乳糖酶的生产技术及其在食品工业应用研究进展.doc

乳糖酶的生产技术及其在食品工业应用研究进展摘 要：乳糖酶亦称-半乳糖苷酶，在工业生产中有广泛的应用，本文通过来源及其性质、基础研究与应用等方面对乳糖酶进行综述。关键词：乳糖酶；固定化；应用乳是各种哺乳动物哺育其幼仔最理想的天然食物。它富含优质蛋白质、乳脂、乳糖等营养成分和钙、磷、钾等矿物质以及多种维生素，还含有多种免疫物质、酶、激素等具有生理活性调节功能的生物活性物质。乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，它是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖组成的双糖，其合成步骤为：以葡萄糖为前体物质，一部分葡萄糖先转化为半乳糖，然后经乳糖合成酶催化。半乳糖与葡萄糖结合，形成乳糖。人体摄入乳糖后，在消化过程中，经乳糖酶催化，分解为葡萄糖和半乳糖。乳糖是矿物质的载体，能促进钙、磷吸收及整理肠道，其分解产物半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，参与脑组织及其神经系统的构成。但是，机体却不能直接利用乳糖，乳糖必须经乳糖酶分解为单糖后才能被吸收和利用（杨卉新等，2014）。若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹涨、肠鸣、肠绞痛直至发生水泻等症状，总称为乳糖不耐受症。乳糖不耐受症状，在中国人群中发生率很高，因此限制了很大一部分国人对牛奶的摄入，而牛奶又是人类良好的优质蛋白、矿物质及维生素的天然来源，故乳糖酶缺乏问题显得尤为突出（张玉英，2014）。1889年荷兰生物学家，Beijerineek 首次报道了乳糖酶可水解乳糖以来，人们对于乳糖酶的研究日趋完整（蒋世琼，2000）。目前，解决乳糖不耐受的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖来生产低乳糖或无乳糖乳制品。而现在商业乳糖酶中乳糖酶的最适温度在 37左右或者更高（P Nicholas，2002）。国外学者经多年研究，已成功地找到产乳糖酶的微生物，并研制了一系列乳糖酶商品，现已投入市场。有学者研究发现环氧活化水凝胶固定化酶可以更好的解决乳糖不耐症问题（Elnashar et al., 2014）。本文就乳糖酶的生产方式及其在食品加工业生产中应用的研究进展作简要论述。1. 乳糖酶的来源及特性1.1乳糖酶乳糖酶，又称-半乳糖苷酶，或-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，它的作用就是在特定的条件下水解-D-半乳糖苷键，将乳糖水解成-D-葡萄糖和-D-半乳糖，乳糖酶同时也具有半乳糖苷的转移作用，能把半乳糖连接到乳糖上，生成低聚半乳糖，作为一种益菌作用因子而用于功能性食品的开发（张红艳等，2004）。乳糖酶是一种白色粉末，无嗅，无味，溶解后是一种浅棕色的液体，是一种无毒副作用的生物酶制剂，已由FDA、FCC、WHO/FAO和JACFA等权威机构评审确定为安全物质，我国卫生部已于1998年10月同意将其列入食品添加剂卫生使用标准GB2760之中，允许在食品工业生产中使用。1.2 乳糖酶的来源 天然来源的乳糖酶：乳糖酶(-半乳糖苷水解酶；E C3.2 1. 23)即乳糖水解酶，主要存在于年幼动物肠道、植物、真菌、酵母和细菌中。许多微生物能产生乳糖酶，细菌中有乳酸菌、芽抱杆菌、大肠杆菌、嗜淀粉乳杆菌等（Mahalakshmi et al., 2013）；霉菌有米曲霉、黑曲霉、疏球曲霉；酵母菌有脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸酵母等；放线菌有天蓝色链球菌等。国内外学者经过多年的研究已成功研制出了一系列商品乳糖酶，标志着乳糖吸收不良研究史上的一次飞跃。商品来源的乳糖酶:酵母菌和霉菌。目前，国际市场的乳糖酶产品，一种是克鲁维酵母制备的乳糖酶。另一种是米曲霉制备的真菌乳糖酶。克鲁维乳酸酵母发酵的乳糖酶.这种乳酸母杆菌最先是山伯约尼克1889年发现的。随着1950年发现了乳糖不耐症的病因，1960年研制出乳糖酶，才得以应用（H.Chick et al., 2001）。1.3 乳糖酶的酶学特性很多微生物都能生产乳糖覆盖，例如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉所产的胞外乳糖酶和脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产的胞内乳糖酶。乳糖酶性质随来源不同而异，不同的性质又决定了不同乳糖酶的特殊用途（张敏文等，2011）。表1 不同来源的乳糖酶的性质来源最适pH最适温度分子量活化金属离子湿热乳酸菌6.2-7.555-57530-保加利亚乳杆菌7.042-45*-大肠埃希菌7.240540Na+、K+脆壁酵母6.637201Mn+、K+乳酸酵母6.9-7.335135Na+、Mn+黑曲霉3.0-4.055-60124*米曲霉5.050-5590*注: *表示尚不清楚，- 表示没有2. 乳糖酶的生产技术2.1基因工程技术在乳糖酶生产中的应用基因工程技术，对于乳糖酶的生产可以将活性高的乳糖酶基因导入易于培养、生长繁殖迅速的微生物体内，从而大大降低成本。如Domingues等利用絮状酿酒酵母和黑曲霉中含有编码分泌胞外乳糖酶的lacA基因构建重组菌株，使重组酿酒酵母菌株能够分泌乳糖酶，且该乳糖酶可以高效利用乳糖。为提高酶的产量和质量，常采用定点诱变，原生质体融合和DNA重组技术（Domingues L et al., 2000）。Ibrahim等使用化学诱变剂对2株双歧杆菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌进行诱变，然后筛选高产菌株。通过与其各自野生型菌株相比，诱变后菌株产酶量明显增加，长双歧的诱变菌株产酶量比野生型增加2倍多（Ibrahim S A et al., 2000）。为了进一步获得高产菌株，新的基因工程菌不断出现。生产酶的工程菌以大肠杆菌、酵母菌为主，此外还有嗜热链球菌、乳杆菌等。通过PCR扩增从乳酸克鲁维酵母基因组获得乳糖酶基因lac4，将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)，并在大肠杆菌BL21中获得表达，酶活性达44.78UmL(徐顺清等，2010)。此外，还有研究者探究了突变基因对于乳糖酶生产的影响。此前的研究已经发现，硫化叶菌的突变体F441YE产生-半乳糖苷酶能增强低聚半乳糖的产率，但由于大肠杆菌的表达系统的一些特性，如形成包涵体和复杂的过程控制技术，故Xiaojun Sun等用PCR扩增此突变基因并在毕赤酵母表达，优化了其生产低聚半乳糖的工艺条件（Xiaojun Sun et al., 2014）2.2乳糖酶的固定化技术固定化酶与游离酶相比，固定化酶具有许多优点，如：固定化酶很容易与底物、产物分离，并可反复使用，可以在较长时间内进行反复分批催化反应；有一定的机械强度，可以在柱式反应器中连续使用，适用于工业化大规模生产；不仅使催化成本降低，而且能大大减少生物催化剂制造过程的废物排放与操作污染；固定化酶在节约能源资源，降低成本，保护环境，生产自动化、连续化等许多方面都十分有利。酶的固定化方法有包埋法、吸附法、共价结合法等。2.2.1包埋法潘晓亚等人在2006年用明胶作为固定化乳糖酶的载体，优化固定条件，酶活力回收率最高可达78.12%，重复回收使用7次后，酶活力还可以保留75%以上，没有谈及机械强度问题（潘晓亚，2006）。Thi Hai Anh Mai等研究发现在藻酸胶中加入羧甲基纤维素有助于提高乳糖酶的固定化的产率和固定化的酶的活性，推测原因可能是羧甲基纤维的加入减少了固定化过程中藻酸胶珠蛋白质的损失并增加其比表面积，并指出当羧甲基纤维素和藻酸胶的质量比为1.0:1.5时，固定化产率可达58.2%，比单独使用海藻胶固定得率高了14.2%（Thi Hai Anh Mai et al., 2013）。张锐制备了羧甲基纤维素- 壳聚糖复合物，氧化羧甲基纤维素- 壳聚糖复合物，氧化羧甲基纤维素-壳聚糖酯复合物，并分别以其为载体优化了固定化乳糖酶的条件并测定了固定化酶的性能，结果表明氧化羧甲基纤维素-壳聚糖复合物固定化酶的活力高，相对于其他两种载体，更有望应用于食品领域（张锐，2010）。杨佳越等用明胶和海藻酸钠作为载体包埋固定化乳糖酶，比较了固定化乳糖酶随贮藏温度及适宜溶解pH值条件下没活力的变化（杨佳越，2013）。2.2.2 吸附法刘芳采用溶胶凝胶法制备多孔玻璃载体，以所制多孔玻璃为载体，优化后固定化乳糖酶的活力回收率分别为20.13%。此种固定化酶稳定性较好，机械强度高，可以重复多次回收使用，具有良好的经济效益。 (刘芳，2008)。Gurdas等以离子交换树脂A568为载体，采用吸附的方法对-半乳糖苷酶进行固定化，研究发现固定化后的酶在所有温度下的活性均高于游离酶，且固定化的最适pH相较游离酶从6.0往碱性方向偏离了0.5（Gurdas et al., 2012）。2.2.3 共价结合Joey Talbert等研究发现乳糖酶与微球共价结合后，其表面的羧酸浓度越高，酶活保留量越小，而在固定化之前用葡糖胺修饰则可显著提高酶的固定化之后的活性(Joey Talbert et al., 2012)。Wong Dana E等将乳糖酶共价附着于低密度聚乙烯（LDPE）得到活性包装组件，通过在交替组装聚乙烯亚胺、戊二醛（GL）和乳糖酶，从而提高蛋白质总量即乳糖酶的活性，用于在无乳糖乳制品的生产包装（Wong Dana E et al., 2013）。2.2.4 其他协同方法钱婷婷等人通过反相悬浮聚合法，以甲基丙烯酸2-羟乙酯（HE-MA）与甲基丙烯钱婷婷酸缩水甘油酯（GMA）为单体，过硫酸铵为引发剂制备得到改性磁性壳聚糖微球。进一步以改性磁性壳聚糖微球为载体,通过吸附、共价结合以及戊二醛交联反应三方协同作用固定乳糖酶。对影响固定化的各种因素进行优化,最终所得的固定化乳糖酶活为685U/g载体，酶活回收率为34.3%。固定化后的乳糖酶的pH稳定性和热稳定性都较游离酶有明显提高;连续操作10次后，固定化酶活仍保持在70%以上,具有良好的操作稳定性(钱婷婷，2011)。3. 乳糖酶在食品工业中的应用3.1在乳产品中的应用在发酵过程中，一般酸奶仅有 20%左右的乳糖被分解， 如果使用中性乳糖酶来水解乳糖， 最高可达 90%的乳糖被分解。在相同的条件下， 乳糖酶水解乳制造的酸乳， 可以缩短乳凝固的时间 35-40%，而且产品又具有较高的粘度， 乳香味更浓， 口感更佳。 另外，在低乳糖酸奶中， 由于乳酸菌生长繁殖的速度较快， 菌数的含量增高， 还可明显的延长发酵乳的货架期寿命（姜旭，2014）。3.2低聚半乳糖的生产低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖为原料，经 -半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，生成半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖苷聚合到葡萄糖端部，从而形成不同聚合度的低聚半乳糖，且有改善便秘、防癌、缓解过敏等生理活性。（Buddhi P Lamsal, 2012）。从机制上看，最近有研究发现了从环状芽孢杆菌ATCC31382中得到的半乳糖苷酶在C末端肽区域包含有一个盘状区域，此区域在抑制低聚半乳糖生产中发挥核心作用，但其作用机理还有待进一步研究(Song Jingyuan et al.,2013)。低聚半乳糖具有较强的耐酸性、耐热性，不会因为在加工过程中的高温杀菌及人体胃酸所分解而失去其本来应有的特性，而且能有效地被双歧杆 B 菌和乳酸杆 A 菌同时利用（Ah Reum Park et al., 2012）。就科学研究而言，从生物体中提取活性更高的乳糖酶，是当前研究的热点。如Cavalcante Braga等从两种来源不同的酵母菌中分离纯化了-半乳糖苷酶，并对其pH、最适温度、热稳定性、热力学和动力学参数以及水解乳糖和生产低聚半乳糖的能力进行测定，结果表明，纯化之后的酶具有更高的最适温度，且使用两种纯化的酶时，低聚半乳糖，低聚半乳糖的含量都增加了30%以上(Cavalcante Braga et al.,2013)。从工业生产来看，主要是以浓缩的乳糖糖浆为原料，用乳糖酶通过酶促反应生产低聚半乳糖来实现其商业化生产，且乳糖酶浓度能达到20-40g/100g，这么高浓度的酶可能是一种精制乳糖或浓缩的乳清渗透物（Buddhi P Lamsal, 2012）。4展望本文对乳糖酶的性质和来源进行了研究，介绍了乳糖酶在食品工业中的应用。目前制备乳糖酶的方法主要有基因工程技术和固定化技术，两种方法均具有较高的得率和纯度，且方便使用。目前国内外研究主要从以下几个方面着手，从工业发酵方面，主要是培养基优化，诱导因子的添加以及发酵模式，条件和提取工艺的优化分离提纯等；筛选高产菌株，诱变育种；通过基因工程和固定化酶等的深入研究得到质量更高的乳糖酶；酶的改性技术；基因水平上探究原发性乳糖不耐症的机理等。随着人们对乳制品营养价值认识的日益提高和对乳糖酶研究的加深，相信在不久的将来，乳糖不耐症将不再成为困扰，牛奶也会更广泛的为人们所用。参考文献Ah-Reum Park, Deok-Kun OhGalactooligosaccharide production using microbial Beta -galactosidase: current state and perspectivesJ. 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