（动物学专业论文）斑马鱼干扰素γ基因克隆表达及生物信息学分析.pdf

北京协和医学院硕士研究生论文 摘要： 目的：克隆斑马鱼的新基因i f n 9 1 j 和i f n 9 1 2 ，验证其编码产物是否为干扰素y ； 构建两个基因的原核表达载体，实现其原核重组表达，为深入研究这两个基因的功 能奠定基础。 方法和内容：首先通过e o n a 药浴，人工诱导斑马鱼干扰素的表达。即刻提取组 织总r n a ，通过r t - p c r 检测这两个基因的表达情况，并对p c r 产物进行测序以 验证结果的正确性。然后将这两个基因克隆入表达载体p e t 2 4 a ，构建高效表达载 体p e t 2 4 a - i f n 9 1 1 和p e t 2 4 a i f n 9 1 2 ，并将这两个基因做原核融合表达。同时运用 生物信息学方法分析这两个基因的结构及功能域，进一步验证这两种斑马鱼干扰素 7 基因是否存在。 结果：利用r t - p c r 方法，成功地从经过c o n a 药浴的斑马鱼组织中扩增出与预 期大小一致的d n a 片段，而未经药浴的斑马鱼体内没有扩增到相应的d n a 片段。 通过测序证实了p c r 产物就是目的基因的片段。表明这两个基因都能够被c o n a 诱 导表达，符合干扰素的基本特性，证实这两个基因不是假基因，但有可能是干扰素 类物质。将目的基因连入表达载体p e t 2 4 a ，成功地构建了重组表达载体 p e t 2 4 a i f n 9 1 1 和p e t 2 4 a i f n 9 1 2 。将载体转化b l 2 1 并用i p t g 诱导融合蛋白的表 达，经s d s p a g e 检测，成功的得到了和目的蛋白大小一致的产物。 生物信息学分析表明，这两个基因产物的大小、等电点、部分保守序列等符合 干扰素y 的特征。但和人的干扰素相比i f n 9 1 2 比i f n 9 1 1 具有更高的同源性，二级 结构和三级结构的预测结果显示，i f n 9 1 1 具有5 - a 螺旋结构，而i f n 9 1 2 具有6 - a 螺旋结构。干扰素丫的一个重要特征是具有6 - a 螺旋结构，因此i f n 9 1 2 明显符合干 扰素丫的特点。系统进化分析表明，虽然i f n 9 1 1 和i f n 9 1 2 在基因组上紧密连锁， 但在长期进化过程中二者已经发生了明显分化。其中，i f n 9 1 2 和其它鱼类干扰素丫 有较近的亲缘关系，而i f n 9 1 1 则较早从鱼类干扰素y 中分化并形成了新的分支。 结论：本实验结果显示：i f n 9 1 1 和i f n 9 1 2 都具有干扰素丫的一些基本特征；其 中i f n 9 1 2 即为干扰素y ；i f n 9 1 1 在长期的进化过程中基因序列发生了大量变化而 导致其结构的改变，属于从干扰素丫中分化出的新的一类干扰素。 关键字：斑马鱼；干扰素7 ；原核表达；生物信息学 北京协和医学院硕士研究生论文 a b s t r a c t o b j e e t i v 铭：t oc l o n et w oz e b r a f i s hg e n e s 矽堙j 一j a n di f n g l 一2 ；t oc o n f i r mw h e t h e r i f n g l - ja n di f n g l - 2e n c o d ez e b r a f i s hi n t e r f e r o ng a m m a ；t oc o n s t r u c tt w oe x p r e s s i o n v e c t o r sc o n t a i n i n gi f n g l 一1a n d i f i a g l - 2 ；t ol a yt h ef o u n d a t i o nf o rf u r t h e rf u n c t i o n a ls t u d i e s o fz e b r a f i s hi n t e r f e r o ng a m m a m e t h o d s ：e x p r e s s i o no fi n t e r f e r o ng a m m ag e n ew a si n d u c e db ym e d i c a lb a t ho f z e b r a f i s hw i t he o n a t o t a lr n aw a si m m e d i a t e l ye x t r a c t e da n dt h ei n t e r f e r o ng a m m a g e n ew a sa m p l i f i e db yr t - p c r a m p l i f i e dd n af i a g m e n t sw e r es e q u e n c e dt oi d e n t i f yi f t h e s ep c r p r o d u c t sa r ef r o mt a r g e tg e n e s t a r g e tg e n e sw e r es u b c l o n c di n t oav e c t o ro f p e t 2 4 at o c o n s t r u c tr e c o m b i n a n tv e c t o r sp e t 2 4 a - i f i a g l 1a n dp e t 2 4 a - i f n g l 一2 t h e e x p r e s s i o no faf u s i o np r o t e i nw a si n d u c e dw i t hi p t ga f t e rt r a n s f o r m i n gt h ev e c t o r si n t o b l 2 1 ( d e 3 ) f i n a l l y , w ec o n f i r m e dt h ee x p r e s s i o no ft h ef u s i o np r o t e i nw i t l ls d s p a g e e l e c t r o p h o r e s i sa n da n a l y z e dt h e i rs t r u c t u r e sa n df u n c t i o n a ld o m a i n sb yb i o i n f o r m a t i c s r e s u l t s ：e x p r e s s i o no fi f n gl - 1o ri f n gl - 2w a si n d u c e db ym e d i c a lb a t hw i t hc o n a w e s u c c e s s f u l l y c l o n e d i f n g l 1 a n d i f n gl - 2 a n dc o n f i r m e dt h e m b ys e q u e n c i n g r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o nv e c t o r so fp e t 2 4 a - i f n gl - 1a n dp e t 2 4 a - i f n gl 2w e r e c o n s t r u c t e da n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n so ft h e s ef u s i o np r o t e i n sw e r es u c c e s s f u l l y c o m p l e t e d b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i si n d i c a t e st h a t i f n g l - 1 a n di f n g l - 2a l es i m i l a rt oo t h e r i n t e r f e r o ng a m m a si nr e l a t i v em o l e c u l a rm a s s ，i s o e l e c t r i cp o i n t sa n da m i n oa c i d s e q u e n c e so fs o m ec o n s e r v e dd o m a i n s a f t e rp r e d i c t i n gt h es e c o n d a r ys t r u c t u r ea n d t e r t i a r ys t r u c t u r eb yb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ，w eh a v ef o u n dt h a tk n o w ni n t e r f e r o n g a m m a sa n di f n gl - 2h a v es i m i l a r6 - ah e l i xs t r u c t u r e s , b u ti f n gl 一1 h a s5 - ah e l i x s t r u c t u r e s t h e s ed a t as u g g e s tt h a ti f n gl - 2i st h ep u t a t i v ez e b r a f i s hi n t e r f e r o ng a m m a c o n c l u s i o n s ：i nt h es t u d y , i f n g l 一2 ，b u tn o ti f n g l - 1 ，w a si d e n t i f i e da sa t y p ei ii n t e r f e r o n e x p r e s s i o no fz e b r a f i s hi f n g l j a n di f n g l 一2c a nb ei n d u c e db yc o n & s u g g e s t i n gt h a tb o t h g e n e sa r en o tp s e u d o g e n e sa n dm a yh a v es o m ef u n c t i o n si nz e b r a f i s hi m m u n er e s p o n s e a m i n oa c i ds e q u e n c ea n ds t r u c t u r eo fi f n g l - 1a l el e s sc o n s e r v a t i v ed u r i n ge v o l u t i o n b e c a u s eo fa b u n d a n tm u t a t i o n si ni t sg e n e a l t h o u g hz e b r a f i s hi f n g l 一，a n di f n 9 1 2a r e 4 北京协和医学院硕十研究生论文 c l o s e l yl i n k a g e di n t h eg e n o m e ，t h e yh a v es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si ns e q u e n c ea n d s t r u c t u r e e v i d e n c ef r o mt h es t u d ys u g g e s t st h a ti f n g l 一2i sam e m b e ro fi n t e r f e r o ni i f 锄i l y f u r t h e rs t u d i e sa r en e e d e dt o 砸l s _ w e ri fl f n g l 一1i sa l s oat y p ei ii n t e r f e r o n k e yw o r d s ：z e b r a f i s h ；i n t e r f e r o ng a m m a ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；b i o i n f o r m a t i c s 5 北京协和医学院硕士研究生论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：签字日期： 年月日 5 8 北京协和医学院硕十研究生论文 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j b 塞坯塑匡堂瞳有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j e 塞蛰塑医堂睦可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：年月日 签字日期：年月日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 5 9 电话： 邮编： 北京协和医学院硕士研究生论文 前言 干扰素( i f n ) 是一类能够诱导细胞进入抗病毒状态的分泌型细胞因子，普遍存 在于各种高等和低等脊椎动物中。在机体抗病毒，抗肿瘤，免疫调节等方面发挥着 重要作用，被称为皮肤之内的“第二道防线 。 l 干扰素的发现 英国病毒生物学家a l i e ki s a a e s 和瑞士研究人员j e a nl i n d e n m a n n 于1 9 5 7 年首 先发现经热灭活流感病毒处理的鸡胚细胞能产生一种特殊的细胞因子，这种细胞因 子作用于其它细胞之后能使受体细胞产生干扰病毒复制的能力，因此将这种细胞因 子命名为干扰素【1 1 。后来科学家相继从其它脊椎动物中发现类似干扰现象，并于1 9 8 0 年成功克隆了人类i f n - c t 干扰素【2 1 。随后，由于干扰素基因在哺乳动物之间同源性 较高，大量哺乳动物的干扰素也相继被发现。随着生物信息学的发展和普及，不断 有新的干扰素在生物信息技术的帮助下被发现，禽类干扰素也于1 9 9 4 年被成功克 型3 1 ，但低等脊椎动物干扰素的研究进展较为缓慢。 从1 9 6 5 年开始人们就发现多种鱼类细胞或组织经病毒或双链r n a 处理后也能 产生干扰其它病毒复制的性质1 4 , 5 , 6 1 ，但未能将此类物质提取和鉴定。t a m a i 【7 】等曾于 1 9 9 3 年报道获得一株牙鲆白细胞系，经病毒诱导后克隆了牙鲆干扰素e d n a ，并纯 化了牙鲆干扰素蛋白。他将牙鲆干扰素e d n a 连接表达载体并成功表达后，所得重 组干扰素蛋白与从细胞中获得的牙鲆干扰素大小一致。其鉴定的牙鲆干扰素蛋白有 1 3 8 个氨基酸，包括一个糖基化位点和由3 0 个氨基酸编码的信号肽，分子量为1 6 k d a 。但是与哺乳动物干扰素相比，其分子量偏小，同源性很低，b l a s t 分析表明 该蛋白的三分之二序列与丝状噬菌体有高于6 0 的同源性，所以该基因未得到众多 科研工作者的认同。 2 0 0 3 年s t e p h e n 8 】等首先报道通过b l a s t 分析在斑马鱼e s t 数据库中发现一 条与鸡干扰素基因同源性较高的序列，经p c r 扩增后得到的基因阅读框架含5 5 8 b p 碱基，编码一条由1 8 5 个氨基酸残基组成的肽链，其中包含一段由2 2 个氨基酸组 成的信号肽，与高等脊椎动物干扰素类似。通过对该基因的功能研究发现，他们克 隆的基因具有典型的干扰素特性：能够被p o l yi ：c 诱导表达；激活m x 启动子；增 强细胞的抗病毒能力等。该基因作为第一个被发现的鱼类干扰素基因己被学术界普 遍认可。但与其它已发现的干扰素不同的是其等电点偏碱性，n 端也缺少n x s t 糖基化位点。体现了鱼类和高等脊椎动物在进化上的巨大差别。随后包括虹鳟、大 6 北京协和医学院硕士研究生论文 西洋鲑、鲶鱼等在内的多种鱼类干扰素基因也相继被成功克斛。各个物种干扰 素的不断发现极大的丰富了g e n e b a n k 等生物信息数据库，为干扰素的研究工作提 供了大量有价值的信息。 2 干扰素的分类 目前已经发现的干扰素有数种，根据干扰素分泌细胞，受体的种类及理化性质 的不同，目前学术界普遍认可的分类方法是将干扰素分为i f ni 和i f ni i 两个家族。 i 型干扰素主要包括耐酸的i f n a 和i f n p 两种，其中i f n a 又包括许多种亚型。 这些亚型之间同源性高，结构相似，功能相近1 1 2 l 主要由白细胞产生【13 1 ，b 细胞和成 纤维细胞也能合成1 1 4 1 。i f n d 只有一种，与i f n 吨同源性较低，但二者功能相似， 且都是5 a 螺旋结构并且结合相同的受体。不同的是i f n p 主要由成纤维细胞分泌 产生【15 1 。i i 型干扰素仅包括i f n 7 一种1 1 6 1 ，对酸敏感，由t 细胞分泌产生，是哺乳 动物主要的巨噬细胞活化因子【 l ，主要起免疫调节作用。 除这三种常见的干扰素之外，人们又相继从各种动物体内分别发现了i f n 6 ， i f n ，i f n 1 c ，i f n 嵋i f n 一( o 和l i m i t i n 等多种类型的干扰素，由于它们性质结构都 和i f n c t 类似，因此也都归类为i 型干扰素。不过随着对这些新的干扰素研究的不 断深入，干扰素种类划分可能会发生改变，因为这些基因的发现往往是通过生物信 息学推测后得到的。由于干扰素在长期的进化过程中产生了多种亚型，并且干扰素 和白细胞介素基因大小相仿，结构相似，并且都属于重要的普遍存在的免疫系统的 细胞因子，因此在预测时难免会出现差错。目前已经有多种原先命名为干扰素的因 子被鉴定为白细胞介素。近年来一种新型干扰素在哺乳动物中被发现，和其他高等 脊椎动物干扰素不同的是，其编码基因和鱼类i f n a 具有相同的外显子内含子组 成，其受体结构也和鱼类干扰素i f n a 受体结构类似，并且抗病毒活性也比i f n 彬p 要低，推测可能和鱼类干扰素来自于共同的祖先基因。在无法鉴定到底该基因为哪 种干扰素的情况下，一个新的名字i f n 九就此诞生了，因此，随着干扰素新的种类 的增多，干扰素的分类也会越来越复杂。 3 干扰素的诱生 干扰素是诱生蛋白，自然状态下其基因处于沉默状态，只有经过刺激后才进行 表达。能够使干扰素表达的物质称为干扰素诱生剂。常见的干扰素诱生剂有病毒、 细菌、立克次氏体、真菌等病原体；细菌的内毒素、外毒素、放线菌素d 等分泌物质； 细菌脂多糖( l p s ) ，植物血凝素( p h a ) ，刀豆素( c o n a ) 等有丝分裂原；以及梯 洛龙( t i l o r o n e ) ，聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸( p o l y i ：c ) 等人工合成的药物制剂。此外，在 诱生干扰素的过程中还有一种特殊的超诱导( s u p e r i n d u c t i o n ) 现象。所谓超诱导现象是 指细胞在某种大分子合成抑制物的适当作用下发生的一种诱生i f n 合成增加的现象。 北京协和医学院硕士研究生论文 如果在诱生干扰素是同时加入蛋白合成抑制剂放线菌酮或m r n a 合成抑制剂放线菌 素d 共同处理时，干扰素产量比不加放线菌酮时增加数倍。其原因是：干扰素合成抑 制物是不稳定的，其相应的m r n a 也不稳定，而干扰素m r n a 却是相对稳定的，当 加入诱生剂的同时加入适当的蛋白或m r n a 抑制剂时，抑制物及其m r n a 合成很快 阻断，而干扰素m r n a 合成则不受影响，从而产生更多的i f n 。 被感染宿主细胞干扰素基因的表达主要通过双链r n a 依赖的蛋白激酶( p i ) 来实现对病毒的识别，并由此触发干扰素诱生信号转导通路l l 川。t o l l 样受体( t l r ) 也是识别入侵病原体核酸的重要蛋白1 1 9 1 。其中t l r 3 识别病毒双链r n a 及p o l yi ：c ； t l r7 和t l r 8 识别病毒单链r n a ；t l r 9 识别病毒和细菌未甲基化的c p gd n a 基序。 此外，干扰素的表达同时受到干扰素调节因子( i f r ) 的调控1 2 , 0 1 。病毒感染宿主 细胞后，机体内t b k l 或：i k k i 能使i f r - 3 磷酸化形成二聚体，促进i f n p 的转录表达， 随后i r f 7 被激活，它可以同时刺激i f n q 和i f n b 的转录，使更多的干扰素参与抗病 毒过程1 2 。目前已发现至少1 0 种i r f 参与到干扰素基因转录的正向和负向调控。 4 干扰素的功能 干扰素是一类具有多种生物活性的糖蛋白，其最主要的作用就是抑制病毒的复 制。但作为一种广谱抗病毒细胞因子，干扰素并不直接作用于病毒，而是作为第一 信使通过结合受体而介导信号转导，产生相应的效应。其中i 型干扰素受体是 i f n a 由i f n a r 1 和i f n a r - 2 两个亚基组成，i i 型干扰素i f n y 的受体为i f n g r , 包括i f n g r i 和i f n g r 2 两个亚基；两型干扰素受体都是组 成型表达，在配体识别方面表现出具有物种特异性。病毒入侵宿主后会自我复制产 生双链r n a ，双链r n a 能够刺激被感染细胞产生并分泌干扰素i f n “b 2 2 刀】，经血液 循环与其它有核细胞相应的i f n “b 受体结合1 2 4 1 ，触发j a k s t a t 信号传导通路，诱 导o a s ，a d a r ，m x 等抗病毒基因的转录表达，从而刺激其它未感染细胞进入抗病 毒状态。病毒入侵后，单核吞噬细胞和抗原呈递细胞能够分泌i l 1 2 和i l 1 8 ，他们可 以刺激n k 细胞产生i f n 吖1 2 5 】。i f n - 7 与不同于i f n q d 受体的另一类受体结合，激活和 i f n 吨僵不同但有部分交叉的j a k - s t a t 信号转导通路【2 6 1 。起到免疫调节作用。其中 i f n a b 是主要的抗病毒干扰素；而i f n 吖是主要的免疫调节干扰素，其免疫调节作用 比i f n a 和i f n b 强数倍睇。 此外，干扰素还具有抗肿瘤的功能，但具体机理不详，推测可能有以下原因： 有些肿瘤的发生是由病毒引起的，尤其是当病毒的基因整合到宿主基因组中长期作 用可能引起癌变，而干扰素可以诱导机体建立抗病毒状态，因此可以减少肿瘤的发 生几率。其次，干扰素可以抑制肿瘤细胞分裂。干扰素和细胞膜受体结合后，激活 腺苷酸环化酶通路，使c a m p 增加，抑制d n a 的合成及细胞分裂，同时也可以起到 8 北京协和医学院硕士研究生论文 抑制肿瘤细胞增殖的作用，此外，由于干扰素的免疫调节功能能够增强巨噬细胞及 n k 细胞的杀伤活性，增加细胞表面抗原和受体的表达，从而增加了对癌细胞的杀伤 作用1 2 5 。 最近有研究表明，干扰素t 在哺乳动物胚胎植入及早期胚胎发育中发挥着重要作 用。在哺乳动物中囊胚植入子宫是建立和维持妊娠的重要事件之一，这一事件需要 许多相关因子如激素生长因子等参与，但是科学家们发现在猪的囊胚植入前滋养层 细胞大量分 泌, i f n 2 9 , 3 0 。因此i f 可能是其它的一些胚胎植入必需因子的辅助物质。 后来人们又在其他实验中发现i f n t 抑制子宫内膜细胞的增殖【”】。近来的研究认为猪 i f 或许能重塑或去极化子宫内膜上皮细胞，而这是胚胎植入和建立有功能胎盘的 先决条件【3 2 1 ，此外还有研究发现i f 的受体2 在小鼠孵育囊胚中特异表达，但功能不 详，推测与囊胚孵育和植入是有关系的【”】。因此干扰素y 可能在胚胎发育过程中发挥 重要作用。 5 本研究的目的和意义 在当前科学研究的众多动物模型中，斑马鱼由于具有胚胎透明、性成熟周期短、 繁殖力强等优点，已经成为了生殖生物学，发育生物学，比较医学等多个学科研究 的首选。而且由于斑马鱼对水体环境十分敏感，已经成为了监测水体环境新的工具， 通过对斑马鱼体内干扰素的检测来实现对水体环境的控制也是我们将要开展的一项 重要探索。然而生活在水中同样也使鱼类面临更多的感染风险。鱼类病毒病是仍在 危及鱼类健康的全球性问题，由于鱼类的免疫系统没有高等脊椎动物完善，所以其 抗病毒能力很差，尤其是人工饲养的实验用鱼类其抵抗力较野生型的更低。由于干 扰素具有广谱抗病毒性，而且目前人们对干扰素的研究也比较透彻，已经有多种重 组产品上市，并取得了很好的疗效，因此这也给鱼类的抗病毒研究指明了方向。 如果能够得到有活性的重组干扰素，将会对鱼类实验动物的发展起到很大的推 动作用，因此这也是我们研究的重点方向之一。然而目前有一个重要的问题还有待 解决，那就是目前已经发现的鱼类干扰素的种类较之哺乳动物来说还很少，而且大 都是通过生物信息学分析后得到的预测基因，其功能结构知之甚少。而且对鱼类干 扰素的分类也没有明确的定义，比如第一种发现的斑马鱼干扰素和虹鳟干扰素都被 命名为i f n l ，虽然现在已经清楚这两种干扰素属于i 型干扰素，但仍未对其分类，因 为人们现在还不清楚到底鱼类干扰素有几种，是否i 型也像高等脊椎动物一样分好多 亚型。但人们根据序列比对发现了斑马鱼基因组中存在两个干扰素丫基因搬，j ( n m 和州 ，这明显区别于高等脊椎动物，因为到目前0 0 1 0 2 0 7 9 3 ) i f n g l 2m2 1 2 8 6 4 ) 为止所有的高等脊椎动物体内都只发现了一种i i 型干扰素。i i 型干扰素的发现对鱼类 干扰素的研究无疑是一个好消息，但这种靠序列比对得出的结论到底能否相信，到 9 北京协和医学院硕士研究生论文 底是不是有两种干扰素丫，我们是不是就可以依次为依据展开对干扰素的研究呢? 显 然，在n c b i 给我们的注释还是p r o v i s i o n a l ( 临时的，假定的) 时，我们对这两 个基因的验证和分类成了摆在我们面前的首要任务。 由于干扰素在抗病毒，抗肿瘤，免疫调节等方面发挥着重要作用，因此对干扰 素的研究已经成为了近年来的热点。尤其是i f n 丫不但是免疫系统中的重要成员，而 且在胚胎发育过程中也发挥重要作用，因此干扰素t 也是研究细胞信号转导通路中重 要的因子。 作为一种重要的动物模型，如果斑马鱼的体内能够被证明含有两种干扰素y ，那 么这将是对免疫系统研究的重要补充，这可能体现了高等脊椎动物和低等脊椎动物 免疫系统在进化上的区别，当然，两个干扰素丫的存在也有可能是分类上的错误。 由于干扰素种类众多，且不断有新的亚型被发现，所以干扰素的分类一直是学 术界的一个难题。目前n c b i 登陆的干扰素序列达到了几百条，但许多干扰素的发现 是通过序列比对分析得到的，因此其结构和功能尚不明确，许多干扰素有多个命名 和归类。而且由于干扰素和白细胞介素同源性较高，结构相似，所以有些基因甚至 同时命名为干扰素和白细胞介素，当这些基因的功能结构信息足以成为为该基因分 类和命名的依据时，n c b i 官方会重新为他们命名。因此，n c b i 登陆的众多基因信 息经常会有更名，改变属性，甚至删除的情况发生。 由于i 型干扰素和i i 型干扰素在功能上发挥着不同的作用，所以对干扰素错误的 分类将直接影响后续实验的设计和实施。然而目前为止还没有关于这两个基因的深 入研究。因此，本实验旨在通过比较基因组学和比较蛋白质组学的方法对斑马鱼新 基因搬，j 和i f r i 9 1 2 进行结构上的分析，为这两个基因的分类提供依据，同时人工 诱生和克隆这两个基因，并构建表达载体实现原核融合表达，为进一步研究其功能 性质及生产重组蛋白奠定基础。 1 0 北京协和医学院硕士研究生论文 第一部分斑马鱼干扰素丫基因的克隆表达 1 材料 1 1 实验动物 a b 系斑马鱼和野生型斑马鱼均由国家人口计生委科学技术研究所实验动物中 心提供。 1 2 实验仪器 主要仪器设备及公司名称： 微量移液器 德国e p p e n d o r f 公司 c e n t r i f u g e5 4 15 d 小型离心机德国e p p e n d o r f 公司 p c r 仪 德国e p p e n d o r f 公司 凝胶成像系统美国b i o r a d 公司 m i l l i q 超纯水系统美国m i l i p o r e 公司 电子天平江苏海门仪器厂 水平电泳仪和电泳槽北京六一仪器厂 旋涡混合器上海第一医学院仪器厂 压力蒸汽灭菌器广州华南医疗器械有限公司 净化工作台苏州安泰空气技术有限公司 组织匀浆器( u l t r a t u r r a xt 2 5 ) 德国j a n k e & k u n k e l i k a l a b o r t e c h n i k 公司 p h 计( p h 2 1 1 型) h a n n a 公司 分光光度仪( d u 6 5 0 )b e c k m a n c 0 2 培养箱长春生物制品研究所 北京协和医学院硕士研究生论文 1 3 实验试剂 1 3 1 质粒和菌株 表达载体p e t 2 4 a ( 图1 ) ：包含n 端t 7 标签和c 端h i s 标签，外源基因的表 达由1 7r n a 聚合酶驱动。 克隆菌株d h 5 a - 用于质粒克隆的菌株，可与载体编码的b 一半乳糖苷酶氨基端 实现融互补，用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：f - ，9 8 0 d l a c z a m l 5 ，a ( 1 a c z y a - a r g f ) u 1 6 9 ，d e o r ，m c a l ，e n d a l ，h s d r l 7 ( r k - ，m k + ) ，p h o a ，s u p e 4 4 ， k ，也i l ，g y r a 9 6 ，r e l a l 。 表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) ：该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体t 7 启动子的表 达载体的基因。t 7 噬茵体r n a 聚合酶位于入噬菌体d e 3 区，该区整合于b l 2 1 的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。基因型：f ，o m p t ，h s d s ( r b b m b 一) ， g a l ，d e m ( d e 3 ) 。 以上菌株和质粒均由我室保藏。 克隆载体p g e m t ( 图2 ) ：经e e o rv 酶切改造的载体，末端含突出的t 碱基， 可与p c r 扩增产物的a 末端连接成环状载体，本载体购自p r o m e g a 公司。 图1 ，p e t 2 4 a ( + ) 图谱 1 2 北京协和医学院硕士研究生论文 x m n i1 9 9 4 1 s c a 8 7 5 7 p g e m - t v e c t o r ( 3 0 0 0 b p ) 淤浮 ，a c 支气 图2 ，p g e m t 图谱 1 3 2 主要分子生物学试剂及厂家名称 砌峪提取试剂盒t r i z o l 逆转录试剂盒 限制性内切酶 t a qd n a 聚合酶 t 4d n a 连接酶 质粒提取试剂盒 胶回收试剂盒 d n a 分子量m a r k e r 蛋白质分子量m a r k e r 核酸染料e b i n v i t r o g e n 公司 p r o m e g a 公司 t a k a r a 公司 北京赛百盛生物公司 t a k a r a 公司 北京天根生化科技有限公司 北京天根生化科技有限公司 北京全式金生物公司 北京全式金生物公司 北京鼎国生物技术有限责任公司 t 7l a p a l a a t l l s p h l b t z i n c o i s a c l l s p e l n o t i b s 亿i p s t l s a l l n d e i s a c l b s t x l n s i i ts p 6 北京协和医学院硕士研究生论文 i v 型刀豆蛋白( c o n a ) 二硫苏糖醇( d 1 v r ) 丙烯酰胺、双丙烯酰胺 s d s 过硫酸氨 t e m e d s i g m a 公司 m e r k 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 b i o r a d 公司 b i o p a d 公司 1 3 3 其它试剂及配方 t a e 电泳缓冲液5 0 x ：2 4 2g i r i s ，5 7 1 m l 冰乙酸，1 0 0 m l0 5 m o l le d t a ，定 容至1 l ，工作液稀释至1 x 。 l b 液体培养基：称取蛋白胨1 0g ，酵母提取物5g ，n a c l1 0g ，溶于8 0 0m l 去离子水中，用n a o h 调p h 至7 5 ， 加去离子水至总体积l 升，高压蒸汽灭菌2 0 分钟。冷却备用。 l b 固体培养基：液体培养基中每升加1 5 9 琼脂粉，高压灭菌，在温度降到5 0 左右加入相应的抗生素，铺于9 c m 玻璃平皿。 氨苄青霉素母液：配成5 0 m g m l 水溶液，2 0 。c 保存备用。 卡那霉素母液：配成1 0 m g m l 水溶液，2 0 1 2 保存备用。 t e 缓冲液：1 0m m o f lt r i s c l ( p h 8 0 ) ，lm m o l le d t a ( p h 8 o ) 。高压灭菌 后储存于4 冰箱中。 l 琼脂糖凝胶：1 o g 琼脂糖加入1 0 0 m l 电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾，熔 化的琼脂物冷却至6 0 ( 2 时加入1 0 m g m le b2 5 皿，充分混匀，将温热的凝胶倒入 已置好梳子的胶膜中，在室温下放至胶凝固后现进行电泳。 x g a l 存储液( 2 0 m g m l ) -称取1 9x g a l 置于5 0 m l 离心管中，加入4 0 m l 二甲基甲酰胺，充分混合溶解后，定容至5 0 m l ，小份分装后，2 0 保存，备用。 i p t g 存储液( 2 4 m g m l ) - 称量1 2 9i p t g 置于5 0 m l 离心管中，加入4 0 m l 灭菌水，充分混合溶解后，定容至5 0 m l ，用0 2 2 9 m 滤膜过滤除菌，小份分装后， 2 0 保存，备用。 3m 醋酸钠：称取4 0 8 9 n a a c 3 h 2 0 置于1 0 0 烧杯中，加入约4 0 m l 的去离子 水搅拌溶解，加入冰乙酸调节p h 值至5 2 加入去离子水将溶液定容至1 0 0 m l ，高 温高压灭菌后，室温保存。 i m 氯化钾：溶解7 4 6 9 氯化钾于足量的水中，加水定容到1 0 0 m l 。 溴酚蓝( 1 ) ：加l g 水溶性钠型溴酚蓝于1 0 0 m l 水中，搅拌或涡旋混合直到 完全溶解。 二甲苯青f f ( 1 ) ：加l g 二甲苯青f f 于1 0 0 m l 水中，搅拌或涡旋混合直到 1 4 北京协和医学院硕士研究生论文 完全溶解。 2 方法 2 1l f n g l - 1 和l f n g l - 2 的诱生 将在实验室标准条件下饲养的斑马鱼a b 系和野生型各6 尾转移至含有 c 伽a ( 1 0 舭) 的水体药浴处型3 4 1 ，并分别在第2 ，1 2 ，2 4 小时各取两尾，分四组 即刻提取总r n a ，并以未诱导斑马鱼作为对照同时提取r n a 。 2 2 总r n a 的提取 2 2 1 器材的处理 在玻璃烧杯中注入去离子水，在通风柜中加入d e p c 使d e p c 的终浓度为0 1 。 将移液器枪头和塑料离心管所有部分都浸泡到溶液中。通风柜中室温处理过夜。 然后将d e p c 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住烧杯，高温高压蒸汽灭菌3 0 分钟。烘箱烘拷至干燥。置于干净处备用。 实验所需剪刀，镊子，玻璃匀浆器于2 5 0 c 烘烤3 小时。 2 2 2r n a 提取过程 1 、将血液较丰富的内脏组织样品按1 0 0 m g m lt r i z o l 加入t r i z o l ，迅速匀浆， 室温放置5 m i n ，使其充分裂解。 2 、1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃沉淀。 3 、按2 0 0 p l 氯仿m lt r i z o l 加入氯仿，振荡混匀后室温放置1 5 m i n 。 4 、4 0 c1 2 0 0 0 9 离心15 m i n 。 5 、吸取上层水相，至另一离心管中。 6 、按0 5 m l 异丙醇m lt r i z o l 加入异丙醇混匀，室温放置5 1 0 m i n 。 7 、4 c1 2 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，弃上清，r n a 沉于管底。 8 、按l m l7 5 乙醇m lt r i z o l 加入7 5 乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9 、4 c8 0 0 0 9 离心5 m i n ，尽量弃上清。 1 0 、室温晾干1 0 m i n 。 北京协和医学院硕士研究生论文 1 1 、用5 0 此t eb u f f e r ，5 5 c 溶解。 1 2 、测o d 值定量r n a 浓度。 2 3 反转录 在0 2 m lr n a - f r e e 的离心管中加入2pgr n a 和1ul o l i g od t ，在p c r 扩增 仪上7 0 变性5 r a i n ，迅速冰浴，然后依次加入下列试剂： 5 xr e a c t i o nb u f f e r ( 烈t p r n a s i n m m l vr t n u c l e a s e f r e ew a t e r 5 止 3 止 l 肛l l 皿 t 02 5 此 将上述反应液混匀，短暂离心，于4 2 。c 孵育l 小时，9 5 加热5 m i n ，灭活反 转录酶。2 0 c 保存，备用。 2 4p c r 扩增i f n g l - 1 和i f n 9 1 2 2 4 1 引物设计 根据g e n e b a n k 登陆的i f n g l l 和i f n g l - 2 的序列信息，设计引物扩增i f n 9 1 1 和 i f n g l - 2 的编码区序列，软件采用p r i m e rp r e m i e r5 0 ，并根据p e t 2 4 a 限制性内切酶 位点及阅读框，设计引物时分别在上、下游引入b a m hi 和x h oi 酶切位点。扩增长 度分别为i f i l g l - l 扩增5 2 2b p ，i f n g l - 2 扩增5 6 7b p 。内参选用b e t a - a c t i n 扩增3 3 6 b p 。 引物设计具体序列为： i f n g l 一1 一f i f n g l 一1 - r ： i f n g l 一2 一f i f n g l 一2 一r ： a c t i n f a c t i n r ： 5 g g a t c c a t g g p 汀t c c t g c c t c3 5 c t c g a g a g a c a t g t g t a a a t g c3 5 g g a t c c a t g a t t g c g c a a c a c3 5 c t c g a g a c c tc t a r ，i r a g a c t3 5 t c a c c a c c a c a g c c g a a a g3 5 g g t c a g c a a t g c c a g g g t a3 1 6 北京协和医学院硕士研究生论文 2 4 2p c r 扩增 p c r 扩增采用北京赛百盛生物公司的v t a q ，产物带有a 碱基末端，可用于t 载体连接，且产物保真度比普通t a q 要高，反应体系为： 超纯水 1 0 xb u f f e r v - t a q d n t p 上游引物 下游引物 模板 4 0 u l 5 u l 0 5 此 2 p l l 皿 l 旺 0 5 r t l p c r 扩增条件： 9 4 3m i n1 个循环 9 4 3 0s 1 5 4 3 0s孓2 8 个循环 7 2 1m i n j 7 2 1 0m i n1 个循环 4 f o r e v e r 反应结束后取样品3 p l ，加入l 此l o a d d i n gb u f f e r ，混匀后产物用1 5 琼脂糖 凝胶电泳检测。 2 5 琼脂糖凝胶回收 将鉴定结果正确的p c r 产物进行琼脂糖凝胶回收，步骤如下： 1 ，向吸附柱c a 2 中( 吸附柱放入收集管中) 加入5 0 0 i t l 平衡液b l ，1 2 0 0 0r p m 离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 2 ，将单一的目的d n a 条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重 量。 3 ，向胶块中加入3 倍体积溶胶液p n ；( 如凝胶重为0 1g ，其体积可视为1 0 0 止， 依此类推) 。5 0 水浴放置1 0 分钟，其问不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块 北京协和医学院硕士研究生论文 充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶 块完全溶解。 4 ，将上一步所得溶液加入一个吸附柱c a 2 中( 吸附柱放入收集管中) ，室温放 置2 分钟，1 2 0 0 0r p m 离心3 0 秒，