（分析化学专业论文）近红外显微图像技术及其在生物学中的应用.pdf

中国农业大学硕士学位论文摘要 摘要 近红外显微成像技术是在f t i r 显微技术的基础上发展起来的，近红外显微成像技术的优势 在于对成像的干扰小，非破坏性，可以适应鲜活组织原位测定和对培养液中的组织或细胞进行直 接的测定。本文以干烟叶、鲜叶片和肌肉组织为样品，研究了近红外显微图像的实验中的波数分 辨率、空间分辨率、不同的波数范围以及不同的图像采集方式对化学成分成像的影响，运用主成 分分析的方法提取特定化学成分分布的图像信息并与相关光谱成像图进行比较，以识别叶片中 的化学成分分布。 研究结果如下：( 1 ) 波数分辨率对天然样品的主成分特征向量的轮廓无明显影响，特定化学 成分对应的特征向量的维数没有变化。( 2 ) 鸡胸部肌肉组织样品采用空间分辨率6 2 5um x 6 2 5 t t m 所采集的图像效果较好；而对干烟叶和鲜叶片样品，采用空间分辨率2 5 m 2 5 p m 所采集 的图像效果较好。( 3 ) 波数范围对鸡胸部肌肉组织样品的近红外显微图像的影响比较显著，采用 不同的波数范围进行主成分分析，载荷矩阵( 特征向量阵) 会发生变化，可能使同一种化学成分 出现在不同的特征向量上。( 4 ) 厚度约为1 5 0 微米的鲜叶片样品采用反射的图像采集方式所采集 的图像效果较好。( 5 ) 对干烟叶样品的近红外显微图像采用了主成分分析的方法提取其特征向 量，并将第二主成份特征向量与淀粉的近红外光谱对比，特征向量与标准物质光谱的相关系数达 到0 9 7 7 9 ，表明第二主成分的特征向量主要源于淀粉，第二主成分得分图像主要代表了干烟叶中 淀粉的分布；将干烟叶样品的第二主成份得分图像与干烟叶样品的淀粉相关光谱成像图进行对 比，结果表明相关光谱成像图和相应的得分图像的分布形状和趋势基本一致；对干烟叶中的淀粉、 烟碱、葡萄糖、纤维、蛋白质和果糖做相关光谱成像图，以确定干烟叶中的化学成分分布。( 6 ) 对鲜叶片样品的近红外显微图像做淀粉、葡萄糖、果糖、纤维、蛋白质和水的相关光谱成像图， 以确定鲜叶片中的化学成分分布。 近红外显微图像技术以其干扰小非破坏的特点，在生物学领域将有广阔的应用前景，尤其 化学成分分布的确定，体现了其原位分析和无损分析的优势。用更好的光谱剥离算法以得到更多 化学成分的分布仍有待于进一步的研究。 关键词：近红外显微镜，化学成像，微区分析 a b s t r a c t t h et e c h n o l o g yo f t h en e a r - i n f r a r e d ( n i r ) m i c r o i m a g ew a sd e v e l o p e do nt h eb a s eo f f t i rm i c r o t e c h n o l o g y t h ea d v a n t a g e so fn i rm i c r o - i m a g ea l i t t l ej n t e f f e r e r , n o n - d e s t r u c t i v ea n dt h eo r i g i n a l a n a l y s i st ot h ef r e s ht i s s u ea n dt h ed i r e c ta n a l y s i st ot h ec e l l si nt h ec u l t u r es o l u t i o n t h i sa c a d e m i c p a p e rm a i n l yd i s c u s s e dt h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n tr e s o l u t i o n so fw a v e n u m b e r , d i f f e r e n ts p a t i a l r e s o l u t i o n s ，d i f f e r e n tr a n g e so f w a v e n u m b e ra n dd i f f e r e n tm o d e so f i m a g e - c o l l e c t i o ni nt h ee x p e r i m e n t s o f n i rm i c r o i m a g et ot h ei m a g e so f c h e m i c a lc o m p o n e n t sw i t ht h es a m p l e so f d r yt o b a c c ol e a f , , f r e s h l e a fa n dt h ec h i c k e nb r e a s tm u s c l et i s s u e p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sw a su s e dt oe x t r a c tt h e i n f o r m a t i o no ft h em i c r o - i m a g e so ft h ed i s t r i b u t i o no ft h es p e c i f i cc h e m i c a lc o m p o n e n t s ，o fw h i c ht h e r e s u l tw a sc o m p a r e dt ot h ec o m p a r ec o r r e l a t i o ni m a g et oi d e n t i f yt h ed i s t r i b u t i o no fc h e m i c a l c o m p o n e n ti nt h el e a v e s t h er e s u l t sw e r e 嬲f o l l o w s ：( 1 ) t h er e s o l u t i o no fw a v e n u m b e rh a dl i t t l ei n f l u e n c et ot h es h a p eo f t h ee i g e nv e c t o r sf o r t h en a t u r a ls a m p l e s ，t h ed i m e n s i o n so fc o r r e s p o n d i n ge i g e nv e c t o r so f t h es p e c i f i c c h e m i c a lc o m p o n e n t sw e r en o tc h a n g e d ( 2 ) t h es p a t i a lr e s o l u t i o no f6 2 5 p a n 6 2 5 1 m aw a sg o o df o r t h e i m a g eo f c h i c k e nb r e a s tm n s c l et i s s u es a m p l e ；w h i l et h es p a t i a lr e s o l u t i o no f 2 5 心l x 2 5 岬w a sg o o df o r t h ei m a g e 。o ft o b a c c od r yl e a fa n df r e s hl e a fs a m p l e s ；( 3 ) t h ew a v e n u m b e rr a n g ec o u l de f f e c tt h en i r m i c r o - i m a g eo f t h e c h i c k e nb r e a s tm u s c l et i s s u es a m p l es i g n i f i c a n t l y , t h el o a d i n gm a t r i x ( e i g e nv e c t o r s m a t r i x ) o fp c a w o u l dc h a n g ew i t ht h ed i f f e r e n tw a v e n u m b e rr a n g e s ，ac h e m i c a lc o m p o n e n tw o u l d a p p e a ra tt h ed i f f e r e n te i g e nv e c t o r s ( 4 ) n er e f l e c t a n c em o d eo f i m a g e c o l l e c t i o nc o u l dc o l l e c tag o o d i m a g eo f t h ef r e s hl e a f , w i t ht h et h i c k n e s sa b o u t1 5 0 p m ( 5 ) t h ep c am e t h o dw a su s e dt oe x t r a c tt h e e i g e nv e c t o r sf r o mt h en i rm i c r o i m a g eo f t h et o b a c c od r yl e a f , a n dt l l e2 ”e i g e nv e c t o rw a sc o m p a r e d w i t ht h en i rs p e c t r u mo fs t a r c h w h o s ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a sh i g hu pt o0 9 7 7 9 ，w h i c hs u g g e s t e d t h a tt h e2 “e i g e nv e c t o rw a sd e r i v e df r o ms t a r c hm a i n l y ；t h e ? 4s c o r ei m a g es h o w e dt h ed i s t r i b u t i o no f s t a r c hi nt h et o b a c c od r yl e a fm a i n l y t h e2 ”s c o r ei m a g ew a sc o m p a r e dw i t ht h ec o m p a r ec o r r e l a t i o n i m a g eo f t o b a c c od r yl e a f w i t hs t a r c h ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tb o t h t h es h a p ea n dt r e n do f t h et w oi m a g e s w e r es i m i l a ro nt h ew h o l e c o m p a r ec o r r e l a t i o ni m a g e so ft o b a c c od r yl e a fw i t hs t a r c h ，n i c o t i n e ， g l u c o s e ，f i b e r , p r o t e i na n df r u c t o s ew e r em a d ei n o r d e rt oi d e n t i f yt h ed i s t r i b u t i o no ft h ec h e m i c a l c o m p o n e n t si nt h et o b a c c od r yl e a f ( 6 ) c o m p a r ec o r r e l a t i o ni m a g e so ft h en i p m i c r o - i m a g eo ft h e f r e s hl e a fw i t hs t a r c h , g l u c o s e ，f r u c t o s e ，f i b e r , p r o t e i na n dw a t e rw e r em a d ei no r d e rt oi d e n t i f yt h e d i s l r i b u t i o no f t h ec h e m i c a lc o m p o n e n t si nt h ef r e s hl e a f t h et e c h n o l o g yo f t h en i r m i c r o - i m a g ew i l lb eu s e dw i d e l yi nt h ef i e l do f b i o l o g 了w i t ht h ef e a t u r e s o fl i t t l ei n t e r f e r e ra n dn o n d e s t r u c t i v e ，e s p e c i a l l yt h ei d e n t i f i c a t i o no fc h e m i c a lc o m p o n e n t s t h e a d v a n t a g e so fn o n - d e s t r u c t i v ea n dt h eo r i g i n a la n a l y s i sw e r ee a s yt os e e f u r t h e rr e s e a r c hl i e si nt h e a c q u i s i t i o no ft h ed i s t r i b u t i o no fm o r ec h e m i c a lc o m p o n e n t sb yt h eb e t t e ra l g o r i t h m o fs p e e t r a s e p a r a t i o n k e y w o r d s ：n e a r - i n f r a r e dm i c r o s c o p y , c h e m i c a li m a g e ，m i c r o a n a l y s i s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：幻们年6 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，i i ：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：王舞 剔毪轹静絮 时间：鲫口 年，月i f - i j 时间：力膨| 7 年月，厂日 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 近红外区域是指波长在7 8 0 n m 2 5 2 6 n m 范围内的电磁波。近红外区域是人们最早发现的非可 见光区域，距今已有近2 0 0 年的历史 近红外光谱分析是指利用近红外谱区包含的物质信息，主要用于有机物质定性和定量分析的 一种分析技术现代近红外光谱分析是从农业分析开始的随着计算机技术和信息提取技术的高 度发展，近红外分析技术才得到了迅速发展，特别是现代近红外光谱分析技术，不但可用于脂肪 酸【l i 、糖 2 1 、脂肪 3 1 、蛋白质嗍、水分”i 、淀粉1 6 1 及其它营养成分的分析，还适用于其它各种农 副产品品质分析( 如蔬菜门、牛奶在线分析嘲，烟草1 9 1 等) 。近红外光谱分析技术正以高效和快速 的特点异军突起。 微区分析( 2 v l i c m a n a l y s i s ) 或微区痕量分析( m i c r os c a l et r a c ea n a l y s i so f m i e r o - t r a c a n a l y s i s ) 一 直是分析化学领域里一个具有挑战性的课题显微镜( 或显微技术) 在微区分析中占有很重要的 地位，常规的光学显微技术已深入到分析化学的各个领域。 红外图象技术是在f f i r 显微技术的基础上迅速发展起来的微观分析技术它将f t i r 显微红 外技术和计算机技术与自动工作台相结合得到样品的立体红外图象，使特定结构在样品上的空 间分布一目了然用透射、反射、a t r 等模式对各种样品进行自动的线扫描和面扫描，通过软件 处理得到等高图、瀑布图，总吸收图、单波数红外吸收图等各种图象红外图象技术在国外化学 分析的相关领域得到越来越广泛的应用与其他物理方法相比，红外光谱不受分子量及光散射的 影响，可用于研究天然状态下的蛋白质等大分子的结构。显微红外技本已经广泛应用于医学及临 床诊蝌6 1 、生物掣、物证学”、地质学印“l 、材料学l r , t 、农学1 2 3 1 、环境学科”1 等领域， 尤其是在植物及动物组织，癌症组织等切片的红外显微成像研究方面，获得了一些新的信息 红外光谱研究生物样品有其自身的局限性，如水的吸收峰正好覆盖在蛋白质结构的酰胺i 带 附近，面生理状态的生物样品大部分处于水环境之中，传统的解决方法是做差谱或2 h - h 交换， 而且显微红外光谱经常还需要把样品进行切片处理，因此不能进行原位分析 近红外显微图象技术也是在f t i r 显微技术发展起来的微观分析技术近红外光谱在常用的 4 0 0 0 1 2 5 0 0 c m 1 波数范围内，是舍h 基团的倍频和组合频信息，有含h 基团与其它基团( 如c - - o 等) 的组合频和c - h 、o - 1 4 、n - h 、p - h 、s i - h 等基团一、二、三、四倍频振动吸收信息近红外 显微图像技术可以提供与红外显微图像技术相似的信息，可以完成与红外光谱类似的化学成像和 成分分布研究 近红外显微图像技术不同于红外显微图像技术，对成像的干扰小，无需切片，是非破坏性的， 可以适应鲜活组织原位测定。也可以对培养液中的组织或细胞进行直接测定，这是红外图像技术 与红外显微图像技术所无法比拟的近红外显微图像技术不同于共聚焦拉曼技术，它不会有强的 中国农业大学硕士学位论文第一覃绪论 荧光干扰，而且目前的近红外成像面积最大可以达到1 0 c m 2 以上，这是目前拉曼显微图像技术所 不具备的。 近红外显微镜的原理与般光学显微镜相同，将观测试辩放大，用可见光观察、确定测定部 分以质，转换成近红外光进行 铡定近红矫显微镜把光柬聚焦到几个微米的面积上。对于细胞和 生物膜体系来说，可以将近红外光聚焦到几个细胞或膜体系上，增大了信号和水吸收噪声的信噪 比，减少了水吸收的影响，并且可以在显微镜下选择所需的细胞，这样就不用将所需的细胞分离 出来近红外显微图像技术还可以观测到位于样品表面下至少1 0 0 “m 深处的细胞，而且即使在 近红外区使用普通的物镜时，成像性能也不会受影响，近红外光对玻璃和石英材料是透明的。 近红外显微图像技术同时具有以下特点：( 1 ) 无需切片抛光和其他处理；( 2 ) 强穿透能力， 固体样品大子3 0 0 p 由，组织以厘米计；( 3 ) 水的干扰小，可以对鲜活组织和溶液中的细胞样品 直接测定；( 4 ) 新的成像仪器可以测定的区域非常大。一般可达到1 0c m 2 以上，并且可以适应粗 糙表面的样品；( 5 ) 非接触性、非破坏性测试。 因此。人们有理由相信，在固体、鲜活组织和细胞的图像学和成分分布研究中，近红外显微 图像技术将提供给我们一种新的工具，并一定会提供给人们新的信息近年来，该方法的应用研 究在国外也刚刚起步 列，而在国内这项技术还未被广泛认识。 1 z 国内外研究现状 卑在1 8 0 0 年，人们就发现了近红外光谱区，但是由于近红外区的倍颡和组台频的吸收弱，光 谱复杂，吸收峰重叠，背景客易变动等特点使得光谱中有效信息无法分离和解析，不像可见光区 和中红外光区那样意义明确，从而限制了近红外光谱在分析中的应用2 0 世纪初，人们采用摄诺 的方法首次获得了有机化合物的近红外光谱，并对有关基团的光谱特征进彳亍了解释，预示着近红 外光谱( n e a rb 血- a m ds p e c 扛口s 。o 隧n i r s ) 有可能作为分析技术的一种手段得到应用， 2 0 世纪5 0 年代中后期，随着简易型近红外光谱仪器的出现以及n o r r i s 等人口1 在近红外光谱 漫反射技术上所做的大量工作，掀起了近红外光谱应用的一个小高潮。由于当时的应用都是基于 传统的光谱定量方法，当样品的背景、颗粒度、基体等发生变化时测量结果往往产生较大的误 差进入6 0 年代中期。随着( 中) 红外光谱技术的发展及其在化合物结构表征中所起的巨大作 用，人们淡漠了近红外光谱在分析测试中的应用进入2 0 世纪8 0 年代后期，近红外光谱才真正 为人们所注意，这在很大程度上应归功于化学计量学方法的应用，再加上过去中红外光谱分析技 术积累的经验，使近红外光谱分析技术迅速得到推广，成为一门独立的分析技术我国对近红外 光谱技术的研究以及应用起步较晚，但1 9 9 5 年以来受到了多方面的关注，并在仪器的研制、软 件开发，基础研究和应用等方面取德了可喜的成果 将近红外光应用于显微技术的研究是近几年才提出来l 列，在国内外这项技术还未被广泛认识 随着近年来光电技术和计算技术的飞速发展。硬件方面的局限已经基本消除，目前近红外显微图 像应用的主要限制因素在于较高的仪器价格和相对较低的仪器性能 目前，制约近红外显微图像技术发展的主要因素是化学成像的方法问题由于近红外光谱的 谱峰重叠严重，特征性不强，因此，很难找到一个专属于某化台物的特征峰，也就是说，近红外 2 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 光谱图像很大意义上是多种成分的复合图像，即使单一波长，也是多种官能团信息的叠加，从而 导致无法对特定化合物成像，也就无从知道化合物在样品中的分布情况要获得单一成分的图像 就必须从多种官能团的复合信息中提取和分离出单一成分的光谱特征信息，并以该特征信息进行 成像，才能从多种成分复合图像中分解得到单一成分的图像对图像进行光谱剥离。得到纯组分 分布的图像是近红外显徽图像研究的难点 目前近红外显微成像技术还局限于总吸收图成像和单一波长的化学成像，严格意义上说，仍 然是多组分成像，并没有进行光谱剥离。成像的准确性还有待于进一步证实基于多元分析的光 谱剥离化学成像技术的研究仅有少数报道j r b a r k s h i r e 等人斛嗓用主成分分析技术提取与特定 元素相关的主成分( 特征向量) ，成功的对不同元素分布进行超显微成像，获得单个元素分布的 化学成像：f i o n ac l a d i 驯采用偏最小二乘法( p l s ) 提取与药片有效成分相关的各个主成分 ( l o m i n g s ) ，对药片样品进行近红外显微成像，获得药片有效成分分布的化学成像但是由于主 成分特征向量不是只有一个，到底采用哪一个特征向量进行化学成像是正确的目前还没有统一的 意见d i w a np a d a n a 等 2 9 1 用主成分分析的方法对黄瓜表面擦伤部位的光谱做分析，从而对黄瓜 表面擦伤做出分析，没有用到提取特征向量确定成像的方法b s b e n n e d s e n 等1 3 0 l 用单波数近红 外图像对苹果表面擦伤做成像。c h i e ud t r a n 等p l 近红外图像研究叶片中水分，没有光谱剥离 j a n i ed u b o i s 3 2 1 对细菌做近红外化学成像，用近红外总吸收图及其中的光谱来对细菌加以区分 s t e p h e n 只n i g h s w a t l d e r - r e m p e l 等田用近红外图像法研究心肌组织的变化情况，没有光谱剥离过 程m i c h a e l a t t a s l 3 ”等用长波近红外图像对活体皮肤的水合作用进行测量，亦无光谱剥离过程 光谱剥离技术目前已经比较成熟，比如常用的有解卷积法、导数法、小波变换等，结合p c a 、 p l s 等因子分析方法应用于显微图像中的光谱信息提取和分离可能是解决近红外显微图像应用 中的关键问题这些技术在近红外光谱数据处理和模型建立过程中都是比较常用的方法，在图像 处理中的应用也有报道p 1 本研究主要采用光谱剥离技术，实现近红夕 显微图像技术中的单组分化学成像。主要解决植 物组织等生物样品近红外显徽图像中的成分分布确认，并为微区定量分析条件的选择提供参考 1 3 研究方法和内容 本论文研究近红外显微成像技术及其在生物学中的应用，使用仪器为傅立叶变换近红身 显微 镜，用适当的预处理方法提高光谱质量，降低噪声，获取信噪比高、背景干扰低的分析信号，再 通过不同图像处理方式获得样品的化学成分分布图像 首先陈述了实验条件的选择，用鸡胸部肌肉组织样品、千烟叶样品以及鲜叶片样品在不同的 实验条件下得到的近红外显微图像的分析结果阐述了近红外显微图像实验条件的选择，印不同波 数分辨率、不同空间分辨率，不同波数范围以及不同的图像采集方式对实验数据处理结果的影响 然后陈述了千烟叶和鲜叶片的近红外显微图像分析结果用光谱预处理、主成分分析得到其 中的重要组分的得分图像，并与相关光谱成像图对比，从而对于烟叶中的化学成分分布进行分析， 再借鉴此方法对鲜叶片中的化学成分分布进行分析 3 中国农业大学硕士学位论文第= 章理论基础 第二章理论基础 2 1 近红外光谱法的物理基础 在近红外光谱分析中，装载分析信息的信号是近红外光，因此近红外光谱分析的信号特征决 定于近红外辐射的物理特征，并决定了近红外光谱仪器应用的光源、检测器与光学材料 近红外光谱分析的信号有以下特征： 近红外光的产生：近红外光的波长范围借于o 8 2 5pm ，由黑体辐射定律可知，在3 0 0 0 左右的色温下在近红外谱区的辐射效率很高，因此获得近红外谱区的光源比中红外谱区的光源方 便，一般用卤素灯 近红外光的检测：近红外谱区光子的能量比可见谱区低，其能量范围为1 6 5 0 5 e v ，该能量 低于碱金属外层电子逸出功，因此检测器不能用光电管或光电倍增管等光电材料常用的测光材 料是半导体材料，如：s i ，p b $ 以及l n s b 、i n a s 等。l n s b 和i n a $ 的导电机制是少数载流子，近 红外谱区的检测效率很高，但温度引起的热噪声很大，因此这类检测器需要在液氮下工作 近红外谱区的光学材料：适用于近红外谱区的光学材料比中红外谱区多，参见表2 - 1 一些材 料在近红外区有良好的光学性能与物理性能。价格又比较便宜，这就使近红外仪器的造价下降， 使得近红外仪器应用更加方便，便于实时分析 表2 _ 1 近红井谱区一些光学材科的透过特征 t a b l e 2 - 1t h e 妇陴f 姐融曲埠o f n 峙o p “c 叠l 蛐i l e 叫s i n t h c 瑚萨o f f i 咖。砌 删 袭2 - l 中，折射率的测定波长为5 8 9 n m lk r s - 5 成分为t i b r 4 2 。1 1 15 8 近红外光谱主要是有机分子的倍频与合频吸收光谱，与中红外光谱一样，本谱区也能够得到 分子的结构，组成、状态的信息因为近红外谱区的吸收主要是分手或原子振动基频在2 0 0 0 c m 1 4 中国农韭大学硕士学位论文 第= 章理论基础 以上的倍频、合频吸收，所以有机物近红外光谱主要包括c - h ，n h ，o - h 等含氢基团的倍频和 合频吸收带这些舍氢基团的吸收频率特征性强，受分子内外环境的影响小，而且在近红外谱区 比中红外谱区的样品光谱特征性更稳定。这些是在近红外谱区做复杂天然物品质分析的前提 有机物近红外光谱谱带重叠与吸收强度弱的特点给分析带来了困难：近红外区定量分析其检 测限比中红外区的定量分析差1 2 个数量级，谱峰重叠严重然而，单吸收强度弱也给分析带 来方便，例如：农业样品不需要经过化学等与处理而直接进行分析，可以使用长光径的样品池分 析样品，光径的误差对分析的影响较小，牯度较大的样品也可以在近红外区进行流动分析 近红外光谱分析由于倍频、合频吸收带宽而多，从而使近红外光谱的图谱解析异常困难复 杂样品近红外光谱分析的信息提取主要依靠化学计量学与计算机数据处理才能实现 2 2 近红外光谱分析的化学信息基础 分子的振动状态用基频、倍频与台频来描述最简单的分子即两个质量分别为m - 、1 1 1 2 的原 子组成的双原子分子，可以模拟为用弹簧连在一起的两个小球组成的弹簧振子。由胡克定律 ( h o o k sl a w ) 可知，这个系统的振动属于简谐振动，因此称为谐振子谐振子机械振动的频率 为： 归去仨 ， 归西怯 式( 2 - - 1 ) 中，v ：振动频率； k ：力常数； p ：甄个原子的折合质量 若组成分子的两个原子的质量分别为m l 、啦，则 = ( j ，l i 一1 + m 2 1 ) 一。( 2 - 2 ) 近红外光谱的信息范围从4 0 0 0 e m 1 开始到1 2 5 0 0 e m 1 在近红外分析中具有实际意义的主要7 是含h 的基团为主的一些特征基团，包括o - h 、n - h 、c - h 等表2 - 2 是主要基团合频与倍频吸 收带的近似位置 褒毒_ 2 主要含氢基团台频与倍频吸收带的近红外光谱的近似位置 t a b l e2 - 2n i p s p 咖p e a ki o e a t k mo f c o m b i n e da n dm u l t i p l ef r e q u e n c yo f m a i nh y d m g e n 础e d 鲫l l p s 5 中国农业大学硕士学位论文 第二章理论基础 近红外光谱分析信息源的特点使得该技术应用广泛、操作简便，另一方面也决定了该技术具 有一系列难点 一，图谱背景复杂影响分析近红外光谱测定的样品经常是不经过提纯等预处理的复杂样品， 在这些样品中与待测成分同时存在高强度的复杂的背景 二、每一个波长位置通常有多个谱峰的重叠近红井光谱的谱蜂宽度比中红外谱区宽很多， 物质分子在近红外谱区吸收峰的分布范围也较宽，同一种基团可以在近红外谱区的二、三、四等 等不同倍频区出现吸收峰。信息分布范围广，谱峰宽度较宽，因此复杂物同一近红外谱区内常有 不同分子、多基团的谱峰重叠在一起 三、近红外光谱的波动性由于样品未经过预处理，因此，样品的状态、测定的方式以及测 定的条件都会影响测量的结果。为了降低近红外图谱测定的不稳定对分析的影响，在硬件方面可 以采用积分球等特殊样品池进行测量，在软件技术方面还可以通过一些校正系统误差的信息处理 技术，如矢量归一化、多元散射校正以及导数光谱等以校正样品光谱的失真，并建立规范的测 试过程以减少光谱的不稳定 四、近红外光谱中谱峰强度较弱有机物近红外谱区各级倍频与台频的吸收强度大致比基频 或上一级倍频低一个数量级。为了将近红外谱区用于分析，必须从硬件与软件两方面解决近红外 分析吸收强度较弱的难点在硬件方面需要提高仪器的信噪比现代近红外仪器运用各种校正随 机误差、降低噪声的方法与技术，可以将信嗓比提高一个数量级左右 。 概括说，近红外光谱分析的难点是从复杂、重叠、变动的背景中提取弱信息。为了解决这个 难点，在硬件上近红外仪器应有较高的波长准确度和吸光度准确度；在软件方面近红外分析必须 依靠现代化学计量学的算法与计算机技术 2 3 近红外光谱分析的数据处理 通常广义噪声包括仪器的随机噪声、基线漂移、测定环境背景以及干扰组分背景光谱等最 重要的信号处理方法有平滑、卷积，微分和积分。采用软件方法来进行分析信号的处理，尤其是 后处理，越来越受到重视。常用的近红外光谱中的噪声和背景的扣除方法有平滑、导数和傅立叶 变换滤波等。 2 3 1 数据的平滑f 3 5 问 光谱平滑的本质是对光谱曲线进行低通滤波，去掉高频成分，保留有用的低频信息光谱平 滑的基本思路是在平滑点的前后各取若干点来进行。平均”或。拟合”，以求得平滑点的最佳估 计值。消除随机噪声，这一方法的基本前提是随机噪声在处理。窗口”内的均值为0 对光谱数， 据进行平滑处理的方法也叫数字滤波器。平滑算法一般可以用下式表示： i - t k - 、+ r 乙o y 兵= 笔i 卜 。( 2 - 3 ) 己q 6 中国农业大学硕士学位论文 第：章理论基础 其中，h ，h 分别为第k 点( 中心点) 的平滑前、后的值，而a l 为平滑系数( 或权重) 窗口 宽度为( 2 一1 ) 个点，在窗口内进行加权平均，平均区段是逐点后移的这种平滑处理方法可以 有效地平滑高频噪声，提高信噪比但是由于它是( 2 r + 1 ) 点的平均平滑，对有用分析信号也进 行平滑。造成信号失真。降低了光谱分辨率，而且数据最前f 点和最后r 点不能做平滑。因此存 在一定的局限。 1 9 6 4 年，s a v i t z k y 和g o 岍提出用最小二乘拟合系数作为数字滤波相应函数来对原光谱进行 卷积平滑处理的方法，这种方法目前广泛应用于信号的滤波处理。s a v i t z k y - g o l a y 系数表见表2 - 3 ： 袭2 - 3s a y i t z k y - t l o l a y 系数表 t a b l e 2 - 3 t h e t a b l e o f c o c t h c i c n t s o f s a v i t z k y - g o l a y 点数 i i97 5 - 53 6 - 4 9 - 2 l - 34 41 4 - 2 2693 9 33 1 8 45 46 1 2 0 8 95 9 71 7 2 3 2 导数d 5 】 导数光谱法作为一种常用的光谱处理方法广泛应用于光谱分析中，导数光谱可以利用按波长 扫描的光谱数据的微分( 逐点相减) 而得到，也可用微分电路来实现。现代光谱分析一般用数学 方法来计算一阶、二阶等导数光谱，如图2 - l 。2 _ 2 ，2 3 所示 固2 1 高斯曲线殛其导数光谱 f i g 2 - 1t h eg a j r v c a n di t sd e c i v i r i v es p e c t r a ： l 。 。0 宙2 2 重叠吸收曲线及其透过率的一阶导数曲线 f i g 2 - 2 0 v e f l a p p e d c u r v ea n d i t s i 。d e r i v a t i v e s p e c m a n 7 圈2 - 3 重叠峰及具二盼导数光谱 f i g 2 - 3mo v e r l a p p e dp b 删i t s 2 _ d e r i v a t i v es p e c t r u m 导数光谱既可以消除基线漂移或平缓背景干扰的影响，也可以提供比原光谱更高的分辨率和 更清晰的光谱轮廓变化 上述讨论中忽略了噪声的存在如果考虑噪声的影响，情况将更为复杂。因为随机噪声一般 都是高频信号，求导将进一步放大噪声信号，园此，必须要求原光谱有较高的信噪比。 光谱数据的求导的方法很多，假设原光谱数据的x 轴( 波长) 是等间隔的。则一阶导数为： 罢= 警或鲤d x 蛩 c ：4 ， 二阶导数为： 公式( 2 - 4 ) 和( 2 5 ) 中，y 为吸光度。采用s a v i t z k y - g o l a y 多项式拟合方法， 确定平滑函数来对原光谱进行卷积处理班5 点二次平滑方法为倒，有如下公式： 砉= 忐( _ 2 靠：一舶+ + ) 鲁= 去( 2 咒五仉嘞帆嘞以) 上述公式利用多个波长点处的信息，因此拟合效果比较好。 2 3 3 傅立叶变换滤波【3 珂 ( 一) 连续傅立时变换 傅立叶变换是时同( 或空间) 域函数粥与频率域函数f ( y ) 间的数学关系，即： ，( o = p ( 力一咖西或联力= f f ( t ) e - 2 m d t 其中，j 是虚数单位。 ( 2 - 5 ) 利用权重系数 ( 2 - 6 ) ( 2 - 7 ) ( 2 8 ) 中国农业大学硕士学位论文第二章理论基础 妁为时( 空) 域函数，f ( v ) 为频率域函数，即时空域与频率域函数可通过一个变换来统一 一般地，f v ) 即常见的谱图，而妁为波形图( 干涉图) ，在傅立叶型仪器中，直接采集到的是f m 信号，然后通过快速傅立叶变换( f f t ) 得到谱图f “) ( 二) 离散傅立叶变换 通常检测器采集到的坟t ) 是由有限长度，等间隔的数据点坟构成的序列，即是数字信号，有： 离散傅立叶变换可写成： 其逆变换为： ，v ) 八) ) ，以= o ，”一l( 2 9 ) ( 2 1 0 ) i 一l ，瓴) 2 专萎，( 弦2 咖。= ”。、一n ( 2 1 1 ) 傅立叶变换在光谱处理中的应用主要有两方面：压缩数据( 特征提取) 和滤波处理。 2 3 4 附加散射校正( m u l t i p l i c a f v es c a t t e rc o r r e c t i o n , m s c ) p 5 】 + 附加散射校正( m u l t i p l i c a t i v es c a t t e rc o r r e c t i o n , m s c ) 的目的是校正每个光谱的散射并获得 比较“理想”的光谱。附加散射校正法假定与波长有关的散射对光谱的贡献和成分的贡献是不同 的，理论上说，通过光谱上许多点的数据分析，可以把这两部分分开m s c 方法认为。每一条 光谱都应该与。理想”光谱成线性关系。而真正的“理想”光谱无法得到，可以用校正集的平均 光谱来近似因此，每个样品的任意波长点下反射吸光度值与其平均光谱的相应吸光度的光谱是 近似线性关系，直线的截距和斜率可由光谱集线性回归获得，并用以校正每条光谱截距( 即附 加效应) 大小反映样品独特反射作用，斜率大小反映样品的均匀性具体计算公式如下： 平均光谱： 万= 彳f 盯( 2 - 1 2 ) 线性回归： 42 嘲4+吃(2-13) m s c 校正： 钿= 掣 c 州， 上 j 述公式中，a 是校正集的光谱矩阵，a 为第i 个样品的光谱。m i 和b i 是第i 条光谱 a i 与平均光谱的线性回归的斜率与截距，都是列向量通过调整m i 和b i 的不同，使得在减少光 9 谱差异的同时尽量保留原有的与化学成分有关的信息通过这样的校正，随机变异得到最大可能 的扣除。在光谱与浓度线性关系较好和化学性质相似的情况下，m s c 校正的效果较好 2 3 5 变量标准化( s t a n d a r dn o r m a l i z e dv a r i a t e , s n v ) f 3 5 l 变量标准化( s t a n d a r d n o r m a l i z e d v a r i a t e , s n v ) 认为每一个光谱中，各波长点的吸光度值应 满足一定的分布( 如：正态分布) ，通过这一假设对每一条光谱进行校正，无需“理想”光谱 s n v 是原光谱减去该光谱的平均值u 后，再处于该光谱数据的标准偏差0 实质是使原光谱数据 标准正态化，即： z ；竺2( 2 1 5 ) 由于s n v 是对每一条光谱单独进行校正，因此一般认为他的校正能力比m s c 强一尤其是样 品组分变化较大的时候。 2 3 6 中心化( m e a nc e n t e r ) 【3 5 】 数据中心化的目的是改变数据集空间的原点，通常原点取数据集的平均值。因此第i 个样品 的第k o 个测量值) 缸的中心化数据) 为： 且 矗；冬粤 钆 墨；击n p 一_ ) ：】l 2 墨= 【志善一确”2 ( 2 1 6 ) ( 2 - 1 7 ) 通过以上变换，把数据阵x 变为x ，使得数据的变化以平均值为原点，变化的特征性更加一 目了然。这种变换称为中心化处理( m e a n c e n t e r ) 2 3 7 归一化( n o r m a l i z a t i o n ) f 3 5 i 标准化处理设定数据集中所有的数据向量的长度相同。每个向量中元素的平方和相似，令 y 矗- - c , ( 2 - 1 8 ) 扣i 为把数据向量归一化为n ，将向量中的每个元素乘以，托令向量为单位长度或单位面 积是常用的方法，即归一化方法归一化方法使向量的方差为1 ，可有效消除一组测量中的随机 误差向量归一化常用于对近红外光谱的标准化处理 2 3 8 主成分分析 2 7 3 6 , 3 7 近红外显微图像是多组分重叠的图像，图像中每一个像素点都是一条完整的近红外光谱对 图像进行光谱剥离，从而得到纯组分分布的图像是近红外显微图像研究的难点 目前国际上最常用的光谱剥离算法是主成分分析( p c a ) 算法用p c a 算法，通过提寥图像 i o x = z n + z 2 + 乙+ + 乙( 2 - 1 9 ) 这些秩为1 的矩阵z h ，可以表示为两个向量的外积，即，乙= t b p a ，维数为n m ，与x 的 相同。因此，公式( 2 1 9 ) 可写为： x = t t p l + t 2 p z + 十乜i p h + 十n ( 2 - 2 0 ) 其矩阵形式表示为： x=tp(2-21) t 和p 分别由t 和p 组成 通常，主成分分析中，人们所关心的是投影操作通过种操作使) 。向一维空问投影，使 得它的每一列用一个标量表示；通过另一种操作使