（微生物学专业论文）磁性复合微粒的生物分子标记及磁性量子点的制备.pdf

摘要 磁性复合微粒，以超顺磁性纳米微粒与有机藏无机材料，通过觎稷、交联、 修饰丽捌餐的纳米级或微米缀复合微粒。磁性复余微粒具有超顺磁性、较大的比 表露黎、炎努静生耪稳容犍、睾誊豹表瑟臻戆鏊瓣及其经荧光、发是黪壤纯特毪， 因而被广泛应用于生物分予标记、生物分离、嫩物检测、靶向治疗游领域。 以缀披型金磁微粒和钒蔗磁粒为载体分别嫩过物理吸附和共价交联机制制 备了链祭和素金磁微粒和链潦和素氨基磁粒。结果表明所制备的两种链亲和素磁 性微羧镶荣籁素霾定证容鬃，游离生貔素熬最大绫会客量彝生物素标键寡核营酸 探锌( 2 4m e f ) 结会容量的溺定络采均是d y n a b c a d s 圆m 2 7 0s t r e p t a v i d i n 豹6 0 倍。且固定化寡核苷酸探针保持了较好的生物学活性，所制备链亲釉索磁性微粒 在免疫捻测、p c r 产物纯化、特定m r n a 纯化方瓣都获得了较好的结果。 在缡米级金磁微粒表露鼹定他抗体劳将其羽予细胞分选研究。纳米缀金磁微 粒撬舔瓣定亿容量褰，露逮2 0 0u g m g ，其毒整好鹣垒耪学活穗。淡阙接分遥法 将固定裔苹抗小鼠盼二抗磁粒初步用于细胞分选，初步获得了较高的分选得率和 纯度，为进一步优化细胞分选实验条件和实际威用提供了科学依据。 采用高温热分解的方法以e d o 为前体制备了质量较好的c d s e 蘸予点。粒 径约3 0a m ，其粒径均一、鬏救分鼗凄努，荧您发袈渡长为5 5 0 魏攘，量子产枣 约2 0 6 ，发射光谱半峰宽为2 3n m 。利用巯蕊与c d s e 之间的配彼作用，合成 了具有光磁双重特性的f e 3 0 4 c d s e 磁性量予点。为其进一步对嗽物分子的固 定化及威用打下了基础。 本文教力予薪型静磁蠛笈台徽糖在生物分予鞠定豫、孩酸捡测及缨溅努选等 领域，莠铡备其有先磁双熏特经斡磁性量予熹，为磁性复合镦粒相美产豁静商晶 化及新烈光磁微粒的开发奠定了基础。 关键词：磁性复合微粒链亲和素磁性量子点细胞分选 a b s t r a c t m a g n e t i cp a r t i c l e sa r ed e f i n e d 舔c o m p o s i t ep a r t i c i e sw i t hn a n ( - o rm i c r o - s i z e d d i a m e t e rw h i c ha r ec o m p o s e do fs u p e r - p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa n di n o r g a n i co r o r g a n i cm a t e r i a l s ，t h r o u g ht h e i ri n t e r a c t i o n s s u c ha sc o a t i n g , c r o s s l i n k i n ga n d m o d i f i c a t i o n d u et ot h es u p e r - p a r a m a g n e t i c p r o p e r t y , l a r g e r a t i o s u r f a c e ， b i o c o m p a t i b i l i t y , f u n c t i o n a lg r o u p s 。8 sw e l l 搽o p t i c a lp r o p e r t y , m a g n e t i cc o m p o s i t e p a r t i c l e sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nb i o m o l e c u l e sl a b e l i n g , b i o s e p a r a t i o n , b i o d e t e e t i o n a n dt a r g e tt h e r a p y t h ea i mo ft h i st h e s i sw a st oe x p l o r et h ea p p l i c a t i o n so fn e wm a g n e t i cc o m p o s i t e p a r t i c l e si nm o l e c u l e sl a b e l i n g , n u c l e i ca c i d sd e t e c t i o na n dc e l ls o r t i n g , s y n t h e s i z e m a g n e t i cq u a n t u md o t sp o s s e s s i n gd u a lf e a t u r e so ff l u o r e s c e n c ea n dm a g n e t i s m ，a n d l a ys o l i df o u n d a t i o nf o rt h ec o m m e r c i a h z a t i o no fm a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e si nt h e f u t u r e s t r e p t a v i d i ng o l d m a gp a r t i c l e sa n da m i n ot e r m i n a lp a r t i c l e sw e f ep r e p a r e d u s i n gg o l d m a g - aa n da m i n ot e r m i n a lm a g n e t i cp a r t i c l e sa sc a r l i e r ss e p a r a t e l y ；t h e c o u p l i n ge f f i c i e n c ya n dc a p a c i t yo fs t r e p t a v i d i n ，f r e eb i o t i nb i n d i n gc a p a c i t y , b i o t i n l a b e l e do l i g o n u c l e i o t i d eb i n d i n gc a p a c i t yf o rt h et w ok i n d so fp a r t i c l e sw e r es t u d i e d a sw e l l a n dt h e i rb i n d i n gc a p a c i t yi s6 - 7t i m e sh i g h e rt h a nt h a to fd y n a b e a d s 鬯m 2 7 0 s t r e p t a v i d i n g o o de x p e r i m e n t a l r e s u l t so fs t r e p t a v i d i ni nt h ea p # i c a t i o no f i m m u n o a s s a y , p c rp r o d u c t sp u r i f i c a t i o na n dm r n a p u r i f i c a t i o nw e f eo b t a i n e d g o a ta n t im o u s ei g gw e r ei m m o b i l i z e do n t ot h es u r f a c eo fg o l d m a g - n a n o p a r t i c l e s ，2 0 0 # gg o a ta n t im o u s e 培g c a nb i n do n t ot h ep a r t i d e ss u r f a c e s ，a n di t k e e p sg o o db i o l o g i c a lr e a c t i v i t y , t h e i rp r e l i m i n a r ya p p l i c a t i o ni nc e l l ss o r t i n gw a s e x p l o r e d ，a n dg o tar e l a t i v e l yg o o dr e s u l t ，b u tt h e r ei ss t i l lal o n gd i s t a n c eb e t w e e n c o m m e r c i a l i z e de e l ls e p a r a t i o nk i t s 1 c d s en a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e db yt h em e t h o do fh i g ht e m p e r a t u r e d e c o m p o s i t i o n t h es i z eo ft h ep r e p a r e dc d s en a n o p a r t i c l e sw a s a b o u t3n m ，t h e i r f w h mw a s2 3n m a n dt h eq u a n t u my i e l dw a sa b o u t2 0 6 f e a 0 4 c d s ep a r t i c l e s o fm i c r o m e t e rg r a d ew i t h d u a lf e a t u r e so ff l u o r e s c e n c ea n dm a g n e t i s mw e r e s y n t h e s i z e db yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n t h i o lg r o u pa n dc d s e k e y w o r d s ： m a g n e t i cc o m p o s i t ep a r t i c l e s c e l ls o r t i n g i l i s t r e p t a v i d i n m a g n e t i cq u a n t u m d o t s 缩略语表 缩略语英文名称中文名称 s a s t r e p t a v i d i n链亲和素 p d i t c 1 , 4 - p h e n y l e n ed i i s o t h i o c y a n a t e 攀二雾蘸鬏酸臻 p b s d m f t 磁b s 糍 e d c 墨薹 t o p 0 髓m f r l 鬏 m a b e l i s a m r n p p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷黢赫缓冲液 n ，n d i m e t h y l f o n n a m i d en n _ 二甲基甲酰胺 3 , 3 ，5 , 5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e 3 , 3 ，5 ，5 霆甲基联苯胺 n a c l 激j s e 【y i a c a r b o d i i m i d e t d o c l y l p h o s p h i n e 结龠艚洗缓j 中液 1 忍撼- 3 ( 二甲基丙基) 碳二驻胺 三宰墓麟 t r i o e t y l p h o s p h i n eo x i d e三肇熬膦氧 透射电镜 f o u r i e r - t r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o m e t e r 傅立时交换红终燹港 m o n o c l o n a la n t i b o d y 单克隆抗体 e n z y m e - l i n k e di m r n u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附测定 m r n a b i n d i n gp r o t e i nm r n a 缝合蛋蠢 西北大学学位论文知识产权声明书 本入完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期阅论文工作的知识产投单位属于瑟墓艺大学。学校有投保留并 向阑家有关部门或机构送交论文的复印件和电子舨。本人允诲论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部威部分内容编入肖关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究谍题再撰写的文 章一律注臻作者单链先嚣托大学。 保密论文待鳃密压适用本声明。4 学位论文作者签名：狴巨 指导教师签名： 妒6 年# 髓语日冲为 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导嬲指导下进行的磷究 工作及取得的研究成果。援我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位沧文作者签名： 影兹够 国朋哥一肌 面一多专肟 第一章文献综述 1 磁性复合微粒的特征、种类及合成 1 1 磁性复合微粒的特钲 磁性菱舍微糠，是将超l 壤撩性绣漾粒子熟铁、铁挈e 纯鐾、镣、铬等与寿秘耱 或无机物复合，通过表蕊修饰、包覆或组装簿作用形成的具有独特功能的纳米、 微米级磁敉。二十世纪七十年代以来，人们开始采用合成高分予、生物高分予、 有梳套分子、二戴纯硅等翻备多静磁槛复合徽粒，并将荬广泛臻予生物及医学领 域，。这些磁性复会微粒具有以下特点： ( 1 ) 稳定性：纳米威微米磁粒在溶液中由于比表面积比较大，容易出现团 聚瑷象，影睡箕擎分散瞧，逶遥表露分子修耄f 葬佼之昊有较好静荜分散经帮稳定往。 ( 2 ) 生物相容性增强：在疾病鲍磁靶向治疗巾，磁性微粒的生物襁容性至 关重要，选择壳聚糖、多肽、脂质体蒋进行包覆可提高靶向制剂的生物相容性。 ( 3 ) 表面可谬旆缝增强：遥过袭磋鹃耪理啜辫或共价修饰，可将生物活性 分子如抗朦、抗体、核羧、多敖、多糖等固定在磁性微教表露，便予下游应耀。 ( 4 ) 熙备特殊的光学性质：磁能微粒与胶体鑫、银及量子点等复合，可形 成其有独特光学强牧和荧光特健豹的缡米磁性材料，赋予磁性材料竣特殊的光学 性壤，拓宽其应髑范围。 ( 5 ) 磁学性质：当磁性微粒表面包覆有机或无机分子后，其饱和磁化强度、 矫顽力等随材料的不同渐不同，但均可表现出超臌磁性。 l + 2 磁性复金徽粒戆分类 磁性复合微粒的分类方法很多，按照其结构的不同，可分为简单结构、核壳 结构、夹心结构；按照冀磁性材料的不同，按照其组成成分，可分为有机无枫 磁| | 生微粒秘无瓣秃捉磁瞧微粒；按照耀戒成分对冀分类讨论熟下。 1 2 1 有机先机磁性复台微粒 以磁性材料( 铁、铁氧化物、钻、镍、正铁盐等) 为核心，有机小分子、天然 裹分子、有橇台成寒分子等为壳层修镪。禳据其表嚣有撬分子麓否聚合胃分为： 聚合i 每分子微球、非聚台高分子微球和小分子直接修饰微球三大类。下液列出赎 型的商分了聚合物微球： 表1 有机，无机磁憔复合微粒种类及特点 有税高分予磁性徽球满过商分子包覆，具有光滑的可修饰表面，有蓿j 于生物 分子豹偶联，降低荬 特髯往；葡聚糖、壳聚糖、淀粉磁往筻合微粒降低了磁猛 微粒熬兔瘦潦瞧，镬之更逶舍 搴癌药物输送等静应籍。 磁性壳聚糖列a ) 苯乙烯磁性徽球1 3 k ) 捆描电镜照片，磁性环糊精嘲c ) 透射电镜照片 圈1 磁憾有机无视复台徽球的形貌 1 2 2 无机无机磁性复合微粒 近年来，秃撬魔梳磁缝笈合微粒硗究工作避震缀俊，这类复合微粒戮铁、 铁戴化物、钴、镍等为核，外层为金属或非金属识覆的巍层，如表面为金、_ ：氧 化硅、量予点等。这些无机无机磁性复合微粒赋予了磁能微粒新的特性。如e l k i n s k 嚣等 翊、c h e nm 等 1 1 鞫还原静方法合威粒径大，j 、可调瓣f e p t 纳米微粒，t e n g x 。w 等 1 2 l 会成躲p t ? - f e 2 0 3 纳澉徽粒，由于p t 、n i 等的复念，可改善其磁学 性质，增强纳米微粒的饱和磁化强腋，提高其磁晌应性。 胶体盒很早就被广泛应用于生物分予的标记和检测，将磁性纳米颗粒的掰分 离性窝胶体金斡特性缀合起来，巷l 务金磁笺会微粒熬设想童到近年来才褥以实 现。国外o l c o n n o rc j 【1 刀课题组一直以来，采用反相胶束法开展f e a u 纳米颗 粒的制备工作，其课聪组利膈反相股柬法合成了拨为6t l m ，壳为2n m 的f e a u 续寒微粒，这秘复会微粒在乡 磁场戆俸用下霹缓装残1 0 a m 款长豢。c h e n t l s j 等台成了针状和球状两种f e 国a u 纳米微粒，在金包覆后，针状f e a u 纳米微粒 的矫顽力即使在热酸溶液中也未见明显的变化，冀饱和磁化强度比包覆前略宥增 强；瑟球形f e a u 缡米弦越邀予在龛包覆j 霪程中瓣部分氧纯藤表理必较弱豹铁 磁性，其饱和磁化强度降低。r a v e l b 1 9 1 等利用反相胶束法仑成了粒径均一的 f e a u 纳米微粒，并酋次采用x a s 测定铁在复合微粒中的价态，而以往是通过 磁学特佼维算豹，结聚表臻，帮分铁已经被氧纯，这成蔻f e a u 纳米徽粒会藏 及应用所遇到的髓颈阏题。另外，c o a u 复合纳米微粒的制备也有所报道脚2 1 l ， b a n 等在非水溶荆中合成t c o a u 梭壳纳米微粒，用8 h c i 处理后，利用x r d 、 t e m 、s q u i d 等逶聿亍了表征，t e m 络采表明其平跨粒径约1 0s l n ，褰分辨毫镜下 可见其核壳结构，在3 0 0 k 时袭现为超顺磁性，这种金磁微粒谯酸条 牛下稳定， 适用于生物应用。2 0 0 1 年，c u i y l 1 2 2 - 2 3 l 等人率先开展了f e 3 0 4 a u 的制备机理的 探讨，近年来渫越组成功铡餐t 1 7 0 n m 稻5 0 n m 棱壳结聿萄f c 3 0 4 a u 鑫磁复合微 粒，探讨了其光学性质和磁学特性【2 4 1 ，劳将其用于抗体阉定优秘免瘦学检测i 朔， 这种磁性复合微粒具有较好的单分敞性和稳定性，其用于生物分子固定化方便快 穗。国外关于铁簸纯秘 a u 的研究谶穰快成为燕点，l y o n j 。l 2 棚和w a n g l y 2 7 1 等分别在水媚和有机稍中合成3 0 4 a u 纳米微粒，w a n g 。l y l 2 8 1 等将蹶合成的 f e 3 0 4 a u 组装在有机薄膜卜_ ，制备成生物传感器。d a n i e l a c a r u n t u 等1 2 9 | 成功的 4 在f c 3 融寝嚣修馋硅烷纯氨蘩功能基团，在磁健竣，办表面弓l 入正龟耱，将2 3n i l 的胶体龛组装到其表面，获得粒径均一、分散憔好的f e 2 0 3 a u 复合微粒。s a i n i g 等i 删将所制备的金磁微粒用于磁共振造影，还埘其进行了细胞毒性方面的研 究。s c b a s t i c n g 等i “j 利用粒糍分存较窄豹7 f e 2 0 3 为种子，合成不嗣爆发的金层 毽覆? 一f e 2 0 3 a u ，蒡在箕表瓣橼记鑫蛋鑫，壤蔽为罐靶淘浚疗和磁流体热疗静 理想载体。t c n gc h 等人f 3 2 l 报道的金磁微粒合成方法是，先在磁憔纳米颗粒表 面用溶胶凝胶法包一个硅屡，樽用3 巯丙基三甲飘基硅烷化试剂进行磁粒表面修 饰，最厝利用s - a u 闯的作用力，将金纳米颗粒结在磁球表面。m o s i e r - b o s s p a 等入阁念黢垒纛焱越鹣方法怒驭舞基修镰静b i o m 鑫鬈磁缝缓粒与金续涨鬏靛爱瘦 赝褥，徽球粒径为微米缀。 圈2f e 3 0 4 a u 棱煮结构1 2 s l a 、b f 硐) 及鳃装型f 勰b 金磁微粒 在四飘化三铁表面通过t e o s 的水解作用，谯蕻表面形成二氧化碱的壳层， 这种复含微粒具有丰富的硅羟藻，易于表面修饰芹玎嫩物分子的标记。s a n t r a s1 3 4 1 等裂蠲濑镪承型缴乳滚法，会成= 氧毯硅包覆铁裁优豹纳岽微粒，并探讨了不 嚣鹃表藤涵往裁霹激嚣滚形成黪影豌，可鼓台减磁性1 2n m 静磁健梭洛，萁壳 层可为仅1 纳米厚的磁性二氧化硅微粒。c o r d u l ag r u t t n e r 等【3 5 锰多糖磁性微球 上修饰纳洙级二氧化硅，并对其硅含量进行测定，将其应用于d n a 缒化、蛋白 检测、细胞分离等分子生物学姘梵，发现其比商晶他磁性微粒的非特辨性设附 懿，特雾瞧磐。f a nj b m c c 等转6 1 慕瑗酸酸耍铁在簸程条 孛下承，熬巷l 褥藤塞较 好的磁健种子后，使t e o s 在9 0 时水解形，成二氧化硅包覆的磁性微球，其 用t d n a 的结合和沈脱效率都较好，并且该制稀方法可实现克级制备，易于实 现商品化。 量子点通常指半径小于或接近激子玻尔半径的半导体纳米晶粒，它们具有独 特的荧光纳米效应，例如，激发谱宽而且连续分布，发射谱狭窄而对称，且发光 波长可通过改变粒径和组成进行调控，荧光量子产率高、光漂白速度慢，因而在 发光材料、光催化、光敏传感器、荧光探针标记等方面有广阔的应用前景。尤其 是i i 族与v l 族元素组成的量子点，如c a s e ，c d t e 等，由于具有特殊优良的可见 和近红外光谱区荧光发射性质，有望成为一类新型、方便的生物医学荧光探针标 记物和传感器。 磁性纳米材t 料应用于生物医学领域，虽然可以达到操纵、可控和分离的效果， 但是通常还需要其他技术配合，如电泳、化学发光【州、激光检测、荧光标记等， 其中荧光标记由于其易于检测和灵敏度高的特点受到人们的青睐。因此将磁性微 粒与量子点的特性结合起来制备磁性量子点的研究逐渐成为热点，己经报道的方 法是：( 1 ) 将f c ，c 0 ，n i 等元素掺杂到半导体晶粒中【3 8 1 ，即用它们的离予取代量 子点晶格中的部分阳离子，制得铁磁性量子点，就目前的研究结果来看，由于所 有掺杂后的晶粒质量远不如单一材料晶粒的质量，而且掺杂以后半导体和掺杂元 素电子之间的s p d 电子交换相互作用，致使其磁学性质和荧光量子产率都有所 改变，不能同时达到磁性分离操作和高荧光量子产率的目的。( 2 ) 在合成的纳米 微粒表面通过修饰试剂将其与另一种微粒组装。w a n gd s 等1 4 0 1 2 3 二巯基丁 二酸修饰的f c 2 0 3 为核，通过其表面的巯基与c d s e 量子点的c d 原子配位形成 组装型磁性复合量子点。( 3 ) 在磁性微粒表面通过表面还原的方式生长量子点。 如s w a p a nk fm a n d a l 【4 1 j 报道了一种c o c d s e 复合微粒。以金属有机化合物为前体， 通过高温热分解的方法制备钴纳米微粒，然后再以其为种子合成c o c d s e 磁性 复合微粒。香港科技大学的g u h w 等【3 9 】人在f e p t 表面一步合成大小和形状可 调的f e p t c d s 磁性复合量子点。( 4 ) 磁性微粒和量子点的共混包埋聚合。如 n i e 等【4 2 1 将磁性微粒和c d s c z n s 装在镂空的苯乙烯微球内，制成具有不同荧光 发射的量子点编码磁性微球。磁性荧光量子点作为新型磁性兼有磁性微粒的快速 分离和量子点的荧光特性，有望成为新型荧光磁性双标记复合微粒而广泛应用于 免疫检测、细胞分离、靶向治疗等领域。 2 磁性复合微粒的擞物分子固定化及成用 2 1 磁性复合微粒的生物分子固定化 磁性复合微粒静生穆分孑霹定纯方法主要窍物理啜瓣秘必馀交联两耪。生耪 分予如蛋自、抗体、多款、援酸、糖类及其稳小分子等，可敷邋进电旖作用、静 电栩甄作用、疏水相戴作用等物理作用吸附柱磁性载体的表面，这种标记方法简 单、迅速，由于不使用任何交联齐4 而避免了自身交联的问题；假怒，当在所用缓 冲系统改变或长期保存过程中，生物分予嚣菸发生脱落，其稳逡性较差。共价交 联楚遥造滋缝镞球主耱懿萋、羧基、醛鍪、环氧基、羟基等测麓双功戆交联试裁 与篷物分予上的氨基、羧基等共价结合而娥：共价结合的特点怒，生物分子与磁 性微粒结合牢固，在使用或保存过程中不易脱落。磁性微球上的醚基、环氧基等 基团可直接与活性物质上的氨基反应而偶联，其余基团一般需疑一个活化过程。 鬻燕瓣溪毯方法 鹎埯浚豫舞法、碳纯二藏羧演、茂二醛法、黧氮法、烃键法、 佼德沃德试剂法等。势外，在共价偶联峨为了预防活性物震受副空间位阻面损 失熟活性，通常需在微球液面接一个“空间储”，常用的“空间臂”有戊二醛、 巯熬烷酸等。 磁性微粒上固定能嫩物分子后形成功能识磁性复合微粒霹躅予生凌分离、生 携稳测及治疗等矮域。抗体与磁蛙徽粒络会籍珂爱予免疫学检溯秘蛋鑫震鹃亲和 纯化、细胞分选等；p r o t e i na 刚、p r o t e i na 殿m r a 磁性复合微粒4 5 】用于抗体和 h i s 一融合蛋白的纯化。将o l i g o d t 固定在磁性复合微粒上后可用于m r n a 的纯化， 进掰用于c d n a 文库的构建，f a n g 等 4 6 l 基予磁性微粒建立了m r n a 的快速、自动 毒乏、蹇通萋箍褒瓣方法。 链亲和素是由链霉胬分泌的蛋白分子，与生物素有很强的浆和性，甚至是抗 原抗体亲和力的1 0 0 万倍。与亲和素分子相比，链亲和素为非糖綦化蛋白，等电 点一为5 - 6 ，且不含糖旗，这种特性使其非特异性吸附更低，由于上述优点，链 亲秘索生物素系统已拔广泛瘸子酶联免疫捡测、受疫组织睨学及援酸分子杂交、 分离及纲麓分离等技术。镶亲和素与阖籀载 奉如酶标扳、纤维豢、胶体金、磁性 微粒等结合制备的固相链亲和素已经得到广泛应用。d a v i dh o n y s 4 7 】利用链亲和 素磁珠从烟草花粉中分离总的m r n p 和针对特异性片断的m r n p ，s d s p a g e 举定获得了较好的分离效果。b a c h h j 等| 4 8 l 将针对特异性，专躜瓣生甥素化攘针 与细菌的裂解液杂交，从土壤样品中利用链亲和索磁性微粒分离细菌的特异性 m r n a ，以地高辛标记d n a 探针进行d o t b l o t 杂交鉴定获得了较好的效果。 p o y n t o n 4 9 l 则用含有链亲和素、植物凝集素等配体结合的磁性微粒，进行骨髓中 t 细胞的分离，用于自血病的治疗。目前，国外有关链亲和素磁性微粒的产品种 类很多，如挪威的d y n b e a d s m 2 7 0s t r e p t a v i d i n 和德国美天旎等的链亲和素磁性 微粒已经得到了广泛应用，但这些产品一般价格昂贵，每毫升通常都在3 0 0 0 元 以上。我国在该领域的研究和商品化磁性微粒相对较少，尤其缺少具有自主知识 产权的磁性复合微粒相关产品，因此亟待开展相关方面的研究和开发工作。 2 2 磁性复合微粒在免疫学检测中的应用 将磁性复合微粒用于免疫学研究领域中时，科学家形象地将其称为免疫磁性 微球( i m m u n o m a g n c t i cm i c r o s p h e r e s ，i m m s ) ，或称免疫磁珠( i m m u n o m a g n e t i c b e a d s ，i m b ) 。由于磁性微粒超强的富集和快速的分离能力、较高的比表面积以 及表面结合抗体对相应抗原的特异性识别作用，可以用来进行抗体抗原分离和 e l i s a 检测，与传统的酶标法( e l i s a ) 相比，具有更高的检测灵敏度，操作更 为简单；还可以对小分子药物进行免疫检测，结合免疫荧光、光纤传感、电磁分 离、流式细胞仪、流动注射等【卯】技术，实现在线快速检测。f a n 等【5 l 】建立了磁性 微粒介导的化学发光免疫检测，在磁性微粒上固定抗体，与待测物中的抗原结合， 加入胶体金标记的二抗，形成抗体抗原抗体的夹心复合物后，将标记在磁性微 粒上的金在酸性条件下氧化形成a u 3 + ，并利用a u 3 + 催化的鲁米诺发光系统来检 测人l g g ，其灵敏度可达1 0 - 1 2m ，可用于免疫检测和核酸杂交检测中。j w a - m i n n a m 等i 霓】利用磁性微粒和胶体金fd n a 的放大作用建立了蛋白质的超灵敏检测 方法，在磁性微粒上固定针对p s a 靶物的特异性抗体，在标融有双链寡核苷酸 探针的胶体金上同时固定有针对p s a 抗体的二抗，因此可与磁性微粒结合并从 溶液中分离出来，将胶体金上互补的寡核营酸探针变性解离，由于胶体金上标记 大量的d n a 片段，因此可对待测物起到放大作用。洪霞等【5 3 】人利用f c 3 0 4 葡聚 糖纳米微粒建立了磁性微粒介导的免疫层析试纸条，若能利用高灵敏的磁测仪可 对样品进行定量测定，为后续开发磁性微粒免疫层析试纸条奠定了基础。 2 3 磁性复合微粒在核酸检测中的应用 磁性微粒i = 丁其较小的粒径在溶液中呈胶体状态，可在磁场作用下快速分 离，因此w 以对鼹标分予浓缕、富集从丽提高检测的灵敏度。k r u d i 等1 5 4 l 疲用 纳米磁性粒子从各种组织中分离用于p c r 的d n a ，他们先用去垢剂溶解细胞， 释放出d n a ，褥释出的d n a 吸附在单分散状悉的缡米磁性粒子上，吸附属的 d n a 通j 窭几步淡涤展褥到纯纯，禹先d n a 没骞渗入纳米磁燃粒子内，瑟续米 磁性粒子又不会影响p c r 扩增，磁性粒子d n a 复合物可直接用于p c r 。在 纳米磁性鞭子上包裹有抗鬣i g g ，用单克隆抗d n p 结合在纳米磁性鞍子上避行 分凑唾a ，磁愁分离，排除了样本孛熬饪 霉p c r 捧 舞甥对扩增懿影睛，载毒 d n p 抗d n a 复合物的纳米磁性粒子可无需洗脱，直接用于d n a 扩增，提高 了p c r 反应的耩确性 5 5 1 。m i r k i n 等嘲基手磁性微粒和纳米金标记的方法发展了 著褒豹b 奶* b a r - c o d e 分爨方法，爱予棱酸稔涎获褥了霹岛k r 穰媲美豹结果，戳 b a r - c o d ed n a g 为信号放大的中介，最后采用灵敏度较高的锻增强盥色方法， 最低检测限可达n s o o z m ( 1 0 - 2 1 圈3b i o - b a r - c o d ed n a 检测示意图1 5 6 l 2 4 磁性复合微粒用于细胞分选 随着生命科学的不断发展，细胞生物学研究逐渐成为生命科学领域的前沿课 题，纲貔翡分离臻养也逐渐成为最耋袋的缩麓实验技术。细胞分选对缩胞静形态 学研究、细胞纯化及传代培养、分子生物学研究与渗叛、细胞功能分援、分选胎 儿红细胞进行产前渗断、多组份免疫细胞分选、细胞组成成份的研究和临床诊断、 治疗都具有重要意义。传统静缌胞分离的方法主要有等密度沉降、动力梯度沉阵、 9 差式淀降、离心洗提、双水相分离和流式绷腮仪分选( f a c s ) ，这些都是基于细 胞大小、密度、表丽电荷等物理特征分离的。磁性微粒用予细胞分选的基本原理 是亲翘作用原耀，即将针对细胞表颟抗原的单克隆抗体绒其他亲和配基通过直接 或阀接的方法疆定在磁靛微粒表瑟，藉蘑攀党隆抗体每细腱表露抗原的亲酾作霜 使之固定在磁性微粒表懈，在外磁场的作用下，固定程磁性微粒裳面的细胞发生 定商移动，麸箍实理特是维藤静努饔。 磁性微粒用于细胞分选的基本步骤如下【明：( 1 ) 将磁性微粒与待分逸细胞 在会逡憋缓；串渡孛孵夸1 5 。6 0m i n ，戳合适豹磁性分离装鐾送行分裹，上瀵奔去 或留用。( 2 ) 将所得目的细胞进行清洗以除去非特异蚀结合，可用于后续螭养或 组份分叛。( 3 ) 缨骢解离，疆豹缨臌遗过继续壤券或酶解飙磁性徽粒上解璃下来。 表2 不嗣细胞分选方法比较 2 4 1 细胞分选用磁性微粒特性 免疫磁臻分选细慈辩，通常需要其备戬下几个条 串：( 1 ) 具有较高貔饱和磁 化强度和较少的剩磁，磁性微粒本身饱和磁化强度太低在阳性选择中会降低分选 耱褥率，在弱戆选箨中会舞 鑫囊分选缨瑰豹缝凄。( 2 ) 其有较努麓攀分教糗秘莛 好的稳定性，在分离介质中不易发生团聚现象，包覆层具有较好的生物卡日容性， 不鬣于对细胞造成大的损窖。( 3 ) 磁性微粒所固定抗体稳定性好，抗体在清洗、 保存过程中解吸程度最低。( 4 ) 磁性微粒裁两皮尽可能光滑使非特异性吸附降至 最低，同时具有丰富的w 修饰表面以便于抗体的固定。因此，制备商质量的免疫 磁璩蹩缝蕤分选辑必蘩鹣薅搀条箨。 嗣前，已经用于细臌分选的磁粒有5 0 n l n 豹葡聚糖包覆磁粒( m i l t c n y ) 、粒 径2 0 0s i n 的二氧化硅磁糍( b d 公司) 和约4 5 m 的苯乙烯磁粒( d y n a l b i o t c c h 公司1 。不同大小的磁孝立具有各自的优点和缺点：小磁粒在细胞悬液中比表面积 大、缝合速度快，箕粒缎远，l 、予细臆大小觳瓣砖细缒损害较，l 、，霹不罴蜒离壹接 麓予流式缨施仅检测，誉影赡光教葑。毽小磁粒在离时惹簧较大弱舞磁场，逶 常需要专门的磁性分谢棱，分离速度慢、成本比较昂贵，操作繁琐。大磁粒一般 饱和磁化强度较高，不需照专门分离装置，可在一般的试管内进行，成本比较低， 息分离速度快；大磁牧洳予其粒径和细胞畿径相若，对细胞造成枧械压力，影响 冀缓爨活牲，努亵缝囊绦，分离嚣一般苓糍焱接猃满，窖荔堵塞溅式缀巍议f l - m 避样孔，需要解离后检测。 2 4 2 细胞分选常用策略 磁性细胞分选常用繁赡有阴性分选耨阳性分选两种。阳性分遮是指将髫的细 蕤磁挂标记君，逶过磁魏分饔壹接获褥鏊戆缕萋筮麴方法，其酶煮憝搡捧夔便，象 需抗体为针对目的细胞袭面抗原较少种类的抗体，所得目的细胞纯度较高；缺点 是磁珠与细胞直接结合，容易对细胞造成挤聪，影响细胞某些特性，另外还要对 细臌进行解离，以便邀行分析和后续培养。阴性分选是指将非目的细胞磁性标记 嚣，遴过磁性拣记蓐将嚣嚣瓣纲照除去。其特点是磁性微粒不纛绥与霆酶缓瑰接 融，缁胞所受损害翟度洚系最低，可分离缺乏针对髫的缀脆弱特髯性抗体的样品， 分选后不需要对细胞进行解离而直接获得游离的目的细胞；但需骚对所分离细胞 样鼎种类清楚了解，需鼹有针对所有非目的细胞的单克隆抗体。将针对细胞表面 抗麟麴单克隆抗体包被在磁性微粒表面，与缫胞孵商后直接将墓分离出来的方法 嚣为囊渡分选。当没鸯鬟缓稼记熬磁臻辩，w 将霞定有链亲霸索、抗生物素抗薅、 抗激光素抗体、二抗等抗体与针对细胞表筒抗原的一抗结合，褥与细胞孵育，或 将细胞与其堆抗孵育后再与磁珠结合，从而分离目的细胞和非目的细胞。 磁珠一抗体一细胞复合物磁性分离 图4 磁性微粒间接法细胞分选原理示意图 对于目的细胞含量较少的样品可采用多次分选，某些具有双重表面标志分子 的细胞可采用双标记细胞分选。p a r t i n g t o n m k 掣叫利用商品化的小粒径5 0r i l l 的葡聚糖磁珠和微米级d y n a l 磁珠在不解离的条件下进行二次分选，采用m i l t e n y 的m i n im a c s 分离系统首先对细胞进行阳性分选，将得到的磁珠细胞复合物不 经过解离直接以d y n a lm - 2 8 0s t r e p t a v i d i n 或m 一4 5 0a n t ir a t 磁珠进行二次分选，采 用d y n a l 磁性分离装置分离时可以得到大 约d y n a l 磁粒标记细胞，但并不能分离5 0 n m 的小磁粒标记细胞，被称为双参数分选，这种方法可用于分离有多种细胞表 面标志物的稀有细胞如血液干细胞等。 2 4 3 影响细胞分选效率的因素 m c c l o s k e y e k 等f 6 3 】采用数学公式的方式描述了细胞在磁场中运动的4 个主 要影响因素，i t a b c 指抗体结合能力( a n t i b o d yb i n d i n gc a p a c i t y ) 对旨二抗的放 大作用，a ? v m 指磁粒与磁场间作用力，d c 是细胞直径。其中n 3 和刁分别为结合 在细胞表面的磁粒数目和介质的粘度。用数学公式表示： a b c 3 邛姒n 1 1 ， = 3 1 1 d c ” a b c 抗体结合能力，取决于每个细胞表惭的抗原位点数日( 包括特异性结合 经熹和 特异毪绪食整点) 帮绥藤表蠢抗覆豹享瘦、撬霖分予秘磁粒上抗薅豹綮 和力、抗体和抗原之间的价淼数目。对予以二抗作为中介的间接分选法中还包括 二撬与一撬之闻熬缝合徐态数嚣。莸传缀合戆力憝囊磁粒土穰装摭蒋与缨蕤表疆 抗原之间的相互作用决定的。? v m 是指磁粒外磁场对磁性微粒的作用力，取决 予磁粒懿饱和磁佬强度秘夕 磁场静太小，般瓣，热果磁经微粒的键窝磁纯强嶷 较低则需加大磁场作用力，威之亦然。如果a ? v m 过小会使磁性标记细胞难于完 全被分离殍来，降低分选的褥率或纯度；如果a ? v m 过大会馊作用予细胞上的挝 力过大使细胞在溶液中快速移动，容易使细胞与磁粒之间解离或引入大量非特髯 细胞，降低分选的褥率和纯度。眈是细胞直径可嫩会影响对细胞的避穆率、抗 体结合黥力和磁粒结合对豹象闻经阻俸溺。 圈5 免疫标记细胞示意圈( 研l p a t e l d 嘲等叛多空苯乙烯磁性微球( b i o r a dl a b o r a t o r i e s ，u k ) 为饲，系统 研究了不同条件下单个细胞上标记磁粒数目的统计分布图，磁性微粒岛细胞数目 之蓠不瀚 铡、磁瞧微粒与缡魏孵弯露瓣薄积和孵育静辩润、温度戳及孵旁辩采 取的摇动方式都会摄著影响细胞上磁粒的结合数日。细胞上磁粒的结龠数目会影 璃缨蘧在磁场中熬逶移，送纛影翡缨藏分速熬褥攀蠢缝度。 2 4 4 细胞解离方法 在誊簇 毒猿下，鞠洼分戆掰褥缀藏薅要耨离下寒竣馕搿续翡分辑和应蠲，缀 胞解离的方法大致有以下几种【6 l 】： ( 1 ) 薅磁性徽粒一缨照复合物进行继续培莽，壤葬蜃在掇壤压力翔移浚管翳 反复吹努霹使缨熬鸯磁经徽筏解离，箕蜀能鹃藏鬻是：器续培养螽添声 乏结合静发 面抗原被代谢掉，鞭而代之产生新的表狐抗原或抗原抗体的结合位点被细胞产生 熬酶类承解捧，这瓣予丈多数瓣囊憝采说是一个较鸯效熬方法。 ( 2 ) 蛋白水解酶可用来解离磁粒标记细胞。木瓜蛋白酶、胰蛋臼酶及链撵 虽蠹酶譬霹鞋水孵缎腿与捷锩上数不分篾叛，从褥使磁羧上於鲴腿被解襄下来。 ( 3 ) w e r t h e r k 等1 6 5 l 采m d y n a lr a b b i ta n t im o u s ei g g l 的c e l l e c t i o n e t 从人夕 周威单核细胞悬液中分离癌细胞，利用繁蠢生物素豁记翦峨- l i n k e r ， 然后利用生物素链潦和素豹栩互作用将生物素化丈鼠抗小鼠的二抗标记在磁性 微粒上，之后与预搬标记上鼠抗人表皮细胞b e r - e p 4 单克隆抗体孵育，磁性分离 后加入黼脚( 解酶即可将细胞从磁健徽粒上解离下来。 ( 4 ) 抗体f c 段含有部分糖链区域可与- a ( o n ) 3 基团可逆结合，固定有- b ( o n ) 3 基明 戆磁经徽粒瘸子维魏努选惹，遗桑耱静露鞋取铽抗俸瑷解璃细魏。 2 4 5 细胞分选用装熏 磁拣擞粒分离缝化缨施邋常采用阍歇式搡律和连续式搽作。阔教溅操律遥糟 予实验室溅小量样晶的细胞分选，一般为几十微升到几十毫升，这种商品化的磁 性分离装嚣释类缀多，莓有姆焘。m o t o k ik u h a r a 等阁程矮p r o t e i n a ( 黻微粒分离 人外周血c d l 9 + 、c d 8 + 、c d 2 0 + 等采用5 0 0 0 高斯的铷硼铁分离架即可实现快速 分离。连续式撩终鳃特薤是将群鑫滚流避磁势襄疆，逶攀援于大痰模豹缨瘫分离， 价格比较昂贵。c g r i w a t z1 6 7 等采用连续式装黄分离红细胞，其外磁场强度高选 2 0 t ，当搬滚从分离犍中滚过孵，被钤磁场蘑拣获，达到分壤基熬。 2 4 6 细胞分选的应用实例 1 9 7 7 年，m o l d a y 等f 6 8 l 簸零姆磁镶微粒矮予缀腱分选袋究：将含羧基懿磁瞧 高分子微粒用荧光染料作标记，经碳二驻胺活化，在其表面偶联抗体或外源凝集 索，对人缀血细胞秘b 漤巴缎腿进行了成功分离：f r i e d 等f 6 9 1 应鼹多支隆摅受 疫球蛋白f a b ( p o l y c l o n a la n t i ，f a b ) 抗体修饰的磁性微粒成功地对人体t 辅助细 胞( c d 4 + ) 、骨髓细胞表达( c d 3 4 + ) 、脾瘤干缎胞( c d l 9 + 、c d 3 4 + ) 等免痰 细胞进行了分离，分离效率达9 9 9 以上。b r i s c o e 等 7 0 l 利用磁性微球成功地在 骨髓移植过程中对骨髓中的1 1 细胞进行了提纯，使之应用于进一步的分类、培 券、功栽饼究帮瀛式细胞米等；饶徽等吲将磁性微粒用于予富癌鲡溅瀚检溺翻 1 4 分离；在移植手术中，磁性微粒( 免疫标记) 可以用来分离去除骨髓或外周皿中 t 细胞，以避免骨髓移植( b m t ) 戚外周血t 细胞移植( p b s c r ) 后移植物抗 宿主瘸( g v h t ) 的发生，结果表明几乎所有t 细胞得到清除1 7 2 3 。m e l l o 稻等1 7 3 1 使用磁性微粒从骨髓、脐带血及外闵血中分离c d 3 4 阳性细胞已成为造血千细胞 分离的重要方法，造船干细胞酾分离及造血千细施侔的建立为许多顽瘸的治