体内( 包括 细胞内) 和植株间传递抗性信息”。 7 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 1 2 4 干扰病毒的装配与释放 植物提取物只要能够对侵人寄主的病毒脱农壳、复制、病毒蛋白合成、病毒装配和胞间运动 扩散等环节中的某一个或几个环节就具有抑制作用，可以表现防治病毒病的作用。a e t h u r 等h 8 1 提出，多胺是含氮生物碱，极易与核酸和蛋白质结合，多胺不仅能抑制病毒复制，还参与寄土与 病原互作的某些信号过程；李重九等h 鲫研究认为，丙酰草素能与t h l v 相结合，形成病毒化合物 复合体，从而抑制了病毒的侵染；江山等m 1 研究发现e 3 ( g 烷基单磺酸) 对t i v 衣壳蛋白聚 合过程的抑制作用最强，其次是3 种碱基类似物：d h t 、d a d h t 和病毒唑；n s 8 3 和大豆卵磷酯也 有一定的抑制作用哺。这些防治剂与病毒衣壳蛋白的相互作用阻碍了病毒的装配，因此起到防治 病毒病的作用。 1 2 5 促进植株生长 长期的生产实践表明，良好的营养条件可以提高植物的抗病能力，增强植物对病毒的忍受力， 使病毒危害症状减轻或推迟发生。例如吴尔福m 1 研制的t s 制剂( 由植物生长调节物质表面活性 钝化剂、免疫剂、离子菌剂等组成) ，处理t m v 侵染的植株后，植株叶绿素含量平均增加1 7 6 2 ， 叶绿体的光还原能力提高了7 8 5 ，细胞分裂素含量提高1 7 3 7 。许多植物激素或其类似物的抗 病毒活性也都是通过这一途径实现的，赤霉素、植物激动素、乙烯利笛约剂与病毒唑复合使用， 不仅可以抑制病毒的增殖，而且避免了病毒唑对植物造成的危害；萘乙酸可抑制例的增殖；以 质量浓度为2 5ug m 11 的激动素喷施在蔓陀罗上，可显著减少t m r 产生的枯斑数，同时也能抑 制t m v 在叶片中的积累，虽然细胞激动素不能抑制t m v 的增殖，但可使对t m v 发生过敏反应的烟 草获得耐病性。另外，周冀衡哺引研究表明：当烟叶含钾量提高后不仅可以增强细胞膜的稳定性， 降低病毒侵染对烟草叶片细胞膜脂的伤害，而且还能明显提高叶片内源保护酶s o d 、p o d 、c a t 、 p p o 等的活性，从而达到抑制烟草花叶病毒的效果。 总之，从植物中筛选抗植物病毒的天然活性物质，不同抽提方法的产物对病毒作用的机制和 强度并不完全一样。利用植物抽提液研制抗病毒制剂已取得显著成效，许多抑制剂的有效成分得 到分离和纯化，对植物病毒病具有良好预防和治疗作用，但大多停留在实验室阶段，要在生产上 大面积应用于防治植物病毒病，还存在许多问题，如提取工艺复杂、原材料繁殖、成本高、对植 物的安全性等都不同程度的限制了产品的开发。随着生物工程技术的应用，利用转基因方法进行 工厂化生产抗病毒病产品，必将促进植物源抗病毒活性物质的开发与应用。 8 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 2 引言 烟草在生长发育过程中，受到许多病虫害的侵染。病毒病是其中一种较严重的病害。由于目 前尚无法完全遏制病毒侵染以及缺乏针对病毒的有效药物，致使病毒病防治难度较大。烟草是以 收获叶片为主要特征的经济植物，烟草花叶病的发生使得烟草叶片的产量和品质严重下降，成为 优质烟叶生产的制约因素之一，特别是近几年田间经常出现病毒粒子复合侵染现象，更是加重了 烟草花叶病对烟草植株的危害，使病毒症状更加复杂化，据吴云峰惜4 1 报道，全世界每年冈烟草 花叶病的危害造成的损失就达到1 亿多美元。另据陈瑞泰隋副报道，1 9 8 9 - 一1 9 9 1 年的3 年中，每 年我国主要烟区花叶病发病面积达1 8 7 万h m 2 ，产量损失8 8 6 5 0 k g ，产值损失2 3 亿元。同时， 大量试验和研究结果表明，传统的栽培措施对烟草花叶病仅仅起到有限的预防作片j ；尽管基因工 程为防病育种提供了捷径，但由于转基冈植物还存在一定的不足之处，实际生产上还没有得到一 致认可邮5 ；化学防治效果快捷，但毒副作用大、残留大且易产生耐药性。因此，目前最佳的 防治烟草花叶病毒的药剂仍然缺乏。 植物提取物对病毒侵染的抗性主要有两种方式，一种是基于植物本身| 刮有的抗病能力，另一 种是诱导植物抗病。前者指植物细胞内含有抑制病毒增殖的物质，或植物细胞内缺乏某些使病毒 增殖及致病所需的辅助因子，因而病毒无法复制，例如烟草中的n 基因可以抗烟草花叶病毒侵 染晡；后者则是指用一些物质处理植株或病毒侵染的植株后，诱导植物对随后的病毒侵染产生抗 性，如水杨酸( s a ) 拍9 眠6 1 一纠、寡糖旧川1 、精胺旧1 、油菜素类固醇3 等。 植物提取液抗烟草花叶病理论在国内外进行了大量的研究，对其防治的作用机理有了一定的 明确。但植物病毒抑制剂开发应用尚无实质性的突破。我国植物资源丰富，植物提取物不但具有 抑杀病毒的作用，而且能够调节机体的免疫及具有非特异性的抗病毒功能。同时，其活性成分能 够在自然界完全降解，不会污染环境，具有副作用小、资源丰富、价格低廉等优势。尽管植物提 取物对病毒有一定的防效，但由于其成分复杂，在实际生产应用上稳定性往往较差，要从植物中 开发出安全、有效的抗病毒制剂，还需对植物提取物中抗病毒活性物质及其作用机理等进行深入 研究。迄今在植物提取物防治烟草花叶病毒病的研究中，其作用机理研究大多集中在抑制病毒对 寄主侵染、抑制病毒复制、诱导寄主产生抗病性和促进植株生长等方面。但生理生化方面研究较 少，而且所报道的植物提取液的防治烟草花叶病毒病的效果不甚理想。 烟草花叶病毒病有t m v 和c m v 之分，但生产上仍以t m v 为主。本试验利用不同植物提 取液处理感染烟草t m v 的烟株，在测量烟株的农艺性状、检测烟叶的生理生化指标和烟叶品质 变化的同时，特别利用电泳技术分析诱导病程相关蛋白产生情况，进而筛选出可以较好的抗烟草 普通花叶病的植物，为研制出预防和防治烟草普通花叶病毒的高效、低毒、低残留安全的生物制 剂，以及为在烟草生产上的应用提供理论依据。 9 植物提取液防治烟草t m v 效果及作用机理研究 3 材料与方法 3 1供试材料 供试品种为系统侵染寄主普通烟( n i c o t i a n at o b a c u mc vk 3 2 6 ) 和局部枯斑寄主心叶烟 ( n g u t i n o s a l ) ；所选植物种类是落葵( b a s e l l ar u r a ll ，代号l ) 、毛叶子花( b o u g a i n v i l l e a s p e c t a b i l i s 趼删，代号m ) 和商陆( p h y t o l a c c aa m e r i c a n a ，代号s ) ，它们的提取液的提取方 法是：分别取新鲜叶片，用蒸馏水洗净并吸干表面水分，去叶尖及叶基部，加0 0 1 m o l l 1p h 7 的磷酸缓冲液进行提取( w ：v = 1 ：1 0 ) ，冰浴研磨后在5 0 0 0 r m i n 条件下离一心1 5 m i n ，上层液即为 植物提取液；制剂( 代号为z ) 为本实验室提供，它是含有上述三种植物在内的十几种植物的提 取液。 病毒的提纯：取经纯t m ，( 纯化t m v 由中国农业科学院青州烟草研究所时焦老师提供) 感染的 病叶，冷冻，加入0 5m o l l p b sp h 7 2 ( 含0 1 巯基+ 乙醇和o 0 1m o l l 叫e d t a - n a ) ，组织捣 碎成匀浆，双层纱布过滤，得滤液；5 0 0 0 r m i n 。1 离一心2 0 m i n ，留上清液，加6 p e g 、l t r i t o n x - - i 0 0 和0 1 m o l l n a c l ，磁力搅拌待p e g 充分溶解，4 c 冰箱过夜，8 0 0 0 r m i n1 离一心2 5 m i n ，收 沉淀悬浮于0 0 1m o l l p b sp h 7 2 ( 含0 1m o l l m g c l 2 ) ，6 0 0 0r m i n 叫离，心2 0 m i n ，得上清 液，加入1 5 蔗糖，4 0 0 0 r m i n 。离心2 h ，收沉淀悬浮于0 0 1m o l l p b sp h 7 2 ，1 0 0 0 0r m i n 1 离一心1 5 m i n ，得上清液( 保存于- 2 0 。c ) 即为接毒液n 2 引。 3 2 试验设计 试验于2