（高分子化学与物理专业论文）星型plga及其载药微球的制备与性能研究.pdf

摘要 摘要 本文以异辛酸亚锡( s n ( o c t ) i ) 为催化剂，以季戊四醇( p t o l ) 为多功能基 引发剂，采用本体熔融聚合法，制得了四臂星型聚合物聚乳酸一乙醇酸( p l g a ) 。 采用”cn m r 、粘度法、g p c 和d s c 等手段，对聚合物结构、相对分子量及其 分布，以及热性能进行表征。结果表明所得产物结构及分子量与设计值基本符 合，玻璃化转变温度( t g ) 随分子量的增加而升高。 分别以牛血清白蛋白( b s a ) 和黄体激素释放激素( l h r h ) 类似物为药物模 型，采用复乳法制得星型聚合物的载药微球。分别用扫描电镜( s e m ) 、傅立叶 红外光谱仪( i r ) 、紫外一可见分光光度计( u v ) 和圆二色谱仪( c d ) 对微球的 形态、结构、载药量和药物包埋率以及微球中b s a 活性进行表征。结果表明， 微球形状规则，有多孔结构，粒径约为8 0 1 5 0 hm ；微球的结构符合实验设计； 所制得b s a 微球的最大载药量和最大包埋率分别为6 7 5 1ug m g 微球和7 8 3 9 ，l h r h 类似物微球的载药量和包埋率都相对较小。微球载药量和包埋率与聚 合物链结构、相对分子量、以及聚合物和药物用量比有关，也受超声时间、搅 拌速度、内外水相及中油相的相对体积、以及水相中加盐等实验条件的影响。 初步判定本实验制备过程中的超声等手段，未使蛋白变性。 星型聚合物b s a 微球在p b s 缓冲溶液进行释放，3 7 h 左右释放完成。用扫描 电镜( s e m ) 观察微球释放前和释放后的形态差异。微球的b s a 释放行为受聚合 物分子量和聚合物用量等影响，突释不明显，最大释放程度可达8 0 以上。l h r h 类似物微球和线型聚合物b s a 微球未检测到药物释放。 关键词：星型p l g a ，载药微球，b s a ，l h r h a b s 订a c t a b s t r a c t t h e s t a r - s h a p e dp o l y ( 1 a c t i d e c o - 9 1 y c o l i d e )( p l g a ) w a ss y n t h e s i z e d v i am e r i n g - o p e n i i l gm e l t 证gp 0 1 y m e r i z a t i o n o f d ，l - 1 a c t i d e a n d g l y c 0 1 i d e ， w i m p e n t a e 删t o l ( p r i o l ) a sa nm u l t i f l 】“o n a li 1 1 i t i a t o ra n ds t a 】m o u s2 一e t h y lh e x a n o a t e a sac a 伽y s t t h ec h a i nc o m p o s “i o n so fp 0 1 y m e r sw e r ec h 盯a c t e r i z e db y1 j cn m r t h e m l a lp m p e r t i e s ，m o l e c u l a rw e i g h ta i l dp 0 1 y d i s p e r s i t yi n d e xw e r ed e t e 玎n i n e db y d i 脑e n t i a ls c a n n 协gc a l o r i m e t e r ( d s c ) ，v i s c o s 姆m e m o da n dg e lp e r n l e a t i o n c l l r o m a t o g r a p h y ( g p c ) 1 1 1 er e s l l l t ss h o w e d 恤tm eo b 诅i n e d 咖呲ea n dm o l e c u l a r w e i g h tw e r eb a s i c a l l y i 1 1a c c o r d 诎ht h ep r e - d e s i g n ，a n dt h e g l a s s - t r a n s i t i o n t 锄p e r a t u r e ( t g ) i n c r e a s e da s 幽em o l e c u l a r 、v e i g h ti n c r e a s i i l g b o v i n es e m ma l b 哪i n ( b s a ) l o a d e da n dl u t e i i l i z i i l gh o m o n er e l e a s i n gh o m o n e ( l h r h ) a i l a l o g l l el o a d e dm i c r o s p h e r e sw e r ef a b r i c a t e du s i n gs t 褂s h 印e dp l g ab ya w o wd o u b l ee m l s i o ns o l v e n te v a p o r a t i o nm e 血o d t h em o r p h o l o g ya n ds t m c t 【l i 。e o f m em i c r o s p h e r e sw e r ec h a r a c t 耐z e db ys c a n i l i n ge l e c t r o nm i c m s c o p y ( s e m ) a i l d f o 嘶e r - t r a n s f o n nds p e c t r o s c o p y ( i r ) 1 1 1 ep a r t i c l es i z eo ft l l ep l g a m i c r o s p h e r e sw a s a b o u t8 0 1 5 0 m t h el o a d i n gc 印a c 时a i l de n c a p s u l a t i o n e 伍c i e n c yo ft h cd r u gw e r cd c t e m 血e db yu l t r a o l c ts p e c 订o m e t c r ( u v ) i tw a s f o u n dt h a tt l l el o a d i i 培c 印a c i t y 姐de c a p s u l a t i o ne m c i e l l c yw e r ci n n u e i l c e db ym e t y p eo fp 0 1 y m e r ( c h a i ns 协l c t l l r ea n dm 0 1 e c u l a rw e i g h t ) a 1 1 dt h er a t i oo ft h ep o l y m e r t od n l g ，a sw e na ss o m ee x p e r i m e mc o n d i t i o n s ，s u c ha ss t i r r i n gs p e e d ，s o n i c a t i o n t i m e ，v 0 1 l l m e 枷oo fw a t e r _ p h a s e st oo i l p h a s e ，a d d i n gs a l ti n t o 恤r - p h a s e s ，a n ds o o n t h em a ) 【i m u ml o a d i n gc 印a c 时a n de n c a p s u l a t i o ne 伍c i e n c yo fb s al o a d e d m i c m s p h e r e sw e r e6 7 51 “( m gm i c r o s p h e r e s ) 戤l d7 8 - 3 9 ，r e s p e c t i v e l yr e l a t i v e l y l o wl o a d i n gc 印a c 蚵a i l de n c a p s u l a t i o ne 伍c i e n c yw e r eo b t a i n e df o rl h r h a n a l o g u e 1 0 a d e dm i c r o s p h e r e s nw a sp 血n a m yd e m o n s t r a t e dt h a tb s an l a i m a i n e da c t i v ei n m i c r o s p h e r e sv i ac i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t m m ( c d ) i nv i t mr e l e a s ea n a l y s e so fm i c r o s p h e r e sw e r ec a r r i e do mi np h o s p h a t eb u 邱叮s a l i n e ( p b s ) t h er e l e a s ep m 丘l e so fb s al a s t e d f o ra b o u t3 7 h t h er r l o r p h o l o g i c a l i i a b s t r a c t c o m p a r i s o no fm i c m s p h c r e sb e f o r ea n da f t e rr e l e a s ew a ss h o w e db ys e m d m g r e l e a s ep r o f i l e sc a nb ea f r e c t e db yp 0 1 y m e r si n o l e c u l a rw e i g h ta n dt h er a t i oo f p 0 1 y m e rt od m g t h em a ) 【i m u mr e l e a s ep e r c e n t a g ew a sa b o v e8 0 b u tt h e r ew e r e n od r u gr e l e a s ed e t e c t e df o rb s al o a d e dm i c r 0 啦! e r e s 糊m c a t e d1 i t hl i n e a rp l g a a n dl h i 出a n a l o g u el o a d e dm i c r o s p h e r e s k e yw o r d s ：s t 扑s h a p e dp l g ad m g1 0 a d e dm i c r o s p h e r eb s al h r h i i i 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含 任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：刎自强 砷6 年岁月 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位做作者虢例确 6 年y 月( 7 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 第一章绪论 第一章绪论 第一节生物可降解高分子p l g a 的研究 1 1 1 高分子材料在药物制剂中的应用 在药物制剂领域中，高分子材料的应用有着久远的历史。远古时代人类在 谋求生存和与疾病斗争的过程中，就开始广泛地利用天然动植物来源的高分子 材料，如淀粉、多糖、蛋白质、胶质等作为传统药物制剂的粘合剂、赋形剂、 助悬剂、乳化剂等。上世纪三十年代以后，合成的高分子材料大量涌现，如聚 脂类、聚丙烯酸树脂类、聚酰胺等，在药物的研究和生产中的应用日益广泛。 可以说任何一种剂型都需要利用高分子材料，而且每一种适宜的高分子材料的 应用都使制剂的内在质量或外在质量得到提高。 上世纪六十年代开始，大量新型高分子材料进入药物制剂领域，推动了药 物缓控释剂型的发展。这些高分子材料以不同方式组合到药物制剂中，起到控制 药物的释放速率、释放时间以及释放部位的作用。 在缓控释制剂中，高分子材料几乎成了药物在传递、渗透过程中不可分割 的组成部分。与以往的常规剂型如片剂、胶囊、注射剂比较，利用高分子材料 制各的缓控释制剂的主要优点是：能够控制药物的释放速度以达到长效药物 治疗的作用，减少给药次数，改善患者的顺应性；减少血药浓度的峰谷现象， 降低毒副作用，提高疗效；增加药物治疗的稳定性，改变给药途径；增加 药物的靶向性；掩盖药物的不良口味，防止药物在胃内失活。由于这些优点， 缓控释制剂被称为继常规制剂后的第二代和第三代药物制剂，是目前发展最快， 产业化水平最高的新型药物制剂【1 。 1 1 2 生物可降解聚合物的应用 1 1 2 1 概述 生物可降解聚合物是指一些能够在水、酶作用下降解的高分子材料，它们 l 第一章绪论 作为微球、毫微球的骨架材料，在生物大分子药物的非注射途径给药制剂和长 效注射剂领域中都得到广泛、成功的应用。 用于制备微球的载体材料可分为天然的、半合成的或合成的高分子材料。 天然的高分子材料有明胶、阿拉伯胶、海藻酸盐、壳聚糖等，因为他们具有稳 定、无毒、成球性好等特点，所以是比较常用的载体材料。半合成高分子材料 多为纤维素衍生物类，如羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟甲基纤 维素等。其特点是毒性小、黏度大、成盐后溶解度大。合成高分子材料可分为 非生物降解的和可生物降解的两类。近年来，可生物降解并可生物吸收的材料 受到普遍重视和广泛应用。如聚乳酸( p l o vl a c t i ca c i d ，p l a ) 、聚乳酸一乙醇酸 共聚物( p o l y1 a c t i c c o g l y c o l i ca c i d ，p l g a ) 、聚乳酸一聚乙二醇共聚物( p o l y1 a c t i c a c i d c o - e t h y l e n e9 1 y c o l ，p l e g ) 、聚氰基丙烯酸烷酯( p 0 1 ya l k y l c y a n o a c r y l a t e ， p a c a ) 、聚己内酯( p o l y c a p r o l a c t o n ，p c l ) 、聚羟丁酸( p o l yh y d r o x y b u t ”a t e ，p h b ) 等，其特点是无毒、成球性好、化学稳定性高，可用于注射。目前用于制备多 肽或蛋白类药物的微球材料主要是生物可降解材料。 p l a 和p l g a 的降解主要为骨架溶蚀( b u l ke r o s i o n ) ，即整个骨架中的聚 合物分子同时降解，多用于制各微球。通过调节聚合物种类、分子量、晶型、 共聚物中单体的摩尔比、微球粒径、微球表面状态及内部结构、药物的水溶性、 药物含量等，可以达到缓释或控释的目的 2 。药物的控制释放就是将药物或其他 生物活性组织和基材结合在一起，使药物通过扩散等方式在一定时间内，以恒 定速率释放到环境中。p l g a 等聚合物可以根据药物的性质、释放要求及给药途 径，制成特定的药物剂型。目前研究热点是制备较为复杂的能有效控释、能靶 向治疗的威力化药物制剂，如层状微粒、微球、微囊和纳米微粒等。 1 1 2 2p l g a 在缓释制剂研究中的应用 p l g a 微球用于制备生物可降解型缓控释或定向给药体系已经研究了近3 0 年，是国内外研究的热点。p l g a 无刺激、无毒、无致癌性，具有生物相容性 和生物降解性，在体内能完全降解为乳酸和乙酸，再经过三羧酸循环转化为水 和二氧化碳排至体外，因此在医药领域中应用极为广泛【3 】。目前，p l g a 生物降 解材料己被f d a 批准用于药物输送系统，该辅料大大改进了药物的输送方法， 延长了药物释放时间，使药物达到了可控释放，因而提高了药效，保证了机体 的安全【4j 。p l g a 微球体系能够控制微球大小、延缓药物降解、延长药物释放时 2 第一章绪论 问、靶向释放、降低药物毒性和刺激性等。国内外大批的科研工作者们正在已 做工作的基础上，继续开发研究该类生物降解型微球，希望可以按照应用环境 要求的机械性能和降解速度进行聚合物的分子设计，从而推出更为优良的 p l g a ，使其更广泛地应用于生物医学领域。 有关p l a 和p l g a 的研究国内外己有大量的论文和报告，以p l a 或p l g a 为载体材料制备的微球已用于包裹避孕药，小分子药物( 如抗癌药、抗生素、 抗疟药和麻醉拮抗剂等) ，多肽和蛋白质生物大分子药物以及疫苗等。目前研究 最多的是多肽和蛋白质生物大分子药物以及疫苗微球的研制。段宏等”】运用 p l g a 制备了碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 缓释微球，结果发现，b f g f p l g a 微球通过较长时间持续释放活性b f g f ，明显促进成骨细胞增殖和分化。郝国荣 等【6 】运用p l g a 制备了缓释破伤风类毒素微球，免疫小鼠后其产生的免疫应答明 显优于铝佐剂疫苗，可长时间维持较高的免疫应答。采用p l g a 制备的纳米球 既可作为理想的静脉注射的药物载体，又可用作缓释、靶向注射剂并保护药物l 。 通过调整微球制各的工艺参数可以制备粒径符合要求的纳米球。n i w a 等【8 j 用自 动乳化溶剂扩散法制各了消炎痛和5 一氟尿嘧啶纳米球，将药物和p l g a 溶解在 丙酮和二氯甲烷的混合溶液中，用高速离心机与p v a 溶液乳化形成水包油型乳 剂，丙酮迅速扩散进入水相，使得聚合物膜在乳滴表面迅速沉积而形成小于 5 0 0 n m 的纳米球。 p l g a 还可以用于制各植入剂，并且采用皮下植入方式给药，药物很容易到 达体循环j 因此其生物利用度高。另外，通过控释制剂给药，给药剂量比较低、 吸收速率比较均匀，血药水平比较平稳且持续时间可达数月甚至数年【7 】。但是用 p l g a 制备的植入剂，在给药时需要在植入部位做一个切口，很多患者难以接受， 人们更倾向于使用经皮下注射或肌内注射给药的新型植入剂。 1 1 2 3 星型p l g a 的研究进展 相比单一的线型高分子，越来越多的研究者将兴趣投向支化、星型、树枝 状等等预先设计形状的高分子，发现这些支化结构带来了许多物理、化学、生 物等性能的改善。 a b r e i t e n b a c h 等人【1 1 将p l g a 接枝到聚乙烯醇主链上得到生物可降解梳型 聚酯。yl i 等1 1 2 ，” ，将p l a 或p l g a 接枝到电荷修饰的、亲水性右旋糖苷主链 上得到刷型共聚物。并研究了其亲水性高分子的控释作用。 第一章绪论 b j e o n 叫等人成功合成出一种新型以聚醚酯为基础的星型热塑性生物可 降解水凝胶聚合物( t h e m o p l a s t i cb i o d e g r a d a b l eh y d r o g e l ，简称t b h ) 。北京大学 冯新德等人i l ”】利用不同的引发剂和连续开环聚合，得到了两种星型的乙醇酸 一乳酸共聚物。他们先以辛酸亚锡为催化剂，以多官能团的三羟基甲基丙烷或 季戊四醇为引发剂，将乙丙交酯开环聚合，得到星型的乙醇酸一乳酸的交替共 聚物( 数均分子质量为6 8 0 0 ) ：再以之为大分子引发剂，同样辛酸亚锡催化，就 合成了相对分子质量更大的星型聚合物。 经b j e o n g 等人研究发现，星型高聚物同线型高聚物相比具有更好的人体内 生物相容性、更大的载药量、更加优越的生物可降解性和更好的工艺可加工性。 也因此提供了一种更为优越的非经肠道药物植入方法。 1 1 2 4p l g a 的应用前景 生物医学的迅速发展需要越来越多的新型生物材料满足l 临床的需要，生物 材料的不断提高与更新也促使这方面的研究工作得到相应的发展。p l g a 具有良 好的生物降解性和生物相容性，可广泛应用与生物医学组织工程，如生物体吸 收缝合材料、组织工程材料、药物控制释放体系等。 在生物体可吸收缝合材料的研究中，p l g a 等可降解生物材料越来越受到广 大医学工作者和患者的关注。在各种外科手术和整形美容手术的缝合中，采用 p l g a 等材料作为缝合线，缝合后无需手术拆除，减少了患者的痛苦。p l g a 材 料具有生物相容性，无机体排斥反应，最大的优势是可以在体内被逐渐降解， 在伤口不断愈合的过程中就可以被彻底降解和清除。 p l g a 也是目前应用较为广泛的组织工程支架材料之一，已在骨、软骨、 肌腱、气管、皮肤、肝、心瓣、血管、角膜、胰及神经组织工程中被广泛应用。 骨组织工程由于在临床应用上具有广阔的前景，始终都是组织工程的重点研究 对象。p l g a 在组织工程的研究中主要用于细胞传输，在软骨的构建、组织工程 化骨、组织工程肌腱的构建和组织工程化周围神经的构建等方面均有大量的应 用。随着材料科学的不断发展，p l g a 在骨科领域中将是一种极有前途的骨组织 工程细胞生长载体材料，在皮肤组织和血管组织工程中也必将有广阔的应用前 景。 p l g a 在药物缓控释体系的研究中，用于制备蛋白质、多肽类药物的可降解 埋植剂、注射微球和纳米粒，已经研究了近三十年。在各种缓控释微球的制备 4 第一章绪论 过程中，可以根据药物的性质、给药途径和释药时间，选用不同的p l g a ，采 用相应的制备工艺，通过调整p l g a 的组成、分子量、载药量及粒径的大小等 因素，来控制药物达到不同的释放模型。还可以通过p l g a 优选药物的输送系 统，从而获得药物的新剂型，这在医药学发展迅速的2 1 世纪有着很重要的意义。 p l g a 作为外科手术缝合材料、组织工程材料和药物载体均有着无可比拟的 优点，由此相信，研究开发p l g a 新制剂与新剂型将会有非常广阔的应用前景。 第二节药物缓释剂型的研究 随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现，其基本剂型是 冻干剂。常规制剂尽管其疗效早为临床所证实，但由于半衰期短，需要长期频 繁注射给药，从患者的心理与经济负担角度看，这些都是难以接受的问题。为 此，各国学者主要从两方面着手研究方便合理的给药途径和新制剂：埋植剂和 缓释注射剂；非注射剂型，如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药 等。 从近年来的发展趋势来看，缓释生物技术药物的注射制剂是很有应用前景 的新剂型。多肽、蛋白质药物缓释制剂的研究与开发，从发展过程及剂型看， 主要分埋植剂和微球注射剂两大类【1 8 】。 1 2 1 埋植剂 1 2 1 1 细棒型埋植剂 细棒型埋植剂外形为一空心微型细棒，一头封闭，另一头开口，棒材为聚 四氟乙烯等非生物降解聚合物，腔内灌入药物与硅胶的混合物。医生通过手术 将埋植剂埋入人体皮下，药物通过硅胶基质开口处缓慢释放，药物释放完后再 经手术取出【1 9 】。 1 2 1 2 微型渗透泵埋植剂 美国a 1 z a 公司2 0 世纪7 0 年代开发了外形像胶囊的埋植剂，该制剂埋植于 皮下或其它部分，体液可渗透过外壳，溶解夹层电解层，使体积膨胀的夹层压 向塑性内腔，促使药物溶液从开口定速释放。有不少生物大分子药物作为模型 第一章绪论 药物的动物体内外研究报道，如胰岛素、肝素、神经生长因子等。 埋植剂对需要长期用药的慢性患者的治疗具有积极的意义，但它存在以下 缺陷：必须经手术途径植入。制剂骨架材料为非生物降解聚合物，释药结 束后还需经手术取出。制剂在局部组织有刺激与不适感。 1 2 1 3 可注射的埋植剂 可生物降解聚合物作为注射型缓释制剂骨架是近3 0 年来国内外学者主要的 研究方向之一，合成聚合物更成为研究热点。合成聚合物理化性质稳定，控制 工艺条件可得到所需规格，批间质量差异小，这些都是天然聚合物无法比拟的 优点川。 z e n i c a 公司研制成功商品名为z 0 1 a d e x 的可注射埋植剂，将多肽药物戈舍瑞 林( g o s e r e l i n ) 与p l g a 在熔融状态混匀后经一多孔装置挤出，挤出物直径为l m m ， 经切割成一定长度的条状物，单剂量3 6 m g ，灭菌后直接密封于一次性注射器内。 该制剂可直接注射于皮下或肌内，基质在体内可逐渐降解，不需要手术植入和 取出，大大减轻了患者的痛苦和经济负担。 1 2 2 微球注射剂 可降解埋植剂有一定的自身缺陷，随着酸性降解产物( 乳酸、羟乙酸) 在埋植 剂内部的逐渐蓄积，多肽、蛋白质的稳定性可能会受到影响，故近来研究重点 转向注射微球。 1 2 2 1 多肽微球注射剂 采用生物可降解聚合物，特别是p l g a 为骨架材料，包裹多肽、蛋白质药 物制成可注射微球剂，使药物在体内达到缓释目的，是近1 0 多年来各国学者致 力研究的新领域。在诸多多肽缓释注射剂中，l l r h 类似物微球是最为成功的研 究品种阮23 1 。其它多肽缓释微球注射剂的研究也有不少报道，例如胰岛素、神经 生长因子、内皮生长因子、转化生长因子一b 等。 1 2 2 2 疫苗微球注射剂f 2 4 】 传统的免疫方法是经过疫苗初次注射后，在一定时间内，再进行多次加强 注射，使人体获得尽可能高的抗体水平，发挥可靠的免疫作用，但是这对成千 6 第一章绪论 上万人的大规模免疫是难以实现的，特别对条件较差的发展中国家更为艰巨。 采用微囊化技术将疫苗或佐剂包裹在可生物降解的聚合物中，一次注射后，抗 原在体内连续释放数周甚至数月，由此产生持续的高抗体水平，甚至可相当于 疫苗多次注射的脉冲模式释药。此种剂型称为一次性注射疫苗( s i n 9 1 ed o s e v a c c i n e ) ，成为l 临床免疫应用中具有巨大实用意义的新剂型。 综上所述，可注射微球药物制剂除具有可靠的缓释效果外，由于其骨架材 料的可生物降解性，改善了埋植剂必须经手术途径植入与取出、局部刺激性与 不适等问题。用微囊化技术制备多肽、蛋白质药物的可注射微球，是生物技术 药物研究和应用中十分重要的发展方向。 第三节药物缓释微球制备方法的研究 近2 0 多年来，采用可降解聚合物，特别是p l g a 为骨架材料，包裹多肽、 蛋白质药物制成可注射微球剂，使其在体内达到缓释目的，是各国学者大力研 究的新领域。现在最为常用的微球制备方法有溶剂蒸发法、相分离法、喷雾干 燥法和超临界流体技术。 1 3 1 溶剂蒸发法随2 6 该方法是从乳状液中除去挥发性溶剂用以制备微球的方法。在包埋多肽和 蛋白质类的亲水性药物时，根据聚合物溶液和水溶液形成乳状液的类型，分为 水包油法( o w 法) 、油包油法( 0 0 法) 和复乳法( 又称为水包油包水法或w o w 法) 。 o w 法是将药物成分悬浮于或者溶解于含聚合物的有机溶剂系统中，再将 溶解有聚合物的有机溶剂分散至大量的含乳化剂( 如聚乙烯醇，p v a ) 的水溶液 中进行乳化，形成o w 型乳状液，在不断搅拌下，有机溶剂挥发，形成聚合物 微球。这种方法制备微球时，亲水性强的多肽和蛋白质药物容易从内油相扩散 至外水相中，致使载药量低、突释效应强。 o o 法是一种无水系统，是将含有聚合物的有机溶剂相与不相溶的油相进 行乳化的一种方法。常用于溶解药物的为一种水不溶性的有机溶剂( 如丙酮) ， 然后将该溶液分散于另一种油相中，如矿物油，其中可以加入适当的表面活性 第一章绪论 剂，例如司班，经过乳化后就得到了o 0 乳液。该乳液再经蒸发法或者萃取法 去除微滴中的有机溶剂，经正庚烷洗涤去除油相，即得到最终的药物微球。 w o w 法是目前制备水溶性多肽、蛋白质药物微球最常用的方法，有载药 量高、蛋白质稳定性好、药物易于释放等优点。制备过程是先将药物溶于缓冲 液或者水溶液中，然后将该溶液加入到含有p l g a 和或p l a 的二氯甲烷溶液中， 剧烈搅拌以制备w 0 初乳。将初乳温和地加入含有乳化剂( 如p v a ) 的大量的 外水相中，制备得到w o w 复乳。然后采用蒸发法或者萃取法去除乳液中的有 机溶剂后固化成球“。 v a p o r 砒b a n b v o m & t m t z m 图1 1 复乳法图示 通过选择不同的有机溶剂、扩散介质、聚合物种类、乳化方式以及调节各 相体积比、离子强度等条件，可制备不同粒径大小及分布、形态、载药量及体外 释放的微球。侯宗柳等采用溶剂蒸发技术制备了甲肝减毒活疫苗p l g a 微球， 微球口服免疫恒河猴后能诱导产生一定保护力的免疫应答。m e n gf t 等采用 w 0 w 复乳法制备牛血红蛋白( b h b ) p e l a 微球获得较好的免疫效果。 1 - 3 2 相分离法2 5 - 2 6 ，3 1 ，3 2 该法是先将药物以固体或乳滴形式分散于p l g a 的有机溶剂中，为凝聚核， 再向该溶液中加入相分离试剂，使p l g a 因溶解度降低而析出，析出的同时将 药物包裹于其中，然后在搅拌条件下使油滴硬化，形成良好的球形。此方法为 8 第一章绪论 非水溶剂法，既适合水溶性药物又适宜脂溶性药物的包埋。主要存在的问题是 需用大量的有机溶剂。1 1 1 0 m a s i nc 等采用相分离技术制备了p l g a 微球，结 果发现共聚物、有机溶剂以及凝聚剂之间的相互作用是影响微球制备的主要因 素。搅拌速度、温度、聚合物浓度等也都会影响微球的包封率及微球的大小。 13 3 喷雾干燥法2 5 ，2 6 3 4 喷雾干燥法是一种迅速、简便、条件温和、受药物和聚合物的溶解度参数 影响较小的方法。可用于固态或液态药物的微囊化，粒径范围为6 0 0um 以下。 喷雾干燥法需要使用特殊的喷雾干燥设备，在喷雾干燥时，只需要将混悬有药 物的p l g a 溶液从喷枪中喷出，即可以获得成形的微球产品。而且可以通过调 节喷雾干燥设备的参数，例如喷枪口径、喷射压力等，方便地控制微球的大小。 但是在喷雾干燥法中，微球与喷雾干燥装置的内壁粘复，严重影响微球收率， 并且容易引起微球聚集。许多研究者们针对这一问题，提出了很多切实可行的 解决办法，例如双喷嘴喷雾干燥法和低温冷冻喷雾干燥法等。 该法中，不同喷雾条件所获得蛋白质的稳定性不同，这与所用仪器设备有 关。减小微球直径能减少蛋白质微球的突释效应【3 ”。制备过程中使用无水溶剂， 避免了油水界面对蛋白质的影响，但在喷雾过程中蛋白质接触的气液界面同样 影响其稳定性，所以在制备过程中须加入各种稳定剂。k a r e ng 口6 】以海藻糖为稳 定剂，采用喷雾冷冻干燥法制备了b s a p l g a 微球，经傅立叶变换红外光谱 仪追踪检测发现，在制备过程中b s a 的二级结构没有发生变化，所得微球突释 量少，具有长期缓释效果。 1 3 4 超临界流体技术 超临界流体技术是最近发展起来的一门新兴技术，在颗粒和微球制备方面 的应用正处于研究开发阶段，其主要优点有以下几个方面：其使用的c 0 2 超 临界流体安全、无毒、无污染，被称为“绿色工艺”；生产过程温和，适用于 热敏性、怕撞击、易改变的生物活性药物( 如蛋白质) 的微粉化和控缓释微球 的制各；生产条件易控，可方便得到亚微米级、纳米级的均匀颗粒，改变生 产条件，可控制粒径范围。正是由于超临界流体技术具有这些优点，近年来， 其研究正日渐深入，并逐渐向产业化发展。 9 第一章绪论 超临界流体技术中较普遍应用的是超i f 右界流体快速膨胀法和超l 临界反溶剂 法。前者适用于任何能形成超? 临界溶液的溶剂一溶质体系，是将溶质直接溶于 超临界流体中形成超临界溶液体系，在膨胀过程中，压力、温度的突然降低使 溶质溶解度降低，形成过饱和溶液，析出大量微粒。由于此过程在瞬间完成， 因此整个流体均匀成核，形成平均粒径小而均匀的微粒。m a t s u y a m a 等例利用非 溶剂的该方法制备了聚酯微球，该方法能避免传统的用甲苯、二甲苯做有机溶 剂对环境的污染，制备的聚酯微球光滑、均匀( 1 3um ) ，可通过调节聚合物 浓度、预膨胀压力及温度等控制微粒的粒径大小。 第四节血清白蛋白及l h 刚类似物的研究 1 4 1 血清白蛋白 生命活动涉及到许许多多种物质的参与、相互作用和转化，其中最重要、 最基本的物质当属核酸与蛋白质等生物大分子。核酸在生物体内的含量虽少， 但携带着生命活动一切必要的遗传信息。蛋白质在体内的含量比核酸大的多， 不仅量大，而且种类繁多，生物体就是靠种类繁多的蛋白质来完成其生物功能 的。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，容易较大量、高纯度地制备， 为研究蛋白质的理化性质、生物学功能、在体内代谢、临床应用及作为药物载 体等方面提供了极好的蛋白质样品【3 8 】。 1 4 1 1 血清白蛋白的结构 蛋白质分子有不同的结构层次：一级结构，二级结构，超二级结构，结构域， 三级结构，四级结构。 蛋白质的一级结构是指肽链中的氨基酸序列陬40 1 。一级结构决定高级结构， 决定蛋白质的生物学功能。从4 0 年代起，许多研究者就致力于白蛋白氨基酸序 列的测定。但直到7 0 年代末才对牛血清白蛋白( b s a ) 、人血清白蛋白( h s a ) ，鼠 血清白蛋白( r s a ) 的氨基酸序列基本弄清楚。 其中b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其中含有2 7 个苯丙 氨酸( p h e ) ，1 9 个酪氨酸( t y r ) 和2 个色氨酸( t r p ) ，分子量为6 7 ，0 0 0 ，其 氨基酸序列与h s a 非常类似。与h s a 不同的是，b s a 在1 3 4 及2 1 2 位上都含有 1 0 第一章绪论 一个色氨酸残基( t r p ) 。 蛋白质二级结构是指多肽链骨架中靠氢键维持的局部的有规则的构象，如 a 一螺旋、31 0 一螺旋、兀一螺旋、b 一折叠、b 一转角以及三股螺旋等，还 包括无规则卷曲以及非氢键维系的规则结构和侧链的构象。血清白蛋白氨基酸 残基中约4 8 排列为q 螺旋，1 5 为b 一折叠，其余卷曲回折成球状分子。 h s a 和b s a 的三维晶体结构有三个类似的结构域【4 0 ：i ，i i ，i i i 。每个结 构域又含有两个亚结构域：a b 和c ，以槽口相对的方式形成圆筒状结构，每 个亚结构域又分为三个螺旋( x ，y ，z ) ，几乎所有疏水性氨基酸都包埋圆筒腔 内部，构成疏水性腔。每个结构域本身都是紧密装配的，但结构域之间的关系 相当松懈，形成裂缝。 蛋白质的四级结构是指寡聚蛋白中亚基的种类、数目、空间排布以及亚基 间的相互作用。 1 4 1 2 血清白蛋白的理化性质【3 8 4 0 】 血清白蛋白在血浆中含量约为4 9 1 0 0 m l 血浆，占血浆总蛋白的6 0 ，是血 浆蛋白质中少有的非糖蛋白之一。人血清白蛋白h s a 在p h7 4 条件下，具有1 8 个净负电荷，离子强度o 1 5 时，等电点在4 7 ，在p h8 6 时，电泳分析得单一 区带。a o k i 和f o r s t e r 提出白蛋白存在同分异构体，他们将p h4 5 时电泳图谱 的白蛋白称为n 型( n o r m a l ) ，即正常型，而将p h3 5 4 5 条件下电泳于n 型 之前的白蛋白命名为f 型( f a s t ) ，这两种蛋白型体能够可逆的互相转变，f 型 蛋白是n 型蛋白的伸展构象，蛋白分子中的螺旋倾向于分开，分子变长的膨胀 构象，n 型是白蛋白在p h 4 o 时的稳定形式。在p h8 附近，蛋白转变为另一种 膨胀的b 构象。 1 4 1 _ 3 白蛋白的生理功能 白蛋白是血液缓冲系统的组分之一，具有营养作用，是维持血液胶体渗透 压的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体，具有重要的生理意义。 ( 1 ) 血液缓冲剂 血浆白蛋白像其它蛋白一样具有两性性质，能与酸碱结合，白蛋白等电点 低于正常血液p h ，它是弱酸，一部分以酸的形式存在，另一部分与阳离子( 主 要是n a + ) ，结合成弱酸盐。这两部分形成缓冲对，构成血液总缓冲系统的较少 第一章绪论 部分。 ( 2 ) 营养作用 在生命活动中，组成组织和器官的蛋白质，经常不断地进行新陈代谢。血 浆蛋白质在体内分解产生的氨基酸可参与氨基酸代谢池，用于组织蛋白等合成， 参与维持体内蛋白质的动态平衡，白蛋白对细胞具有较高的价值。 ( 3 ) 维持血浆胶体渗透压和液体交换 正常人血浆渗透压在3 7 时，约为7 7 个大气压。血浆中蛋白质浓度大于 组织液，故具有较高的渗透压，血浆与组织液渗透压差称为血浆的有效渗透压， 正常约为1 5 m m h g ，它有从组织间隙吸收水分进入血循环的作用。在正常人体微 循环中，血浆与组织液间不断频繁的交换液体及溶于水的营养物质和代谢产物， 在新陈代谢中起重要作用。 ( 4 ) 运输功能 血清白蛋白是血浆蛋白质中具有广泛结合能力的蛋白质。能结合内源性和 外源性物质，能结合大、中、小分子的化合物，也能同难溶于水和溶于水的物 质相结合，具有重要的生理意义、临床意义以及作为药物载体的功能。 血清白蛋白能与许多化合物结合，可能与它的“构象适应性”有关。在生 理条件下，白蛋白的结合部位易变，几乎能以相同能量产生不同的构象。因为 它的螺旋内维系力量较弱，当与某化合物结合时，螺旋分开，肽链内残基侧链 方位改变，导致分子表面活性基团适宜分布，新的结合位点随之产生，发生构 象变化和协同效应。白蛋白分子表面结构疏松，对于白蛋白在血浆中起着运输 载体及解毒剂的作用具有重要意义。 1 4 1 4 血清白蛋白的变性 蛋白质变性后，其物理性质( 如溶解度、结晶能力、紫外吸收光谱、荧光 光谱等) 、化学性质( 如水解速度、与某些试剂反应的能力等) 以及生物性质( 如 酶的催化活性、抗体与抗原的专一结合能力等) 都会发生变化。变性可以涉及 次级键、二硫键的断裂，但不涉及一级结构的变化。能够引起蛋白质变性的因 素很多： ( 1 ) 温度：蛋白质在5 0 6 0 的溶液中，经过一段时间，往往发生热变性。 热变性仅仅涉及次级键的变化。 ( 2 ) 酸、碱：大多数蛋白在p h4 1 0 之间是稳定的，超过这个范围，就 第一章绪论 发生变性。这种变性作用是通过静电作用来实现的。不同种蛋白对酸碱的稳定 性不同。 ( 3 ) 表面活性剂：表面活性剂，如十二烷基硫酸钠( s d s ) 和溴化十六烷 基三甲铵( c t a b ) 等，很容易与蛋白质结合。这类变性剂不需要高浓度，在很 低的浓度下就能与蛋白结合，使蛋白的构象发生变化。 ( 4 ) 盐：在蛋白质的研究中广泛地使用了各种盐以维持一定的离子强度。 不同的盐对蛋白质的构象有着不同的影响。 另外，有机溶剂、尿素等也能引起蛋白质的变性。 1 4 1 5 血清白蛋白的光谱性质 ( 1 ) 紫外光谱。 血清白蛋白能够吸收紫外光。由于色氨酸( t r p ) ，酪氨酸( t y r ) 残基对光 的吸收，大多数蛋白质在2 8 0 册附近有一个吸收峰。苯丙氨酸( p h e ) 残基的吸 收峰在2 5 7 n m 附近。肽键在2 2 5 n m 附近有一较强的吸收峰。在2 8 0 n m 处，血清 白蛋白溶液的光吸收与其含量成正比，可用作定量分析。 基于紫外光谱的常用蛋白含量检测的方法有紫外吸收法 4 2 ，4 3 、考马斯亮蓝法 o 5 j 等。2 8 0n m 单波长紫外吸收法简单、方便，但灵敏度不高。考马斯亮蓝法迅 速、灵敏度高，但相对紫外吸收法较复杂，且易受p h 变化的影响。 当血清白蛋白生色基所处的环境发生变化时，其紫外吸收光谱随之发生变 化：吸收峰红移或者蓝移，吸光度及谱带亦有变化。变化前后的光谱之差称之 为差光谱( ( d i f f e r e n t i a ls p e c t r u m ) 。利用紫外差光谱可以获得蛋白质的结构 信息。差光谱的种类很多，常用的有溶剂微扰差光谱、p h 差光谱和变性差光谱 等。利用溶剂微扰差光谱可以探测血清白蛋白分子中生色基团的暴露程度，利 用p h 差光谱作为指标可以研究在变性因素下血清白蛋白的变性过程。 ( 2 ) 荧光光谱。 血清白蛋白分子中的色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 和苯丙氨酸( p h e ) 残 基能吸收紫外光，并且能发射荧光，所以血清白蛋白具有天然荧光。由于t r d ， t y r 和p h e 的r 基团不同，三者的荧光光谱也不同。其荧光峰位分别是3 4 8 ，3 0 3 和2 8 2 n m 。t r p 的荧光强度最大，p h e 的荧光强度很小。血清白蛋白的内源荧光 主要是t r p 和t y r 残基所发射的。荧光光谱法可以研究血清白蛋白分子的构象 变化，研究t r p 或t y r 残基的微环境以及研究血清白蛋白的变性等。现在，常 第一章绪论 用荧光探针技术( 外源荧光法) 来测定血清白蛋白的含量或进行构象等方面的 研究，这种技术比利用蛋白质的内源荧光有更高的灵敏度。 ( 3 ) 圆二色谱( c d ) 。 血清白蛋白的圆二色谱分为远紫外区( 1 8 5 2 4 5 n m ) 和近紫外区( 2 4 5 3 2 0 n m ) 。远紫外区是肽键的吸收峰范围，反映了主链构象。在远紫外区，一般 天然蛋白质的c d 光谱包含一个正峰