（园林植物与观赏园艺专业论文）珍珠黄杨的同工酶与ISSR指纹图谱分析.pdf

摘要 珍珠黄杨( b u x u ss i n i c av a r p a r v i f o ，地) 是我国特有的国家二级保护树种，因 其分布范围狭小，近年来又被大量挖掘作盆景栽培，资源已濒于绝灭，为了进一 步研究其亲缘关系，有效地保护和利用这一优良的种质资源，本文采用过氧化物 酶同工酶( p o d ) 标记技术和i s s r 标记技术，并辅以形态标记对选育出的珍珠 黄扬无性系进行指纹图谱分析，主要结论如下： 1 、珍珠黄杨各无性系经p o d 同工酶电泳后条带数少，只有4 条，并且多态 性不强，虽然能根据酶谱染色深浅来区别各个无性系，但是其可能受实验操作影 响较大，因此难以正确体现珍珠黄杨无性系之间的差异。 2 、为从珍珠黄杨幼叶中提取高质量的总d n a ，比较了4 种d n a 提取方法， 结果表明：2 ( w v ) 浓度的c t a b 提取缓冲液所提d n a 效果最好；并在此基 础上，以( c t ) 8 g 为引物，采用单因素实验法，确立了适合珍珠黄杨的i s s r p c r 反应体系：在总体积2 0j a ! 的反应体系中，含3 0 n g d n a 模板，2 0 m m o l lm 9 2 + ， 0 3 0g m o l l 引物，0 2 0m m o l ld n t p s ，1 uy a qd n a 酶。 3 、从1 0 0 条i s s r 引物中筛选出1 9 条多态性较强的引物，扩增出2 5 6 务条 带，其中2 1 1 条是多态带，多态率达到8 2 4 ，每条引物平均扩增出1 3 5 条条带。 其中引物u b c 8 4 8 扩增的结果显示每个供试材料的扩增条带都不一样，因此运用 这一引物就能将所有的供试材料区分开来。 4 、将同工酶标记的酶谱、i s s r 标记的聚类图，结合形态特征进行比较，采 用单一酶系试验( 过氧化物酶同工酶) 分析，其标记的数量比较有限，产生的多 态性不高，因而当珍珠黄杨无性系问的亲缘关系太近时，就表现出其局限性。而 i s s r 标记位点多，直接反映d n a 水平上的差异，利用i s s r 标记，可以更详细 地了解各个珍珠黄扬无性系间的差异、亲缘关系的远近。因此，认为i s s r 指纹 图谱比过氧化物酶同工酶指纹图谱更趋于合理与真实，更能准确体现各无性系试 材的亲缘关系。 关键词：珍珠黄杨元性系同工酶i s s r 指纹图谱 s t u d i e so nf i n g e r p r i n t i n go fc l o n e si nb u x u ss i n i c av a rp a r v i f o l i a b vt e c h n i q u e so fi s o z y m ea l l di s s rm a r k e r s a b s t r a c t b l a x “ss i n i cv a r p a r v j 厂0 “臼i so n eo fs t a t e p r o t e c t e dt r e e ss p e c i e s i t sd i s t r i b u t i o n r e g i o n sa r en a r r o w ，a n dm a n yo ft h e mw e r ed u gf o rp o t t e dl a n d s c a p ei nt h e r e c e n t y e a r s ，s ot h er e s o u r c e sa r ee n d a n g e r e d i no r d e r t os t u d yt h er e l a t i o n s h i po ft h e c l o n e s ，a n dt oe f f e c t i v e l yc o n s e r v ea n du t i l i z e t h e s u p e r i o rg e n e t i cr e s o u r c e s ， f i n g e r p r i n t so fc l o n e so fb s i n i c av a r j p a r v t f 。l i aw e r ea n a l y z e db yt e c h n i q u e so f i s o z y m ea n di s s rm a r k e r s ，a s s i s t a n t e dw i t hm o r p h o l o g i c a lm a r k e r si nt h i sp a p e r t h e m a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h ep e r o x i d a s ei s o z y m ep a t t e r n si n a n a l y z e db yp o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i s e a c hc l o n ec o u l db ed is t i n g u i s h e df r o mt h e i n f l u e n c e db yt h ef a 。t o f so fe n v i r o n m e n t s ， f r o n le a c ho t h e r c l o n e so fbs i n i cv a r p a r v i f o l i aw e r e a n do n l y4i s o z y m eb a n d sw e r ef o u n d d e g r e eo fd y e i n g ，b u tt h er e s u l t sw e r e w n * d lw o u l dn o te x a c t l yd i f f e rc l o n e s 2 t og e th i g h q u a l i t yd n af r o my o u n gl e a v e so fb s i n i cv a r p a r v i f o l i a ，f o u r d i f f e r e n td n a e x t r a c t i n gm e t h o d sw e r ec o m p a r e di nt h i sp a p e r t h er e s u l t ss h o w e d t h a t ：t h e2 c t a bw a st h eb e s tm e t h o dt og e th i g h q u a l i t yd n a b a s e do nt h i s ，t h e i s s r p c rr e a c t i o ns y s t e mw a so p t i m i z e dw i t hp r i m e r ( c t ) s gb yt h es i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t t h es y s t e mw a s ：3 0n gg e n o m i cd n a ，2 ，0 m m o l l m g ”，o ，3 0 9 m o l l p r i m e r ，o 2 0 m m o l l d n t p s ，iut a qp o l y m e r a s ew i t ht o t a l2 0 e lr e a c t i o ns o l u t i o n 3 n i n e t e e np o l y m o r p h i cp r i m e r sw e r es c r e e n e df r o m10 0p r i m e r s ，t h e r ew e r e 2 5 6r e p r o d u c i b l ea n dc l e a ra m p l i f i c a t i o np r o d u c t s ，2 1lo fw h i c hw e r ep o l y m o r p h i c ( 8 2 4 1 t h ea v e r a g en u m b e ro f d n a b a n d sa m p l i f i e db ye a c hp r i m e rw a s13 5 t h e d n a p r o f i l e sb a s e do nu b c 8 4 8h a v er e v e a l e dp o t e n t i a ld i a g n o s t i cf i n g e r p r i n t sa n d s p e c i f i cb a n d sf o re a c hc l o n e s 4 a s s i s t a n tw i t hm o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ，c l o n e so fb s i n i cv a r p a r v i f o t i aw e r e a n a i y z e db yi s o z y m em a r k e r sa n di s s rm a r k e r s ，i tw a s h a r df o rt h ei s o z y m em a r k e r s t or e v e a lt h ed i f f e r e n c e sa m o n gt h os ew i t hv e r yc l o s er e l a t i o n s h i ps i n c el a c ko f m a r k e r ss i t e st h es i n g l ee n z y m ec o u l da f f o r d w i t ha d e q u a t em a r ks i t e s ，t h e i s s r m a r k e ra n a l y s i sw a sc o m p e t e n tf o rp r e c i s er e v e a l i n gd i f f e r e n c e sa n dr e l a t i o n s h i p s a m o n gt h ec l o n e so fb s i n i cv a r p a r v f 南，妇s ot h ei s s rm a r k e r sm i g h tb eb e t t e ri n r e f l e c t i n gt h er e l a t i o n s h i po fc l o n e s k e y w o r d ：b u x u ss i n i c av a r p a r v i f o l i a ，c l o n e ，i s o z y m e ，i s s r ，f i n g e r p r i n t 本学位论文知识产权声明 本学位论文是在导师( 指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 文中所引用他人的研究成果均已注明出处。对本论文研究有所帮助的 人士在致谢中均已说明。 基于本学位论文研究所获得的研究成果的知识产权属于南京林 业大学。对本学位论文，南京林业大学有权进行交流、公开和使用。 喊蝼名：, 口- j 吾煎 引磴轧舫蚀 日j 胡：扣 - i ； 致谢 本论文是在季孔庶教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。从论文 的选题到实验设计，从实验的具体实施到论文的撰写和修改，都倾注 了导师的大量汗水和心血。回望三年的学习生涯，导师渊博的学识、 严谨的治学态度以及崇高的敬业精神令学生终生难忘和钦佩。 感谢国家林业局和江苏省林木遗传与基因工程重点实验室的王章 荣教授、黄敏仁教授、徐立安教授、诸葛强教授、李火根副教授在实 验和论文写作过程中所给予的热心指导和帮助。 实验室先进的实验设备和条件，浓厚的学术氛围为科研和学习创 造了良好的条件。实验过程中，本实验室黄焱、姜福星、吴小萍博士 及赵阿风、俞良亮、郭素敏、王鹏良、赵景奎、杨春霞、龚佳、李妲、 姜自红、赵志新、牛琳、孙志勇、毛桃、张小芹、王燕青、吕昭萍、 张薇、陈玮等硕士都提供了无私的帮助，在此对他们表示衷心的感谢! 值此论文完成之际，向三年来所有给予我关心帮助的老师、学友、 室友致以最诚挚的谢意! 感谢男友在我求学过程中所给予的方方面面关心与帮助! 最后，感谢我的父母和妹妹，感谢他们多年来的支持、理解和鼓 励。 作者：吕乐燕 第一章文献综述 珍珠黄杨( b u x u ss i n i c av a l p a r r i f o l i a ) 属于我国特有的国家二级保护珍贵树 种。因具有叶片密集、枝干苍劲、自然成型以及生长较慢、树型稳定等诸多优点， 是制作盆景、点缀山石、建造袖珍园林的极好材料，因而被园艺界公认为优秀的 盆景树种，具有较高的应用和观赏价值。自2 0 世纪7 0 年代发现珍珠黄杨以来，国 家对其采取了原生地针对性保护措施，但野生资源依然遭受到严重破坏。大量生 长了几十年乃至上百年的树木被偷盗。异地栽植的珍珠黄杨，由于突然改变了其 原生地的土壤、气候等特定自然环境，幸存者寥寥无几，种质资源近于灭绝的境 地。自1 9 8 9 年起经过长达1 4 年从高山至山脚再到平原3 个阶段的引种、驯化与繁 育，终于使珍珠黄杨这一濒临灭绝的珍贵树种，在完全保留了其原有形态特征的 前提下，逐步适应了栽培环境。 1 1 珍珠黄杨研究概况 1 1 1 珍珠黄杨的生物学特性、生态学习性 黄杨科属于泛热带成分，起源于古南大陆，分布遍及东西两半球的热带地区 及亚热带甚至温带，但分布中心或原始类型仍在热带范围内 1 1 。黄杨科全世界共 有4 属f b u x u s ，s a r c o c o c c a ，p a c h y s a n d r a ，n o t o b u x u s ) ，约1 0 0 种，生热带和温带i 2 j 。 除n o t o b u x u s ( 7 种) 见于非洲热带和非洲南部以及马达加斯加岛外，其余3 属，我 国均产；在我国已知有2 7 种左右。分布于西南部、西北部、中部、东南部，直 至台湾省。 黄杨属，本属约有7 0 余种。分布于亚洲、欧洲、热带非洲以及古巴、牙买加 等处。我国已知约1 7 种及几个亚种和变种，西自西藏，东至台湾，南达海南岛， 西北至甘肃南部均产，但主要分布于我国西部及西南部。 珍珠黄杨是黄杨( b u x u ss i n i c a ) 的变种 3 - 4 ，又名小叶黄杨、鱼鳞黄杨、鱼鳞 木。分枝密集，小枝节间长4 6 r a m ，小枝稍被短柔毛。叶椭圆形至宽卵形，长不 及1 c m ，宽5 - 7 r a m ，基都宽楔形，薄革质，上面无光泽，侧脉明显隆起，先端圆 或有小凹口，边缘下曲。花期5 月，花序多项生。果期9 月，蒴果近球形，长6 - 7 r a m ( 不包括花柱) ，无毛。 性喜温暖湿润，忌炎热干燥积水，耐荫，耐寒；喜微酸性肥土，忌盐碱。 产于江西庐山五老峰七星衡附近、福建崇安黄岗山、浙江龙荡山海拔1 6 0 0 m 、昌 化海拔1 7 0 0 m 、安徽大别山区潜山水吼岭海拔1 4 0 0 1 7 0 0 m 、天柱峰海拔1 2 0 0 1 6 0 0 m 、舒城晓天猪头尖海拔1 2 0 0 1 7 0 0 m 、歙县清凉峰海拔1 2 0 0 一1 7 2 0 m 、黄山 海拔6 0 0 一1 6 0 0 m 。生于溪边、松林或杂木林中，与安徽杜鹃( r h o d o d e n d r o n d n h w e i e ”s e ) 、毛叶石楠( p h o t i n i av i l l o s a ) 、日本椴( t i l i a j a p o n i c a ) 、大果冬青( h e x m a c r o c a r p a ) 、灯笼花( e n k i a n t h u sc h i n e n s i s ) 、黄山栎( q u e r c u ss t e w a r d i i ) 、黄山花 楸( s o r b u sa m a b i l i s ) 、天女花( m a g n o l i as i e b o l d i i ) 、天日琼花( v i b u r n u ms a r g e n t i i ) 等混 生，也有纯林分布p j 。 表1 1 华东地区黄杨科( n u x s c e a e ) 植物分布 t a b l e1 - 1t h ed i s t r i b u t i o no f b u x a c e a ei ne a s to f c h j f l a 中文种名拉丁学名 分布 黄杨属b u x u s 尖叶黄杨 ba e m u l a n s ( b s i n i c as s pa e m u l a n s ) 闽赣浙皖 雀舌黄杨占b o d i n i e r i闽赣浙沪皖 匙叶黄杨b h a r l a n d i 闽赣 大花黄杨bh e n r y i赣 大叶黄杨 b m e g i s t o p h ) ，l l a 赣 黄杨 b s i n i c a 佃m i c r o p h y l av a r s i n i c d j 闽赣浙沪苏皖 珍珠黄杨bs i n i c av a r p a r v i f o l i a赣浙沪皖 越橘叶黄杨 b ，m n i c av a r ，v a c c i n i i f o l i a赣 狭叶黄杨 b s t e n o p h y l l a 闽赣 板凳果属p a c h y s a n d r a 多毛板凳果pa x i l l a r i sv a r s t y l o s a ( p b o d i n i e r i )闽赣 顶花板凳果pt e r m i n a l i s赣浙皖沪 清香桂( 野扇花) 属 s a r c o c o e c a 东方野扇花 s o r i e n t a l t s 闽赣浙 野扇花 s r u s c i f o l i a ( s p a u c 讲o r a ) 赣沪 注：左上角带$ 代表人工栽培 1 1 2 黄杨属及珍珠黄杨当前的研究概况 目前，有关黄杨科黄杨属植物在扦插繁殖方面有大量的研究，且自花镜 开始，积累了丰富的经验。如b l y t h eek 等 6 1 对b u x u ss i n i c av a r i n s u l a r i sc v w i n t e r g r e e n 在有机促根平衡基质( 由泥炭和聚合胶组成) 中的生根情况作了研 究。f l o r i n c e s c ua 等【7j 在使用促根剂的情况下对b u x u ss e m p e r v i r e n sc v , g l o b o s a 的扦插繁殖作了研究。国内方面，罗风霞等【s 】对锦熟黄杨扦插繁殖技术作了较系 统的研究。颜宪武【9 】和宋凤梅等 i 0 1 都对黄杨扦插繁殖技术作了一定的研究。房伦 革等1 1 1 、姚雷d 2 1 和张石生等 1 分别对朝鲜黄杨和金叶瓜子黄杨扦插繁殖作了研 究。 另外关于黄杨属的研究多集中在甾体生物碱及其它一些方面。h o r m a e t x ek 等f 】4 1 在研究中认为在越冬光合作用受抑制情况下，锦熟黄杨通过光保护系统产 生类胡萝卜素的积累以来适应环境。m u s s e l w h i t es 等 1 5 1 研究了容器栽培的锦熟 黄杨一些品种的养分需求情况及评价了通过养分手段无法破除黄杨类的夏季休 眠。b a l t h a z a r m t l 6 】研究了黄杨科的典型属的花器的数目与结构以及开花与授粉 的生物学过程，并阐明了黄杨科的系统发育。 但目前关于珍珠黄杨的文献仅仅是对其生长特性及苗圃扦插繁殖的基本介绍 2 1 7 - 2 1 l 。发现用当年生半木质化枝条作插条，扦插最适时间为5 至8 月，株行距 为4 6 c m 左右等；用硬枝扦插则在新梢萌发前的早春进行，株距1 0 1 5 c m ， 有利于提高扦插成活率。黄焱等【2 2 】利用继代扦插得到的芽变材料针对树型、树 姿、新梢、芽叶等主要形态特征，对其种质资源进行了定性和定量描述，初步整理 出5 个无性系，为申报新品种和合理利用珍珠黄杨资源提供了依据。其它内容的 研究未见报道。 1 2 指纹图谱 生物指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的图谱，近年来多以分子水平 上的电泳图谱为主。这种电泳图谱多态性丰富，且具有高度的个体特异性和环境 稳定性，就像人的指纹一样，为个体所具有，因而被称为“指纹图谱”1 2 “。 指纹图谱目前主要有两种类型，一类是较早开始研究的蛋白质电泳指纹图 谱：另一类是9 0 年代之后发展起来的d n a 指纹图谱。 1 2 1 蛋白质电泳指纹图谱 蛋白质是植物基因表达的产物。当将蛋白质在凝胶上电泳时，不同品种表现 出不同的蛋白质谱带模式，以区分品种。蛋白质与形态性状、细胞学特征相比， 数量上更加丰富，受环境影响更小，能够更好地反映遗传多样性。而且通过蛋白 质电泳产生指纹图谱简便快速，通常只需l 一2 天就可完成检测工作。用作标记的 蛋白质通常分为贮藏蛋白( 可分为醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白、球蛋白等) 和同 工酶【2 ”。 1 2 1 1 同工酶概述 同工酶是具有相同催化功能而结构及理化与性质又不同的一类酶，其结构的 差异来自基因类型的差异，因此并不一定是同一基因的产物。每一酶的不同电泳 酶谱表现型可能是由不同基因引起的，也可能是同一基因座上的不同等位基因引 起的。 早在1 8 9 5 年，f i s c h e r 就提出了同工酶的概念，不同种类、不同器官和组织 起源的酶可作用于同一底物，催化相同的化学作用，但在其他性质方面可以不尽 相同。但是，由于人们对酶是蛋白质这点尚未取得一致和明确的认识，妨碍了人 们对同工酶的研究，直到二十世纪五十年代，人们对蛋白质的四级结构有了较清 楚的了解，为研究同工酶确立了牢固的理论基础。 1 9 5 7 年，m a r k e r t 和m o l l e r 发明了酶谱技术，即将淀粉凝胶电泳和组织化学 染色法相结合鉴定分离酶类。此技术首先成功地用于数种酯酶，以后又用于其它 几种酶，其中特别突出的就是乳酸脱氢酶【25 1 。7 0 年代以后，同工酶电泳技术开 始在植物研究中使用【2 “，由于同工酶是基因的产物，是基因表达的结果。同工 酶在结构上的差异主要来源于基因，同工酶谱是基因表达后分子水平的表型，研 究同工酶就有可能联系基因，基因表达和代谢、细胞和整体表型的关系。由于同 工酶结构的相似性反应了生物间的亲缘，并且同工酶分析能排除环境条件干扰， 定量分析分类群的变异和分化，因此同工酶分析可用于种的分类，酶谱资料可以 作为鉴定物种、研究分类、进化、遗传与变异的重要指标口卜2 8 】，其中又以过氧 化物酶同工酶( p o d 同工酶) 研究最广，因为它普遍存在于各种植物组织中， 易于提取和分离，又是一类比较稳定的同工酶【29 1 ，现在被广泛应用于小麦【3 0 1 、 苹果【3 1 1 、西番莲【32 1 、葡萄 33 1 、杨树3 4 】等植物。 但是，应该考虑到以p o d 为代表的同工酶遗传背景较为复杂，对于最终获 得的谱带需做十分认真和仔细的分析。因为同工酶的谱带是会因构成该酶多态数 目、编码基因位点数目及分析个体基因组成而有很大变化，因此，凝胶上的酶谱， 这种电泳表型既有它的遗传背景，也会受生理和人为等因素的影响，并不能直接 反映d n a 水平的情况。所以，进行特定遗传分析是酶电泳技术一个不可缺少的 步骤。 i 2 i 2 同工酶电泳技术的应用 1 ) 品种鉴定 同工酶特征可作为植物分类与亲缘关系探讨的重要指标，近几年来有关这方 面的报道较多。付桂荣等1 35 】对东北蒿属植物2 9 种、4 变种、1 变型进行了过氧 化物酶同工酶的研究。结果表明3 4 个样品中没有一条共有谱带，几乎每一个种的 酶谱都具有特异性，说明属内种间分化较大；酶谱数学聚类分析，找出了一些最不 相似的种，有明显的种的鉴定性。姜海英等【3 6 】测定禾本科植物狗尾草，看麦娘、 鹅观草、鸭嘴草、自顶早熟禾、罗汉竹、小麦、狗牙根、倭竹等9 种植物叶片的 过氧化物酶( p o d ) 和酯酶( e s t ) 同工酶，结果表明被测植物的p o d 相似系数在2 7 以上，e s t 相似系数在2 9 以上。就其亲缘关系来看，倭竹与罗汉竹关系最近， 其次鸭嘴草与自顶早熟禾的关系也较近。贾元义等p7 j 对1 8 个月季品种进行了过 氧化物酶同工酶测定，共检测出8 条谱带，对酶带作聚类分析，兼顾品种的形态特 征进行品种分类，将供试品种分成5 大类型。郭风根等【38 j 采用垂直板聚丙烯酰胺 凝胶电泳法分析了7 份云南紫苏地方品种的酯酶同工酶。结果表明，这7 份紫苏 品种存在着8 种酶谱类型，并且聚合成5 支，支持将云南省紫苏属植物分成回回 苏、紫苏、耳齿紫苏、野生紫苏和白苏5 个变种的观点。 2 ) 证实杂种和推断杂种亲本 与通常所用的形态学、染色体、地理分布和实验杂交等手段相比同工酶电泳 技术准确性更高。对任何一个类群来说，要么含有某个等位基因，要么不含有这 个等位基因，不存在形态性状中难以推断的中间性。因此，我们可以从每个等位 酶位点上来比较杂种和双亲所含的等位基因。只要双亲在某些位点上具有不同的 等位基因，我们就能对推测的亲子关系作出正确判断 3 9 1 。例如：黄苏珍等1 40 】对 鸢尾属植物进行了杂交育种，对亲本及f 1 代植株进行了同功酶的鉴定，鸢尾 ( z r i s t e c t o r u m ) 德国鸢尾( ，g e r m a n i c a ) d p 的杂种i z 2 得到了证实，并得到很好的 效果。徐秀芳等【4 l 】对6 种不同种类榛树叶中过氧化物酶( p o d ) 同工酶测定比较的 4 结果显示，杂交榛酶带特征与母本( 平榛) 接近，为探讨榛属植物的亲缘关系及种 类的区分提供了依据，也为榛树遗传基础的评价和杂交育种提供了参考资料。李 彦平等【4 2 j 利用远缘杂种8 6 1 lx17 q 与紫苏、h i c k s 与罗勒的杂交子代f 1 及其亲 本进行酯酶同工酶对照分析，结果表明：两杂交组合8 6 1 1 1 7 q 与紫苏、h i c k s 与罗勒杂交子代f 1 的酶谱特征主要偏向于母本烟草，在其酶谱中发现都含有双 亲同源的酶带和新增的双亲不含有的特异酶带，在h i c k s 与罗勒杂交组合子代酶 谱中还发现了缺失了其母本的a 1 ，c 3 酶带。此研究为远缘杂交种真伪鉴定提供一 种简单有效的方法。但由于蛋白质是基因的表达产物，产生的多态性不高，因而 当遗传基础越来越狭窄时，则表现出其局限性。随着d n a 分子标记的出现，d n a 分子标记技术开始被应用到品种分类领域中。 1 2 2d n a 指纹图谱 d n a 指纹图谱是指特定d n a 样品通过分子标记技术所显示的d n a 片段的 总称。由于d n a 指纹图谱直接反映d n a 水平上的差异，因而成为当今最先进 的遗传标记系统。d n a 指纹图谱技术主要有限制性片段长度多态性( 简称r f l p ) 技术；随机扩增多态性d a n ( 简称r a p d ) 技术；简单重复序列( 简称s s r ) 技术； 简单重复序列区间( 简称i s s r ) 技术；扩增片段长度多态性( 简称a f l p ) 技术等 【4 3 1 。 1 ) r f l p 指纹图谱 r f l p 是一种利用限制性酶切片段长度差异来检测生物个体之间差异的分子 标记技术。8 0 年代r f l p 开始应用于植物，目前在水稻、小麦、玉米、蕃茄和马 铃薯等作物上的研究都已有报道。但是，r f l p 的多态信息含量是相对而言的， 在一些作物上r f l p 探针可进行品种问及种间的鉴别，而在小麦、马铃薯、大豆 等作物上的多态性较低，因而r f l p 在指纹图谱中的应用受到限制。 2 ) r a p d 指纹图谱 r a p d 是w i l l a m s 【4 4 j 等在1 9 9 0 年发明的利用扩增d n a 片段长度差异来检测 生物个体的分子标记技术。它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对 其进行基因组指纹图谱的构建。这种方法相对于r f l p 来说比较简便，d n a 用 量也较少，且省去了使用放射性同位素，因而受到了许多学者的重视。广泛应用 于大豆【45 1 、棉花【4 6 1 、竹类【4 7 48 1 、玉米【4 9 】等，m cd o n a l d 5 0 1 对玉米、大豆、花生、 棉花、小麦进行r a p d 检测，结果认为r a p d 技术是鉴定品种纯度的有效方法。 v i l a n o v as 等【5 1 】用3 6 个随机引物检测3 3 个枇杷品种，结果发现2 2 个品种用一 种引物就可区分出来。但是r a p d 是显性标记，不能区分杂合型和纯合型，更重 要的是r a p d 扩增产物的重复性和稳定性差，受反应条件的影响很大，从而严重 影响实验结果的可靠性。 3 ) s s r 指纹图谱 s s r 是一类由几个核苷酸( 一般为1 5 ) 为重复单位组成的长达几十个核苷酸 的串联重复序列。s s r 具有r f l p 的遗传学优点，且避免了r f l p 方法中使用放射 5 性同位素的缺点，又比r a p d 重复率和可信度高，已经在许多研究领域展示出较 大的应用潜力，如基因组作图、群体和进化遗传研究、种质资源遗传多样性分析、 构建指纹图谱、品种鉴定和基因诊断研究等。聂永心等”2 j 从8 5 对s s r 引物中筛 选出7 2 对扩增产物具有稳定多态性的引物，进行玉米自交系遗传多样性分析，并 用于杂种优势群的划分。宛煜嵩等【53 】利用由大豆主栽种晋豆2 3 和农家种灰布支 ( z d d 2 3 1 5 ) 杂交培育的f 1 0 代大豆重组自交系群体j i n f ，共4 7 4 个家系作为作图 群体，依据1 9 9 9 年c r e g a n 等发表的大豆“公共图谱”，选用4 4 1 对s s r 引物，建 成了含有2 2 7 个s s r 座位的大豆s s r 连锁图，这是迄今为止最新的一张大豆“公共 图谱”。 4 ) i s s r 指纹图谱 i s s r 是一种新型分子标记，其原理是根据s s r 的特点，采用锚定s s r 策略， 即在s s r 序列的5 端或3 端加上2 4 个随机核苷酸，对简单重复序列间的遗传信息 进行多态性扩增的分子标记技术。由于其引物设计比s s r 简单，不需要知道s s r 两端的碱基序列，多态性高，重复性好，能够提供更多的信息，己在多种动植物 的种质鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究方面得到应用。d e l i a n w 等 5 4 1 采用i s s r 技术对中国西南地区翠柏的五个群体进行遗传多样性的研究，发 现它们的遗传多样性水平相当较低，这可能与它们的进化过程和小范围分布有 关。 5 ) a f l p 指纹图谱 a f l p 以p c r 为基础，实际上是r f l p 和p c r 相结合的一种方法。a f l p 可 以分析基因组较大的作物，多态性高，重复性强。利用放射性标记在变性的聚丙 烯酰胺凝胶上可检测到1 0 0 1 5 0 个扩增产物，因而适合于绘制品种的指纹图谱及 进行分类研究等工作。s e m e r i k o vv 等【55 】以嵩柳全同胞家系为材料，利用a f l p 技术和s o u t h e r n 杂交技术构建了一张柳树性别连锁遗传图谱，根据该图谱他们 认为嵩柳基因组中只有一个位点控制性别，没有性染色体重组。邸宏等 5 6 1 详细 阐述了a f l p 技术的原理、特点及其在马铃薯育种中进行包括遗传多样性分析， 构建高密度遗传连锁图，基因定位及克隆，d n a 指纹图谱分析等。 1 2 3 简单重复序列区间( i s s r ) 标记技术 1 2 3 1i s s r 标记技术的原理 i s s r 标记是一种基于微卫星序列发展起来的一种新技术，由加拿大蒙特利尔 大学的z i e t k i e w i c z 等【5 7 】于1 9 9 4 年提出。其基本原理是在57 端或37 端加上l 一4 个嘌岭或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列s s r 的一段基因组 d n a 序列进行扩增，然后进行电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置，来分 析不同样品问i s s r 标记的多态性。i s s r 引物通常为1 6 1 8 个碱基，其主体是2 4 个碱基组成的串联重复序列，然后在其57 端或3 端加上1 4 个锚定碱基，从而 保证i s s r 引物能够对s s r 之间的d n a 序列进行p c r 扩增。由于微卫星在 基因组中广泛分布，且等位变异特别丰富，因而i s s r 可以检测到高的多态，是 6 一种快速、可靠、可以提供有关基因组丰富信息的d n a 指纹技术。 1 2 3 2i s s r 标记技术的特点 1 ) 实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建基因文库、杂交和同位素显 示等步骤。 2 ) 扩增基因组d n a ，适用于任何富含s s r 重复单元和s s r 广泛分布的物种， 可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体间变异的信息。 3 ) 遗传多态性高，重复性好。i s s r 标记技术采用了较长的引物( 1 7 2 4 b p ) ，退 火温度较高，因此，引物具有更强的专一性，与模板结合的强度提高，降低了杂 带的干扰，随之提高了实验结果的可重复性。 4 ) i s s r 标记为显性标记，符合孟德尔遗传规律。 5 ) 无需知道任何靶标序列的s s r 背景信息。i s s r 标记技术在引物设计上比s s r 标记技术简单得多。不需要知道d n a 序列即可以用引物进行扩增，又可以揭示 比r f l p 、r a p d 和s s r 更多的多态性。 6 ) i s s r 标记技术结合了r a p d 和s s r 标记技术的优点，耗资少，模板d n a 用 量少。 1 2 3 3 与其它分子标记技术的比较 尽管r f l p 、r a p d 、s s r 、i s s r 和a f l p5 种分子标记在植物辅助育种、遗 传图谱构建、数量性状基因位点作图及种质资源遗传多样性研究上得到了广泛的 应用，但它们在实际应用上仍有各自的特点d “。 表1 2常用分子标记的特点比较 t a b l e1 2t h ec o m p a r i s o no fd i f f e r e n tm o l e c u l a rm a r k e r sc h a r a c t e r i s t i c s 7 对几种主要的分子标记技术进行比较( 表1 2 ) 可见，r f l p 和a f l p 技术虽 然克服了形态学鉴定及等位酶分析的局限性，但也存在着操作程序繁琐、工作量 大、费用高、需要特异性探针，尤其是同位素易造成污染，损害操作人员健康等 缺点，从而限制了它们在实践中的应用。而r a p d 在实际应用中也表现出不足， 稳定性较差，由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次得到的实 验结果不可能一致。而且它使用单引物，引物较短，因而，错配扩增产物较高。 s s r 尽管操作简单，微卫星探针具有高度的种属特异性，为理想的标记。但要预 先知道微卫星两翼序列信息才能设计引物，许多物种需要构建文库，而且研制开 发引物需要几个月的时间，设计这样的引物所花费的时间和成本是相当大的，虽 然它分析结果可靠但工作效率却较低。因而，不可能在大规模的遗传分析中广泛 应用。 而i s s r 标记的原理和操作简单，而且快速、灵敏度高，重复性好，可靠性 高，是显性遗传，成本低，所用试剂都比较便宜。该标记无需事先知道d n a 序 列，不用同位素，d n a 用量少，多态性十分丰富，稳定性好，重复性相对较高 等特点。所以本研究选择i s s r 作为研究的手段。 1 2 3 4i s s r 标记技术的应用 1 ) 品种鉴定 在同一物种的各个品种问存在大量的多态性标记，某一品种具有区别于其它 品种的独特性标记即一些特异性的d n a 片段，依靠这些特异性片段可以对品种 的真实性和种子的纯度进行鉴定。以往根据形态学、生理学、农艺性状、同工酶 标记进行鉴定分类，但基因型与环境互作使这些鉴定方法受到了许多限制，而分 子标记技术提供了更为有效的品种鉴定方法 5 9 1 。 目前，已有许多i s s r 标记在品种鉴定方面应用的报道，沈永宝等 6o 】采用i s s r 标记技术，仅用2 个i s s r 引物就将银杏1 3 个品种区分开来，鉴定效率和稳定性 明显优于r a p d 标记。王心宇等【6 1 】应用i s s r 标记技术对多态水平很低的小麦种 内指纹图谱构建做了初步研究。发现( a g ) n 、( a c ) 。、( t g ) 。等二核苷酸重复引物 类型在小麦中多态水平最高，能将亲缘关系很近的品种或品系区分开。f a n g d q 等【6 2 】用i s s r 标记技术能够正确区分柑橘属5 个种6 8 个品种。邱英雄等【63 j 进行 了乐昌含笑不同类型鉴定的i s s r p c r 分析，发现6 种类型乐昌含笑仅大叶稠密 型无特有条带，其它5 种类型能根据其特有条带可各自分开。宣继萍等 6 4 1 以富 士、长富2 、长富6 、红星、新世纪、美国8 号及凉香等7 个品种为试材，进行 了i s s r 分析，构建了这几个苹果品种的i s s r 指纹图谱。发现引物i s 0 6 1 可将富 士、长富2 与长富6 三个品种一一区分开；而i s 0 2 6 则能将富士、红星、新世 纪及美国8 号4 个品种相互区别开。初步证明利用i s s r 标记技术能很好地将不 同苹果品种鉴别出来。 2 ) 亲缘关系分析 在自然界中存在许多天然杂种，许多古老品种是突变或自然杂交得到的，其 亲本来源不明。i s s r 标记通过对d n a 序列的同源程度分析，可以为确定物种间 亲缘关系和进化地位提供佐证。汪岚等1 6 5 利用i s s r 技术对1 2 个莲藕品种进行了 d n a 多态性分析。从6 5 个随机引物中筛选出7 个引物扩增基因组d n a ，共获得9 1 条带，其中7 5 条为多态性标记，每个引物平均提供1 3 个标记信息。由u p m g a 方 法得到的聚类分析结果表明了1 2 个品种闻的亲缘关系，聚类结果与它们的系谱关 系非常吻合。刘晓莉等【66 】利用简单重复序列区间( i s s r ) 标记对1 0 种报春花的种 间变异进行了研究，结果表明：这l o 种报春花明显聚为三大类：即鄂报春，无粉头 序报春，灰岩报春聚为一类；滇北球花报春，报春花、欧报春聚为一类；香海仙 报春，橘红灯台报春，霞红灯台报春，海仙花聚为一类。其中第3 类与形态学分 类结果一致。并探讨了香海仙报春与海仙花的关系。l m sg 等 6 7 1 对苹果的4 1 个商 业品种进行i s s r 分析，用7 个引物就可把它们区分开来，品种间的相似系数在 o 7 1 0 9 2 范围内，很好地说明了它们之间的亲缘关系。李文红等1 6 引采用i s s r 标 记对龙须菜一个野生型群体和选育品系两个不同年代的栽培群体，进行了亲缘关 系分析，构建了龙须菜选育品系的指纹图谱。通过遗传距离聚类分析证明，龙须 菜选育品系与其青岛野生型亲缘关系很近。何予卿等【6 9 】利用i s s r 分子标记研究 了3 7 份栽培稻和野生稻的亲缘关系。聚类分析将3 7 份栽培稻和野生稻明显分为5 组，a a 型的普通野生稻和栽培稻遗传关系密切，而与非a a 型野生稻有一定亲缘 关系。 3 ) 遗传多样性分析 同一基因型在不同的环境条件下可发育出不同的形态或生理特征，而相同的 形态又可能涉及不同的基因型。表型变异如果没有经过遗传分析确证，严格地讲 不能称为遗传多样性。i s s r 是对物种的基因组多态性分析从而避免了环境和分 析位点的限制。k o c h e v aez 等 7 0 1 对3 4 个西红柿野生和栽培种进行i s s r 分析， 1 4 个引物共产生3 1 8 条带，种间多态率达9 5 6 ，从分子水平上很好地论述了种 间、种内以及品种闻的关系。刘勋成等 ”应用i s s r 分子标记技术对云南邱北、 易门、龙庆、双柏和浙江平湖5 个种源( 每种源1 9 个样本) 的榉树进行了遗传多 样性的研究。对5 个榉树种群遗传多样性的研究结果表明，邱北种群的遗传多样 性明显高于其他种群，该种群具有更加丰富的遗传基础，为了有效地对榉树的遗 传多样性施行保护，应重点加强对邱北种群的保护。冯富娟等【72 j 利用i s s r 技术 分析了长白山不同海拔高度红松的遗传分化，发现该地区红松的遗传多样性水平 呈现随海拔升高而降低的趋势。长白山不同海拔高度红松的变异主要来自群体 内；红松之间的遗传距离和垂直地理距离之间有明显的正相关性。s h u g u a n gj 等 【7 3 】对来自中国和澳大利亚的共1 0 个银叶树种群进行i s s r 分析，1 1 个引物共扩 增出1 7 3 条带，多态性达到9 3 1 ，研究结果表明，澳大利亚种群的遗传多样性 高于中国种群。x u e j u ng 等【7 4 】利用i s s r 技术对内蒙古濒危特有灌木四合木进 行遗传多样性的分析，研究表明，8 个现存种群遗传分化不高，遗传多样性处中 9 等水平。宾晓芸等【75 j 采用i s s r 分子标记对金花茶的4 个自然分布居群的1 2 6 份 样品遗传多样性水平进行了研究。结果表明：金花茶总的遗传多样性水平较高， 但金花茶居群内的遗传多样性相对较低。 4 ) 遗传连锁图谱构建 遗传连锁图谱是随着各类分子标记的发展而形成的现代育种观念，可