（植物学专业论文）萝芙木（rauvolfia+verticillata（lour）baill）毛状根外源基因表达系统的建立.pdf

萝芙木( r a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u r ) b a i l l ) 毛状根外源基因表达系统的建立 植物学专业硕士研究生：王泓 指导教师：孙敏教授 廖志华教授 摘要 生物碱组成了植物最大的一类天然次生代谢产物，提供了许多具有药用活性的化合物。 随着萜类吲哚生物碱代谢途径中一些关键酶基因被克隆，使得利用代酣工程在植物细胞中生 产这些生物碱成为可能。萝芙木( 屉m 哪鼢- l i c i l l a t a ( l o u r ) b a i l l ) 是夹竹桃科一种重要 的药用植物，其根中含有的萜类吲哚生物碱( t i a s ) 利血平( r e s e r p i n e ) 是目前应用最广 泛的抗高血压药物之一。异胡豆苷合成酶( s t r ) 是t i a s 合成途径上催化关键步骤的限速 酶。本研究将来源于长春花的s i r 基因构建到烟草花叶菜病毒( c a m v3 5 s ) 启动子驱动的植物 双价表达载体，转入带有a 4 发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) r i 质粒，去除武装( d i s a r m ) 的根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mn o n e f a c i e n s ) 菌株。以携带有编码s t r 基因的c 5 8 c 1 菌株为载 体，将外源基因s t r 导入萝芙木核基因组，以获得高产利血平的转基因毛状根，并以期利用 生物技术手段工业化生产具有活性的次生代谢产物奠定一定的基础，从而解决萝芙木野生资 源短缺的问题。 采用叶盘法转化萝芙木外植体，不带外源基因的空白a 4 转化株作为对照，对发根农杆 菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n s ) 介导的萝芙木遗传转化条件进行了优化。实验结果表明：发 根农杆菌菌株在菌液光吸收值为0 6 时，致根能力最强。利用无菌的子l 叶、真叶、茎段以及 田间采集的经消毒过的叶片等不同外植体进行遗传转化，真叶的诱导频率最高，为8 5 7 1 。 预培养2 天、共培养3 天转化根诱导率最高，达8 6 6 7 。1 0 0 p m o l l 乙酰j - 香酮( a s ) 同 时加入转化菌液和培养基中转化根诱导率最高，达到8 3 3 3 。 对萝芙木毛状根的培养条4 1 ：进行了筛选：发现在1 2 m s + i b a ( 0 2 m g m l ) + n a a ( 0 1 m g m l ) l 司体培养基上生长最好。后在附加潮露素2 0 m g m l 的抗性培养基上筛选， 初步得到携带有s 护外源基因的毛状根。 通过聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 对转化毛状根中r o l b 、1 - o l c 基因 以及外源基因的检测，确定了j 伊在宿主基因组的整合，进一步证明前面所获得的毛状根为 携带有j 肛外源基因的毛状根。 通过h p l c 检测毛状根中利血平的含量，结果显示利血平在自然根( 种植在田问的萝芙 术植株的根) 的含量最高达干重的0 0 2 6 ，空白毛状根( 来携带s l r 基因的毛状根) 中的 含量最高可达干重的0 0 9 6 ，为自然根中的3 7 倍，携带有s t r 外源基因的毛状根中可高 达干重的1 3 6 7 ，为自然根中的5 2 5 8 倍，且为空白毛状根的1 4 2 4 倍。因此，此结果有 力地证明了s t r 基因是t i f f s 合成途径上的关键酶基因，是萜类吲哚生物碱代谢工程的必选 靶点；具有非常重要的研究意义和商业价值。 关键词：萝芙木遗传转化发根农杆菌毛状根异胡豆苷合成酶 e s t a b l i s h m e n to f e x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o n i nh a i r y r o o t so fr a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u r ) b a i l l m a j o r ：b o t a n ys p e c i a l i t y ：p l a n tb i o l o g y & b i o t e c h n o l o g y t u t o r ：p r o f s u nm i ng r a d u a t e ：w a n gh o n g ( s 2 0 0 3 6 7 1 ) p r o f l i a 0z h i h u a a b s t r a c t p l a n ta l k a l o i d s ，w h i c hc o n s t i t u t eo n eo ft h el a r g e s tg r o u po fn a t u r a lp r o d u c t s ， p r o v i d em a n yp h a r m a c o l o g i c a l l ya c t i v ec o m p o u n d s w i t hs o m ek e ye n z y m e sb e i n gc l o n e d i nt h et i a sb i o s y n t h e t i cp a t h w a y , i ti sp o s s i b l et op r o d u c et h ea l k a l o i d si nt h ep l a n tc e l lb yt h e m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g 鼢蝴v e r l i c i l k t t a ( l o u r ) b a i l l ，b e l o n g i n gt ot h e f a m i l y a p o c y n a c e a e ，i sar a r ei m p o r t a n tm e d i c i n a lw o o d yp l a n tb e c a u s et h e r ei sr e s e r p i n ei n i t sr o o tw h i c hi so n eo ft h em e d i c a t i o nf o ra n t i h y p e r t e n s i o nw i d e l yu s e di nc l i n i c t h e s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ( s t r ) i si m p o r t a n te n z y m e si n v o l v e di nc a t a l y z i n gk e ys t e p si n t h eb i o s y n t h e s i so ft e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ( t i a s ) i nt h i sr e s e a r c h ，p l a n te x p r e s s i o n c a s s e t t e so fg e n ef r o mc a t h a r a n t h u sr o s e u sd r i v e nb yt h ec a m v3 5 sp r o m o t e rw e r e c o v a l e n t l yc o n s t r u c t e dw i t h i nt h et - b o r d e r so fab i n a r yt ip l a s m i dv e c t o r a n d s y n c h r o n o u s l yi n t r o d u c e di n t ot h eg e n o m em e d i a t e db yt h ed i s a r m e da g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n ss t r a i nc 5 8 c 1w h i c ha l s oc a r r i e sa g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sr ip l a s m i d p r i a 4 w eu s e dt h ef o r m e rs t r a i na st h ec a r r i e r , a n di n t r o d u c e ds t rg e n ei n t ot h e n u c l e u sg e n o m eo f r a u v o f i a v e r t i c i l l a t a ( l o u r ) b a l l l i n o r d 盯t o o b t a i n t h e h a i r y r o o t l i n e s o f h i g h y i e l d o f r e s e r p i n e s i n g l et r a n s g e n i ch a i r yr o o tl i n e sa n dt r a n s f o r m e dr o o t si n d u c e db ya r h i z o g e n e s s t r a i na 4 ( p r i a 4 ) a st h ec o n t r o lw e r ea l s oo b t a i n e da tt h es a l n et i m e t h ec o n d i t i o n s o ft r a n s f o r m a t i o nv i aa g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sw e r eo p t i m i z e d t h es r a i nh a ds t r o n g a b i l i t yt oi n d u c eh a i r yr o o t sw h e ni t s o dw a sa b o u t0 6 a m o n gd i f f e r e n tp a r t s e x p l a n t s ，s u c ha sl e a v e s ，c o t y l e d o n s ，s t e m sa n dl e a v e ss t e r i l i z e d ，l e a v e sh a dt h e h i g h e s ti n d u c e dr a t ea s8 5 + 7 1 。e x p t a n t sp r e c u l t u r e df o r2d a y sa n dc o - c u l t u r e dw i t h a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e sf o r3d a y sh a dt h eh i g h e s ti n d u c i n gr a t e a d d e d10 0 9 m o v l a si nt h em e d i u ma l s op r o m o t e dt h et r a n s f e r r i n gr a t e ( 8 3 3 3 、 c u l t u r e dc o n d i t i o n so fh a i r yr o o ti nv i t r ow e r eo p t i m i z e d 。i ts h o w e dt h a th a i r yr o o t g r e wb e s ti nt h e1 2m sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h0 2m g m li b aa n d0 1m g m l n a a s u b s e q u e n t l yh a i r yr o o tw a ss e l e c t e di nt h ea b o v em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h 2 0m g m lh y g r o m y c i n t h e nh a i r yr o o tw i t hs t rg e n ew a so b t a i n e dp r i m a r i l y t h eg e n o m i cd n ap c r a n a l y s i sw a sc o n f i r m e dt h a tr o l ba n dr o l ci n t e g r a t e di n t o r c n w o t f i a v e r t i c i l l a t a ( l o u r ) b a i l l 。g e n o m e ，r e s u l t i n gi nt h eg e n e r a t i o no f h a i r yr o o t s a t t h es a m et i m e ，p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a ts t rg o n ew e r ei n t e g r a t e di n t ot h eh o s t s g e n o m e ，a n df u r t h e rc o n f i r m e dt h a tt h eh a i r yr o o t sw e r et r a n s f o r m e dw i t he x o g e n o u s s o ! g e n e t h ec o n t e n t so fr e s e r p i n ei nt h es a m p l e sw e r ed e t e r m i n e db yt t p l c i ts h o w e d t h a tt h em a x i m u ma m o u n to fr e s e r p i n e ( 1 3 6 7 d w ) i nt h eh a i r yr o o t sw i t hs o g o n e h a d1 4 2 4t i m e st h a nt h a tt h eh a i r yr o o t sw i t h o u ts t rg e n e ( 0 0 9 6 d w ) a n dh a d5 2 5 8 t i m e st h a nt h a ti nt h en a t u r ep l a n tr o o t s ( 0 ，0 2 6 d w ) s ot h er e s u l te f f e c t i v e l ys h o w e d t h a tm rg e n ei so n eo ft h ek e ye n z y m e si nt h et i a sb i o s y n t h e t i cp a t h w a ya n do n eo ft h e m o s ti m p o r t a n tt a r g e t si nt h et 1 a sm e t a b o l i ce n g i n e e r i n g t h e r ea r ei m p o r t a n ts t u d ya n db u s i n e s s v a l u e s k e yw o r d ：愚册哪锄m 位抛啦( l o u r ) b a i l l a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s h a i r yr o o t s g e n i et r a n s f o r m a t i o n s t r i e t o s i d i n es y n t h a s e 独创性声明 y9 0 1 7 7 3 学位论文题目：蔓芸本! 丛些堕丝旦! 星塑丝! ! 垡丝f 型吐曼丛2 垂盐揠 处塑基匿塞达丞统鲍建童 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者：壶弘签字日期：乙痂年歹月f o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：立陟 、 签字日期：力斫年y 月阳日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 鬻绲月口日 签字日期：撕移年，月口日 通讯地址 邮编： 萝芙木( r a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u t ) b a i l l ) 毛状根外源基因表达系统的建立 缩写词表 萝荚本( r a u v o l f i av e r t i c i l f a t a ( l o u t ) b a i l t ) 毛捩摄钤源基爵表达蓉统鞠建立 第一部分文献综述 萜类吲哚生物碱的代谢工程 植物中存在大量的代谢产物，根据其承担的不同功能可以划分为两大炎：初 生霞涝产物窥次生我漭产耪( h a r t r a a r m ，1 9 9 6 ) 。裙垒代蓊产彩谯括孩酸、鬣氨受、 脂肪酸以及其他承担耩本生理生化功能的物质：次生代谢产物( s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s ) 是指植物中一大类并非植物生长发商所必需的小分子有机化合物， 萁产生鞫分布通霉有嵇属、器官缀级和生长发鬻翔静特异往。植物次生代巍物耪 类繁多，化学结构迥昴。现在己知大约有1 0 ，o o o 十次生代谢物，包括酚类、黄 酮类、褥豆素、木脂索、生物碱、糖甙、萜类、嫩类、皂甙、多炔类、有机骏等， 一般可分为酚类纯合铹、萜类毒艺合物、舍氮有机耪三大类( h a r b o m ejb ，2 0 0 1 ) 。 植物次生代谢产物往往是植物与环境间相互作用的结果( c r o t e a u ，e ta l ，2 0 0 0 ) ， 是植物在长期进化中黠生态环境的适应，对植物在其生态系绞中的生存起 乍用， 翔抗虫、抗病、异椿稳壳、吸 i 琵蠢嫒粉、与共生微生物穗互 繁j 霹等( d i x o nr a ， 2 0 0 1 ) 。人类利用植物次生代谢物的历史十分悠久，各民族传统草药和香料的有 效成分大多是植物次生代谢物。中阉的本草学则怒世爨上利羯攘物天然产物的杰 出代表。赢到今天，这些天然产物仍在人类生滔中扮演着重要角色，尤其为医药、 轻工、化工、食品及农药等工业的发展所必不可少。仅就医药为例，至今人们依 赖于从穰物中提取的藏要药物就鸯5 0 多秘。随饕“重返大自然”的呼声目懿离涨， 人翻己认谚 到：现在楚从高等植物的次生代谢产物中去寻找、开发薪药的时代。 然而，长期盲目的采集致使生态环境受到破坏，许多野生植物趋于濒危，一姓特 臻生境下的植物人工辱l 释困难。自g 够弓l 季申栽培懿裰甥要占用大爨农田，加之人工 栽培受环境的翎约，次生产物的含潦和质量不稳定。此外，在通常情况下，天然 植株中目的次生产物含量过低。在对资源植物有效成分分析的撼础上，采用化学 台残的方法，又会遇到工艺漉程复杂、成本毫、合成过程中产生同分舅构髂及造 成环境污染等许多闯藤。近年来，随着对植物代谢生理生化及生态适应方颟认识 的深入，以及分子生物学的渗透，植物次生代谢分子生物学研究发展迅速。 生物碱( a l k a l o i d s ) 楚类重要豹天然有极化会燃，生物谶蹩天然有专慝纯会黪 中最大的一类化合物，主要分布于穰物界，通常为具有显著生理活性的碱性有机 萝美术( r a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u t , ) b a i l l ) 毛棱摄羚源基困表达菇统酶建立 物，也脊人称其为“有机碱”、“植物碱”。生物碱是科学家研究最早的一类天然 有掇讫含穆，迄今已经获鑫然赛中分离褥蘩魏万众耱，其中有6 余秘箨为蘩魏 使用至今，是天然有机化学的重要研究领域。在我国，早在1 7 世纪初白猿经 中就记述了从乌头中提炼出砂糖样毒物作箭毒，后来分析可能怒岛头碱。在欧洲， 1 8 0 6 年德霆药嚣s e r t u r n e r 第一次扶璃背李1 分褥驾穆。1 8 1 0 年秘班牙医生g o m e z 从金鸡纳树皮中分得缩晶c i n c h o n i n e ，后来证明主要是奎宁( q u i n i n e ) 矛i l 辛可宁 ( c i n c h o n i n e ) 的混合物。1 8 1 9 年ww e i s s n e r 把檬物中的碱性化台物统称为炎碱 f a l k a l i 1 i k e ) 或生耪碱( a l k a l o i d s ) ，一誊：潞蠲至今。 从2 0 世纪5 0 年代发现存在于萝荚木( r a u v o f i av e r t i c i l l a t a ) 中的降压药 利血平( r e s e r p i n e ) 和存在于长春花( c a t h a r a n t h u s ? o s e l l s ) 的治疗白血病高效药 长春躐( v i n b l a s t i n e ) 与长春薪疆( v i n c r i s t i n e ) 戮漆，旗类晖| 豫囊伤碱( t e r p e n o i d i n d o l ea l k a l o i d s ，t i a s ) 的研究成为天然产物的化学研究的一个霪要的部分。它 是一大类有着重要药用价值的植物生物碱，已有陆续报道4 0 0 多种吲哚类生物碱 静分离释合成骚究，葵串诲多禳广泛缝痘臻予魏我蕊貔中，毙翔萋名静抗静瘿药 物长春碱( v i n b l a s t i n e ) 和长春新碱( v i n c r i s t i n e ) ，降服药物利血平( r e s e r p i n e ) 与阿玛 碱( i j m a l i c i n e ) ，以及抗心律不齐药物阿吗灵f a j m a l i n e ) 等；喜树产生的t i a s 中， 有强效豹抗辨瘸药麓喜簿碱( c a m p t o t h e c i n ) 和羟基喜褥簸 ( 1 0 - h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ) 。目前主鼙从天然植物中提取长春碱和长春新碱，但是 它们在植物体中的含量极其微少，仪为百万分之几至十万分之几，化学合成和半 合藏成本太高，不其蠢巍整前景；虽獯株生长受环虢影嫡、生长髑期长、来源困 难，前者缚年只能生产1 2 k g ，后者只能生产l k g ，远远不能满飓市场需求；辫树 碱，特别熄羟基喜树碱的生产也遇到翱长春碱和长存新碱同样的问题。开展t i a s 生物合成的分子遗传学、生物纯学萋舅究，获褥该途径上豹基因；著进行筏落王程 研究将是解决抗肿瘤t i a s 药物稀缺的有效方法之一。遗传代谢工程已经成功的 应用于旗类晖i 哚生物碱合成途径。这些生物碱都由共同的代谢中间体异胡豆萤 ( s t r i e t o s i d i n e ) ，跌j 麓：徒下代谢途镪如现分支。蠢自孑研究工佟主要集中予怒黧表 达合成途径上游的代谢关键酶基因，调控代谢流( m e t a b o l i cf l u x ) 向生物碱合成 途径流动。rv e r p o o r t e 和jm e m e l i n k 等在长嚣花细胞培养中对色氨酸脱羧酶 ( t r y p t o p h a nd e c a r b o x y l a s e ，t d c ) 和异胡豆替合成酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ， 萝荚东( r a u v o l f i a v e r t i e i l l a t a ( l o u t , ) b a i l l 毛状穰井耀基西表述系统翦建立 s t r ) 进行了深入的研究，发现t d c 的超表达掇高了中间产物色胺的水平，但 是生物簸瓣含量没有援毫。超表逸s t r 翻嚣羲挺毫了生物碱夔台袋麓力 ( v e r p o o r t er ，v a nd e rh e o d e nr ，m e m e l i n kj ：c a n e lc ，l o p e z c a r d o s om i ， w h i t m e rs ) 。在转化手段上，除了农杆菌介导的转化外，l e e c h 簿用基因枪将t d c 露瓣- 转入矮革。逶遘对整合了嚣个纂嚣熬1 5 0 搽姻摹逶嚣分援，发蠛2 6 豹翅 草发生双菇因沉默，4 1 有单基因沉默，3 3 表达了双基因。插入拷贝数和外源基 因转录水平没有明确相关。转基因烟革种子中t d c 活力比对照提高了2 4 倍，s t r 提高了1 l o 傣。( l e e c h m j ，m a y k ，h a l l a r d d ，e t a l 1 9 9 8 ) 萜类吲哚生物碱生物合成的共同前体物质强3 a ( s ) 异胡豆苷，它是由色氨 酸的衍生物色胺( t r y p t a m i n e ) 以及萜类衍生物裂环马钱予苷( s e c o l o g a n i n ) 在 异麓委棼台戒酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，s t r ) 经纯下缝合生戏豹( 瑟1 ) 。该 步反应烧t i a s ( 如萝美木中的利血平、阿吗碱，密树中的喜树碱，长春花中的长 春花碱、长春瓶碱、长枣花朵灵等) 生物合成中的瓶颈之一。强多种产萜类吲哚 堂耱碱熬猿物中，买麓豆营是t i a s 瓣普遍戆裁塔纺矮，萁毯静转j 嚣特异瞧黪籍j 罄 自发的转化反应决定了之后生成的备种t i a s 的最终形式。因此辩胡豆苷合成酶是 萜类吲n 朵生物碱生物会成途径中的最重要的关键酶，在t i a s 代谢中具有至关驻要 静传臻( m e m e t i n kj ，v e r p o o r t er ，k 0 n ejw ，2 0 0 1 ：y a m a z a k iy ，u r a n oa ，s u d o h ，酣a 1 2 0 0 3 ) 。 t i a s 生物合成上游途径有两条：莽草酸途径和d x p ( 或m v a 途径) 途径。由 莽草酸谂经来戆色羧酾d x p ( 或m v a 途径) 途径缀多步反应生戏豹裂环骂钱予营 f s e c o l o g a n i n ) 在异胡越瞥( s t r i c t o s i d i n e ) 合成酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，s t r ) 催化下 耦合成吲哚生物碱的共同前体异胡豆瞽( s t r i c t o s i d i n e ) ，s t r i c t o s i d i n e 的生物合成在 挢有棱秘中是共通静，觅圈l 。s t r i c o s i d i n e 生秘会残途径上克隧到蕊关键酪麓因 在图上标出，最重要的关键酶是d x s 、t d c 、g i o h 和s t r ，黑底加框的袭示 m e j a 处理( 在长春花中) 可以使其表达上调，异胡豆苷经不同的下游途径生成各 释t i a s 。正是由于这个 共丽途径静存在，镬褥簌长春花中获褥斡基因可以糯于 在其他植物中开展t i a s 的代谢工程。 4 萝荚木( r a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u t ) b a i l l ) 毛状根外源基因表达系统的建立 图1 植物中t i a s 生物合成途径。框中是所有t i a s 生物合成的共同途径( 即t i a s 通用前体 异胡豆苷的生物合成) ，框外部分表示各种t i a s 下游生物合成途径。实线箭头表示只有一 步酶促反应，虚线表示多步酶促反应，相应重要步骤酶的编码基因在其对应位置显示。 f i g 1t i a sb i o s y n t h e t i cp a t h w a yi np l a n t b i o s y n t h e t i cp a i h w a yo f t h ek e yg e n e r a lp r e c u r s o rf o r t | a s s t r i c t o s i d i n e ，i ss h o w e di nb o xa n do u t s i d eo f t h eb o x8 t ed o w n s t r e a mp a t h w a y so f t i a s b i o s y n t h e s i s u n b r o k e na r r o w si n d i c a t es i n g l ee n z y m a t i cc o n v e r s i o n sa n db m k e na l t o w si n d i c a t e m u l t i p l ee n z y m a t i cc o n v e r s i o n s e n z y m e sf o rw h i c ht h ec o r r e s p o n d i n gg e n e sa r ei n d i c a t e d 图l 中的英文名称及英文缩写词与中文名称对应如下 邻氨基苯甲酸合成酶( a n t h r a n i l a t es y n t h a s e ，a s ) ；邻氨基苯甲酸( a n l h r a n i l a t e ) ： 色氨酸( t r y p t o p h a n ) ：色氨酸脱羧酶( t r y p t o p h a nd e c a r b o x y l a s e ，t d c ) ；色氨( t r y t a m i n ) ； 甲瓦龙酸( 甲羟戊酸、( m e v a l o n a t e ，m v a ) ； 1 脱氧- 术酮糖- 5 - 磷酸( 1 - d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e ，d x p ) ： l - 脱氧一d - 木酮糖- 5 - 磷酸合成酶( 1 - d e o x y - d - x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，d x s ) 3 羟基3 一甲基戊二酰c o a 还原酶( 3 一h y d r o x y - 3 一m e t h y l g l u t a r y l - c o ar e d u c t a s e ，h m g r ) c 萝莛东( r u u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u t ) b a i l l ) 毛捩穰外源基因表遮系统的建立 香叶醇= 磷酸( g e r a n y l * d i p h o s p h a t e ) ：褥叶醇( g e r a n l 0 1 ) ：g 1 0 h ( 香叶醇- 1 0 - 羟化酶) 1 0 一羟基蛰时醇( 1 0 - h y d r o x y - g e r a n i 0 1 ) ； 马钱子首( l o g a n i n ) ；裂环马钱子营合成酶( s e c o l o g a n i ns y n t h a s e ，s l s ) ； 裂环马钱予萤( s e c o l o g a n i n ) ：异胡豆替合成酶( s t r i c t o s i d i n es y n t h a s e ，s t r ) ； 舅麓豆萤( s t r i c t o s i d i n e ) ；旗薅璇( c a m p t o t h e e i n ) ：裁趣平( r e s e r p i n e ) 鬻吗璇( a j a m a l i c i n e ) k 舂碱( v i n b l a s t i n e ) ：故春新碱( v i n c r i s t i n e ) ； 萜类哼i 哚生物碱( t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ，t i a s ) 1 1t i a s 生物合成上游途径中的关键酶t d c 和s t r 及其挝孀 1 1 1 色氨酸脱羧酶( t r y p t o p h a nd e e a r b o x y l a s e ，t d c ) 琶甄酸麓羧酶毽纯瞧氨酸疆羧生成色氨，惫氨是t l a s 鹣耄爱翦俸之，釉c 催化的这一步反应是t i a s 生物合成上游途径中的一个关键步骤。编码t d c 的基 因已经从长春花c a t h a r a n t h u s r o s e g s ( d e l u c a v ，m a r i n e a u c ，b r i s s o n n 1 9 8 9 ) 、 喜褥c a m p t o t h e c a a c u m i n a t a ( l o p e z m e y e r m ，a n d n e s s l e r cl ，1 9 9 7 ) 稻短小鸵 根草o p h i o r r h i z a p u m i l a ( y a m a z a k iy ，u r a n oa ，s u d oh ，e l a l 2 0 0 3 ) 等檬物 中克隆。长春花t d c 綦因受到转录因子o r c a 3 的难调控；在长春花中超量袭达 t d c 基因，导交色氨静大羹= 积累，毽下游的t i a s 积累并不明鬟，两同对转化t d c 和s t r 基因就使下游t i a s 积累增加( c a r t e lc ，l o p e s c a r d o s omi ，w h i t m e rs ， 1 9 9 8 ) ；在马铃薯块茎中超表达长春拢t a l c 基因，引起了m e t a b o l i cs i n k ( 代谢消沉， 特定 弋潦途径中找霭| 产物生兹合或靛降低) 现象，长春花t d c 在马铃薯获茎中豹超 量表达，改变了莽草酸途径和p h e n y l p r o p a n o i d 途径原有的平衡，使得代谢流往 色氨及其下游方向流动，由于p h e n y l p r o p a n o i d 途径前体物质受到t d c 的巨大竞 争，使褥p h e n y l p r o p a n o i d 途径豹产物 蕊瓣瓣基嚣，滚爱裔与寝籽秣蠹痰蠢美赫基辫器垒羲豢 i a a 愉成有靛的基因。( c h i l t o nmd ，t e p f e rda ，p e t i ta ，e ta 1 1 9 8 2 ) 。r i 矮裁黪t j ：d n a 鬟受烫源澈繁会或冀影黎，套篱亵舞谶豢宫藏麓关蕊基嚣黎凌定 形戚嘏状根j 疑其形态姆征的m a 、b ，g 、d 撼困群( j ；l ：c o r et - d n a ) 。除了边器 亭弼，转魏誉需要荬袋夔暑搿矗孝龋。致辩基嚣搿袋稚瓣粒嚣熬瘸嚣v 舻 r e g i o n ) 、c h v 熬因与煳蕊染龟传奔学黪t - d n a 鹣转移豁关。瓢r 区基戮黔活纯邋 接调捺着t - d n a 静转移，爵裔大量辩验证麓黼类德合物对v i r 区基嘲的活纯蕊 毒萋爨终爨，露；己激丁香黧( a e e t o s y r i n g o n e ，a s ) 耱8 羟鏊己醮丁篱蘩憋黪 诱导擞病区的转录。炼眺转化的植物w 以通道储号分予诱导绷黼的致炳蒸因或糟 在受爨遥缓窝寂释蘩黪离篱共潦莠摹孛燕天黎号努予蒋蠢转茕簸辜。二蘸丁香黼 和相必化合i ! 甜能够撼黼发根绺扦菌介鼯的转化效率已缀在许弗植物种浆上襁粼 证实( 麓雾孚，李羚，潘臻甄，i 晷季7 e 不藏瓣褡与己虢了蚤舔褥霹搭褥爵磷诱 导致瘸基因驰窝表达，不同蕊株的发凝农誊_ l ；= 越舆枣不爨靛转钝疑力( k u m a rv ， 轻 萝蒸摩( g a u v o l f w t 确勰洳缘也槲，b a i l i 。鼍蔽壤辩辫熊援袭逸畚羲蕊建立 j o n e sb ，d a v e ymr ，t 9 91 ) ，感潦蕊褥产懋静毽撩擞挺鸯不露戆黪蕊。 蘩臻蛰弯瓣爨靛萃懑露蕤莲鬻蕊藩竣爨爨嘉黪罨馥壤蕊璧羲蘧嫠鏊蒙黪冬 菇冀静舔麟( n g u y e nc ，b o u r g a u df ，f o r l o tp ，e ta l 。1 9 9 2 ) 。生长培养攀瓣罨 弑裰翁嚣簿寮撩藿澎蟪。潞蕊黎蜜港黪蕊，辩臻h n s m a i e r 嚣醚，鑫錾鏊敬 t 9 6 5 ) 戴黼( m 凇a s n g et ，s k e o gk ，1 9 6 2 ) 对辫骥撬鹈凌鼗竣掺瓣骞稳。镊 熬浓度臻嚣蕊，辩蕊( g a m b o r gol ，m u r a s n g e 譬，t h o r p et 矗，槲a t 。 1 9 7 6 ) 测予绥慧戆燧鸯，嫂照转挺骼篱要臻垮撬懋豢靛壤羚麓土壤代数汰。墩静麓鹣汰 壤黎霆雾磷甍滚投黟鍪黉鬻予。羧溉深囊瓣鏊菠套褥酸转豫藜灏溅麓黪嚣宠不 够，麓滚囊又套产譬囊争辩糕降鬣转蕊漆( k u m a rv ，j i n e s b ，d a v e ymr ，1 9 9 t 。 蕺峻壤生长遮遴，瑟淘越悭，不零登添怒燕灏激焱。弼程憾熬浓度淡w h i t e 姥器 4 豢主蘩黎怒嚣滚蒋蘩篓蕊枣遥羹、溪臻、轰霪臻势下，褰熬一夸篾霹壤麓爨 予谗，巍瀚虢浓度静蹒熔擀基上璐褡，溅状穰生俄僚止，程禚部荆蔗部产生许 露瀵获突麓籀惑爨鼗缓漫。 窑霪裳妻 瓷瀣产貔叠：产 r i 绶靛瀵嚣盼越状嗽怒溅激辩姆辫蕊上培羚，鞭逸遴燎魅，熊越蟛合成次 受蕊落产稳；惹装瓣露黎醛菠熬誊瓣戆褥藤受囊喾蕊穗露蕊，霞邃凳长，砉蠡予爨 露，麓蓼耱搂食簸雾爨秘食懒警绕熹必淑熏霞落产撩会躐爨爨了辫的漶疑；簿获 褥凇密发靛蛾器笔状根，垮蕊条释必颁褥鬻谯倔。浚照代瓣声物斡声鬣不键簿 囊繁运霉糖哭。鼍黎臻癸羧爨霉麓鼙黢戆，篱攀，饕：黎鼗，囊爨浚灏裁，爨毯爨 寄遮戮镪赭能誊产的潜力。谇多植镪瀚转健罨状禳靛广泛酾精采讲潲鬻体变j 辩次 璧拣淫辏，辩室戆蘸、蘩醚，蘩醒，藩：瓣爨簿( h a r n i l t j d ，p a r r a j ，r o b l 燃r 匙 r h o d e sm ，1 9 8 6 ；s i g n sm 琴，f l o r e s 董薹嚣，t 9 9 0 ：瑟蟪a m i nb 黪，i 澜鼗稳， h e b l em r 。t 9 9 4 ) 。毽敲裰鬈霄漆壤黎栽徐藏浚激栈褥产麓游艇为慧不会簧疑 遗键秘坐黪合残瓣稔窥性。鞭默道过遮转搽撵，霉嬲逡令将靛攫窝燃煺鸯或越走。 黠纂焱穰窘赣器蒸瓣骚襄懑骥，一拿露壤竣蕊攀令辩藏筑蕤籍蹇凝蒋。凳鼗疆撩 拣辩骞戆受麓黪筏黪蘧蛰势繇避步袭瀚，子捷黪分瀚袋遴突垒嚣祭奉麴一争灏 骥嫩分樱一致( s e v o nn ，d r a g e r b ，h i l t u n e nr ，1 9 9 7 ) 。 籍蘩罨稳鼹孛雯蘩蠹鼹浚裳蔑瀑辫蹩貔遮爨蘩溅黪，瓣黪遴受搿嚣萋襄涔瀵 翻漆簸影确。螭器蒸翡成分瓣喻毛状根的囊饺和次擞代谢貔的生产( n u s s b b a u m e r 萝美术c e a u v o l f i av e r t i c i l l a t a ( l o u t ) b a i l l ) 毛获搬外源基霞表达系统的建立 p ，k a p e t a n i d i si ，c h r i s t e np ，1 9 9 8 ) 。蔗糖浓度，外源生长激索，氮源以及它们 静稳对鬓，光照，漫凌，添燕 皂舍魏郝将影稳生长，总生穆产豢纛次玺 弋落锈麓 生产( r h o d e smjc ，p a r raj ，c e i e l u t ta ，e ta 1 1 9 9 4 ) 。蔗糖是最好的碳源， 通过植物细胞的消化水解成葡萄糖和果糖；不同的掇物细胞吸收利用的速率不同 ( s r i n i v a s m lv ，p e s t c h a n k e rl ，m o s e rs ，1 9 9 5 ) 。毛滚校中耨生缓憝谴予壤失 顶端所以增殖只是发生在顶端分生组织，延长区域再向侧面生长。这种生长方式 导致了在根部稳定的积累生物量。为了获得高密艘的培养毛状根，培养条件威保 持在最鼹羧态。毛获蔽霹以稳定合成大量戆蘧诧产瑟，鑫培势萋中释敖多羹鹣霾 标产物，威馈抑制其在毛状根中的积累。b e t av u t g a r i s 毛状根在氧饥饿处理下释 放甜菜花海素。吐温2 0 处理可渗透介质可以促使d a t u r oi n n o x i a 毛状根释放的 大量莨磬躐两没有裂终翊( b o i t e lcm ，g o n t i e re ，l a b e r c h ejc ，e ta l 。1 9 9 6 ) 。 添加x a d - 2 ，液体石蜡油刺激了紫草索的产生( s h i m o m u r ak ，s u d oh ，s a g a h ， e ta 1 1 9 9 1 ) 。l e e 等( l e e k t ，y