（动物学专业论文）mapk信号通路对p21蛋白表达调控机制的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 ，木论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实 的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机 构已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表 示了谢意。 作者签名； 日期： 焚茜桶 盟：苎：型 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文咱勺电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：货色描 日期：丑：翌 j n k 对p 2 1 蛋白表达调节机制的研究 第一部分中英文摘要 摘要： p 2 l 是一种重要的细胞周期调控蛋白，它参与细胞的生长、分化、衰老及死 亡过程，同时又与肿瘤发生密切相关，在细胞的生理、病理过程中发挥重要的作 用。p 2 l 能够与c y c l i nd c d k 形成复合物使细胞周期停滞在g 1 期；它还可以通过c 端与p c n a 相互作用，阻断p c n a 活化d n a 聚合酶的活性从而抑f l i l j d n a 的合成， 使细胞周期停滞。 p 2 l 最初是作为p 5 3 的下游因子被发现的，它能够被p 5 3 转录激活，p 2 1 蛋 白的调控方式有转录和转录后两种调节方式。p 2 1 的转录水平的调控已经有很多 报道，而关于p 2 1 的转录后调控是近些年的研究热点。p 2 l 是极不稳定的蛋白， 在大多数细胞中，它的半衰期只有2 0 - 6 0r a i n ，所以有关p 2 1 蛋白稳定性的调节 对于探索一些病理、生理现象是非常重要的。 已经有研究发现，p 2 1 蛋白是通过蛋白酶体依赖的泛素化途径降解的。i n k 能够通过磷酸化p 2 1 稳定其表达，但其详细机制仍不清楚。 我们研究了在p 5 3 缺失的k 5 6 2 细胞中j n k 对砬l 蛋白稳定性的调节。我们 发现，h 2 0 2 能够强烈激活j n k ，而且激活所需时间只有3 0m i r a 而同样的h 2 0 2 可以在随后诱导胞内p 2 1 蛋白的积累。j n k 特异性抑制剂s p 6 0 0 1 2 5 和j n k l 的 活性突变体j n k l ( m u t ) 在定程度上降低了h 2 0 2 诱导的p 2 1 的蛋白量的积累。 同样被h 2 0 2 激活的e r k 就没有如此效应。我们进一步研究发现在k 5 6 2 细胞中 j n k l 与p 2 l 可以形成复合物，此结果与以前的研究结果相符。过表达j n k 能够 提高胞内p 2 1 的蛋白表达，而s p 6 0 0 1 2 5 减少了内源和过表达j n k l 诱导的p 2 1 蛋白表达。这些结果从正反两方面说明j n k 对p 2 l 蛋白表达具有重要的调节作 用。为了进一步阐明其调节机制，我们采用r t p c r 法研究j n k 对p 2 1 转录水 平的调节。结果发现，过表达野生型j n k 不影响内源p 2 l 的m r n a 水平，而且。 s p 6 0 0 1 2 5 和j n k 的活性突变体均不影响h 2 0 2 引起的p 2 l m r n a 水平的上升。 由此可以推断，k 5 6 2 细胞中j n k 对p 2 l 的调节发生在转录后水平的。随后的研 究结果发现，过表达野生型i n k ( 而不是j n k 的活性突变体) 能够延长p 2 1 蛋自 的半衰期，同样s p 6 0 0 1 2 5 能够减短h 2 0 2 引起的p 2 l 半衰期的延长。进一步的 研究发现，j n k 能够降低内源或转染的p 2 1 蛋白的泛素化程度，而s p 6 0 0 1 2 5 却 是增加了内源p 2 1 蛋白的泛素化程度。所有这些数据均表明j n k 能够通过降低 2 第一部分中英文摘要 胞内蛋白酶体依赖的p 2 1 蛋白的泛素化程度进两稳定p 2 1 蛋白的表达，这为今后 研究在应激通路中肿【对p 2 1 的调节机制提供了新的参考，为阐明一些重大疾 病的病理发生，寻求最佳的治疗方法提供理论依据。 关键词：p 2 1 ；烈k ；泛素化；蛋白酶体；如0 2 第一部分 中英文摘要 a b s t r a c t ： t h ec y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o rp 2 1 ，t h ep r o d u o to ft h ec i p l g e n e ，i s c r i t i c a lf o rr e g u l a t i o no ft h ec e l lc y c l ea n dd n a r e p l i c a t i o n i tp l a y sar o l ei nc e l l d i f f e r e n t i a t i o n , s e n e s c e n c e ，a n dm o d u l a t i o no fa p o p t o s i s p 2 1w a f l 肛i p l ( 9 2 1 ) i n h i b i t s t h ec e l lc y c l et h r o u g hi t si n t e r a c t i o nw i t hc y c l i n - c d kc o m p l e x e s a d d i l i o n a u y ，p 2 1 c a na c ta sa l li n h i b i t o ro fd n a r e p l i c a t i o nt h r o u g hi t sa s s o c i a t i o nw i t hp c n a ，a p r o t e i nr e q u i r e df o rp r o c e s s i v ed n as y n t h e s i s b i n d i n go fp 2 1t op c n aa f f e c t st h e a b i l i t yo f p c n at oa s s o c i a t ew i t ho t h e rf a c t o r sr e q u i r e df o rd n ar e p l i c a t i o n a l t h o u g hp 2 1i so r i g i n a n yc o n s i d e r e da sam a j o rm e d i a t o ro ft h eg 1g r o w t h a n e s ti n d u c e db ya c t i v a t i o no fp 5 3i nr e s p o n s et od n a d a m a g e , m o s to ft h es t u d i s o n p 2 1r e g u l a t i o n h a v ec o n c e n t r a t e do ni t s t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o nb y p 5 3 一i n d e p e n d e n tm e c h a n i s m s as e r i e so fn e ws t u d i e sh a v es h o w nt h a tp 2 1c a nb e r e g u l a t e dp o s t - t r a n s l a t i o n a l l y p 2 li sah i g h l yu n s t a b l ep r o t e i nw i t hah a l f - l i f eo f2 0 - 6 0r a i ni nm o s tc e l l s r e c e n ts t u d i e sd e m o n s t r a t et h a tp r o t e a s o m a ld e g r a d a t i o no fp 2 1i sr e g u l a t e db yt h e u b i q u i t i np a t h w a ya n ds u g g e s tt h a tt h es i t eo f t h eu b i q u i t i nc h a i ni sc r i t i c a li nm a k i n g p 2 1ac o m p e t e n ts u b s t r a t ef o rt h ep r o t e a s o m e i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w ea n a l y z e dt h er e g u l a t o r ye f f e c t so fj n ko np 2 lp r o t e i n a c c u m u l a t i o ni np 5 3n u l lk 5 6 2c e l l s r e s u l t so ft h i ss t u d ys h o w e dt h a tj n kw a s a c t i v a t e df r o m3 0m i na f t e rh 2 0 2e x p o s u r ea n dp 2 1e x p r e s s i o np e a k e da t4ha f t e r c e l l sb e i n gt r e a t e dw i t hh 2 0 2 s p 6 0 0 1 2 5 ( aj n k s p e c i f i ci n h i b i t o r ) a n df l a g - j n k a ( m u t ) ( ad o m i n a tn e g a t i v ec o n s t r 雠to fj n k l ) d e c r e a s e dh 2 0 2 - i n d u c e dp 2 1p r o t e i n u p - r e g u l a t i o n j n k ia s oe x i s t e da sac o m p l e xw i mp 2 】i nk 5 6 2c e l l s , w h i c hi n a c c o r d a n c ew i t hp r e v i o u ss t u d y o v e r - e x p r e s s i o no fj n k l ( w db u tn o tj n k l ( r o u t ) i n c r e a s e d e n d o g e n o u s p 2 lp r o t e i nl e v e la n ds p 6 0 0 1 2 5n o to n l yd e c r e a s e d e n d o g e n o u sb a s i cc e l l u l a rp 2 1p r o t e i nl e v e lb u ta l s oi n h i b i t e dt h ep 2 1p r o t e i n a c c u m u l a t i o ni n d u c e db yo v e r - e x p r e s s i o no fj n k l ( w d r t - p c rw a sp e r f o r m e dt o t e s tt h ee f f e c to fj n ko np 2 1 t r a n s c r i p t i o na c t i v i t y r e s u l t s s h o w e dt h a t o v e r - e x p r e s s i o no f 肿l ( w dd i dn o ti n c r e a s ep 2 1m r n al e v e l si nk 5 6 2c e l l sa n d 4 第一部分 中英文摘要 h 2 0 2s t i m u l a t i o ns i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dp 2 1m r n a , b u ts u c he n h a n c e m e n to fp 2 1 t r a n s c r i p t i o nw a sn o ta f f e c t e db yj n k l ( r o u t ) t r a n s f e c t i o no rs p 6 0 0 1 2 5t r e a t m e n t , s u g g e s t i n g t h a tj n kp o s t - t r a n s c r i p t i o n a l l ym e d i a t e d e n d o g e n o u s p 2 1p r o t e i n a c c u m u l a t i o n f u r t h e re x p e r i m e n t sf o u n dt h a t o v e r - e x p r e s s i o no fj n k l ( w 1 ) p r o l o n g e dt h eh a f t - l i f eo f p 2 1a n ds p 6 0 0 1 2 5r e d u c e dt h eh a l f - l i f ep r o l o n g e db yh 2 0 2 f i n a l l y , w ct e s tt h ee f f e c to fj n ko nu b i q u i t i n a t i o no fp 2 1i nv i v o r e s u l t ss h o w e d t h a ts p 6 0 0 1 2 5i n c r e a s e dt h eu b i q u i t i n a t i o nl e v e lo fe n d o g e n o u sp 2 1a n dj n k d e c r e a s e dt h eu b i q u i t i n a t i o no f e n d o g e n o u sa n dw a n s f e e t e d p 2 1 a l lt h e s ef i n d i n g si n d i c a t e dt h a tj n kc o u l dr e g u l a t ec e l l u l a rp 2 il e v e lv i a i n h i b i t i n gu b i q u r i n a t i o no fp 2 1 ，w h i c hp r o v i d e dan e wi n s i g h tf o ra n a l y s 吨t h e r e g u l a t o r ye f f e c to f p 2 1a f t e rs t r e s s k e y w o r d s ：p 2 1 ；j n k ；u b i q u i t l n a t i o n ；1 - 1 2 0 2 ；p r o t e a s o m e 5 第一部分第一章综述 第一章综述 第一节细胞周期调控蛋白p 2 1 w a h 廊7 1 研究进展 一细胞周期 2 0 世纪之前，有丝分裂和分裂间期的细胞通过显微镜显示出来。上世纪中叶 即1 9 5 3 年，s 丽r 、h o w 卸d 和p e l c 对细胞周期( c e l lc y c l e ) 进行了定义，他们将 细胞周期的循环过程划分为四个阶段：g 1 期、s 期、g 2 期和m 期( 图1 1 ) 。g 1 期 是为d n a 及蛋白质合成作准备；s 期是d n a 合成期；g 2 期是为有丝分裂作准 备；m 期进行有丝分裂。生物信息通过一系列复杂的信号传递过程来诱导相关 基因的表达、调控细胞分裂，决定细胞的转归，两次细胞分裂之间的周期大约为1 天。 图1 1 细胞周期进程 在随后的岁月中，生物先驱们对浓缩于细胞周期中的细胞生理情况不断探 索。早期实验技术的重要革新引发了许多使细胞同步的方法来探索细胞周期的发 展。1 9 8 3 年细胞周期素( c y c l 蛐被识别【1 】，随之生物化学和分子生物学方面的 研究迅速发展。1 9 8 9 年，h l m t 、r 1 1 d e r m a n 和他们的同事根据细胞周期过程中由 于在合成、磷酸化和分布等方面的不同而造成的细胞周期素表达峰度不同将其一 一识别 2 】。c y c l i n 分a 、b 、c 、d 、e 5 种。其中c 、d 、e 为g 1 期蛋白，在g 1 期和g i s 期交界处发挥作用；a 、b 为m 期周期蛋白，在g 2 舟d 期交界处发挥 6 第一部分 第一章综述 功能，诱导细胞分裂。 细胞周期蛋白激酶( c y e l i n - d e p e n d e n t k i n a s e $ ，c a k s ) 是一类重要的丝氨酸酪 氨酸蛋白激酶，由n u r s e 等在1 9 9 2 年发现，它以复合物的形式出现，其本身为催化 亚基，调节亚基为c y e l i n 【3 】。c d k s 周期性的激活和失活对于细胞的生长和增殖是 非常关键的【4 】。迄今发现c d k 有6 种，主要通过抑制r b 活性，促进细胞周期各时相 的转换。c y e l i n 能够激活e d k s 并在细胞周期的定阶段磷酸化特定底物，这是缅 胞周期进程中所必需【5 】。c d k s 的抑制因子( c k d 也已经被发现。这些抑制因 子属于两个家族：i n k 4 家族和c i p k i p 家族。其中i n k 4 家族成员包括：p 1 5 、p 1 6 、 p 18 和p 1 9 ，它们主要针对e y c l i nd e d k 4 6 发挥作用；c i p k i p 家族成员包括；p 2 1 、 p 2 7 和p 5 7 ，它们的特异性不高，能够抑制几种e y e l i n c d k 复合物。c k i 通过与 c y c l i n c d k 形成复合物使细胞g 1 期阻滞。这样c k i 与c y c l i n 在细胞周期、发育和肿 瘤发生过程中共同调节c d k s 的活性，使其达到平衡【6 】。 二细胞周期调控蛋白p 2 l 1 衄p 1 w a f l 是d e i r y 等人于1 9 9 3 年发现的一种能够被p 5 3 转录激活的基因。它 位于染色体6 p 2 1 2 ，它由1 6 4 个氮基酸组成，编码一种分子量为2 1 k d a 的蛋白， 因此命名为p 2 i 【7 】。p 2 l 的表达能够抑制人脑、肺、和结肠肿瘤细胞的生长。在 p 2 1 的编码区的上游2 4 k b 处有p 5 3 结合位点，因此能够被p 5 3 转录激活【8 】。p 5 3 肿瘤抑制基因是细胞分子信号级联指导发生致死性d n a 损伤的细胞进行自我毁 灭的关键【8 ，9 】，它能够激活特定序列的转录活性，能够被p 5 3 转录激活的基因 参与了p 5 3 的肿瘤抑制功能【1 0 1 。 p 2 1 通过其氨基末端与各种c y c l i n c d k 复合物相结合从而抑制其活性进而 导致细胞周期的阻滞 1 1 ，1 2 】。所以普遍认为p 2 1 是细胞周期依赖性激酶的抑制 因子( c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e i n h i b i t o r s ) 或c i p k i p ( c d k - i n t e r a e t i n g p r o t c i n k i n a s e i n h i b i t i o n p r o t e i n ) 。增殖细胞核抗原( p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a r a n t i g e n , p c n a ) 是1 9 7 8 年m i y a c h i 等在系统性红斑狼疮患者的血清中发现并提纯 的一种自身抗原【1 3 】，是d n a 多聚酶8 a n d 的辅助蛋白 1 4 ，d n a 合成必不可 少的因子。p 2 1 通过c 端与p c n a 相互作用，阻断p c n a 活化d n a 聚合酶的活性从 而抑制d n a 的合成使细胞周期滞( 图1 - 2 ) 。 7 第一部分第一章综述 2 l 图1 - 2p 2 1 与c y e l i n s c a k s 、p c n a 形成复合物 而在许多肿瘤细胞中，p c n a 和p 2 1 失去与e y e l i n c d k 复合物的结合，这种 结合对于细胞周期的阻滞作用减少，造成细胞的无限增殖，形成肿瘤。所以，普 遍认为p 2 l 与肿瘤发生密切相关。 三p 2 1 蛋白的调节机制研究进展 尽管p 2 1 最初是作为p 5 3 的下游目标因子被发现的，其活性受至i j p 5 3 的严密调 控，但近几年的研究发现，许多情况下p 2 1 蛋白的诱导表达是不依赖于p 5 3 调控的 【1 5 ，1 6 。 p 2 1 的蛋白通常通过转录调节和转录后调节两种方式 1 习。目前，关于p 2 1 的转录水平的调节已经有很多报道，但关于p 2 l 转录后蛋白稳定性调节机制的研 究还有待进一步阐明。p 2 1 蛋白在大多数细胞中是不稳定存在的，它的半衰期很 短，一般只有2 0 1 2 0 分钟。1 9 9 6 年，m i k h a i lv 等人研究发现，p 2 1 的表达与蛋 白酶体( p r o t e a s o m e ) 密切相关f 1 7 】。蛋白酶体包括两种形式：2 0s 复合物和2 6 s 复合物。蛋白酶体抑制剂乳胞素( 1 a c t a c y s t i n ，l c ，一种特异性蛋白酶体抑制 剂，能够选择性抑锟 2 0 s 蛋白酶体【1 8 1 ) 能够诱导内源p 2 1 蛋白水平的明显上升， 由此可以推断p 2 1 蛋白的不稳定存在与蛋白酶体依赖的降解途径相关。 2 0 0 1 年研究发现，在p 2 1 蛋白的c 末端存在着与其降解相关的信号区，此区 域能够与2 0 蛋白酶体的c 8 a 亚基直接相互作用从而介导体外p 2 1 的降解【1 9 】。泛 索与蛋白酶体是紧密联系在一起的，既然口2 1 蛋白的降解是蛋白酶体介导的，那 么这个降解过程是否与泛素相关昵? 2 0 0 3 年b l o o m 等人研究发现蛋白酶体介导 的p 2 1 蛋白的降解是通过泛素化途径调节的，p 2 1 的降解依赖于蛋白n 端的泛素化 【2 0 】。缅胞周期控制点之间的转换依赖于几种调控蛋白的泛素化或蛋白酶体依赖 的降解，而对于由蛋白酶体复合物引起的这些半衰期较短的蛋白的降解首先是将 第一部分第一章综述 多个泛素链共价结合到目标蛋白上2 1 - 2 3 ，进而发生降解。 目前，许多研究发现p 2 1 蛋白稳定性的调节对于研究细胞的增殖、分化、凋 亡等生理变化过程是非常重要的。p 2 1 蛋白的表达受到多种因素的调节，2 0 0 2 年 k a r i n b a r n o u i n 等人研究发现，h 2 0 2 能够通过上调p 2 1 的蛋白表达水平而引起多个 阶段细胞周期进稃的阻滞【2 4 。t g f 和e g f 能够通过延长p 2 1 蛋白的半衰期而提 升胞内p 2 l 水平【2 5 ，2 6 ，而s c f s k p 2 则促进了p 2 1 的泛素化降解【2 7 】。 第二节$ n k 信号通路的研究进展 一m a p k 激酶家族 丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n - a e t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ，m a p k ) 级联是真核 细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统，调节着机体细胞的生 长、分化、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等多种过程 2 s ，2 9 ，并在细胞 恶性转化等病理过程中起重要作用。m a p k 可由生长因子( e g f ) 、癌基因r 雒、 酪氨酸蛋白激酶、诱变剂佛波醇酯( p m a ) 及其它有丝分裂原刺激激活。m a p k 采用了进化保守的三级激酶级联的形式转导信号：细胞受刺激后激活m a p k 激 酶的激酶( m a pk i n a s ek i l l 硒ek i n a s e ，m k k k ) ，进而激活m a p k 激酶( m a p k i n a s ek i n a s e ，m k k ) ，m k k 激活后通过苏氨酸( r r ) 、酪氨酸( y ) 双位点磷酸化活 化调控m a p k 的活性 3 0 】。如图1 3 所示： 目前，已在哺乳动物细胞克隆和鉴定了细胞外信号调节蛋白激酶 ( e x t r a c e l l u l a r - s i g n a lr e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e ，e r r ：) 、e - j u r t 氨基末端激酶( c - i u n a m i n o - t e r m i n a lk i n a s e ，m k ) 、p 3 8 和e r k s b m k i ( b i gm a pk i n a s e1 ) 等m a p k 亚族 2 9 】。除e r k 5 亚族只有一个成员外，其余均由多个成员组成：e r k 亚族包 括e r k l 、e r k 2 ；p 3 8 亚族包括p 3 8 ( 吩、p 3 8 p 、p 3 8 7 和p 3 8 8 ；j n k 亚族包括j n k i 、 j n k 2 和j n k 3 。e r k 主要在有丝分裂原和生长因子的刺激下调控细胞的增殖和 分化 3 t ，j n k 和p 3 8s a p k 则主要被应激反应如氧化应激、渗透压的改变、炎 症反应因子等因素所激活 3 2 3 s 。 m e k k1 5 和m l k s 、g c k s 调控m k k 4 ，7 及m k k 3 6 ，前者进一步调 控j n k ，后者则调控p 3 8 e r i c 。i n k 核内作用靶目标是c - 2 j u n 、j u n b 、a t f 2 等； 9 第一部分 第一章综述 p 3 8 k k 的核内作用靶为g a d d l 5 3 、m a x 、m a p k 、a p k 2 ，后者可磷酸化激活 图1 3 m a p k 信号转导通路 转录因子c r e b ( c a m l 反应元件结合蛋白) 。实验证明p 3 8 的调控点在 g 1 s 期，僵s a p k 在这些途径中的作用及m a p k 和d 1 之间的作用机制仍有待 研究。 哺乳类细胞m a p k s 信号通路之间除了相互关联，还具有各自的独立性 【3 6 】。这种独立性的维持主要取决于每个反应级联蛋白激酶的底物特异性，另外 还与支架连接蛋白的产生有关。这种蛋白可以和m a p k 级联的多个激酶成分结 合，形成一个功能性信号传递模型，从而维持每一条m a p k 信号通路的特异性。 但是，并行的m a p k s 信号通路之间又存在着广泛的交互作用。这种交互作用几 乎存在于激酶级联传递的每个水平细胞对外界刺激的反应是综合着各个信号通 i o 第一部分第一章综述 路之间的激活或者抑制效应而产生的。m a p k 家族成员序列同源性大于4 0 ， 但不同的细胞外刺激能激活不同的m a p k 亚族，转而作用于不同的下游底物， 从而产生特定的细胞反应。而且，每个亚族包含多个亚型，不同亚型之间也具有 不同的特性。进一步实验表明，e r k 与细胞生长、增殖等发育过程相关；而j n k 与p 3 8 通路则与细胞凋亡相关。 m a p k 信号通路除参与细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种 生理功能之外，还在细胞恶性转化等病理过程中起重要作用。近年来发现m a p k 在细胞恶变和肿瘤浸润转移过程中起着重要作用【3 8 ，3 9 1 ，m a p k 的激活导致细 胞增生。肿瘤中可见到可刺激激活m a p k 的r a s 、s r e 及其它癌基因的活化。因 此，其与肿瘤的关系引起了学术界的广泛重视。m a p k 通路表达的抑制作用可能 改变肿瘤细胞对毒性损害的敏感性。另外，m a p k 在败血性休克( s e p t i cs h o c k ) 、 全身炎症反应综合征( s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e ，s i r s ) 和急性呼 吸窘迫综合征( a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a p , d s ) 等疾病的发生和进展 中起重要作用，阻断特定的m a p k 通路能减轻这些疾病症状 4 0 】。 总体上说，目前m a p k 信号通路成为国际细胞信号转导这个生物研究新兴 领域中的焦点。并且已经取得了一些进展，对其调控机制的研究正在逐步加深。 但仍存在很多问题需进一步阐明：( 1 ) e r k 、j n k 与p 3 8 激酶是否具有特异的生 物学功能；( 2 ) 不同的m a p k 通路执行不同的生理功能，其作用机制有什么不 同? ( 3 ) 不同m p a k 通路在执行不同生物学功能时其作用底物是否具有特异 性? 研究m a p k 作用机制的深入研究，并使我们利用这些知识来作为指导 m a p k 特异性抑制剂作用的分子基础，对于开发新的、更为有效和特异的m a p k 通路抑制剂，为临床治疗某些严重疾病提供新的药物，进而治疗恶性疾病，有着 重要的指导意义。 二, i n k 信号通路 1 9 9 1 年作为一种“p 5 4 微管相关蛋白”的新的m a p k ，j n k 被发现和纯化 4 1 】a 它具有两个不同于e r k 的特征：( 1 ) 能够被细胞应激( 如紫外线照射等) 所激活； ( 2 ) 磷酸化c - j u nn h 2 末端的6 3 和7 3 位点，而不是作用于c 2 末端的抑制位点。克隆 了编码此激酶的基因后，将人类的同源物称为c - j u nn h 2 末端激酶( j n k ) ，将大 第一部分第一章综述 鼠的同源物称为应激活化蛋白激酶( a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，s a p k ) 。另两个编 码j n k 家族成员的基因亦得以克隆。m k k k 、m k k 及j n k m a p k 家族成员构成 了j n k 级联反应。j n k 同样也含有两个磷酸化单元，t n f 或i l 1 或多种形式的环 境刺激如摩尔渗透压和氧化还原刺激、辐射等均可激活j n k 信号通路 4 2 】。 j n k 蛋白激酶由三个基因编码，其中j n k l 和j n k 2 是普遍表达的，相对来说， j n k 3 基因具有相对有限的表达形式，通常它只在大脑、心脏和睾丸中表达。这些 基因可选择性地拼接成l o 种j n k 的亚型1 4 3 ，4 4 。j n k 蛋白激酶是通过m k k 7 和 m k k 4 对其t h r 和t y r 位点的磷酸化而被激活。m e k 家族的两个成员m k k 4 ( s e k l ，m e k 4 ，j n k k l ，s k k l ) 和m k k 7 ( m e k 7 ，j n k k 2 ，s k k 4 ) 参与j n k s a p l 途径。它们最初都是通l 立c d n a 克隆而被鉴定的。其中m k k 4 在体外主要 使j n k s a p k 活化环中的酪氨酸磷酸化，而m k k 7 则主要使苏氨酸磷酸化，从 而激活j n k 4 5 1 。这些特异性上的差异表明这些酶可能共同发挥作用激活j n 甜 s a p k ，因而使得信号整合在一起。活化的j n k 可以和转录因子a t f 2 及c - j u n 的氨 基末端区域结合，使转录因子的活性区域发生磷酸化 4 6 ，4 7 】。不同的j n k 结 合及激活转录因子的能力不同，不同的j n l ( 所受的调节亦不同。j n k 也可使a p 1 其它的组份蛋白磷酸化，包括j u n b 、j u n d 和及e i k - i 4 2 】如图1 - 4 。肿对其底物 的磷酸化稳定了它们的表达。 0 a ( 用i i l ， p j x 忘甜诳a 、s k 嬷聪1 2 3 4 l 啦。k ， - k 唾m 强7j r l k , 1 - 2 细胞存活 c - j 嘲 仵2 e l k 0 细胞弼亡，分化 图1 - 4j n k 信号转导通路 1 2 第一部分第一章综述 许多研究证据表明，j n k 是细胞凋亡过程中的一个重要分子。j n k 信号通 路的激活是因为细胞受到一定的刺激。然而，j n k 在细胞对刺激作出反应中的作 用仍不清楚。j n k 也许是介导施加于细胞上的刺激的效果，另外一种可能是，j n k 的激活也许产生一种对细胞受到刺激而引发的保护作用。j n k 的特殊作用也许取 决于分子之间的相互联系。确实，i n k 信号通路已经同时与凋亡和存活通路交织 在一起。近年来许多证据表明i n k 在肿瘤的发生发展中发挥重要作用【4 8 】。 三j n k 与p 2 l 关系的研究进展 研究发现，j n k 的活化会影响细胞周期的进程，导致细胞周期的阻滞【4 9 。 已经有报道说明j n k i 与p 5 3 、p 2 l 形成复合物，从而对j n k l 的活性进行调节 5 0 。j n k l 能够与p 2 l 在胞内动态结合，当j n k l 从p 2 1 w 廿1 j n k l 复合物上脱 落后即被激活【5 h 。进一步研究发现，j n k l 能够在体内和体外通过对p 2 1 蝌”o 位点的磷酸化提高其蛋白稳定性 5 2 ，j n k 的活化能够提高胞内p 2 l 的蛋白表 达【4 9 】。 所有这些研究结果均表明，j n k 与p 2 1 之间存在着非常密切的关系。i n k 能 够提高胞内p 2 1 蛋白的表达，但其具体机制仍然不清楚，这种作用是否跟p 2 1 的泛 素化降解过程相关，有待于进一步研究。 本部分论文研究发现，i n k 能够通过降低蛋白酶体介导的p 2 1 的泛素化进程 稳定p 2 1 蛋白。这些研究结果为探索外界刺激诱导的p 2 1 蛋白积累过程中j n k 的调 节作用提供新的参考，为一些疾病发生机理的进一步阐明提供理论参考。 第一部分 第一章综述 参考文献 【l 】e v a n st ，r o s e n t h a le t ，y o u n g b l o mj ，d i s t e ld ，h u n tt c y c l i n ：ap r o t e i n s p e c i f i e db yr n a t e r n a m r n ai ns e au r c h i ne g g st h a ti sd e s t r o y e da te a c hc l e a v a g e d i v i s i o n c e l l1 9 8 33 3 ( 2 ) ：3 8 9 9 6 【2 】m i n s h u uj ，p i n e sj g o l s t e y nks t a n d a r tn m a e k i es ，c o l m a n 气b l o wj ， r u d e r m a nn h u n tt t h er o l eo f c y c l i ns y n t h e s i s , m o d i f i c a t i o na n dd e s t r u c t i o n i nt h ec o n t r o lo f c e l ld i v i s i o n j c e l ls c i 1 9 8 91 2 ：7 7 - 9 7 【3 】n o r b u r yc ，n u r s ep a a n i m a lc e l lc y c l e sa n dt h e i rc o n t r 0 1 k n n u ，r e v b i o c h e m 1 9 9 26 1 ：4 4 1 - 4 7 0 一 【4 】m o r g a ndo p r i n c i p l e so f c d kr e g u l a t i o n 1 9 9 5n a t u r e3 7 4 ：1 3 1 - 1 3 4 l 【5 】c r o s sf ，r o b e r t sj ，w e i n t r a u bh s i m p l ea n dc o m p l e xc e l lc y c l e s c e l lb i 0 1 1 9 8 9 5 ：3 4 1 - 3 9 5 1 6 s h c r rc lr o b e r t sj m c d ki n h i b i t o r s ：p o s i t i v ea n dn e g a t i v er e g u l a t o r so f o l - p h a s 口p r o g r e s s i o n g e n e sd e v 1 9 9 91 3 ：1 5 0 1 1 5 1 2 【7 】e l - d e i r yw s ，t o k i n ot ，v e l c u l e s c uv e ，l e v yd b ，p a r s o n sr t r e n tj m , l i nd ， m e r c e rw e ，k i l l z l e l k w ，v o g e l s t e i nb w a f l ，ap o t e n t i a lm e d i a t o ro f p 5 3t u m o r s u p p r e s s i o n c e l l1 9 9 37 5 ：8 1 7 - 2 5 8 】g i a e c i a , a j , k a s t a n ，m b t h ec o m p l e x i t yo fp 5 3m o d u l a t i o n ：e m e r g i n gp a t t e r n s f r o md i v e r g e n ts i g n a l s ，g e n e sd e v 1 9 9 81 2 ：2 9 7 3 - 2 9 8 3 【9 】p f i v e s ，c ，h a l ，p a t h ep 5 3p a t h w a y j p a t h 0 1 1 9 9 91 8 7 ：1 1 2 - 1 2 6 【i 0 v o g e l s t e i nb ，k i 叼e rk w p 5 3f u n c t i o na n dd y s f u n c t i o n c e l l1 9 9 27 0 ：5 2 3 一& 。， 1 1 】s h e a rc ，r o b e r t sj c d ki n h i b i t o r s ：p o s i t i v ea n dn e g a t i v er e g u l a t o r so f g l - p h a s e p r o g r e s s i o n g e n e sd e v 1 9 9 91 3 ：1 5 0 1 1 5 1 2 1 2 】n a k a n i s h im ，r o b e t o r y er s ，a d a m io r , p e r e i r a - s m i t ho m , s m i t hj r i d e n t i f i c a t i o no ft h ea c t i v er e g i o no ft h ed n as y n t h e s i si n h i b i t o r y g e n e p 2 i s d i l ，c 口i m 盯1 e m b oj 1 9 9 51 4 ：5 5 5 - 5 6 3 【1 3 】m i y a c h ik f r i t z l e rm j ，t a ne m a u t o a n t i b o d yt oan u c l e a ra n t i g e ni n p r o l i f e r a t i n gc e i l s j i m m u n 0 1 1 9 7 81 2 1 ：2 2 2 8 3 4 f 1 4 】k e l m a nz ，o d o n n e l lm 。s t r u c t u r a la n df u n c t i o n a ls i m i l a r i t i e so fp r o k a r y o t i c a n de u k a r y o f i cd n a p o l y m e r a s es l i d i n gc l a m p s 。n u c l e i ca c i d sr e s 1 9 9 52 3 ： 1 4 墨二堡坌 苎二兰堡垄 3 6 1 3 -