（分析化学专业论文）spr技术在生化分析中的应用.pdf

硕士学位论文 m a s t e r sf h e s i s 中文摘要 本文从表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 技术的应用入手，运 用了s p r 技术考察不同条件下两种物质的反应过程，得出了相关结果，同时也讨论 了微流控芯片的发展情况，共分为五章，各章内容如下： 第一章介绍了s p r 技术的发展、原理及其特点。然后简单的谈到了目前s p r 仪器的发展情况，总结了s p r 技术在1 1 个方面的应用情况，最后介绍了s p r 技术 的最新发展情况和发展趋势。 第二章在介绍了微全分析系统的历史及其特点的基础上，总结了现行的检测技 术，并就微全分析系统的发展与应用进行了展望。 第三章应用了s p r 技术研究s s b 与s s d n a 的相互作用。首先研究的是通过静 电吸附到金膜表面的s s d n a 与s s b 的反应，并考察了m d + 和n a + 对该反应的影响。 其次谈到了用含有巯基的核苷酸片段自组装的s s d n a 芯片与s s b 的反应，结果表 明，在流速为1 7 1 2 1 a l m i n ，p h = 7 4 的 i r i s h c i 作缓冲溶液时s s b 与s s d n a 有特 征性的结合，相应的s p r 响应信号与s s b 的浓度成正比，s s b 的浓度范围为0 1 - 1 0 0 n g m l ，s s b 的检测的极限( s n = 3 ) 为0 0 7 n g m l 。 第四章采用了s p r 技术研究了铁( i i ) 与邻二氮菲的相互作用，分别探讨了铁 ( i i ) 、邻二氮菲在金膜表面的吸附以及s p r 响应规律。结果表明，在1 0 - 6 _ 1 0 4m o l l 浓度范围内，铁和邻二氮菲各自s p r 角度变化较小，而它们的络合物有较大的s p r 响应，据此进行它们的相互作用研究。通过s p r 技术测得其络合比为l ：3 ，络合 常数为1 7 9 x 1 0 “l m o l 。 第五章采用胺基偶联的方法，成功地将b s a 固定在s p r 2 0 0 2 仪金膜表面，印 证了优化的实验条件。 关键词：表面等离子体共振技术：微全分析系统：单链d n a ：铁( i i ) ； 牛血清白蛋自 一m a s t e r s t h e 啪 a b s t r a c t n e t e c h n o l o g yo fs u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c ew a sa p p l i e di nt h ee q u a t i o no ft w o d i f f e r e n ts u b s t a n c e s ，s o m ec o n c l u s i o n sw e r ee d u c e d ，a tt h es a m et i m e ，t h ed e t e c t i n g t e c h n i q u e sa n dt h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o no ft h em i c r et o t a la n a l y s i ss y s t e r n sw e r ea l s o d i s c u s s e di n t h i st h e s i s t h ec o n t e n to ft h i st h e s i sw e r ed i v i d e di n t of i v ec h a p t e r sa n d l i s t e da sf o l l o w s ： 1 t h ed e v e l o p m e n to ft h eh i s t o r yo fs u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e a n di t s p h y s i c a l o p t i c sp r i n c i p l e s c h a r a c t e r i s t i c sw e r ed i s c u s s e di nt h ec h a p t e r , a n dt h ec u r r e n t d e v e l o p m e n ti n s t a n c eo fs p ri n s t r u m e n t sw e r er e f c f r e ds i m p l ya l s o a tl a s t t h e a p p l i c a t i o n so fs p rt e c h n o l o g yw f r ec o n c l u d e d i n1 1f i e l d s ，a n dt h en e w e s td e v e l o p m e n t a n dt r e n d so fs p r t e c h n o l o g yw e r ea l s oi n t r o d u c e d 2 u n d e ri n t r o d u c i n gt h eg e n e r ma s p e c t sa n dh i s t o r yo ft h em i c r ot o t a la n a l y s i s s y s t e m ，t h i sp a p e rs u m m a r i z e dt h ed e t e c t i n gt e c h n i q u e sa n dd i s c u s s e dt h et r e n d sa n di t s p o t e n t i a la p p l i c a t i o n 3 t h ei n t e r a c t i o n so fs s d n aa n ds s bw e r es t u d i e di nt h et h i r dc h a p t e lf i r s t 。t h e i n t e r a c t i o n so fs s d n ac o n n e c t i n gt oa uc h i pb ys t a t i ca f f i n i t ya n ds s bw e r es t u d i e d ， t h e nt h er o l e st ot h er e a c t i o no tt h em a n dn fi nt h es o l u t i o nw e r ea l s os t u d i e d t h e s e c - 2 0 n d - a ns s d n a g o l d c h i p w a s p r e p a r e d b a s e do n s e l f - a s s e m b l y o ft h e t h i o l d e r i v a t i z e do l i g o n u c l c o t i d e ，a n du s e df o rt h ei n t e r a c t i o n so fs i n g l e s t r a n d e db i n d i n g p r o t e i n ( s s b ) b ys u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts s b b i n d e d s s - d n aw i t hh i g hs p e c i f i c i t y ，a n dt h er e l a t i v es i g n a lo fs p r r e s p o n s ei sp r o p o r t i o n a lt o t h ec o n c e n t r a t i o no fs s bi nt h er a n g eo f0 1 - 1 0 0n g m lw i t had e t e c t i o ni i m i to f0 0 7 n g m lu n d e rt h ec o n d i t i o no ft h ef l o wr a t ei s1 7 1 知i j m i na n dt h ep ho ft h eb u f f e r t r i s h c “s7 4 4 t h ei n t e r a c t i o n so fp h e n a n t h r o l i n ew i t hi r o n ( 1 1 ) i o nw e r es t u d i e db ys p r t e c h n i q u e b o t ht h es p rr e s p o n s er u l e sa n dt h ea d s o r p t i o nt o t h eg o l ds u r f a c eo f p h e n a n t h r o l i n ea n di r o n ( 1 1 ) a r ed i s c u s s e dr e s p e c t i v e l y 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a ts p ra n g e l c h a n g e dv e r yl i t t l ew h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp h e n a n t h r o l i n eo ri r o n ( i i ) c h a n g e df r o m 1 0 。om o l lt o1 0 1m e l lb u tt h ec o m b i n a t i o no fp h e n a n t h r o l i n ew i t hi r o n ( 1 i ) p r o d u c e d g r e a ts p rt e s p o n s e j u s tf o rt h i sr e a s o n s o m em e a n i n g f u li n f o r m a t i o na b o u tt h e i n t e r a c t i o np r o c e s sc a nb cg a i n e db ys p r t e c h n i q u e ，s u c ha st h ec o m b i n a t i o nr a t i oi s3 ， t h ec o m b i n a t i o nc o n s t a n ti s1 7 9 x 1 0 “l m 0 1 5 i nt h ef i f t hc h a p t e r b s aw a si m m o b i l i z e do nt h es p r 2 0 0 2g o l dc h i pb yad u a l a m i n eb o n ds u c c e s s f u l l y , a n dt h eo p t i m i z e de x p e r i m e n tc o n d i t i o n sw e r ep r o v e d ， k e y w o r d s ：s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ；m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m ；s s d n a ； i r o n ( i i ) ；b s a n 硕士孝位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究i 作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作糌名：彻魄叶r 月盯日 1 f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签 日期- 导师签名： 日期 厂月。日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。园重迨塞握童卮澄屋! 旦圭生；旦二生；旦三至蕴查! 作者娩锅伽气 日期：洳啼j 月$ 日 1 1s p r 概述 第一章绪论 1 1 1s p r 技术的发展 表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c es p r ) 技术是一种简单、直接的传 感技术，是表面等离子体在金属和电介质的交界面上形成的一电荷层，在电磁波的 激励下，表面等离子体发生共振现象【1 】。在2 0 世纪的初期，w o o d 等人就利用衍射 光栅观测到光栅的反常衍射现象【2 ，第一次公开对表面等离子波进行描述。1 9 0 9 年，索末菲从麦克斯韦的电磁理论出发，引入复介电常数的概念。得到了表面局部 的等离子表面波解，等离子波是一种在表面和界面传播的t m 波。其振幅随离开界 面的距离而按指数规律衰减。1 9 4 1 年，f a n o 用金属与空气界面的表面电磁波来激励 等离子波，并对其进行了解析，1 9 5 7 年，r i t c h i e 发现电子穿过金属薄膜时产生的“能 量降低”现象，第一次提出“金属等离子体”概念，1 9 5 9 年，p o w e l l 和s w a n 用实验 的方法证实了r i t c h i e 的理论。s t e m 和f a r r e l l 称这种现象为“表面等离子共振”( s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e ) 。1 9 8 8 年，k r e t s c h m d n n 3 和o t 2 t o 4 用衰减全反射方法证实了表 面等离子共振现象的存在。1 9 8 2 年，n y l a i l d e r 和“e d b e r g 【5 6 】将表面等离子共振技术 应用于气体的检测和生物传感的研究。由于等离子波随介质的折射率的变化较敏 感，如果让被测样品( 如氢气等气体) 与发生表面等离子共振的金属薄膜相接触，由 于存在着先吸附，再吸收，最后可发生化学反应等过程，导致薄膜的介电常数发生 变化。根据这一原理，人们研究了各种的s p r 传感器，报道的有气体传感器、液体 传感器、化学传感器和生物传感器 7 - 8 1 。 表面等离子体共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 技术由瑞典科学家l i e d b e r g 等于8 0 年代首次运用于l g g 抗体与其抗原相互反应的测定【9 】。随后，该技术被引 入生物传感器领域并迅速渗透至基础生命科学研究中。基于s p r 技术的光学生物传 感器具有其它相互作用技术所无法比拟的优点，如不需对分子进行标记、能实时检 测生物分子结合反应的全过程等，其发展非常迅速，已经成为一种成熟的检测生物 分子间相互作用的方法【1 0 1 。特别是在1 9 9 0 年，瑞典的b i a c o r e a b 公司开发出世界 上第一台商业化的s p r 生物传感器b i a c o r e x m 之后，s p r 生物传感器的研究全面展 开并不断深入，其应用范围不断扩大。近几年，s p r 技术广泛应用于从蛋白、寡核 苷酸、寡糖、脂类至o - b 分子、噬菌体、病毒颗粒、细胞等各种生物体系。商业化的 硕士学位论文 m a s f e r + sr h e s i s s p r 生物传感器已经从根本上改变了生物分子识别科学，成为生命科学和制药研究 上的标准工具【1 l 】。 1 1 2s p r 技术的原理 表面等离子体共振( s p r ) 是一种物理光学现象。表面等离子体( s p ) 是沿着金属和 电介质问界面传播的电磁波形成的。在介质( 一般为玻璃) 表面镀上一层金属薄膜后， 当入射光的入射角和波长在某一适当值时，金属受到光电磁场的作用时，金属中的 电子密度分布不再均匀，如果在金属中的某个区域的电子密度小于平均密度，则存 在过剩的正电荷，这些过剩的正电荷对邻近的负电荷产生库伦力的作用，使邻近的 负电荷向这个区域运动过来，同时获得多的能量，然后，这区域出现过多的负电荷， 由电子间的相互排斥作用，电子又远离该区域运动，从而形成电子相对于正电荷的 密度的起伏振荡，即金属中的等离子体振荡。而表面等离子体共振具有其特有的特 征，其可存在于两种介质的分界面处，而且可沿着界面传播，形成等离子体表面波 ( s p w ) 。当表面等离子体子与消失波的频率和波数相等，二者将发生共振，入射光 被吸收，引起金属中自由电子的共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其 中使反射光完全消失的角度称作共振角( s p r a n g l e ) 。当平行表面的偏振光以称之为 表面等离子体共振角入射在界面上，发生衰减全反射时，入射光被耦合入表面等离 子体内，光能大量被吸收，在这个角度上由于表面等离子体共振引起界面反射光显 著减少。由于s p r 对金属表面电介质的折射率非常敏感，当电介质折射率不同时， 其共振峰不同，其表面等离子体共振角也不同。对于同种电介质，其附在金属表面 的量不同时，其s p r 的响应强度也不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具 有特异识别属性的分子即配体固定于金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体 的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随 即被s p r 生物传感器检测出来f 1 0 1 1 】。 1 1 3s p r 技术的特点 与传统的相互作用技术如超速离心、荧光法、热量测定法等相比【9 】，s p r 生物 传感器具有如下显著特点： ( 1 ) 实时检测，能动态地监测生物分子相互作用的全过程 ( 2 ) 无需标记样品，保持了分予活性 ( 3 ) 样品需要量极少，一般一个表面仅需约l l a g 蛋白配体 ( 4 ) 检测过程方便快捷，灵敏度高 2 ( 5 ) 应用范围非常广泛 ( 6 ) 高通量、高质量的分析数据 ( 7 ) 能跟踪监控固定的配体的稳定性 ( 8 ) 对复合物的定量测定不干扰反应的平衡 ( 9 ) 大多数情况下，不需对样品进行预处理 ( 1 0 ) 由于s p r 基于对未穿透样品的反射光的测量，所以检测能在混浊的甚至 不透明的样品中进行 1 2 】 基于以上特点，s p r 生物传感器碍以在生物分子相互作用、药物筛选、临床诊 断、食物检测及环境监控、膜生物学等领域广泛应用。 1 1 4 s p r 仪器概述 图1 1 显示了s p r 仪器的简单装置示意图。目前已有许多不同型号的s p r 生物 传感器商品化，国内唯一具有实用水平的s p r 生化分析仪器也已研制成功【1 3 】。表 l 提供了几种主要的s p r 产品及公司信息【1 4 】。 缸一，瓣 p 一一一一址圳 图1 - 1s p r 装置示意图 硕士擘位论文 m a s t e r sf h e s i s 表1 - 1 主要的产品及s p r 信息 s p r 的激励原理可筒单表示如图】，2 所示，光学s p r 传感器从结构上分，可分为4 种类型【l 】： ( 1 ) 棱镜耦合式s p r 传感器 ( 2 ) 集成光波导s p r 传感器 ( 3 ) 光纤s p r 传感器 ( 4 ) 光栅耦合型s p r 传感器 图l - 2s p r 基本工作原理 1 1 5s p r 常用分析方法 根据激励原理的不同，s p r 分析方法可以分为如下四种： ( 1 ) 角度调制法：固定入射光的波长，改变入射角度，观测反射光的归一化强 度 ( 2 ) 波长调制法：固定入射光的角度，改变入射光的波长，观测反射光的归一 化强度 ( 3 ) 强度调制法：入射光的角度和波长都固定，借强度的变化测量折射率的变 化 ( 4 ) 相位调制法：入射光的角度和波长都固定，观测入射光与反射光的相差 4 1 2s p r 研究的主要方面 1 2 1 动力学研究 动力学研究主要目的是通过测定相互作用的亲和常数及动力学参数后，提出生 物学模型。具体内容可包括： ( 1 ) 在被分析物质流经配体时，实时检测它们他们的结合常数 ( 2 ) 当被分析物与配体结合后，用缓冲溶液冲洗把被分析物冲下来，实时检测 分析物和配体二者的解离常数 ( 3 ) 用动力学速率分析来考察体系的动力学行为 ( 4 ) 结合曲线和解离曲线将会适合一种供选择的反应模式 ( 5 ) 利用得到的拟合常数和计算的动力学常数，证明所选模式是否正确 ( 研另外，可计算平衡常数，用于平衡分析。平衡分析主要用来测定键合的强 度，可以设计成两种来进行，其过程是让流动的被测物流经固定的配合体，通过两 者之间的结合与分离，可得出结合常数 中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室陈受惠等人采用 溶液竞争法，测定了小分子吗啡与其抗体作用的结合常数k 一，并计算了吗啡抗体与 吗啡化牛血清白蛋白的结合常数k 2 ，证明了多抗对抗原的亲和力较单抗大，并表明 大分子蛋白质的存在对抗体与待测物的结合有阻碍作用【1 5 】。裴仁军等人应用实时 b i a 技术，探讨了蛋白a 与小鼠免疫球蛋自g ( m i g g ) 之间的相互作用，求出相互作 用的动力学速率常数k a = 5 0 7 x 1 0 4 ( m o l l ) s _ 1 ，k d = 9 6 5 1 0 5 r s o ) ，结合常数 k a = 5 2 5 x 1 0 8 ( m o l l ) 。同时使用蛋白a 固定的传感片用于m i g g 浓度的检测，在 o 6 4 - - - 1 2 m g l 浓度区间内，m i g g 的响应值与其浓度有非常好的线性关系 1 6 1 。刘雪 松等 1 7 幂l j 用生物传感器l as y s p l u s n 定了t n f 与重组的单抗之间的亲和力，亲和常 数k a 介于1 0 5 - - 1 0 7l m o l 之间 1 7 1 。杨帆等利用表面等离子体共振技术进行t n f 免疫 复合物的动力学分析，采用s 种浓度的t n f 进行测定，利用b i a c o r e 附带的结果评价 软件b i ae v a l u a t i o n3 1 0 ，选用1 ：l ，l a n g r n u i r 作用模型，根据上述关系计算出t n f 与固定单抗的动力学常数：k a = 1 6 8 x 1 0 3 l t o o l s ，k d = 1 7 3 x 1 0 - 4 s ；亲和常数 k a = 9 7 x 1 0 6 l m o l ，k d = 1 0 3 x 1 0 m o l l 1 8 1 。中国农业科学院植物保护研究所陈巨莲 也有计算g 蛋白l s n i ”结合常数( k a ) 及解离常数( k d ) 的报道【1 9 】。 1 2 2 生物分子结合位点的研究 生物分子结合位点的研究的主要是获取靶分子的拓扑结构信息及结构变换与 硕士学位论文 m a s t e r 。st h e s i s 功能的关系。其广泛用于蛋白质问、d n a 间及蛋白质d n a 间的结合分析。它的研 究内容主要涵盖生物分子相互作用分析和特异性分析。用于蛋白质之间的分析时， 一是看一种或多种作用试剂之间相互键合、相互反应的情况，二是看这种键合或反 应强度的程度，三是测定实际的结合和解离速率，另外，两种物质之间的反应还可 以通过标准曲线来测定其中一种反应物的浓度。d n a 间及蛋白质d n a 间的结合分 析主要是寻找键合配体，但这并不是直接来源于动力学数据。其首要目的在于尽可 能快的确定参与者中哪一个是最好的配体。这些特异性研究相对简单易行，加入分 析物后过一段时间测定一次信号，通过做曲线来确定最佳配体。1 9 9 8 年，a l f t h a n 将 s p r 生物传感器用于抗体工程，它可以检测抗体的抗原结合活性以及特异性，还可 检测多聚抗体或多价抗体的构建过程【2 0 】。1 9 9 9 年，g o m e s 等人利用s p r 研究合成 肽与抗口蹄疫病毒单克隆抗体之间的相互作用。在实验过程中，他们得到了一些动 力学方面的数据，分析这些数据能够了解到口蹄疫病毒( f m d v ) 主要抗原位点的 结构【2 l 】。 1 2 3 生物分子浓度的测定 用s p r 检测器所得的信息可直接来自表面的样品，也可间接来自能与样品特异 结合的相关试剂。且该相关试剂一方面可以放大样品信号，另一方面还可以从样品 的嘈杂信号中获得微量待测样品的特异性信号。生物分子浓度的测定是通过在传感 芯片表面吸附或固定着高浓度的配体，在这种方法中，键合速率只与分析物向表面 扩散的速度有关，键合速率和分析物的浓度成正比，经过确立标准曲线就能够准确 快速的测量出分析物的浓度等。如中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家 重点实验室崔小强，沙宇芳等人应用表面等离子体共振技术在传质控制下对铁蛋白 进行了检测，铁蛋白的分子量较高，传质较慢；通过增大抗体固定量和控制流速，使 抗原2 抗体间的反应在质量传输控制下进行，利用结合速率分析法对不同浓度的铁 蛋白进行了灵敏检测，其线性范围为2 0 8 0 0 p g l ，明显宽于“三明治”分析法，本方 法检出限为2 0 i t g l 2 2 1 。 1 3s p r 技术的应用研究 自l i e d b e r g 等于1 9 8 3 年首次运用s p r 技术进行抗原抗体相互作用分析以来， s p r 生物传感器已广泛应用于基础生命科学、制药、食品及环境科学等领域。近几 年，新的技术理论和方法学的发展又推动了s p r 生物传感器向小分子的相互作用研 究、药物筛选、临床诊断、细胞膜模拟、蛋白质组学等新兴的应用领域扩展【9 】。 6 硕士擘位论文 m a $ t e r sf h e s i $ 1 3 1 生物分子的相互作用 监控小分子( o 5 k d ) 的相互作用是s p r 生物传感器的最重要的新兴应用之一。 b i a c o r e 系列仪器一直用于高亲和力( 间的相互反应。在 金膜上固定物质可以选择在线固定或离线固定两种方式，在固定方法上则可直接利 用静电吸引固定，也可以借助巯基化合物或p d d a 等作为中问体，然后再来把该物 质固定上去。 4 参考文献 【1 】符运良，傅军，吴英才，旋光积毒2 0 0 6 ，2 7 ，1 5 1 7 f 2 1r w w o o d ，p h i l m a g m ，1 9 0 2 ，4 ，3 9 6 【3 】e k r e t s c h m a n n ，h ，z ，r a e t h e r , n a t u r f o r s h ，1 9 6 8 ，2 3 a ，2 1 3 5 【4 】a a o t t o ，p h y s i k , 1 9 6 8 ，2 1 ，3 9 8 【5 】c n y l a n d e r , b l i e d b e r g ，t l i n d ，s e n s o r sa n d a c t u a t o r s ，1 9 8 2 ，3 ，7 9 6 】b l i e d b e r g ，c n y l a n d e r , i l u n d s t r o m ，s e n s o r sa n da c t u a t o r s ，1 9 8 3 ，4 ，2 9 9 f 7 1h p h o ，s y w u ，y a n gm e t ，e ta l ，s e n s o r sa n d a c t u a t o r sb ，2 0 0 1 ，8 0 ，8 9 8 】w b l i n ，j r n i n c o l e ，j m c h o v l o n ，e ta l ，s e n s o r sa n da c t u a t o r s , b ，2 0 0 1 ，8 0 ，2 0 7 【9 】程慧，黄朝峰，段子渊目笙钐乙氇貅；2 0 0 3 ，2 3 ，4 6 f 1 0 r l r i c h ，d g m y s z k a ，j o u r n a l o f m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n ，2 0 0 0 ，1 l ，5 4 【i l 】r l r i c h ，d gm y s z k a ，j o u r n a lo f m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ，2 0 0 1 ，1 4 ，2 7 3 f 1 2 1r l r i c h ，d c tm y s z k a ，j o u r n a lo f m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ，2 0 0 1 ，1 4 ，2 2 3 【1 3 1 崔大付，李向明，蔡浩原，等，叨臂群学伙器，2 0 0 1 ，6 ，3 4 【1 4 】j m m cd o r m e l l ，c u r r e n to p i n i o ni nc h e m i c a lb i o l o g y , 2 0 0 1 ，5 ，5 7 2 【1 5 】陈受惠，崔小强，杨帆，等，蔚鲁学：兹纪笋雩匈职2 0 0 3 ，2 4 ，1 7 7 0 【1 6 】裴仁军，杨秀荣，汪尔康，手唇羁蝴谚绍竺谬浮掘2 0 0 0 ，1 7 ，3 4 1 7 】刘雪松，金伯泉，朱勇，尹华缴竺纺学和免疫学荣矗象2 0 0 0 ，2 0 ，2 4 0 【1 8 】杨帆，崔小强，杨秀荣，尚等学j 兹纪学弓锻2 0 0 2 ，2 3 ，3 8 2 【1 9 】陈巨莲，层盛躬堀2 0 0 3 ，4 0 ，1 1 9 f 2 0 1k a l f f i a a n ，占i o s e n s 盘b i o e l e c t r o n i c s ，1 9 9 8 ，1 3 ，6 5 3 2 1 1p g o m e s ，e g i r a l ta n dd j a n d r e u ，i m m u n o l o g i c a lm e t h o d s ，2 0 0 0 ，2 3 4 ，1 0 1 f 2 2 】崔小强，沙宇芳，杨帆，等，分笏纪研苑街现2 0 0 5 ，3 3 ，1 6 3 9 2 3 y s d a y , c l b a i r d ，r l r i c h ，e ta l ，p ，d t e i ns c i ，2 0 0 2 ，1 1 ，1 0 1 7 【2 4 】j h o f f m a n n ，c u p i e t r z i k ，m p k u m m e r , e ta l ，h i s t o c h e m c y t o c h e m ，1 9 9 9 ，4 7 ， 3 7 3 【2 5 】k m h a n s s o n ，tp v i k i n g e ，m r a n b y , e ta l ，b i o s e n s b i o e l e c t r o n ，1 9 9 9 ，1 4 ，6 7 1 【2 6 】j l s o u l a g e s ，z ，s a l a m o n ，m w e l l s ，gt o l l i n ，p r o cn a t l a c a d , s c i u s a ，1 9 9 5 ，9 2 ， 5 6 5 0 【2 7 】王海明，钱凯先，物：冱天搠r 舅锡，2 0 0 3 ，3 7 ，3 5 4 【2 8 】a a s t o o p ，l j e s p e r s ，m 0 1 b i o l ，2 0 0 0 ，3 0 1 ，1 1 3 5 【2 9 】k s c h l e i nk o f e r ，a d i n g l e y ，i t a c k e n ，e ta l ，m 0 1 b i o l ，2 0 0 1 ，3 0 6 ，2 6 3 3 0 1c e j o r d a n ，a g f r u t o s ，a j 1 1 1 i e l ，r m c r o n ，a n a l c h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ，4 9 3 9 1 5 【3 1 1y o k a h a t a , m k a w a s e ，k n i k u r a , f 。o h t a k e ，h f u r u s a w a , y e b a r a ，a n a lc h e m ， 1 9 9 8 ，7 0 ，1 2 8 8 【3 2 1a g f r u t o s ，r m c o m ，a n a l c h e m n e w s f e a t u r e s ，1 9 9 8 。7 ，4 4 9 【3 3 】牟颖，张寒琦，金钦汉，叨严e 烈力嚣，2 0 0 1 ，2 ，2 7 【3 4 1i b a b i c ，s e a n d r e w ，e r j i r i l ，m u t a t i o ng e s ，1 9 9 6 ，3 7 2 8 7 【3 5 】i c h o ，n k l g o t t s c h a l k ，s c i e n c e ，1 9 9 0 ，2 5 0 ，8 1 4 【3 6 】r j f i s h e r , a d b a x e v a n i s ，g m a v r o t h a l a s s i t i s ，b i a s y m p o i s u m ，1 9 9 2 ，2 ，4 4 【3 7 】陈焕文，牟颖，赵晓君，宋大干，张寒琦，金钦汉，分析改爱最2 0 0 1 ，2 ，3 3 8 】r k a r l s s o n ，a m i c h a e l s s o n , l m m u n o lm e t h o d s ，1 9 9 1 ，1 4 5 ，2 2 9 3 9 】r r i c h ，l d a y ，y s m o r t o n ，a n a lb i o c h e m ，2 0 0 1 ，2 9 6 ，l 9 7 【4 0 】a f r o s t e l l - k a r i s s o n ，a r e m a e u s ，h r o o s ，e ta l ，m e d c h e m ，2 0 0 0 ，4 3 ，1 9 8 6 【4 l 】s s t a r e m i ，w p r o s i s e ，j d u r k i n ，m o l e c u l a ri n t e r a c t i o na n a l y s i s , 1 9 9 6 ，3 ，2 0 【4 2 m m a l m s t e n ，p h y s i c o c h e m i c a la n d e n g i n e e r i n g a s p e c t s ，1 9 9 9 ，1 5 9 ，7 7 【4 3 】j h r a o ，l y a n ，j l a h i r i ，g m w h i t e s i d e s ，r m w e i s ，h s w a r r e n ，c h e m b i o l o g y , 1 9 9 9 ，6 ，3 5 3 4 4 1 弛小林，宣春学院学报( 自然科学 ，2 0 0 6 ，2 8 ，1 2 0 【4 5 】m h v v a n ，r e g e n m o r t e l ，d e v e l ，b i o ( b a s e l ) ，2 0 0 0 ，1 0 3 ，6 9 【4 6 】s o h l s o n ，c j u n g a r , m s t r a n d h ，c ta l ，t r e n d sb i o t e c h n o l ，2 0 0 0 ，i8 ，4 9 【4 7 】 l e i n d y k ，b s p e r s s o n ，m c c a s e l u n 曲e ，e ta l ，a o a ci n t ，2 0 0 2 ，8 5 ，7 2 【4 8 】a r a s o o l y , f o o d p r o t ，2 0 0 1 ，6 4 ，3 7 4 9 】陈玲，黼与缴磊统2 0 0 6 ，2 5 ，4 【5 0 】b b a d e r , k k u b n ，d j o w e n ，e ta l ，n a t u r e ，2 0 0 0 ，4 0 3 ，2 2 3 【5 l 】gf e f i o u o ，a f e r l i n i ，a r a v a n i ，e ta l ，h u m m u r a t ，2 0 0 1 ，1 8 ，7 0 【5 2 】qf e f i o t t o ，m b o r g a t t i ，c m i s c h i a t i ，e ta l ，a g r i c f o o dc h e m ，2 0 0 2 ，5 0 ，9 5 5 【5 3 】许鑫华，韩明川，陈强，李冬光，姚康德，序分子透掘2 0 0 4 ，4 ，4 2 【5 4 杜卫冲，陈抗生，光学学弼1 9 9 1 ，1l ，11 2 5 【5 5 】肖才德，隋森芳，赵南明，等，垆每笙勿筐 笋z = 翟笋掘2 0 0 0 ，1 9 ，6 0 【5 6 】a b a b a ，m k p a r k ，r a d v i n c u l a ，e ta l ，l a n g m u i r ，2 0 0 2 ，18 ，4 6 4 8 【5 7 】a b u n d ，a b a b a , s b e r g ，d j o h a n n s m a n n ，e ta l ，p h y s c h e m b ，2 0 0 3 ，1 0 7 ，6 7 4 3 【5 8 】r j g r e e n ，s c o r n e i l l i e ，m c d a v i e s ，e ta l ，l a n g m u i r ，2 0 0 0 ，1 6 ，2 7 4 4 【5 9 】a n 。n a i m u s h i n ，s d s o e l b e r g ，d k n g u y e n ，e ta l ，b i o s e n sb i o e & c t r o n ，2 0 0 2 ，17 ， 5 7 3 f 6 0 】o p k a r l s s o n ，s l o f a s ，a n a l b i o c h e m ，2 0 0 2 ，3 0 0 ，1 3 2 f 6 1 1a h s e v e r s ，r b m s c h a s f o o r t ，b i o s e n sb i o e l e c t r o n ，1 9 9 3 ，8 ，3 6 5 【6 2 】g s t e i n e r ，m t p h a m ，c k u h n e ，r s a l z e r , f r e s e n i u s ，a n a lc h e m ，1 9 9 8 ，3 6 2 ，9 1 6 硕士擘位论文 m a s t e r l st h e s i s 6 3 t w i n k ，s j v a nz u i l e n ，a b u l t ，w p v a nb e r m e k o n ，a n a lc h e m ，1 9 9 8 ，7 0 ，8 2 7 【6 4 】d g h a n k e n ，r r n a u j o k ，j m ，g r a y ，r m c o m ，a n a lc h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ，2 4 0 【6 5 】d g h a n k e n ，r m c o r n ，a n a lc h e m ，1 9 9 7 ，6 9 ，3 6 6 5 6 6 】r r f r a n k e ，b k o n i g ，t p s a k i n a r ，h g ，k h o r a n a ，k p h o f m a n n ，s c i e n c e ，1 9 9