（渔业资源专业论文）三角帆蚌四个群体遗传多样性的ssr分析.pdf

华中农业大学2 0 0 6 年硕士学位论文 摘要 三角帆蚌是我国主要的淡水育珠蚌，在我国东部、南部及中部有着广泛的分布， 关于它的研究涉及了形态学、生态学、生物化学、细胞生物学等领域。随着淡水珍 珠养殖业的发展，三角帆蚌在我国的养殖范围与规模越来越大，所产生的经济效益 越发显著。但随着蚌类栖息地的破坏和环境污染加剧，贝类捕捞强度加大，以及蚌 类人工繁殖和集约化养殖规模的扩大，三角帆蚌的遗传多样性受到不同程度的破坏， 自然资源不断减少，开展三角帆蚌遗传多样性研究，有利于保护其种质资源，为进 行大规模养殖和获得高产提供相应理论依据。 本研究从e p i o b l a s m ac a p s a e f o r m i s 和m a r g a r i t i f e r am a r g a r i t i f e r a 的2 0 个微卫星 d n a 标记中筛选出了在三角帆蚌( h y r i o p s i sc u m i n g i i ) 中扩增产物多态性较好的8 个微卫星标记，利用这8 个微卫星标记对三角帆蚌四个群体进行了遗传检测。这四 个三角帆蚌群体分别为湖南养殖群体( h y ) 、洞庭湖野生群体( d y ) 、鄱阳湖野生 群体( p y ) 、太湖野生群体( t y ) 。用非变性聚丙烯酰胺电泳检测微卫星的p c r 扩 增产物，计算了三角帆蚌四个群体的个体样本在8 个微卫星座位上的等位基因频率、 有效等位基因数、微卫星的多态信息含量( p i c ) 、各群体的遗传杂合度( h ) 、群体 间的遗传距离，并根据遗传距离对这几个群体进行了聚类分析。 结果表明，所选择的8 个微卫星位点在所检测群体中都表现出了较好的多态性， 平均每个微卫星位点检测到5 0 个等位基因和3 1 个有效等位基因，8 个微卫星标记 的平均多态信息含量为0 5 8 2 4 ，这表明所选择的微卫星标记适合用于三角帆蚌的遗 传多样性分析。四个三角帆蚌群体的遗传杂合度均较高，其中太湖野生群体的群体 杂合度最高( 0 7 5 0 0 ) ；其次为洞庭湖野生群体( 0 7 0 8 3 ) 和鄱阳湖野生群体( 0 6 5 0 0 ) ； 湖南养殖群体的群体杂合度最低( o 6 1 6 7 ) 。结果表明我国的三角帆蚌野生群体的遗 传多样性比较丰富，可以进一步进行合理的选择和利用。对遗传距离计算的结果表 明各群体间的遗传距离较小，彼此之间有较近的亲缘关系，聚类分析的结果表明洞 庭湖野生群体和湖南养殖群体的亲缘关系最近。 关键词：三角帆蚌；群体；微卫星d n a ；遗传多样性 罗玉敏三角帆蚌网个群体遗传多样性的s s r 分析 a b s t r a c t h y r i o p s i sc u m i n g i ii st h em a j o rf r e s h w a t e rp e a r lm u s s e l ，s p r e a dw i d e l yi nt h ee a s t e r n ， s o u t h e r na n dc e n t e ro fc h i n a t h er e s e a c ho fh y r i o p s i sc u m i n g i ic o n s t i t u t e so f m o r p h o l o g y , e c o l o g y , b i o c h e m i s t r y , c e l lb i o l o g ya n ds oo n a st h er e s u l t o fp e a r l p r o d u c t i o ni n c r e a s e d ，t h ec u l t u r e ds c a l e so fh y r i o p s i sc u m i n g i ie x p a n d e d w i t ht h el a r g e q u a n t i t yc a t c h i n ga n dh i g h d e n s i t yc u l t u r i n g ，t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fh y r i o p s i sc u m i n g i i w a sd e s t r o y e di nd i f f e r e n te x t e n t ，t h er e s o u r c e sd e d u c ey e a rb yy e a r w o r k i n ga b o u tt h e g e n e t i cd i v e r s i t yo fh y r i o p s i sc u m i n g i iw i l lb e n e f i tp r o t e c t i n gt h er e s o u r c e so fh y r i o p s i s c u m i n g i i ，a n dp r o v i d et h es c i e n t i f i ce v i d e n c ef o rb r e e d i n ga n do u t p u ti ng r e a tl a r g es c a l e g e n e t i cd i v e r s i t yo ff o u rh y r i o p s i sc u m i n g i ig r o u p sw a se v a l u a t e do nt h eb a s i so f e i g h tm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sw i t hp o l y m o r p h i s m ，s e l e c t e df r o mt w e n t ym i c r o s a t e l l i t e m a r k e r sw h i c h b e l o n gt oe p i o b l a s m ac a p s a e f o r m i sa n dm a r g a r i t i f e r am a r g a r i t i f e r a t h e s a m p l e so ff o u rg e o g r a p h i cp o p u l a t i o n so fh y r i o p s i sc u m i n g i iw e r ec o l l e c t e df r o m d o n g t i n gl a k e ( d y ) ，p o y a n gl a k e ( p y ) ，t a il a k e ( t y ) a n dh u n a nc u l t u r e dp o p u l a t i o n ( h y ) 。t h ep c ra m p l i f i e dp r o d u c t so fm i c r o s a t e l l i t e sw e r ed e t e c t e db yp o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s ( p a g e ) a l l e l ef r e q u e n c y , e f f e c t i v en u m b e r so fa l l e l e so e ) ， p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t ( p i c ) ，g e n eh e t e r o z y g o s i t y ( 印，a n dg e n e t i cd i s t a n c e s ( 玟) b e t w e e nt h e s eg r o u p sw e r ee s t i m a t e d a n dt h e n ，c l u s t e ra n a l y s i sb a s e do nt h o s e c a l c u l a t e dg e n e t i cd i s t a n c e sw a sp e r f o r m e df o r t h ef o u rh y r i o p s i sc u m i n g i ip o p u l a t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a te v e r ym i c r o s a t e l l i t el o c u sa n a l y z e dw e r ep o l y m o r p h i ci n t h o s eh y r i o p s i sc u m i n g i ip o p u l a t i o n sw i t ha na v e r a g en u m b e ro fa l l e l e sp e rl o c u sa n dt h e p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t ( p i c ) e q u a lt o5a n d0 5 8 2 4r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sc a nb e u s e dt o e v a l u a t e dg e n e t i cd i v e r s i t yo f h y r i o p s i sc u m i n g i i r a t e so fh e t r o z y g o s i t yi nf o u rg r o u p sa r ea l lh i g h ，a n dt h a ti st h e h i g h e s ti nt y ( o 7 5 0 0 ) ，t h es e c o n di sd y ( 0 7 0 8 3 ) ，t h et h i r di sp y ( o 6 5 0 0 ) ，a n dt h el a s ti s h y ( 0 6 5 0 0 ) ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h o s eh y r i o p s i sc u m i n g i ig r o u p sh a d a b u n d a n tg e n e t i c d i v e r s i t ya n dp o t e n t i a lo fs e l e c t i o n t h er e s u l to fg e n e t i cd i s t a n c ei n d i c a t e dt h a tt h e r e w e r ec l o s eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n gt h o s eh y r i o p s i sc u m i n g i ig r o u p s t h er e s u l t so f c l u s t e ra n a l y s i ss u g g e s tt h a tt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd ya n dh yi st h en e a r e s t k e yw o r d s ：h y r i o p s i sc u m i n g i i ；p o p u l a t i o n ；m i c r o s a t e l l i t ed n a ；g e n e t i cd i v e r s i t y i i 华中农业大学2 0 0 6 年硕十学位论文 n g 肛g l d m p c r s s r r n a s e u p g m a n j e b o d t a q 酶 s d s 1 m s e d l = a t e p a g e b p m i c r o l i t t e r 缩略语表 纳克 微克 微升 d e o x y n u d e p s i d et r i p h o s p h a t e脱氧核糖核苷三磷酸 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 s i m p l es e q u e n c er e p e a t 简单重复序列或微卫星 r i b o u n c l e d s e 核糖核酸酶 u n w e i g h t e dp a i rg r o u pm e t h o do f 非加权组对算术平均法 a r i t h m e t i cm e a n s n e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o d 邻接法 e t h i d i u mb r o m i d e o p t i c a ld e n s i t y 溴化乙锭 光密度 t h e r m a sa q u a t i c u sd n a p o l u m e r a s e 栖热、水生菌d n a 聚合酶 十二烷基磺酸钠 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a n i o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 e t h y l e n ed i a m i n et e t r aa c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 t r i s - - h c l 、e d t a 缓冲液 p o l y c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 b a s ep a i r i 碱基对 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 是 如需保密，解密时间 & c o8 年7 只3 e l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究x - 作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 、歹白上 时间：九旧年6 月9 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定计，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者签名：、罗丕敏翩签名：篡硕乳 签名日期：y 年6 月夕日 签名日期：渺6 年6 月侈日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学2 0 0 6 年硕十学位论文 1 前言 淡水蚌类是滤食性的初级消费者，在水生生态系统的物质循环和能量流动中具 有重要作用。蚌类不仅是水环境监测的重要指示生物，同时在富营养水体的生态修 复方面具有重要价值。长期以来，蚌类不仅被作为人类重要的食物蛋白源以及鱼类、 家禽的优良饲料加以利用，优良的育珠蚌还可用于生产淡水珍珠和加工珠核后用于 珍珠养殖业。但是，随着蚌类栖息地的人为破坏和退化日益加剧，淡水蚌类已成为 世界上最濒危的无脊椎动物之一。由于对蚌类的资源调查、监测以及种质资源保护 关注和研究不足，蚌类生物多样性的衰退已经成为世界性的普遍现象，蚌类种质资 源保护的重要性已引起各国贝类学家的关注。 北美是世界上淡水蚌类多样性最为丰富的地区，但近年的研究发现，美国淡水 蚌类的多样性和丰度在过去的i 0 0 年中已经严重衰退，3 4 4 种珠蚌中已有3 5 种灭绝， 另有1 3 0 多种处于濒危、受威胁或面临威胁的状态( w i l l i a m s 等，1 9 9 3 ，1 9 9 7 ：b o g a n ， 1 9 9 8 ) 。欧洲的情况也是如此( k i l e e n 等，1 9 9 8 ) 。面对蚌类生物多样性的日益衰退， 迫切需要采取措施对淡水蚌类的生物多样性进行有效的保护和管理。 近年来，随着我国工业化进程的加快，湖泊、河流等内陆水域的污染程度加剧， 淡水珍珠养殖业的快速发展又导致对三角帆蚌等淡水蚌类的过度开发利用，蚌类的 栖息地受到不同程度的干预和破坏，加之对蚌类资源和生物多样性的研究、保护力 度不够，我国内陆水域特别是内陆湖区、河流的蚌类资源呈现日益衰退的趋势，蚌 的种类、数量明显锐减，一些珍稀蚌类甚至濒临灭绝，因此，迫切需要加强我国淡 水蚌类的生物多样性保护和管理。 1 1 三角帆蚌的研究与应用现状 三角帆蚌( h y r i o p s i sc u m i n g i i ) 隶属于软体动物门( m o l l u s c a ) ，双壳纲 ( b i v a l v i a ) ，蚌目( u n i o n i d a ) ，蚌科( u n i o n i d a e ) ，帆蚌属( h y r i o p s i s ) ，别名：三 角蚌、水壳、劈蚌、江贝、翼蚌、溪蚌、铲蚌、小壳等。三角帆蚌是我国特有的优 质淡水育珠蚌，分布于河北、山东、安徽、江苏、浙江、江西、湖北和湖南等大、 中、小型湖泊及其周围的河流内。用三角帆蚌培育的珍珠珠质细腻、光滑、色泽鲜 艳、形状较圆( 蔡英亚等，1 9 9 5 ) 。 1 1 1 三角帆蚌的基本生物学特征 三角帆蚌贝壳大而扁平，呈三角形状，壳长可达1 9 0 m m ，壳高9 0 m m ，壳宽3 8 m m ， 最大者壳长可达2 4 0 m m 。三角帆蚌栖息于常年水位不干涸的大、中型湖泊及河流内， 喜生活在水质清爽、水流急、底质略硬的泥沙或泥底的水域。通常以水中的细菌、 罗玉敏三角帆蚌四个群体遗传多样性的s s r 分析 浮游植物、原生动物、轮虫、小型枝角类、小型桡足类和有机碎屑为食。摄食量取 决于水中饵料的多少、适口的程度和蚌的体质状况等。 三角帆蚌是雌雄异体，在性成熟期，鳃丝排列紧密的为雌蚌，鳃丝排列稀疏而 沟纹明显的为雄蚌。三角帆蚌在三足龄开始性成熟，通常以5 7 龄的雌蚌怀卵量最 多，质量最好。三角帆蚌的繁殖季节为4 7 月，当水温上升到1 8 以上时，三角帆 蚌的性腺开始发育成熟，雄蚌排精，雌蚌排卵。卵在雌蚌的外鳃受精发育，到4 月 底至6 月下旬，水温达到2 5 ，胚胎逐渐发育长成钩介幼虫，同时钩介幼虫被排除 体外。排入水中的钩介幼虫寄生在合适的鱼体身上，吸收鱼体的营养供自己完成变 态发育，变态完成的仔蚌脱离鱼体，沉入水底营底栖生活( 赵明森和龚惠卿，2 0 0 3 ) 。 1 1 2 三角帆蚌的组织与细胞学研究 近年来，随着珍珠养殖业的飞速发展，我国的部分学者对三角帆蚌的组织和细 胞学作了大量的研究。欧阳珊等( 1 9 9 5 ) 对三角帆蚌的消化系统作了研究，对唇瓣、 食道、胃、肠的电镜扫描结果显示三角帆蚌存在细胞内消化和细胞外消化两种途径。 石安静等( 1 9 9 5 ) 对淡水育珠蚌分泌珍珠质的外表皮进行组织培养，结果表明，离 体组织分泌的珍珠质的化学成分与活体基本相同。邱安东等( 1 9 9 9 a ) 研究了不同 p h 值对三角帆蚌外套膜珍珠分泌的影响机制，结果表明在中性水环境中，蚌能积极 地从外界环境中吸收钙，并能旺盛地合成和分泌贝壳珍珠质及珍珠有机基质前体， 而在酸性和碱性环境中其合成与分泌能力减弱，而且酸碱度越高，其影响越大。同 时，邱安东等( 1 9 9 9 b ) 对三角帆蚌珍珠囊细胞的分泌活动进行了亚显微结构的研究， 结果发现，珍珠囊表皮细胞能积极合成蛋白质，中性粘多糖等物质。郭延平等( 2 0 0 2 ) 观察了在光镜和透射电镜下三角帆蚌精子的发生过程和一些重要的形态变化，包括 核延长，染色体浓缩，线粒体逐渐融合并后移，胞质减少及鞭毛形成。谈奇坤等( 2 0 0 2 ) 运用电子显微技术对三角帆蚌精子的形态和结构进行了研究，王国夫等( 2 0 0 2 ) 也 运用透射电镜对三角帆蚌精子的超微结构进行了研究。汪晓晶等( 2 0 0 0 ) 研究了三 角帆蚌体细胞染色体，核型为2 n = 3 8 ，染色体划分为a 、b 两组。 邵健忠等( 1 9 9 5 ) 对健康及患瘟病三角帆蚌的1 3 种脏器组织作了系统的形态结 构观察和组织化学分析，结果表明，三角帆蚌瘟病的组织病理变化主要集中在病蚌 肝脏和直肠等组织，并认为三角帆蚌瘟病是一种病毒性消化器官坏死病。 1 1 3 三角帆蚌的生化遗传研究 邵健忠等( 1 9 9 3 ) 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对三角帆蚌8 种组织中1 6 种 同工酶系统的酶谱表型、组织分布、活性含量和迁移特征等做过研究，结果表明三 角帆蚌瘟病的病理机制与消化系统脂类代谢异常密切相关。万谦等( 1 9 9 4 ) 对三角 帆蚌、褶纹冠蚌、背角无齿蚌的外套膜的一种碱性磷酸酶( a l p ) 进行了比活力和 2 华中农业人学2 0 0 6 年硕上学位论文 动力学性质的比较研究，结果表明a l p 比活顺序是：褶纹冠蚌 背角无齿蚌 三角 帆蚌，其中三角帆蚌6 曲作用于底物磷酸苯二钠的最适p h 值为9 4 0 ，最适温度为 3 7 ，米氏常数k m 为0 5 3 m m o l l ，三种蚌的伽l p 均为m 9 2 + ，c a s + ，b a 2 + 所激活， 为c u “，z n “，k h 2 p 0 4 ，m e ，e d t a - n a 2 所抑制。孙家美等( 1 9 9 2 ) 采用超薄层聚 丙烯酰胺凝胶电泳法及f s z a 凝胶电泳扫描器，研究了三种育珠蚌的外套膜边缘膜、 斧足及后闭壳肌中酯酶同工酶的差异性。研究发现：异种育珠蚌之间，三种器官中 酯酶酶带总数存在着种间差异性，同种蚌不同器官之间存在着器官差异性，异种蚌 的同种器官之间，也存在着种间差异。 1 1 4 三角帆蚌的病害及防治研究 1 9 7 5 年江苏无锡首次报道三角帆蚌蚌病的发生，8 0 年代初蚌病已在江浙地区普 遍流行。1 9 8 2 年国内首次报道了三角帆蚌蚌病的病原及发病规律，1 9 8 6 年开始，蚌 病由江浙一带波及到安徽、江西、湖北、湖南等省的多数育珠生产区。 目前报道的三角帆蚌病害主要有以下几种：病毒性疾病、细菌性疾病、寄生性 疾病、非生物病原引起的疾病、附着生物和敌害生物的影响。瘟病是三角帆蚌的主 要病毒性疾病，张治国等认为病毒粒子感染是瘟病爆发的主要原因之一，邵健忠等 对瘟病病毒的精细结构以及三角帆蚌染病后的病理变化进行了详细研究。引发三角 帆蚌流行病的细菌种类主要有点状气单胞菌、嗜水气单胞菌、河弧菌生物变种以 及耐盐产气单胞菌等。1 9 9 9 年，张根芳等报道了多种细菌性病原引起的蚌病病症及 病理变化间的关系，为蚌病诊断提供了重要方法。同鱼类一样，三角帆蚌的寄生性 疾病常有发生，侵袭三角帆蚌的寄生虫主要有车轮虫、肾形虫、线虫和轮虫等。非 生物病原引起的三角帆蚌疾病主要有触手溃疡、水肿和藻毒素中毒等，这往往与水 质环境有着密切的联系。此外，摇蚊幼虫因争夺营养和生存空间而对育珠蚌也有一 定危害；腔肠动物、多孔动物、水栖寡毛类、苔藓动物等喜附着于网笼和蚌壳上， 对珠蚌的呼吸和滤食也会产生不良影响。 在蚌病防治方面，蚌病发生后，在没有确定病原病症的情况下，生产上一般采 取泼洒生石灰、漂白粉、硫酸铜和各种抗生素等简单做法。尽管抗生素的注射、浸 泡等方法对蚌病有一定的疗效，但在规模化生产中的操作性不强，外用消毒剂是最 常用的一种方法。在实际生产中，蚌病的预防主要从控制水质、规范手术操作、消 灭传染源等方面入手，通过以防为主，可以在一定程度上控制蚌病的泛滥。 3 罗玉敏 三角帆蚌四个群体遗传多样性的s s r 分析 1 1 5 三角帆蚌在淡水育珠中的应用现状及存在问题 我国是淡水珍珠生产大国和出口大国，目前淡水珍珠年产量已达1 2 0 0 吨，占世 界珍珠年产总量的9 6 左右( 张根芳等，2 0 0 4 ) 。在淡水珍珠养殖业中，帆蚌属的三 角帆蚌( h y r i o p s i sc u m i n g i ) 因品质优良而成为我国的主要淡水育珠蚌，具有体大、 扁平、壳厚、质坚的外观特点，用其插蚌，不仅便于手术操作，而且所产珍珠色泽 鲜艳，细腻光滑，售价也高。 近年来，随着淡水珍珠业的日益发展，对三角帆蚌的过度开发利用，加之湖泊、 河流等内陆水域的污染程度加剧，三角帆蚌天然资源日益减少，许多珍珠主产区几 乎绝迹，三角帆蚌的人工繁殖业也应运而生。其发展迅猛，势如破竹，但也出现了 一些问题。由于不注重品种改良，连年就地采用亲蚌近亲繁殖，几代“同堂”，互相 “滥交”，致使其后代出现了双壳变薄、硬度下降、抗病力下降的逆向变异，种质退 化，珍珠质量下降。快速流行的蚌病造成许多珠农全军覆没而停产。中国“入世 前的2 0 0 0 年，因珍珠业的再度复兴，三角帆蚌人工繁殖势头也再次回升。从1 9 7 5 年首次发现三角帆蚌疾病病例至今，蚌病的研究还不到3 0 年的历史。虽然陆续有学 者报道了危害三角帆蚌的病毒、细菌等病原研究成果，但三角帆蚌疾病防治仍然是 生产上的一大难题，因蚌病引起大面积死亡造成的经济损失难以估量，特别是2 0 世 纪9 0 年代以来，蚌病日趋严重。 要使我国淡水珍珠立足国际市场，就必须致力提高珍珠的质量，并着手培育大 规格、高质量的有核珍珠，这必须有充足的生长快速、壳形较厚的良种育珠蚌作为 保证。由于原产于日本琵琶湖的池蝶蚌( h y r i o p s i ss c h l e g e l i ) 壳间距较大，贝壳和 外套膜均厚，生长快，成活率高，培育的珍珠个体大、质量优，1 9 9 7 年江西省抚州 市洪门水库开发公司从日本引种成功，并进行了驯养、繁育和育珠试验。2 0 0 5 年3 月，农业部将池蝶蚌审定为适宜推广的境外引进品种，但要求严格控制在人工可控 水体中养殖。随着池蝶蚌在我国部分地区的推广和产业化进程加快，池蝶蚌的育珠 面积将会快速扩大，池蝶蚌的苗种很有可能随寄主鱼流入江河、湖泊等天然水域， 对我国帆蚌属的同属优良育珠蚌三角帆蚌的天然种质资源将构成潜在威胁。 因此，采取有效措施保护和增殖三角帆蚌的天然种质资源已迫在眉睫，同时应 加强三角帆蚌的种群遗传学研究，为优良种质的筛选、优良品种的选育以及种质资 源保护策略的制定提供遗传学依据。 4 华中农业人学2 0 0 6 年硕士学位论文 1 2 遗传多样性及常用d n a 分子标记 1 2 1 遗传多样性及其科学意义 广义地讲，遗传多样性是生物所携带遗传信息的总和，但一般所指的遗传多样 性是指种内的遗传多样性，即种内的个体之间或一个种群内不同个体的遗传变异的 总和( 钱迎倩和马克平，1 9 9 4 ) 。它不仅指遗传变异的高低，也包括遗传变异分布的 格局，即种群的遗传结构。种内的多样性是物种以上各水平多样性的重要来源。所 有的遗传多样性都发生在分子水平，自然界中存在的变异源于突变的积累，这些突 变都经受过自然选择，些中性突变通过随机过程整合到基因组中，上述过程形成 了丰富的遗传多样性。遗传多样性体现在不同水平上：居群( 种群或群体) 水平， 个体水平，组织水平和细胞水平及分子水平( 沈浩和刘登义，2 0 0 1 ) 。 对遗传多样性的研究可以揭示物种或种群的进化历史，也能为进一步分析其进 化潜力和未来的命运提供重要的资料，有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨( 陈 灵芝，1 9 9 5 ) 。其次，通过遗传多样性的研究，得以了解种内遗传变异的大小，时 空分布及其与环境条件的关系，我们就可以采取科学有效的措施保护人类赖以生存 的遗传资源( 基因) 。其三，对遗传多样性的认识是生物各相关学科重要的背景资 料。总之，对遗传多样性的研究有助于人们更清楚地认识生物多样性的起源和进化， 为动植物分类，进化研究提供有益的资料，进而为动植物育种和遗传改良奠定基础 ( 杜晓东，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 遗传多样性研究中几种常用d n a 分子标记的特点 分子遗传标记是指利用分子生物学的方法来区分不同的个体或群体，并且可以 稳定遗传的物质或性状，是生物个体或群体间遗传差异的客观表征( 龚鹏，杨效文 和谭声江，2 0 0 1 ) 。分子遗传标记是随着分子生物学技术的发展而发展起来的，在 分子生物学技术兴起之前，人们主要通过形态标记，细胞标记和生化标记来研究遗 传多样性。与这些标记相比，d n a 分子标记具有以下特点：( 1 ) 直接以d n a 的 形式表现，在生物体的各个组织，各发育时期均可检测到，不受季节，环境限制， 不存在表达与否的问题；( 2 ) 数量极多，遍及整个基因组；( 3 ) 多态性高，自然 界存在着许多等位变异；( 4 ) 样品需求量少；( 5 ) 有许多分子标记表现为共显性 ( c o d o m i n a n c e ) ，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息( 钱 惠荣和郑康乐，1 9 9 8 ) 。 理想的分子标记必须达到以下几个要求：( 1 ) 具有高的多态性；( 2 ) 共显性 遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中的杂合和纯合基因型；( 3 ) 能明确辨别等位 基因；( 4 ) 遍布整个基因组，除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个 5 罗玉敏 三角帆蚌四个群体遗传多样性的s s r 分析 基因组；( 5 ) 选择中性，即无基因多效性；( 6 ) 检测手段简单，快速，如实验程 序易自动化；( 7 ) 开发成本和使用成本尽量低廉；( 8 ) 重复性好( 李红蕾，2 0 0 3 ) 。 1 2 2 1r f l p ( 限制性酶切片段长度多态性) 该技术由g r o d z i c k e r 等于1 9 7 4 年创立，特定生物类型的基因组d n a 经某一种 限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段或称限制性等位片段， r f l p 标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引 起酶解位点变异的突变，如点突变，新产生和去除酶切位点和一段d n a 的重新组 织，如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化等均可导致限制性等位片段的变 化，从而产生r f l p 。该技术包括以下基本步骤：d n a 提取，用d n a 限制性内 切酶消化，凝胶电泳分离限制性片段，将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操 作的滤膜上，用放射性同位素或非放射性物质标记的d n a 作探针与膜上的d n a 杂 交，称s o u t h e r n 杂交放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶 切片段多态性。 r f l p 标记的主要特点有： ( 1 ) 遍布于整个基因组，数量几乎是无限的； ( 2 ) 无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； ( 3 ) 共显性，可区分纯合子和杂合子； ( 4 ) 结果稳定，可靠； ( 5 ) d n a 需要量大，检测技术繁杂，难以大规模应用。 1 2 2 2r a p d ( d n a 随机扩增多态性) 该技术由w i l l i a m s 和w e l s h 等于1 9 9 0 年创立。其基本原理与p c r 技术一致， p c r 技术是一种体外快速扩增特异基因或d n a 序列的方法，由m u l l i s 等于1 9 8 5 年 首创，该技术在试管中建立反应体系，经数小时后，就能将极微量的目的基因或某 一特定的d n a 片段扩增数百万倍。其原理与细胞内发生的d n a 复制过程相类似， 首先是双链d n a 分子在邻近沸点的温度下加热时便分离成两条单链d n a 分子，然 后d n a 聚合酶以单链d n a 为模板，并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸 d n t p s 合成新生的d n a 互补链，以上过程为一个循环，每一个循环的产物可以作 为下一个循环的模板，经过2 0 3 0 个循环后，介于两个引物间的特异d n a 片段以指 数形式得以大量复制。r a p d 标记技术就是用一个，有时用两个随机引物，一般8 1 0 个碱基，非定点地扩增基因组d n a ，然后用凝胶电泳分开扩增片段，遗传材料的基 因组d n a 如果在特定引物结合区域发生d n a 片段插入，缺失或碱基突变，就有可 能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致p c r 产物增加，缺少或发生分子 量变化。若p c r 产物增加或缺少，则产生r a p d 标记。 r a p d 标记的主要特点有： ( 1 ) 不需d n a 探针，设计引物也无须知道序列信息； ( 2 ) 显性遗传，极少数共显性，不能鉴别杂合子和纯合子； 6 华中农业人学2 0 0 6 年硕士学位论文 ( 3 ) 技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； ( 4 ) d n a 样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； ( 5 ) 实验重复性较差，结果可靠性较低。 1 2 2 3a f l p ( 扩增片断长度多态性) 该技术由z a b e a u 和v o s 于1 9 9 3 年发明。a f l p 标记是选择性扩增基因组d n a 酶切片段所产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶切片段的长 度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来。该技术结合了 r f l p 的稳定性和p c r 技术的简便高效性，同时又能克服r f l p 带型少，信息量小 以及r a p d 技术不稳定的缺点。其基本技术原理和操作步骤如下：首先用限制性内 切酶酶解基因组d n a 形成许多大小不等的随机限制性片段，接着在这些片段的两 端连接上特定的寡聚核苷酸接头( o l i g on u l e o t i d ea d a p t e r ) ，然后根据接头序列设计 引物，由于限制性片段太多，全部扩增则产物难以在胶上分开，为此在引物的3 端 加入1 3 个选择性碱基，这样只有那些能与选择性碱基配对的片段才能与引物结合， 成为模板被扩增，从而达到对限制性片段进行选择扩增的目的，最后通过聚丙烯酰 胺凝胶电泳，将这些特异性的扩增产物分离开来。 a f l p 标记的主要特点有： ( 1 ) 由于a f l p 分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类，数目很多， 所以该技术所产生的标记数目是无限多的； ( 2 ) 典型的a f l p 分析，每次反应产物的谱带在5 0 - 1 0 0 条之间，所以一次分 析可以同时检测到多个座位，且多态性极高； ( 3 ) 表现共显性，呈典型孟德尔式遗传； ( 4 ) 分辩率高，结果可靠； ( 5 ) 目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。 1 2 2 4s s r ( 简单序列重复或微卫星) 微卫星( m i c r o s a t e l l i t e ) 是d n a 序列中以1 - 6 个碱基为一个重复单位，重复1 0 2 0 次左右，首尾相接的串联重复序列，又称为简单序列重复d n a ( s i m p l es e q u e n c e r e p e a t ，s s r ) 。微卫星d n a 一般以1 - 6 b p 碱基为核心序列，如( c a ) n ( g t ) n 等。 可变重复数的核心序列头尾相连组成串联重复序列( e l l e g r e n 等，1 9 9 2 ) 。微卫星 d n a 以多拷贝方式均匀分布于真核生物的基因组中，其可变重复数构成了微卫星 d n a 多态性的基础。 根据微卫星核心序列碱基数目的不同，可以将其分为单核苷酸、二核苷酸、三 核苷酸等不同类型。根据微卫星核心序列排列方式不同，可分为完全、不完全和复 合型微卫星( w e b e r 等，1 9 9 0 ) 。w i n t e r 等( 1 9 9 2 ) 研究指出，不同物种间这三种类 型的微卫星所占比例不同。 微卫星d n a 广泛分布于各种真核生物基因组中，而且是随机分布的。在真核 生物中大约每隔1 0 5 0 k b 就存在一个微卫星( t a u t z ，1 9 8 9 ) 。据估计在哺乳动物基因 7 罗玉敏三角帆蚌四个群体遗传多样性的s s r 分析 组中微卫星的平均拷贝数约为5 1 0 万个。h e a m e 等( 1 9 9 2 ) 估计的微卫星的突变率 为5 x 1 0 - 4 1 0 。5 。 许多研究表明微卫星的遗传呈孟德尔遗传规律，能够稳定地从上一代传给下一 代，并且等位基因问呈共显性遗传特点，同时这种稳定性还表现在，同一个体的不 同年龄段、不同组织器官等产生的d n a 指纹图谱都完全一致( s u n d e n 等，1 9 9 3 ) 。 微卫星具有高度的保守性。s t a l l i n g s 等( 1 9 9 1 ) 研究发现微卫星位点在哺乳动 物物种间，特别是一些关系较近的物种如牛与羊、马，鸡与火鸡，人与灵长类间具 有一定的保守性。m o o r e 等( 1 9 9 1 ) 用牛的微卫星引物分别在羊、马及人的基因组 中进行扩增，发现：在羊中5 6 的引物可扩增出特异产物，其中4 2 的扩增产物表 现多态性，而在马和人中未扩增出多态产物。l e v i n 等( 1 9 9 5 ) 用4 8 个鸡微卫星位 点，以火鸡基因组d n a 为模板扩增，9 2 引物扩增出产物，3 3 的扩增产物与鸡 相同，约2 8 产物未表现出多态性。由于微卫星保守性的存在，我们可以在一个物 种的微卫星研究中利用另一个物种的研究结果，从而更快更准确地找到微卫星位点 用于遗传作图及其它用途。 微卫星位点是由其核心序列和两侧的特异序列构成。由于微卫星的侧翼序列在 基因组中是单拷贝，使得某一微卫星可特异定位于染色体的某一部分，且具有一定 的通用性，这就可使用相关物种的微卫星引物进行扩增。微卫星位点多态性体现在 自身基本单位的重复数。微卫星多态性反映着物种的进化历史，共有的等位基因在 该物种基因组中最为古老、保守，其余的等位基因则是在进化过程中由于插入、缺 失等机制所造成。a r r a n z e 等( 1 9 9 6 ) 进一步指出，不同品种在同一微卫星座位上等 位基因数目和频率的差异体现出其遗传的差异，并可借此区分品种的类型。微卫星 呈共显性，即个体基因组中某座位的核心序列重复数相等，则该个体在此座位的基 因型是纯合的，如不等则表现为杂合型。故微卫星p c r 扩增产物在聚丙烯凝胶电泳 上为一条片段，则为纯合子，两条片段则为杂合子。 检测过程通常是以其侧翼序列为引物进行p c r 扩增，即可以用一对引物扩增， 也可按龚炎长( 1 9 9 7 ) 应用多重p c r ，由于微卫星序列短，产物分离可以在测序p a g e 胶也可以在非变性p a g e 胶上进行电泳，产物检测可采用同位素标记放射自显影技 术，硝酸银染色分析以及荧光标记自动化检测。根据分离片段的大小决定基因型并 分析等位基因在所研究群体中的频率及各位点的杂合度。根据等位基因频率采用分 析软件计算遗传距离等相关指标。再利用遗传距离构建聚类图，分析群体间的遗传 变异。 微卫星分子标记主要特点有： ( 1 ) 丰富的多态性和信息量。微卫星寡核苷酸的重复数在同一物种的不同基因 型间差别很大，因此微卫星d n a 具有丰富的多态性，这也是此项技术迅速发展的 原因之一。微卫星位点的多态性使其具有高的信息量，同时微卫星具有较好的重复 性。 8 华中农业人学2 0 0 6 年硕士学位论文 ( 2 ) 微卫星引物的通用性。微卫星d n a 位点在不同物种间具有保守性，因此 微卫星的引物具有通用性，可采用引物p c r 技术对其进行快速有效的分析。 ( 3 ) 微卫星标记的共显性。微卫星标记呈共显性，简化了分析过程，且利于不 同作图群体间的标记转换和从遗传图谱向物理图谱的过渡( i n o u e 等，1 9 9 4 ) 。 ( 4 ) 分析操作简单。微卫星分析操作简单使得其应用更加大众化，微卫星d n a 位点的多态性可以直接用p c r 以凝胶电泳分析。电泳记录下片段大小后可以直接用 相关软件进行数据处理。 ( 5 ) 使用样品量少。微卫星分析使用的样品量非常少，使得用非损失取样法获 得样品成为可能，例如在粪便( h o s s 等1 9 9 2 ) 、毛发( m a r t i n 等1 9 9 2 ) 、羽毛( e l e g r e n ， 1 9 9 1 ) 中获得微卫星位点。 ( 6 )由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一 定困难，费用也较高。 1 2 2 5i s s r ( i n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) i s s r 技术由z i e t k i e w i c z 等于1 9 9 4 年创建，是以微卫星重复序列作为引物检测物 种多态性发展而来。该技术在s s r 序列的5 或3 末端加上2 4 个随机选择的核苷酸作 为引物，如：5 端的引物为b d d a ( c a ) 7 ，3 端的引物为( c a ) 8 r y ，以引起特定序列位 点的退火，降低其他可能靶标退火的数目。该策略的优点是在基因组上只有与锚定 的核苷酸匹配的那些位点才能被靶定，因而避免了引物在基因组上的滑动，可提高 p c r 扩增反应的专一性。这种方法即可对反向排列、长度适中的重复序列间的基因 组节段而非重复序列本身进行p c r 扩增。i s s r 标记通常为显性标记，扩增反应所用 的两翼引物中，可以是i s s r 三j i 物或是随机引物如果一个是i s s r 弓i 物，另一个是随机 引物，则又称为随机扩增微卫星多态性( r a n d o ma m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t e p o l y m o r p h i s m s ，r a m p ) 。 i s s r 是一种在p c r 中直接使用微卫星序列进行d n a 扩增的分子标记，具有如下 特点： ( 1 ) 扩增基因