（儿科学专业论文）小鼠心脏神经嵴细胞的生物学特性及其相关基因研究.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注鞠致谢的遗方外，不包含其德大或其它桃稳已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了潺意。 作者签名 论文使用授权声明 日期：型! ! ：竺 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阏；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段缳存论文。僳密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：堂! 叁 导师签名：逝日期：丛翌：! c 1 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究中文摘要 小鼠心脏神经嵴细胞的生物学特性及其相关基因研究 中文摘要 圆锥动脉干是在心脏胚胎发育时期连接动脉弓的动脉干和连接心室的圆锥 部的总称。心脏圆锥动脉干缺损是圆锥动脉干发育障碍所造成的一类先天性心脏 病，包括法洛四联症、大动脉转位、右室双出口、永存动脉干等多种导致紫绀和 低氧血症的心脏复杂畸形，这类复杂心血管畸形约占先天性心脏病的3 0 。人 类c i d 的发病机制复杂，但近二十年来的研究发现提示，c o 蚰e x i n4 3 ( c x 4 3 ) 基因及心脏神经嵴细胞与心脏锥干部发育密切相关心脏神经嵴细胞是从枕部神 经嵴分化出来的一群细胞，这群细胞通过第3 ，4 ，6 咽弓向原始心管迁移，最后 停留在动脉干和动脉圆锥等部位分化为问充质细胞，主要参与心脏流出道隔及大 血管的形成。研究发现，如果在迁移之前切除散发到第3 、4 、6 咽弓的神经嵴细 胞，就会出现永存动脉干、主动脉骑跨、右室双出口、主动脉弓畸型和室间隔缺 损等心血管畸形，且切除的长度与畸形的种类相关，如切除长度大于两个体节可 产生永存动脉干，切除长度小于两个体节则产生右室双流出道，由此可见，心脏 神经嵴细胞对于心脏圆锥部的发育意义重大。c x 4 3 是细胞缝隙连接基因家族的 成员之一，近年的研究发现其与心血管发育密切相关。研究发现，c x 4 3 基因剔 除小鼠、过量表达c x 4 3 的c m v 4 3 转基因小鼠和显性失活抑制c x 4 3 组成的细胞 间隙的信息交流的f c 转基因小鼠均可见右室流出道畸形和梗阻，从而说明， 精确的c “3 基因表达对于圆锥部的发育至关重要。在小鼠胚胎发育过程中，c x 4 3 大量表达于迁移性神经嵴细胞之上( 最早于e d 9 5 d 即可见) ，并参与形成心脏神 经嵴细胞的缝隙连接。越来越多的研究提示c x 4 3 可能通过调节心脏神经嵴的行 为而间接影响心脏的形态发生。因此，本课题利用c x 4 3 基因剔除( 1 m o c k o u t ， k 0 ) 小鼠模型结合日益发展的基因芯片技术进行研究，旨在研究c x 4 3 基因对心 脏神经嵴的诱导、发生、分离、迁移、分化的调控机制，进一步阐明c x 4 3 影响 心脏圆锥发育过程其可能的分子机制 2 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉千畸形的发病机制研究中文摘要 第一部分小鼠心脏神经嵴细胞的体外培养与生物学特性研究 研究目的 体外培养和鉴定心脏神经嵴细胞，并探讨其增殖、迁移及分化等生物学特性 材料与方法 成年2 月龄c 5 7 ，b l 6 小鼠交配，取e d 8 5 d 小鼠胚胎枕中部至第3 体节神经 管，应用包含碱性纤维生长因子( b e g f ) 和表皮细胞生长因子( e g f ) 的无血 清培养基培养，利用m r r 法检测细胞增殖能力，利用流式细胞仪检测细胞周期， 采用转录激活因子纽( a p - 缸，a c l i v a t o rp r i 咖i n 2 a ) 作为其生物学标记物，观 察其增殖状况、细胞周期、迁移、分化等生物学特性。 结果 从胎鼠神经管中分离培养的细胞增殖旺盛，a p 缸表达阳性，细胞具有明显 迁移特性，传代后以含血清培养基培养后能诱导分化成神经元和神经胶质细胞。 小结 1 采用无血清培养技术在体外培养可成功获得心脏神经嵴细胞； 2 体外培养的心脏神经靖细胞增殖旺盛，具有迁移特性和多向潜能分化能力 第二部分c x 4 3 基因敲除鼠心脏神经嵴细胞的基因表达及验证 研究目的 研究c x 4 3 基因敲除( c x 4 3k o ) 小鼠胚胎心脏神经嵴细胞中基因表达谱的改 变，筛选可能导致c x 4 3 k 0 小鼠圆锥动脉干畸形的相关基因，并探讨相关机制。 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉千畸形的发病机制研究 中文摘要 材料与方法 以胎龄( e l b r y o i l i cd a y ，e d ) 8 5 天的c x 4 3 k 0 和野生型( c x 4 3 w r ) 鼠胚心 脏神经嵴细胞为研究对象，分别提取总r n a ，逆转录成c d n & 并在体外转录 为c r n a ，同时进行生物素标记及片段化；再与a 自睁m e t i i x - 4 3 02 o 基因芯片进 行杂交。杂交信号经扫描后，应用相关生物信息软件分析基因表达情况。选取部 分差异基因应用r t p c r 方法验证基因芯片结果的可靠性。 结果 l 、与、t 组相比，c x 4 3 k o 组中表达上调2 倍以上的基因共有2 8 8 个，表达下 调2 倍以上的基因有1 2 4 个。这些差异基因主要涉及转录调控、细胞运动、 细胞周期及代谢等多种功能，其中与转录调控相关的基因数改变最多。 2 、p t p c r 结果与基因芯片结果相符，a 晦m e 仃奴基因芯片结果能够很好的反映 c x 4 3 敲除鼠心脏神经嵴细胞与野生型鼠心脏神经嵴细胞的差异基因表达。 小结 利用基因芯片技术初步筛选出c x 4 3 k 0 鼠心脏神经嵴细胞中多个差异基因， 这些差异基因主要涉及转录调控、细胞运动、细胞周期及代谢等多种功能，其中 转录调控相关基因数改变最多，提示c x 4 3 可能主要通过转录调控等途径影响心 脏神经嵴细胞的诱导、发生、分离、迁移等生物学功能并最终影响心脏圆锥部的 发育。 【关键词l连接蛋白4 3 ；心脏发育；先天性心脏病；基因芯片；神经嵴细胞 【中图分类号】q 9 5 4 6 6 ；q 3 “+ 1 3 4 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究英文摘要 b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fm o u s ec a r d i a cn e u r a i c r e s tc e u sa n dt h ea s s o c i a t e dg e n e s a b s n 翟c t c o t i 瑚sa n 鲥。鼠培i st h ec 0 锄n c a lp o s i t i i n c i u d i n gc o n e c t e dt n m c u s a r t e f i o m s 锄dp a f t i a lv e n 函c l ei n v o l v e d c o n o 仃i i n c a ld e f b c t s ( c t i ) ) i sai 【i i l do f c o m p l i c a t e dh r td i s e a 诚hc y 粕o s i sa n dh y p o 髓i i i i a ，i n d u d i n g 删o g yo f f a l l o t ( t o f ) ，锄s p o s i t i o no f n 蟛盼ta n 耐e s ( t g 舢，d a u b b o u n e t 啦灿v e n n i d ep o r v ) ， p e r s i s t e m 们i n a l sa n 鲥o m s a ) ，w l l i c ha c c 伽| n t s 蠡吖3 0 o fc o n 蹦d t a lh 础 d i s e a a h h o u g ht h em e c l l a n i 蛐o fh u m 蛐c o n o t m n c a id c 触si sc o m p l i t e d ， s t i i d i e sh a v ed l o w nt l l a tc 0 舢蒯n 4 3a i l d r d i 删r a lc 他s tc e l l s ( ( = n c c s ) d o 鲥y r e l a t e dt o 仃咖c a ld c v e l o p m e m q 屹c 8 1 i g f a t e 丘口m3 ，4 ，6p h a r y n g e a lg l a l l d 协 o r i g i n a lh 朗nt i l b e ，l o l i z e 砒饥l n c u sa r t 舐o s u sa n dc m o t n m c a lr e 萄，d i 任b 坞m i 砒e i m om e 始n d l y m a tc e l l st l l a tg i v er i t o 曲峙f b 珊砒i o fo 咖o wt r a c t p t i l ma n d b l o o dv s e l h e 叭m a l f o 删a t i o n ，跚c h 鹤p t a ，d 0 l r v ，v s d 柚da o r 如a r c h m a l f o m 谢o i i ，w e 陀d e t t e dw 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s e d mc n c c sd u i i n gm i 鲥i ( 鹊d y 砒e d 9 5 d ) ， w h i c ha l t a l 【e p a n i n g a p j u n c t i o n f o 眦a t i o no f c n c c 8 l 碰s o f s t i i d i e s i l l d i c a t e 蛳 c x 4 3 咖l ya f 触h e a nd e v e l o p m e mt l l i 0 u g h 嘲；i l l a t i n gt i l eb i o l o g i lc h a r a c t e r i s t i c s 0 f c n c c s 5 c “3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究 英文捕要 l i e e ，i i lt h i s 咖d y 啊，eu s e dc x 4 3 k 0m o u a n dl n i c f o a n 可t h l o g yt o 唧i o 托t l 地r o l eo fc x 4 3i na 岱斌i i l gt h ei l l d u 面o l i ，g 朗盯a t i 0 i i d e i 锄i i l 砒i o n m i g r a t i o na n dd i 丘打e m i a t i o n0 fc a r d i a c 玳u r a lc r e s tc e l l s ，a n dt l l e 他f o r ef i l n h 盯旭吼l t h em o i e c u l 盯m i l a i l i s m so f t h e 玳) n m lm a l f o m a t i si nc x 4 3 k om i c e p a r ti i s o i a 6 0 n ，c l l l t i v a t i o na n db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i 鹤a n a l y s i s o fc a r d i a c 肿u m lc 嗍tc e o fe m b r y o n i cm i c e o b j 雠t i v e t oa 吐a b l i s ht h ei n v 珀r 0a d l i l 托m e t h o d 3o fc a r d i a cn a 枷c r e 吼c d l so f 伽曲r y o n i cm i c ea n di d e m i 句t h e i rb i o l o g i c a lp m p e r s 鲫c h 鹪p r o l i f 锄t i o n p a c i t y ， m i 鲈a 虹a l l dd i 行b 他n t i a t i p o t 朋商a i f 肌r a l 砌坞si l 砒e d 舶mt h er 晒o nb e t w e 锄i i l i d 舐cp l a c o d ea n dt h j 阳m i 协 o fm o u e m b r y oa le d8 5 dw e 他a d t l i r e di nd 匝m f 1 2s 栅m 一丘m e d i u m c o m a i n i n gb 粕i cf i b r o b l a s t 鲈a m 矗l c t o r g f ) a n de p i d 锄a lg f o w l l l 觚0 r 但g f ) t 五ec e i lc y d eo fc n c c sw 黼柚a l y z e d 谢t l in o wc y t o m e h mt h ep r 洲【觚t i o n c a p a b i l i 哆w 船d e t 咖咖e db ym r rm e t l l o d ，a p 一2 ae x p 化s s i o nw 鹬d e t e c c c db y i m m u n o c y t o c h e m i s t r y 鹞ab i o l o g i c a lm a f k 盯o fc 盯d i n e u r a lc 瞄t u s t h e f e a t l l | 瑚o fn l i g r a t i o n ，枷i t i - d i 豫：t i o n a ld 珊b r e n t i a t i o nw e o b s 州嬲w e l l i h e f f r t 锄dc e l lc y c l ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tc e n sp l d n 蠡嚣a t e da c t i v e l y a p - 2 ao 币r e s s e da b i l 玳l a i l t l yi nt h ea l h u r e dn e u f a ic r 眦s ，w h i c hw 酗o f t h ea b i l 姆 o f l l l i g r a t i o na n d 、a sa b l et od i f f b 他m i 砒ei m on e u r o 珊锄d 蜘c y t e s 鹞w e l l c o n d u l i o n 摹 1 t h ec a r d i a cn e u r a lc s tc e l l so fm o u 伽曲r y o 咖b e 蛐c c s f h l l y 锄l n l r e di l l v m 6 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机耕研究英文摘要 2 t _ i l e l 伯r e do d l sh 4 v et h ea b i l 时o fp f o l i f 孤i o qi i l i g r a t i 觚dt b ep o t e n l i a i o f 舢l t i - d i 他c t i o n a ld i f f 吼n t i a t i o n p a r t d i 凰咖t i a n y 旺p r 鹤s e dg e n 鹤i n 恤ec x 4 3k n o c k o u tc a r d i a c n e u r a lc r e s tc e i l so fm i c e o b j e c t i v e t bi n v e 妇g 砒ec ：h a i l g 部o fg 即e 曰甲坤媚i o ni l lt l l ec a r d i a cn e u r a lc f e 毗n si n c x 4 3k c k o i i tm 叫s e 锄b r y o ，龃d 协e l u c i d a t et h eg 钮懿i n v o i v i n gi n 也e p “h o 静嵋s i so f c 0 加协m c a li i l a l 向a t i o ni nc x 4 3l d l o c k o i i tm o u m e t h o d t h ec d n aw 勰他蚋) n 硼埔嘶b e df 岫mr n a 蝴e d 丘o mc a r d i n e u r a lc r e 吼 c e n so fb o t l lc x 4 3l 【i l o c k o l i ta l l dc x 4 3 诵l d t y p em o u e m b r y o s e d 8 5 d n 把 b i o t i n - l a b e l e dc r n a 涮v e d 矗| o mt h et f a n s 嘶t i o fc d n aw 勰：丘鹋m e n t e d 私 p r o b 骼1 kp f o b 瞄w e r eh y b r i d i z e d 耐t l la 晦m e t f 奴m o u s e6 e m e4 3 02 o 蛔 ( 洳ea r 髓ys n n e rw 船u s e dt os c r 啪t h es i g n a i so fh 州d i z a t i o na n dt h e 唧r 8 i o no fg e sw 私d e t e c t e d 鼬撇w 鼬u t i l i z e dt oc o 蚯mn 蛇c h a n g e so f p a r t i a lg 蛐e st h a lw e r ed d e c t e db ya 丘y m e t r i xm o u s ei 蕊o m e 4 3 02 oa m y r 船u i 臼 1 a i l l o l l gt h ed i 侬髓n i l y 唧旭s s e dg e n e s ，t h 肿w 2 8 8u p r e j ；i l l a t e da n d1 2 4 d o 啪佗毋l l a 湖i l i 臼叱c so f c x 4 3k n o c k o 眦m i c e 髂c o m p a r e d 晰t l it h o o f c x 4 3 谢l dt y p el n i c e f u n c t i 鲫o fp r m e i n s 舶c o d e db y 龇a l t e f e d 鲫 蚰c o m p a s 3 e da l lf h n c t i o n a lc a t 9 9 嘶韶，w 弛l a r 驴s tp 盯c e n t a g ei ng 锄e si n v o l v e d i nr e g u i a t i o no f 饥m 蚴j p t i ，u 珊砸l 蚵，o e c y c l e 柚dm e t a b o l i s i i l 2 t i l ed a 协o f r t - p c ri n d i c a t et h a t 倒似a r i 可僦l l t sa c c i j r a t e l yr e n e c tc h a n g e s i ng ee 印r e s s i o np 眦锄si i lc 盯d i n 饥r a lc 豫船o fc 】一3 k 0m 髓 c o m p a r e d 耐t l lm o o f 、j l r tm o u 7 c 1 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究 英文摘要 c o n c i u s i o n s b yc d n aa 啪yt e c h n o l o g y 、ec o m p a r ec h a n 雩r e si ng e n ee 啦陀s s i o nb e t w 嘲 c n c c so f c x 4 3k om 叫锄dt h o o f 、t 啪m e i nw l l i c hg e 鹏s 州瞰e dt 0 r e g u i a t i o n “t 舢s 嘶p t i o nc i i a n g e dm o 吼，i n d i c a t i i i gc x 4 3m a y 碉i b c tt h ef h n c t i o no f c 盯d i n e 删c 佗s tc e n st i l r d u g hr e g u l a t i o no f 仃锄l s c r i p t i o n 、 瞰e yw o 岫lc o n n 虹i n 4 3 ； h e a r t d 钾e i o p m e n t ； n g e n n 柚 h 既r t d 缸e 柏e ； m i c m a m y ；n 伽r 柚c 嘲tc d b 【c l c 咖m b 州q 9 5 4 6 6 ；q 3 4 4 + 1 3 s c 1 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究 前言 小鼠心脏神经嵴细胞的生物学特性及其相关基因研究 前言 先天性心脏病( 先心病) 是我国l 岁以下婴儿最主要的死亡原因之一。先心 病发病率为6 l o 。按照我国每年新出生婴儿1 5 0 0 2 0 0 0 万来计算，每年新 生婴儿中患先心病者有1 5 万左右，其中有右室流出道梗阻的复杂畸形约占3 3 3 8 。因此寻找此类先心病的病因，揭示其发病机理，对于开展先心病的预防或 在其发病早期进行干预，具有十分重要的意义。先天性锥干畸形( c t d ) 是胚胎 时期圆锥动脉干发育障碍所造成的一类先天性心脏病，包括法洛氏四联症、大动 脉换位、右室双出口、肺动脉闭锁、动脉单干和主动脉弓离断等，这类复杂心血 管畸形约占先心病的3 0 。人类c t d 的发病机制复杂，但近二十年来的研究 发现提示，c 咖e 菇n4 3 ( c x 4 3 ) 基因及心脏神经嵴细胞与心脏锥干部发育密切 相关。 1 心脏神经嵴细胞与心脏圆锥动脉干发育 神经嵴细胞来源于外胚层，是脊椎动物胚胎发育过程中的一个暂时性结构， 它起源于神经板两侧的神经褶( 图1 ) ，在胚胎发育至7 天时，从枕部神经嵴分 化出来的一群细胞，即称为心脏神经嵴细胞，这群细胞通过第3 ，4 ，6 咽弓向原 始心管迁移，最后停留在动脉干和动脉圆锥等部位分化为间充质细胞，主要参与 心脏流出道隔及大血管的形成( 图2 ) 。近年来在鸡胚研究中发现，神经嵴细胞 在心脏血管发育中起着重要作用，切除神经嵴的特定部位可获得预期的解剖畸 图l神经嵴起源示意图图2 心脏神经嵴细胞迁移 形，如果在迁移之前切除散发到第3 、4 、6 咽弓的神经嵴细胞，就会出现永存动 9 c 1 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究前言 脉干、主动脉骑跨、右室双出口、主动脉弓畸型和室间隔缺损等心血管畸形【1 4 】， 且切除的长度与畸形的种类相关，如切除长度大于两个体节可产生永存动脉干， 切除长度小于两个体节则产生右室双流出道【垌，由此可见，心脏神经嵴细胞对 于心脏圆锥部的发育意义重大。 2 c 1 4 3 与心脏圆锥动脉千发育 连接蛋白( c 蛐喇n ，c x ) 是由多基因家族编码的一类结构相似、分子量不 同的蛋白质，目前已发现至少2 0 种c x 存在于哺乳动物，其命名则应用c x 基因 c d n a 推导出的编码蛋白理论分子量来区别连接蛋白家族的不同成员，如心肌分 离出的为c x 4 3 ( 分子量4 3 k d a ) 、肝分离出的为c x 3 2 ( 分子量3 2 k d a ) 等。在 细胞膜上，每6 个相同或不同的c x 围绕中央孔( 直径1 5 2 0 n m ) 排列形成一个 连接子( 或半通道) ，相邻细胞膜上的连接子对接形成缝隙连接( g a pj u n c t i ， g j ) ，后者是广泛存在于动物细胞的一种重要的通讯连接，它为相邻细胞问离子、 小分子代谢物及和信号分子( 分子量 l l 8 ) 的跨膜转运提供了一个低阻力通道， 该通道可控制某些离子及小分子物质的通过，包括第二信使c 怂口、口3 等，由 此参与许多重要的生物学功能，如细胞发生、细胞分化等n 叼 c x 的基本结构包括4 个疏水的跨膜区( m l - m 4 ) ，中间隔以亲水的2 个胞外 环( e l - e 2 ) 和1 个胞内环( c l ) ，而氨基末端( n - t a i l ) 和羧基末端( c i t a i l ) 均 位于胞浆内连接蛋白家族成员之间有较高的同源性，各类c x 分子序列和长度 上的差别主要在羧基末端和胞内环部分。各种c x 的分布具有组织特异性，目前 在人类心脏中主要有c x 4 3 、c “o 和c x 4 5 等，而c x 4 3 是哺乳动物心脏中最主 要的连接蛋白缝隙连接( g a p j 岫c t i ，g j ) c x 4 3 是细胞缝隙连接基因家族的成 员之一p ，1 们，近年的研究发现其与心血管发育密切相关。 r e 粕m e 等【1 1 】研究发现，c “3 基因剔除小鼠在出生后不久即出现紫绀、呼吸 困难而死亡，解剖发现肺动脉圆锥部明显膨胀并阻塞。随后的研究进一步证实， 过量表达c ) 【4 3 的西小，4 3 转基因小鼠和显性失活抑制c x 4 3 组成的细胞间隙的信 息交流的f c 转基因小鼠，也显示右室流出道畸形和梗阻，磁共振成像、超声心 动图、组织病理学分析等均证实了这些c x 4 3 异常的动物模型存在右心室流出道 梗阻，并在组织学上保持胚胎表型。从而说明，精确的c x 4 3 基因表达对于圆锥 部的发育至关重要1 1 2 1 。 既然心脏神经嵴细胞及c x 4 3 基因均与心脏圆锥部发育密切相关，那么二者 1 0 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉千畸形的发病机制研究 前言 之间有有何联系呢? 对此，不同的实验室分别从不同的角度进行了探讨，l o 等【l ，】 运用多种方法研究发现，在小鼠胚胎发育过程中，c x 4 3 大量表达于迁移性神经 嵴细胞之上( 最早于e d9 5 d 即可见) ，并参与形成心脏神经嵴细胞的缝隙连接， 对c m w 3 转基因小鼠及f c 转基因小鼠的研究也表明，转基因的表达正是局限 于包括心脏神经嵴在内的神经嵴细胞亚群及其在神经管背侧的祖代细胞中为了 进一步明确其机制，h u 柚g 等利用神经嵴体外培养，分别研究了c x 4 3 k o 小鼠、 c m v 4 3 转基因小鼠，f c 转基因小鼠以及直接抑制g 陀的非转基因神经嵴细胞 的迁移和增殖情况结果发现神经嵴细胞迁移速率与c x 4 3 功能水平呈正相关。这 些研究提示c x 4 3 可能通过调节心脏神经嵴的行为而间接影响心脏的形态发生 f 。 c x 4 3 作为细胞间的缝隙连接蛋白，以往并没有很多证据表明它参与信号通 路或某些调控机制的过程。但是近年来，逐渐有研究者发现，c x 4 3 通过和其它 蛋白结合伴侣如信号蛋白邮连环蛋白、连环蛋白p 1 2 0c m ，结构蛋白z 0 一l 、小 凹蛋白1 ，膜蛋白如钙粘蛋白，以及与细胞骨架相关的蛋白如a - 辅肌动蛋白、微 管等的结合；与介导细胞粘附、细胞活动和细胞骨架的信号通路发生联系。这些 都赋予c x 4 3 结构蛋白以外的其它定义和功能【1 5 l 。 越来越多的研究表明，c x 4 3 基因的作用不仅仅局限在介导细胞间的通讯， 它还具有其它更广泛的功能，如c x 4 3 对于细胞生长的影响并不依赖细胞间缝隙 连结的形成，而与增加，减少生长抑制分子相关1 6 1 7 l ；另外，c x 4 3 还与程序性细 胞死亡关系密切，它可改变抗凋亡基因b c l 2 的表达或者开启非连接性半通道等 其它机制而影响细胞凋亡的发生、发展【18 ，埘 综上所述，我们推测c x 4 3 基因可能是胚胎发育过程中复杂的基因调控网络 中的枢纽性环节，它的改变可能通过影响其它调控基因的表达而最终影响心脏神 经嵴细胞的行为( 如分离、迁移、增殖、分化、凋亡等) ，从而最终影响心脏圆 锥部的发育 因此，本课题利用c x 4 3 基因敲除( 1 d l o c k a i i t ，k 0 ) 小鼠模型，结合日益发 展的基因芯片技术进行研究，旨在研究c x 4 3 基因对心脏神经嵴的诱导、发生、 分离、迁移、分化的调控机制，进一步阐明c x 4 3 影响心脏圆锥发育过程中可能 的分子机制。 c x 4 3 基因敲除小鼠既锥动脉干畸形的发病机制研究第一部分 第一部分心脏神经嵴细胞的体外培养及生物学特性研究 引言 胚胎神经嵴细胞( n 肌r a lc f 嘲c e l l s ，n c c ) 为脊椎动物所特有的一组起源于 胚胎神经板边缘的具有迁移特点的细胞群。心脏神经嵴细胞( c a r d i n 即r a i 哦 c e n ，c n c ) 是从枕部神经嵴分化出来的一群细胞，这群细胞通过第3 、4 、6 咽弓 向原始心管迁移，最后停留在动脉干和动脉圆锥等部位分化为间充质细胞，主要 参与心脏流出道隔及大血管的形成，如果在迁移之前切除散发到第3 、4 、6 咽弓 的神经嵴细胞，就会出现永存动脉干、主动脉骑跨、右室双出口、主动脉弓畸型 和室间隔缺损等心血管畸形【1 卅；且切除的长度与畸形的种类相关，如切除长度 大于两个体节可产生永存动脉干，切除长度小于两个体节则产生右室双流出道 i 堋由此可见，心脏神经嵴细胞对于心脏圆锥部的发育意义重大。为研究神经 嵴细胞的生物学特性，需要在体外获得大量纯度较高的神经嵴细胞。以往神经细 胞培养多采用有血清培养体系并添加有丝分裂抑制剂以抑制胶质细胞的增长。但 是，这些细胞分裂抑制剂本身对神经细胞的生长也有不同程度的细胞毒性作用 f 2 1 1 。随着无血清培养技术的不断进步，人们己成功地在体外培养出高纯度的啮齿 类皮层及海马神经元，而且，在适当时间点进行取材培养，纯度可达9 5 以上网。 本研究即利用无血清培养技术进行培养，希望在体外培养获得高纯度的心脏神经 嵴细胞，并对其生物学特性进行初步研究。 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉千畸形的发病机制研究 第一部分 一、主要仪器与设备 1 恒温培养箱 2 恒温振荡水浴箱 3 超净工作台 4 电热恒温鼓风干燥箱 5 漩涡混合器 6 超低温冰箱 7 冷冻离心机 8 光学显微镜 9 显微照相机 1 0 图像分析系统 1 1 酶标仪 1 2 流式细胞仪 材料与方法 上海医疗器械七厂 上海医疗器械七厂 苏州净化设备公司 上海一恒科技有限公司 上海精密仪器仪表有限公司 丹麦h e t o 公司 美国n e 咖o m c 公司 日本n o n 公司 日本n o n 公司 德国l e i 公司 美国b i o t e k 公司 美国b e c t o nd i c l 【i n n 公司 二、主要试剂及抗体 1 d 征强讧，f 1 2 ( 1 ：1 ) g i b c o ，u s a 2 6 9 儿葡萄糖s i 舯a u s a 3 2m m 0 1 ，l 谷氨酰胺g i b c o ，u s a 4 3m m o l l 碳酸氢钠 g i b c o ，u s a 5 5m m o l ，l h 印e s s j g m a ，u s a 6 表皮生长因子e g f s i 舯a ，u s a 7 碱性成纤维细胞生长因子”g f s 咖a u s a 8 小鼠抗转录激活因子2 a ( a p 2 a ) 单克隆抗体s 跚t ac m 五u s a 9 小鼠抗微管相关蛋白2 ( m a p 2 ) 抗体s i g m a u s a 1 0 兔抗胶质纤维酸性蛋白( g f a p ) 抗体武汉博士德生物公司 1 1 f i t c 或c y 3 标记的二抗武汉博士德生物公司 1 2 山羊血清封闭液上海华美生物公司 c x 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉千畸形的发病机制研究 第一部分 三、主要试剂配制 1 基础培养液 d 加既仰1 2 培养基 量m i c 0 3 1 2 9 b s a l g 溶于l 升经高压灭菌消毒的去离子水中，o 2 2 u i l l 滤膜过滤分装，4 保存。 2 p b s 液 n a c l 8 0 9 k c l 0 2 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 3 1 7 9 k 堙0 40 2 9 加去离子水至lo o o m l ，高压，备用。 3 青霉索和链霉素储存液( 1 0 l i i 咖l 链霉素，1 万单位，n l l 青霉素) ： 链霉素o 8 克 青霉素8 0 万单位 溶于8 0 毫升经高压灭菌消毒后的去离子水中，o 2 2 岬滤膜过滤，分装，2 0 保存。工作液浓度：1 0 0 删测链霉素，1 0 0 单位舢青霉素。 4 细胞消化液 配成0 5 的胰蛋白酶( 用高压的p b s ) 并以0 2 2 岬滤膜过滤，同时配成 o 0 4 e d t a ( 用高压的p b s ) 高压灭菌消毒，将两种液体以等体积混合使其终 浓度为o 2 5 胰蛋白酶+ o 0 2 e d t a ，分装，2 0 贮存。 5 1 的多聚受氨酸： 将o 1 克多聚- l 赖氨酸溶于1 0 毫升高压灭菌去离子水中，o 2 2 岬滤膜过滤后， 分装，2 0 贮存临用前用去离子水稀释至o o l ，4 贮存 6 层粘连蛋白 临用前用m 棚既d 伊1 2 稀释至1 0 峪，n l l ，4 贮存。 7 2 0 0 f n m 谷氨酞胺贮存液 称取2 9 2 9 谷氨酞胺粉末，溶解于l o o m l 双蒸水中，o 2 2 岬滤膜过滤，分装，- 2 0 1 4 c 1 4 3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究 第一部分 保存。 8 e g f b f g f 贮存液 将e g f ，b f g f 溶于t r i s 缓冲液q h 7 6 ) 至终浓度为o 1 啷m l ，分装，- 2 0 保存 9 神经干细胞培养液 d h 仍m f1 2 基础培养液1 0 0 i n l 2 0 0 m m 谷氨酞胺 l m l e g f 贮存液 2 0 “l b f g f 贮存液2 0 l 临用前配制，4 贮存 1 0 碘化丙啶( p i ) 贮存液 粉剂1 0 0 m g 以2 m lp b s 溶解，浓度为5 0 m g ，m l 。避光4 冰箱保存。 1 1 细胞周期染色液 含p i 终浓度5 0 咖l ，配方为p i5 m g 、r n a 酶2 m g 、t r 的nx 1 0 0l i i i l 、生理盐 水6 5 n l l 、枸橼酸钠l o o n 喀、加蒸馏水至l o o m l ，调p h7 2 7 6 ，4 避光保存备 用。 1 2 4 多聚甲醛固定液 多聚甲醛 4 9 p b s 9 0 m l 加热至6 0 使溶液澄清，调节p h 至7 4 ，用p b s 补至i o o m l ，过滤后4 保存， 一周内使用。 1 3 0 3 1 梳x _ l o o 阳sl o o i i i l + 3 0 0 m “t x 1 0 0 四、动物交配及胎龄计算 实验动物由中国科学院动物实验中心提供。生育期成年c 5 7 b l 6 j 小鼠，按雌 雄2 ：l 数量比于晚1 0 时合笼，次日晨7 点查见阴道栓定为胎龄( e d ) o 5 d 。 五、细胞培养与检测 c “3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究第一郭分 1 心脏神经嵴细胞( 伽r d i n a 啪lc r e s to d l s ，o 屺c s ) 的分离与体外培养 本研究以胎龄8 5 d 的c 5 础j 胎鼠为研究对象。引颈处死孕8 5 dc 5 删，6 j 小鼠，体视显微镜下无菌操作取出鼠胚，去尽羊膜，切取枕中部至第3 体节之前 的神经管( 如图1 1 ) 【1 】；0 1 7 5 9 l 胶原酶消化5 1 0m i n ，然后将神经管组织置 于经纤维粘连蛋白( 矗b 瑚e c t i n ) 预孵的3 5m m 培养板中，3 7 培养3 0m i n 后组织 块贴壁，加m 伍m 伊1 2 无血清条件培养基，分别于2 4 、4 8h 观察c n c c s 的细 胞形态及迁移情况，用迁移指数代表迁移情况，迁移指数= 细胞迁移面栅组织块 的周长【2 1 4 8h 后待细胞生长至9 0 融合时，去除组织块，o 2 5 胰蛋白酶消化，离 心收集，洗涤后再以l 1 0 4 m l 的密度接种，称为第一继代( p 1 ) 。待细胞再次增 长至9 0 融合时，同法传代，称为p 2 ，p 3 ，p 如此类推。 2 c n c c s 的增殖率测定 分别取生长良好的p 2 代c n c c s ，胰蛋白酶消化，计数，以2 0 0 0 个细胞孔按 种于9 6 孔板培养。于接种当时及培养l ，2 、3 8 天的同一时间点，分别取l o 个样本作增殖率测定，取平均值绘制生长曲线。增殖率( m 兀法) 的测定步骤如 下：弃去培养液，p b s 清洗，加无血清功皿m 培养液l o o 一，m r r1 0 山，3 7 孵 育4 h ，加入s d sl o o i l ，3 7 放置2h ，冷却至室温，经酶标仪5 7 0 帆波长测定吸 光度o d 值。 3 c n c c s 的细胞周期分析 取p 2 、p 3 代细胞，消化收集，7 0 冷乙醇4 固定2 4 h ，预冷的p b s 清洗两遍， 加入lm g ，m lr 越a2 0o 山，3 7 水浴3 0m i n ，再加5 0 峙，i i l l 碘化丙啶( p i ) 染色 液避光反应3 0i n i n ，f a c s n 流式细胞仪检测细胞内d n a 含量，m u l t i c y c l e 软件 分析。 4 c n c c s 的诱导分化 将传代中生长约2 d 的c n c c s 接种到6 孔板中，孔中事先置入用o 0 2 5 多聚赖 氨酸( p l l ) 包被的盖玻片。加少量含血清( 1 嗍白牛血清) 培养基( 功旺m ，f 1 2 ) ， 次日用含血清培养基全量换液，观察神经嵴干细胞的分化 5 免疫组织化学检测 分别对原代培养的细胞及传代后以含血清培养基培养的细胞进行染色。染色 1 6 c “3 基因敲除小鼠圆锥动脉干畸形的发病机制研究 第一部分 步骤如下：取出待染细胞，p b s 漂洗两次，用4 多聚甲醛室温固定1 5 m i n ，p b s 洗3 次，o 1 5 t r j t o n x 1 0 0 透化2 0 m i n ，p b s 洗3 次；3 h 2 0 2 和羊血清孵育以封闭 非特异性反应，p b s 洗3 次；一抗分别为抗a p 一2 缸g g ( 1 ：2 0 0 ) 、抗m a p 2 i g g ( 1 ：2 0 0 ) 、 抗g f a pi g g ( 1 ：5 0 0 ) 。4 过夜，次日加入标记有c y 3 荧光索或f i t c 荧光素的二 抗( 1 ：2 0 0 ) ，3 7 孵育1 h ，p b s 洗3 次，缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察并摄 像 1 7 c x 4 3 基因敲除小鼠圆