（急诊医学专业论文）对氧磷酶1对敌敌畏毒代动力学影响.pdf

五、参考文献1 6 六、附录 综j 丕1 7 在学期间科研成绩2 4 致谢2 5 个人简介2 6 对氧磷酶1 对敌敌畏毒代动力学影响 目的 通过研究对氧磷酶1 对有机磷药物代谢动力学影响，证明对氧磷 酶1 是有前景的有机磷催化清除剂。 方法 w i s t a r 大鼠，4 0 只，雌雄各半，随机分成4 组：染毒组：腹腔注射 d d v p l o m g k g 。p o n l 预处理组：大鼠尾静脉注射p o n l9 6 0 0 u k g ， 3 0 m i n 后腹腔注射d d v p l o m g k g ；治疗组：d d v p l o m g k g 腹腔注射后， - 0 _ h i ( 2 m i n ) 尾静脉注射阿托品o 0 5 m g k g + 解磷定1 2 0 m g k g 。联合治疗 组：大鼠尾静脉注射p o n l9 6 0 0 u k g ，3 0 m i n 后腹腔注射d d v p l o m g k g ， 立即尾静脉注射阿托品o 0 5 m g k g + 解磷定1 2 0 m g k g 。分别于染毒前、 染毒后3 m i n 、5 m i n 、1 0 m i n 、2 0 m i n 、3 0 m i n 、l h 、2 h 、4 h 、6 h 分别经 眶后静脉采血0 2 m l 。测定全血胆碱酯酶活性和液质联用法测定血中敌 敌畏含量。同一时间点胆碱酯酶活性值采用一元方差分析，毒代学参 数采用3 p 9 7 软件合成。 结果 1 胆碱酯酶活性：对4 组相同时间点上数据进行双因素方差分析。 因素“p o n l ，p 0 0 5 ，可以认为p o n l 效应差异显著，p o n l 可明显 改善胆碱酯酶抑制水平；因素“a t r o p i n e + p a m p 0 0 5 ，可以认为 “a t r o p i n e + p a m 效应差异显著，明显改善胆碱酯酶抑制水平；因素 “p o n l 和“a t r o p i n e + p a m 在所有时间点上p 9 9 5 ) ，天津农药股份有限公司； 乙腈( 色谱纯) ，甲酸( 色谱纯) ，( 天津银利达化工有限公司) ；吲哚美辛标准品， 天津一方科技有限公司；碘化硫代乙酰胆碱( 分析纯) ，美国s i g m a 公司；对硝基 苯醋酸酯( 分析纯) ，美国s i g m a 公司。三羟甲基氨基甲烷、氯化钙、氯化钠、盐 酸等均为国产试剂。 二、动物 清洁级w i s t a r 大鼠，雌雄各半，体重2 0 0 , - , 3 0 0 9 ，购自北京维通利华实验动物 技术有限公司。实验期间自由进食水。 三、主要仪器 五k t ap u r i f i e r 全自动层析仪( 美国g e 公司) ；e p p e n d o r f5 4 1 7 r 冷冻离心机 7 ( 德国爱德本公司) ；u v l 6 0 1 分光光度计( 日本岛津) 。t h c r m o f i n n i g a n t s qq u a n t u m 三重四级杆串联质谱仪，美国热电公司。 四、实验设计及分组 4 0 只大鼠随机分成4 组，每组1 0 只。染毒组( a 组) ：腹腔注射d d v p l o m g k g 。 p o n l 预处理组( bg r o u p ) ：大鼠尾静脉注射p o n l9 6 0 0 u k g ，3 0 m i n 后腹腔注射 d d v p l o m g k g ：治疗组( cg r o u p ) ：d d v p l o m g k g 腹腔注射后，立o p ( 3 0 0 0 u m l 。使用前将酶溶于注射缓冲液( 1 3 6m mn a c l ，0 1m mc a c l 2 ) ， 定容为0 5 m l 。 六、血清p o n l 活性检测方法 p o n i 乙酸苯酯活性 7 1 是通过在2 5 1 2 ，2 7 0 n m 波长下，用u v l 6 0 1 分光光度 计连续测定2 0 s 内底物乙酸苯酯水解为苯酚的初始速度而获得。1 l 检测液含 1 0 m m 氯化钙，5 0 m m 的t f i s h c i ( p h = 8 o ) ，1 2 8i il 乙酸苯酯。反应体系由3 m l 检测液加1 0 pl 血清反应构成。将不加血清的3 m l 检测液作为空白对照。酶活性 单位u m l ，1 u 的酶每分钟水解1i im o l 的乙酸苯酯。 p o n m 1 ) = a m i n t v 1 0 6 ( s v l ) 其中a m i n 为每分钟吸光度变化值，t v 为反应总体积( m 1 ) ，s v 为样 本体积( m 1 ) ，l 为比色杯光径( 1c r n ) ，1 0 6 是将m o l 换算成um o l 的系数， 8 为对硝基酚的摩尔消光系数( 6 1 1 1 2 m 0 1 ) ，值为1 31 1 0 6o l l l 2 m o l 。 七、d d v p 浓度检测方法 ( 一) 样品处理方法 5 0 u l 血浆+ 2 5ul 内标( 5 0 n g m l 吲哚美辛) + 1 0 0 ul 乙腈，混匀，高速离心 ( 1 2 0 0 0 r p m ) ，取2 0 l il 上清进样。 ( 二) 液质条件 液相条件：分析柱为迪马公司d i a m o n s i l ( 钻石) c 1 8 柱( 1 5 0 4 61 t l n li d ，5 r t m ) 预柱为p h e n o m e n e xe t a 保护柱( 4 x 3 0m mi d ) ；流动相为乙腈一水一甲酸 ( 9 0 ：1 0 ：0 2 ，v v v ) ；流速为0 4 5m l m i n ；柱温为室温；进样量为2 0p l 。 质谱条件：离子源为化学大气压离子源( a p c i 源) ，源喷射电压为4 2k v ， 加热毛细管温度为2 7 0 1 2 ；汽化室温度为4 2 0 。c ；鞘气m ) 压力为3 0a r b ，辅助 气( n 2 ) 压力为5a r b ，碰撞气( a t - ) 压力为1 2m t o m 碰撞诱导解离( c r d ) 电 压分别为2 3e v ( d d v p ) 和4 4 e v ( 吲哚美辛) ；正离子方式检测；扫描方式为选 择反应监测( s l 蝴) ；用于定量分析的离子反应分别为m z2 2 1 _ m z1 0 9 ( d d v p ) 和m z3 5 8 _ m z1 1 1 ( 吲哚美辛) ；扫描时间为0 3s t 引。 将d d v p 标准品加入空白血浆中，分别测定d d v p 浓度为61 tg m l 、5l ag m l 、 2l ag m l 、1l ag m 1 、o 5l - tg m l 、o 11 1g m l 、0 0 5l ag m l 的峰面积。以d d v p 浓度 为自变量，d d v p 峰面积内标峰面积的比值为因变量，经线性回归得d d v p 测量 的工作曲线。 八、胆碱酯酶活性测定 。 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p h8 0 ) 稀释肝素化全血( v ：v = l ：9 9 ) 。全血胆碱酯酶 活性测定反应体系含有0 5 m l0 0 0 3 ma t c h - i 、0 5 m l0 0 0 1 md t n b 和1 5 m l 稀释 的全血。3 7 c 水浴中反应6 m i n ，加入2 0 1 tl 毒扁豆碱( 2m g r n l ) 中止反应。冷却 1 5 m i n 后，4 1 2 n m 处测定吸光度值9 ，1 0 1 。 未加入稀释全血的反应体系作为对照管，加入蒸馏水的作为空白对照管，l m m 谷胱甘肽的作为标准管。 a c h e 活性值= o d ( 检测值) 一o d ( 标准管) o d ( 对照) 一o d ( 空白) 9 九、统计学方法 对相同时间点胆碱酯酶活性值采用双因素方差分析，分析p o n l 和a t r o p i n e + p a m c i 的交互作用：d d v p 工作曲线采用一元线性回归分析；对四组相同时间点 数据进行单因素方差分析；各组问药动学参数采用单因素方差分析。统计学软件 采用s p s s1 6 0 统计。药动学参数计算采用3 p 9 7 软件合成，应用统计矩模型。 实验结果 一、胆碱酯酶活性 对4 组相同时间点上数据进行双因素方差分析。因素“p o n l ”，p 0 0 5 ，可以 认为p o n l 效应差异显著，p o n l 可明显改善胆碱酯酶抑制水平：因素“a t r o p i n e + p a m ”，p 0 0 5 ，可以认为“a t r o p i n e + p a m ”效应差异显著，明显改善胆碱酯酶抑 制水平；因素“p o n l ”和“a t r o p i n e + p a m ”在所有时间点上p 0 0 5 ，所以两个因素 交互作用显著( 见表1 ) 。 表1 ，血浆胆碱酯酶活性 对4 组相同时间点上数据进行双因素方差分析。因素“p o n l ”，p 0 0 5 ，可以 认为p o n l 效应差异显著，p o n l 可明显改善胆碱酯酶抑制水平；因素“a t r o p i n e - 6 p a m ，p 0 0 5 ，可以认为“a t r o p i n e + p a m ”效应差异显著，明显改善胆碱酯酶抑 制水平；因素“p o n l ”和“a t r o p i n e + p a m ”在所有时间点上p 0 0 5 ，所以两个因素交 互作用显著。 二、d d v pl c m s 方法学 采用上述实验条件分析d d v p ，约在4 1 m i n 处检测到d d v p 的特征峰，约在 4 9 m i n 处检测到内标吲哚美辛的特征峰( 见图1 ) 。 1 0 经线性回归分析，得d d v p 浓度与峰面积的回归方程为：y = - 0 0 4 0 4 2 8 2 + 0 16 0 4 8 x r 2 = 0 9 9 4 5 线性范围为0 1u 咖卜一6 i lg h a oi234 t i m e ( m i n ) 图1 ，空白血浆加d d v p 标准品加内标图 大鼠体内d d v p 浓度 对相同时间点上4 组的数据进行单因素方差分析，a 组与c 组无显著性差异， b 组与d 组无显著性差异，a 组、c 组与b 组、d 组间有显著性差异( 见表2 ) 。 表2 ，4 组大鼠各时间点d d v p 浓度表 o暑口量t d，暑一s_ oo暑oq，o曼若 注：，p 0 0 5 ，与a 组比较；，p 0 0 5 ，与b 组比较；# ，p 0 0 5 ，与c 组比较。 四、d d v p 毒物代谢动力学参数 毒代动力学分析采用统计矩模型。对4 组的毒代动力学参数进行一元方差分 析，曲线下面积( a r e a u n d e rc i l _ r v e ，a u c ( 0 _ ) ) 数据a 组与c 组间无显著性 差异，b 组与d 组间无显著性差异。a 组、c 组与b 组、d 组有显著性差异。平 均保留时间( m e a nr e t e n t i o nt i m e ，m r t ( o ) ) 数据4 组间无显著性差异。峰 浓度( m a x i m u mc o n c e n t r a t i o n ，c m a x ) 值由观察表2 中的最高浓度而得，经一元 方差分析，a 组和c 组间差异无统计学意义，b 组和d 组问差异无统计学意义。 a 组、c 组与b 组、d 组间差异有统计学意义( 见表3 ) 。 表3 ，d d v p 毒代动力学参数表 注：，p o 0 5 ，与a 组比较；，p o 0 5 ，与b 组比较；# ，p 3 0 h ) 。另外的实验揭示了有机磷暴露前或暴露后( 甚至到达3 h ) ，外源性 p o n l 可以提供对抗毒死蜱毒性的保护作用。最近，表达于一种肠道病毒载体的 重组人类p o n l ( l r 或l q ) 能增加6 0 的血清p o n l 活性，从而增加小鼠对抗 毒死蜱毒性的能力。总之，这些研究揭示了通过人工增加血清p o n l 水平可能降 低某些有机磷的毒性。 最近的实验通过研究基因敲除小鼠( p o n l - - ) 对有机磷的毒性来完成【1 4 1 。这 种小鼠是通过靶定位毁坏p o n l 基因的外显子制造出来的。基因敲除小鼠血清和 肝没有对对氧磷和二嗪农氧化物( d i a z o x o n ) 的活性，对毒死蜱氧化物活性很低。 这种小鼠对毒死蜱氧化物和二嗪农氧化物的敏感性有很明显的增高，对母化合物 毒死蜱和二嗪农的敏感性轻微增高。实验中令人惊奇的是对氧磷一对氧磷酶名 字由来的化合物。尽管血清和肝脏没有p o n l 活性，基因敲除小鼠并不显示对对 氧磷的敏感性增高。 人类p o n l q l 9 2 和人类p o n l r l 9 2 都被静脉注射到p o n d 小鼠体内，检测脑 和膈的效应。在毒死蜱氧化物的例子中【1 5 1 ，两种基因型都具有保护作用，r 1 9 2 比 q 1 9 2 保护作用多5 0 ，这与之前的体外实验发现一致。两种基因型对二嗪农氧化 物保护作用相同。这与之前实验相反【1 6 】，但与之前催化效能的体外试验相一致。 两种基因型都不提供对对氧磷的保护作用，证实了上面的发现。尽管，p o n l r l 9 2 催 嗪 磷的观点。也就是说p o n l 在体内不能有效水解对氧磷，其他途径可能负责体内 有机磷的水解。 四、展望 目前，人类p o n l 三维结构的信息是通过重组p o n l 研究得出的，所以人类 p o n i 的结构还未确定。尽管r p o n l 的晶体结构代表了天然p o n l 的总体结构，但 并没有提供p o n l 的有机磷水解活性的催化机理，参与有机磷水解的残基还没有确 定。所以如何准确的分析出人类p o n l 立体结构对于研究催化效能，尤其是活性中 心的作用机理至关重要。同时，对于合成更高催化效能的突变体也有着重要的意 义。 尽管8 6 的结构完全相同，人类和兔酶在很多特征上不同。人类、兔、和r p o n l 测序显示他们有几个不同的区域。这暗示了这些区域可能参与对应酶的功能区编 码。所以，必须实行天然和重组人类p o n l 的分子和催化性质的对比研究。 目前，经过大量的动物实验证实了对氧磷酶对于有机磷的催化解毒作用，但如何 能够大量生产出可作为临床试剂的对氧磷酶，以及应用于临床实践，是现在急需 解决的问题。 2 l 参考文献 1 d r a g o m i ri d ，p h i l i pl s ，w a t s o nc e ，e la 1 r a b b “s e r u mp a r a o x o n a s e3 ( p o n 3 ) i sah i g h d e n s i t yl i p o p r o t e i n - a s s o c i a t e dl a c t o n a s ea n dp r o t e c t sl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i na g a i n s t o x i d a t i o n j b i o lc h e m , 2 0 0 0 ，2 7 5 ( 4 3 ) ：3 3 4 3 5 - 3 3 4 4 2 2h a r e lm ，a h a r o n ia ，g a i d u k o vl , e ta ls t r u c t u r ea n de v o l u t i o no ft h es e r u m p a r a o x o n a s ef a m i l y o f d e t o x i f y i n ga n da n t i - a t h e r o s c l e r o t i ce n z y m e s n a ts t r u c tm o lb i o l ，2 0 0 4 ，1l ：4 1 2 - 4 1 9 3y e n n gd t ，j o s s ed ，n i c h o l s o nj d ，e ta 1 s t r u c t u r e f u n c t i o na n a l y s e so f h u m a ns e r u m p a r a o x o n a s e ( h u f o n i ) m u t a n t sd e s i g n e df r o mad f p a s e - l i k eh o m o l o g ym o d e l b i o e h i m 4r o s e n b l a tm ，g a i d u k o vl ，k h e r s o m k y0 ，e t 以t h ec a t a l y t i ch i s t i d i n ed y a do f h i g hd e n s i t y l i p o p r o t e i n - a s s o c i a t e ds e r u mp a r a o x o n a s e - 1 ( p o ni ) i se s s e n t i a lf o rp o n1 - m e d i a t e di n h i b i t i o n o fl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i no x i d a t i o na n ds t i m u l a t i o no fm a c r o p h a g ec h o l e s t e r o le f f l u x jb i o l c h e m ，2 0 0 6 ，2 81 ：7 6 5 7 - 7 6 6 5 5y e n n gd t ，l e n zd e ，c e r a s o l id m a n a l y s i so f a c t i v e - s i t ea m i n o - a c i dr e s i d u e so f h u m a ns 删m p a r a o x o n a s eu s i n gc o m p e t i t i v es u b s t r a t 呛s f e b sj ，2 0 0 5 ，2 7 2 ：2 2 2 5 - 2 2 3 0 6 k h e r s o n s k yo ，t a w f i kd s t h eh i s t i d i n e11 5 - h i s t i d i n e1 3 4d y a dm e d i a t e st h el a c t o n a s e a c t i v i t yo f m a m m a l i a ns e r u mp a r a o x o n a s e s jb i o lc h e m ，2 0 0 6 ，2 81 ：7 6 4 9 - 7 6 5 6 7m a s s o n ap ，d e n i sj ，o k s a n al ，e tn 1 e n z y m e s h y d r o l y z i n go r g a n o p h o s p h a t e sa sp o t e n t i a l c a t a l y t i cs c a v e n g e r sa g a i n s to r g a n o p h o s p h a t ep o i s o n i n g jp h y s i o l o g y ( p a r i s ) ，19 9 8 ，9 2 ：3 5 7 - 3 6 2 8c o s t al o ，c o l et b ，f u r l o n gc e p o l y m o r p h i s m so f p a r a o x o n a s e ( p o n l ) a n dt h e i r s i g n i f i c a n c ei nc l i n i c a lt o x i c o l o g yo f o r g a n o p h o s p h a t e s jt o x i c o ，c l i nt o x i c o ，2 0 0 0 ，3 4 1 ( 1 ) ： 3 7 4 5 9d a n i e l c h a b r i t a l ee ，m a s s e n ap h u m a np a r a o x o n a s e ：ap r o m i s i n ga p p r o a c hf o r p r e - t r e a t m e n ta n dt h e r a p yo f o r g a n o p h o s p h o r u sp o i s o n i n g t o x i c o l o g y , 2 0 0 7 ，2 3 3 ：4 - 5 9 1 0 d r a g a n o vd i ，l ad ubn p h a r m a c o g e n e t i c so f p a r a o x o n a s e s ：ab r i e f r e v i e w n a u n y n - s c h m i e d e b e r g sa r c hp h a r m a c o l ，2 0 0 4 ，3 6 9 ：7 8 - 8 8 11c o s t ai x ，r i c h t e r1 l i ，l iw f p a r a o x o n a s e ( p o n l ) a sab i o m a r k e ro f s u s c e p t i b i l i t yf o r o r g a n o p h o s p h a t et o x i c i t y b i o m a r k e r , 2 0 0 3 ，8 ( 1 ) ：l - 1 2 1 2c o s t al g ，a n n a b e l l av ，c o l e at b ，e ta 1 m o d u l a t i o no f p a r a o x o n a s eo o n i ) a c t i v i t y b i o c h e m ip h a r m a c o 2 0 0 5 ，6 9 ：5 4 1 - 5 5 0 1 3c o s t al g ，c o l e at b ，a n n a b e l l av ，e ta lm e a s u r e m e n to f p a r a o x o n a s e ( f o n ds t a t u s 船a p o t e n t i a lb i o m a r k e ro fs u s c e p t i b i l i t yt oo r g a n o p h o s p h a t et o x i c i t y c l i n i c ac h i m i c aa c t a , 2 0 0 5 ， 3 5 2 ：3 7 4 7 1 4a m b e rl p ，h o w a r dw c h a m b e r s bj e o r g a n o p h o s p h a t ed e t o x i c a t i o np o t e n t i a lo f v a r i o u sr a t t i s s u e sv i aa - e s t e r a s ea n da l i e s t e r a s ea c t i v i t i e s t o x i c ol e f t 19 9 5 ，7 8 ：2 4 5 - 2 5 2 1 5 f u r l o n gc e ，c o l et b ，j a r v i kg p ，e t 口，r o l eo f p a r a o x o n a s e ( p o n l ) s t a t u si np e s t i c i d e s e n s i t i v i t y ：g e n e t i ca n dt e m p o r a ld e t e r m i n a n t s n e u r ot o x i c o ，2 0 0 5 ，2 6 ：6 51 - 6 5 9 1 6l e n zd e ，d a v i dy j ，s m i t h 心e ta ls t o i c h i o m e t r i ca n dc a t a l y t i cs c a v e n g e r sa sp r o t e c t i o n a g a i n s tn e r v ea g e n tt o x i c i t y ：am i n ir e v i e w t o x i c o l o g y , 2 0 0 7 ，2 3 3 ：3l - 3 9 在学期间科研成绩 参与了导师赵敏教授的国家自然科学