（生物化学与分子生物学专业论文）凝血因子Ⅷ的纯化.pdf

摘要 凝血因子是目前一种重要的临床用药，广泛应用于甲型血友病、血管性血 友病、纤维蛋白原缺乏症、获得性凝血因子缺乏症、弥漫性血管内凝血、获得 性凝血因子抑制物所致疾病等疾病，受到医药工业的高度重视。用于临床的凝 血因子主要是从血液中分离出来的。过去几十年间，治疗血友病甲的凝血因子 浓缩物不断取得进展。凝血因子分离制备方法主要有甘氨酸沉淀法、p e g 分段沉淀法、p e g 甘氨酸沉淀法、肝素酸性沉淀法等。9 0 年代，随着凝胶层析 技术的生产应用日益成熟，层析介质的开发，越来越多的凝胶过滤提纯法、离子 交换层析法、疏水层析法、单抗亲和层析等方法应用于凝血因子的产业化制备。 我国现在用于治疗的凝血因子都是血液来源的，国外的重组凝血因子在中国 的注册还没有获批。目前由于原料血浆供应不足，凝血因子产量的骤减导致了 临床供应的紧张。华兰生物股份有限公司是我国能生产凝血因子的四家生物公 司之一。目前采用p e g 沉淀法制备的血源凝血因子，虽然工艺成熟可靠，但 凝血因子比活( 3 5 i u m g ) 和回收率较低。离子交换层析法有利于微量血浆 蛋白的工业化分离，且能通过层析容易地去除病毒灭活s d 试剂而无需其它额外 的去除方法，整个过程简单易行；故计划引入离子交换层析法来提高凝血因子 的比活和回收率。 凝血因子原料为血浆，纯化工艺为新鲜冰冻血浆一p e g 沉淀一s d 处理一 离子交换层析。实验中采用d e a e 6 5 0 m 阴离子胶作为层析介质来纯化凝血因子 。影响离子交换层析的因素有离子强度、p h 、温度和流速，本文主要探讨离 子强度和p h 对离子交换制备f 的影响。先采用线性梯度洗脱法，初步筛选制 备凝血因子平衡缓冲液含氯化钠的浓度范围和洗脱缓冲液中氯化钠的浓度；然 后在同一p h 条件下，改变平衡缓冲液中氯化钠的含量，计算在每种平衡缓冲液 下凝血因子的回收率和比活，选择最佳的平衡缓冲液的氯化钠的含量；再在同 一离子强度条件下，改变p h 值，通过计算凝血因子回收率和比活，选择最佳 p h 值。最后通过正交法去验证不同离子强度和p h 值组合，从而筛选出最佳组 合。本实验可以看出离子强度和p h 值均能不同程度地影响凝血因子的制备。 在实验范围内，平衡缓冲液中含1 3 5 m m o l l 氯化钠和p h 为6 8 为最佳组合。不 论小试还是中试放大效果都很好。本工艺通过对离子强度和p h 的筛选，制备人 高纯凝血因子的可行性，获得了满意的结果，凝血因子比活在1 2 0 i u m g 以 上，总纯化倍数达1 5 0 0 倍( 经p e g 沉淀s d 灭活后样品的比活为0 0 8 i u m g ) 以上，收率为9 0 。该工艺简单、成本低、回收率和比活高。 关键词：凝血因子，离子交换层析，离子强度，p h 值 a b s t r a c t c o a g u l a n tf a c t o r h a sd i v e r s ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n a n db e c a u s eo ft h i si th a sb e e n e x t e n s i v e l yu s e di nc l i n i c i tw a su s e dt oc u r ea r m o u rh e m o p h i l i a ，v w d ，f i b r i n o g e nd e f i c i e n c y , a c q u i r e dc o a g u l a n tf a c t o r d e f i c i e n c y , d i s s e m i n a t e di n t r a v a s c u l a rc o a g u l a t i o n ，a c q u i r e d c l o t t i n gf a c t o r ss u c ha sd i s e a s ec a u s e db yv mi n h i b i t o r s ，e ta l ，a n dw a sh i g hr e g a r e db ym e d i c i n e i n d u s t r y t h ec o a g u l a n tf a c t o r w h i c hw a su s e di nc l i n i c a lw a sf r o mt h eb l o o d o v e rt h ep a s t f e wd e c a d e s ，c o n c e n t r a t i o no fc o a g u l a n tf a c t o r u s e df o rt r e a t i n gh e m o p h i l i aaa r ep r o g r e s s i n g e a r l yt r e a t m e n ti sa ni n f u s i o no ff r e s hb l o o do rb l o o dp l a s m ac o n s i s t i n go fb l o o d - c l o t t i n ga g e n t s ，b u tb yi n f u s i o nq u a n t i t y , t h ee f f e c tn o tb e a u t i f u l b u ti n s t e a do fp l a s m a ，b l o o d - c l o t t i n ga g e n t s c o n t a i n i n gc o h n sic o m p o n e n t si ss t i l ld i f f i c u l tt os a t i s f a c t o r ye f f e c t i nt h em i d 一19 6 0 s p o o l f i r s td i s c o v e r e dt h a tt h ep l a s m ac o l dp r e c i p i t a t i o ne n r i c h e df a c t o r a c t i v i t y , a n di n t r o d u c e dt h e p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o nm e t h o do fc o l dp r e c i p i t a t i o n ，t h e r e b yo p e n e d an e we r ao f l o o d - c l o t t i n ga g e n t s c o m p e n s a t i o nt h e r a p y s e p a r a t i o na n dp r e p a r a t i o nm e t h o d so fc o a g u l a n t f a c t o r a r em a i n l yg l y c i n e p r e c i p i t a t i o n ，p e g s u b s e c t i o n p r e c i p i t a t i o n ，p e g - g l y c i n e p r e c i p i t a t i o n ，h e p a r i n a c i d i cp r e c i p i t a t i o ne t c i nt h e19 9 0 s ，w i t ht h em a t u r a t i o no fp r o d u c t i o n a n da p p l i c a t i o no ft h eg e l c h r o m a t o g r a p h yt e c h n o l o g ya n dp r o t e i nv a c u u mf r e e z e - d r y i n g t e c h n o l o g y , m a n ym e t h o ds u c ha sf i l t r a t i o np u r i f i c a t i o nm e t h o da n dg e lc h r o m a t o g r a p h y , i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , w a t e rr e s i s t a n c ea n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ya p p l i e ds u c c e s s f u l l yi n t h ei n d u s t r i a l i z e dp r e p a r a t i o no fc o a g u l a n tf a c t o r c o a g u l a n tf a c t o r f o rt h et r e a t m e n ti sn o w f r o mt h es o u r c eo ft h eb l o o di no u rc o u n t r y , f o r e i g nr e c o m b i n a n tc o a g u l a n tf a c t o r i nc h i n a h a s n ta p p r o v e dr e g i s t r a t i o n r e d u c e dp r o d u c t i o no fc o a g u l a n tf a c t o r i nt h ec l i n i c a ls u p p l y r e s u l t si nt h ep l a s m as h o r t a g en o w h u a l a nb i o e n g i n e e r i n gc o ，l t di so n eo ff o u rb i o t e c h n o l o g y c o m p a n i e sc a p a b l eo fp r o d u c i n gc o a g u l a n tf a c t o r b u tc o a g u l a n tf a c t o r f r o mt h es o u r c eo f t h eb l o o di sm a d eb yp e gp r e c i p i t a t i o nm e t h o d s b e c a u s et h ep u r i t ya n dp e r c e n tr e c o v e r yo ft h e c o a g u l a n tf a c t o r a r el o w , w ew i l la d o p ti o ne x c h a n g em e t h o dt oi m p r o v e t h e r e f o r ei t i s n e c e s s a r yt od e v e l o pp u r i f i c a t i o nm e t h o d o l o g ys a t i s f i e dw i t ht h es i m p l ep r o c e s s ，l o w e rc o s t , h i g h e rp e r c e n tr e c o v e r ya n ds p e c i f i ca c t i v i t y t h er a wm a t e r i a l so fc o a g u l a n tf a c t o r i st h ep l a s m a a n dt h ep u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yi sf r e s h f r o z e np l a s m a p e gp r e c i p i t a t i o n s dh a n d l i n g i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i ta d o p t s d e a e 6 5 0 ma n i o n i cg e lf o rc h r o m a t o g r a p h ym e d i u mt op u r i f yc o a g u l a n tf a c t o r i nt h e e x p e r i m e n t s i n f l u e n c ef a c t o r so fi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yh a v ei o n i cs t r e n g t h ，p h ， t e m p e r a t u r ea n dv e l o c i t y , t h i sp a p e rm a i n l yd i s c u s s e st h ei o n i cs t r e n g t ha n di n f l u e n c eo ft h ep ho n i o ne x c h a n g ep r e p a r a t i o nf o rf a c t o r t h el i n e a rg r a d i e n te l u t i o nm e t h o d ( 1 3 0 - 3 0 0 m m o l l s o d i u mc h l o r i d e ) w a sa p p l i e di nt h ep r e l i m i n a r ys c r e e n i n gf o rd e t e r m i n i n gt h es o d i u mc h l o r i d e s c o p eo fs t a r tb u f f e ra n ds o d i u mc h l o r i d ec o n t e n to fe l u t i o nb u f f e r t h e nt h ed i f f e r e n ts o d i u m c h l o r i d ec o n c e n t r a t i o nf r o m13 0 - 15 0 m m o l l ( i n c l u d i n g13 0 m m o l l ，1 3 5 m m o l l ，14 0 m m o l l a n d15 0 m m o l l ) w a ss e l e c t e da s t h es t a r tb u f f e r ( p h 6 8 ) ，a n dt h eb e s ti o m cs t r e n g t hw a s d e t e r m i n e db yf a c t o r r e c o v e r ya n ds p e c i f i ca c t i v i t yi ne l u e n t t h ed i f f e r e n tp hv a l u ef r o m 6 2 - 7 0 ( i n c l u d i n g6 2 ，6 5 ，6 8a n d7 0 ) w a ss e l e c t e da ss t a r tb u f f e r ( i n c l u d i n g13 5 m m o l ls o d i u m c h l o r i d e ) 。a n dt h eb e s tp hv a l u ew a ss e l e c t e da c c o r d i n gf a c t o r r e c o v e r ya n ds p e c i f i ca c t i v i t y i ne l u e n t f i n a l l y ，t h eo p t i m a lc o m b i n a t i o no fi o n i cs t r e n g t ha n dp hv a l u eo fs t a r tb u f f e rw a s g o t t e nb yo r t h o g o n a lp o r t f o l i oo fd i f f e r e n ti o n i cs t r e n g t h ( i n c l u d i n g13 0 m m o l l ，13 5 m m o l la n d 1 4 0 m m o l l ) a n dp hv a l u e ( i n c l u d i n g6 2 ，6 5a n d6 8 ) t h i se x p e r i m e n tc a nb es e e nt h ev a l u eo f i v i o n i cs t r e n g t ha n dp hc a nb ea f f e c t e dt ov a r y i n gd e g r e e sf a c t o r p r e p a r a t i o n t h es c o p eo ft h e e x p e r i m e n t ，b a l a n c e db u f f e rc o n t a i n i n g 13 5 m m o l ls o d i u mc h l o r i d ea n dp h6 8f o rt h eb e s t c o m b i n a t i o n w h e t h e rs m a l lo rp i l o tt e s tr e s u l t sw e r ev e r y9 0 0 dz o o m t h es c r e e n i n go fi o n i c s t r e n g t ha n dp hi nt h ep r o c e s s i tw a sf e a s i b i l i t yt op r e p a r a t eh i g h - p u r i t yh u m a nf a c t o r i tw a s o b t a i n e ds a t i s f a c t o r yr e s u l t s f a c t o r s p e c i f i ca c t i v i t yc o u l da c h i e v em o r et h a n12 0 i u m g t h e m u l t i p l eo ft h et o t a lp u r i f i c a t i o nw a s15 0 0 一f o l da b o v e ( t h es a m p l es p e c i f i ca c t i v i t yw a s 0 0 8 f u m ga f t e rp e gp r e c i p i t a t i o ns di n a c t i v a t e d ) t h ey i e l dw a s9 0 t h ep r o c e s si ss i m p l e ， l o wc o s t ，h i 【g hr e c o v e r ya n ds p e c i f i ca c t i v i t y k e yw o r d s ：c o a g u l a n tf a c t o r ，i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , i o n i cs t r e n g t h ，p hv a l u e v b p v b 1 9 d i c f h a h a v h b v h c v h i v p df v ! p e g r f v w d v w f 缩略语表 b o v i n ep a p i l o mv i r u s h u m a np a r v o v i r u sb19 d i s s m i n a t e di n t r a v a s c u l a rc o a g u l a t i o n f a c t o r h e m o p h i l i aa h e p a t i t i sa v i r u s h e p a t i t i sbv i r u s h e p a t i t i sc v i r u s h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s p l a s m a - d e r i v e df p o l y e t h y l e n eg l y c o l r e c o m b i n a t ef a c t o r v o nw i l l e b r a n dd i s e a s e v o nw i l l e b r a n df a c t o r 牛乳头状瘤病毒 人类微小病毒b 1 9 弥漫性血管内凝血 凝血因子 甲型血友病 甲型肝炎病毒 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人类免疫缺陷病毒，艾滋病病毒 血液来源的f v i 聚乙二醇 重组凝血因子 血管性血友病 血管性血友病因子 v 独创性声明 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河南师范大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：敷雌日期卫仁 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：曙乏监导师签名：复严日期：2 竺与l 5 5 第一章文献综述 1 1 前言 第一章文献综述 血浆大分子糖蛋白凝血因子( f a c t o r ，f ) 在循环血液中与血管性血友病因 子( v o nw i l l e b r a n df a c t o r ，v w f ) 以复合物的形式存在；凝血反应中，f 是因子的 辅因子，在c a ：+ 和磷脂存在的情况下激活因子x ，从而延续和加速凝血过程。f 在凝 血酶生成的内源性和外源性两条途径中都起着巨大的作用。另外它还是甲型血友病 ( h e m o p h i l i aa ，h a ) 患者的救命药。目前h a 主要治疗方法是给患者输注含有f 的血制 品替代治疗，但由于曾出现过血源严重污染情况，致使有的患者先后感染乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒和或艾滋病病毒，引起输血相关并发症，因此应用安全的f 替代治疗便 成了最佳的选择【1 3 】。如果血液来源的f ( p l a s m a d e r i v e df ，p d f v i d ) 制剂纯度不够 高( 含有过量的杂蛋白或活病毒) 就可能引起发热、溶血与免疫异常等副反应【4 】。纯度 越来越高的p d f v $ 浓缩物在h a 的治疗中发挥了巨大的作用【5 6 】。因此关于此蛋白质的纯化 研究变得很重要。目前我国原料血浆供应不足，f 产量的骤减导致了临床供应的紧张。 华兰生物工程股份有限公司是我国生产f y $ 的四家生物公司之一，目前采用p e g 沉淀法 制备的血源f v i ，虽然工艺成熟可靠，但f 的比活( 3 5 i u m g ) 和回收率较低。前处理 方法的不同，后期纯化的方法也不尽一样，目前主要采取低温乙醇法、凝胶过滤法、离 子交换层析法、亲和层析法等方法。尽管采用亲和层析可获得超高纯的f 制剂( 按当 前f 的纯度标准，高纯的比活在1 0 0 - 2 0 0 i u m g 左右，超高纯的比活在1 0 0 0 i u m g 以上) ， 但存在污染鼠免疫球蛋白的危险，反复输注f 会引起免疫异常；而离子交换层析法有 利于微量血浆蛋白的工业化分离，且能通过层析容易去除病毒灭活s d 试剂而无需其它 额外的去除方法，能保持蛋白质的分子构象，整个过程简单易行；故计划引入离子交换 层析法来提高f 的比活和回收率。因此研究开发出一条工艺简单、成本低、回收率和 比活高的纯化工艺具有巨大的经济价值和社会效益。 本章对f 的特点、结构、安全性等进行了简要介绍，并在此基础上总结f 的制备 方法，介绍了离子交换的原理和影响因素，最后指出了本课题的研究内容和研究意义。 凝血冈子的纯化 1 2 生化分离的特点以及要求 分离技术属于生物下游加工技术。下游加工技术包括产物的提取、浓缩、纯化以及 成品化等。下游加工过程占生物加工过程总成本的8 0 - - 9 0 ，因此在生物加工过程中 占很重要的地位。下游加工过程中每步的回收率不能达到1 0 0 ，如果能设计合理的下 游加工过程就可以大大降低生物加工过程的生产成本【7 , 8 1 和回收率。 生化产品的分离有下列特点 1 初始原料成分相当复杂。初始原料中除了产物还含有大量的细胞、代谢物和无 机盐等。 2 目的产物含量较低。 3 生物活性物质的稳定性较差。一般的生物活性物质对p h 值、温度、金属离子、 有机溶剂等都非常敏感。 4 生化产品种类繁多，分子量范围分布广泛，而且这些生化产品的结构和性质复 杂又各异。 5 生化产品应用面广。许多产品用作医药、食品、试剂等，因此对含量和纯度要 求不同。 2 发酵液或者培养液 f 恚一 z 基i | 笔i 上 一、 上 i 1 离心或过滤il 离心或者过滤i 厂裔恕或著过滤一 ! 一 干燥 细胞破碎 整体细胞萃取 占 厶 产物 离心或者过滤l l - 巴黔婴坠： 一萃取过滤等1 1 一i 产物 _ 一干燥k 一 精制层析、结晶等 图1 1 生化产品分离纯化的一般步骤 第一章文献综述 基于生化产品的特殊性，应用于生化产能品的后处理过程中的分离纯化技术必须满 足一下一些要求： 1 条件合适，特别对具有生物活性的物质。 2 分离纯化技术的选择性好、专一性强，能从复杂的混合物中有效将目的产物分 离出来，以达到较高的分离纯化倍数。 3 目的产物的量和活性具有较高的收率。 4 在提高单个分离技术的收率的同时，注意各个单元间的有效组合和整体协调， 以减少工艺过程的步骤。 5 快速，以保持较高的生产能力及目标产品的稳定性。 6 2 0 世纪9 0 年代，随着层析技术的生产应用日益成熟，层析介质的开发，越来越 多的凝胶过滤提纯法、离子交换层析法、疏水层析法、单抗亲和层析等方法应用于生物 产品的产业化制备。 1 3 凝血因子简介 1 3 1 凝血因子 国际凝血因子命名委员会规定以罗马数字命名的凝血因子i xi i i ，其中因子是 因子v 的激活态，现已被废除，加上高分子量激肽原( h m w k ) 和激肽释放酶原( p k ) 共1 4 个因子参与凝血过程。根据因子的理化特性可分为四组。 维生素k 依赖性凝血因子：包括因子i i 、x ，其共同特点为各分子结构中 含有数量不等的6 羧基谷氨酸，可与钙离子结合，其合成在肝脏并依赖于维生素k 。 ( 4 ) 因子i i ( 凝血酶原，p r o t h r o m b i n ) 是单链糖蛋白，激活时被水解掉两个碎片( f l + 2 ) 而形成凝血酶( t h r o m b i n ) 。 ( 2 ) 因子v u ( 稳定因子，s t a b l ef a c t o r ) 是单链糖蛋白，主要参与外源性凝血途径的激活， 半寿期短( 6 8 h ) ，口服香豆素类药物时其浓度最先下降。 ( 3 ) n 子( 血浆凝血活酶成分，p l a s m at h r o m b o p l a s t i nc o m p o n e n t ，p t c ) 是单链糖蛋 白，参与内源性凝血途径的激活，缺乏时患血友病乙。 3 凝血冈子的纯化 ( 4 ) 因子x ( s t u a r tp r o w e r l 园子) 是双链糖蛋白，在凝血过程中处于内外源性凝血途径 和共同凝血途径之间，有重要的生理和病理意义。 接触凝血因子：指内源性凝血途径中与接触活化有关的因子，包括因子、高 分子量激肽原和激肽释放酶原。 ( 1 ) 因子x l l ( 接触因子，h a g e m a nf a c t o r ) 是单链糖蛋白，它可被固相( 胶原或带负电荷 物质) 及液相( 酶类等) 激活，是内源性凝血途径的始动因子。 ( 2 ) 因子：( 血浆凝血活酶前质，p l a s m at h r o m b o p l a s t i na n t e c e d e n t ，p t a ) 是双链蛋 白质，参与内源性凝血途径激活，缺乏时患血友病丙。 ( 3 ) 激肽释放酶原( p r e k a l l i k r e i n ，p k ) 是单链糖蛋白，参与内源性凝血途径激活，p k 激活后转化为激肽释放酶( k a l l i k r e i n ，k k ) 。 ( 4 ) 高分子量激肽原( h i g hm o l e c u l a rw e i g h tk i n i n o g e n ，h m w k ) 是单链蛋白质，参与内 源性凝血途径激活，促进x l l a 对x i 的激活。 对凝血酶敏感的因子：包括因子i 、xi i i ，它们的共同特点是对凝血酶敏 感。 ( 1 ) 因子i ( 纤维蛋白原，f i b f i n o g e n ) 是由三对肽链组成的二聚体糖蛋白，三条肽链分 别命名为a a 、b b 和g ，它是凝血酶作用的底物。当纤维蛋白原被凝血酶水解掉两个肽段， 即纤维蛋白肽a 和肽b ( f i b r i np e p t i d ea a n db ，f p a 和f p b ) 后形成纤维蛋白单体，通过因 子xi i i a 的转酰胺作用，最终形成交联纤维蛋白网状结构。 ( 2 ) 因子v ( 易变因子，l a b i l ef a c t o r ) 是一种单链糖蛋白，辅助因子x a 参与共同凝血途 径的激活。因子v 在体外最不稳定。 ( 3 ) 因子( 又称抗血友病球蛋白，a n t i h e m o p h i l i ag l o b u l i n ，a h g ) 是常与高分子量的 v w f 组成巨分子复合物f 9 1 。v w f 占该复合物的9 9 ，f 占1 ，v w f 对f 有稳定作用， 缺乏时可使f 活性减低。f 是因子i x a 的辅因子，参与内源性凝血途径的激活。f 先 天缺乏时患血友病甲。 ( 4 ) 因子x i i i ( 纤维蛋白稳定因子，f r i b f i ns t a b i l i z i n gf a c t o r ) 是由四条肽链组成的糖蛋 白。因子x i i i 被激活后起转酰胺酶作用，使可溶性纤维蛋白交联后转化为不溶纤维蛋白。 其它因子： ( 1 ) 因子i i i ( 组织凝血活酶，t i s s u et h r o m b o p l a s t i n ) 是存在于内皮细胞或单核细胞等多 种组织细胞中的糖蛋白，从牛肺中提取的因子是一种大分子脂蛋白，蛋白部分为因子 4 第一章文献综述 的辅因子，磷脂部分为凝血提供催化表面。 ( 2 ) 因子( 钙离子，c a l c i u mi o n ，c a z 3 是促使活化的凝血因子在磷脂表面形成复合 物而促进血液凝固，去除c a 2 + 后血液即不能凝固。 1 3 2 凝血机理( 瀑布学说) 凝血过程是一系列酶促反应，每个凝血因子都被其前一个有关因子所激活，最后生 成凝血酶和纤维蛋白。 血液凝固可分为三条途径： 外源性凝血途径( e x t r i n s i cp a t h w a y ) 是指从因子i i i 的释放到因子x 被激活的过程，包 括因子i i i 、和c a 2 + 之间的相互作用。 内源性凝血途径( i n t r i n s i cp a t h w a y ) 是指从因子激活到因子x 被激活的过程，包括 因子、c a 2 + 、p k 、h m w k 2 _ 间的相互作用。 共同凝血途径( c o m m o n p a t h w a y ) 是指因子x 的激活到纤维蛋白形成的过程，包括因 子x 、v 、i i 、i 、xi i i 、c a 2 + 之间的相互作用。 内外凝血途径并非截然无关而是互有联系，可以相互促进。x l l a 、i x a 可促使因子 活化；a c a 2 + i i i 复合物也能直接激活因子。 j 一一一! 恁缝要塞l 一一 图1 - 2 凝血机理 ( 来源于h t t p ：w w w c p e n c o m c n n e w s c e n t e r n e w s 2 0 0 8 0 1 0 5 一1 1 5 1 1 9 9 4 9 4 0 0 9 6 h t m ) - 备 漪 漾 警 i l l 5 凝血冈子的纯化 1 4 凝血因子简介 1 4 1 凝血因子的发现以及研究进展 公元1 9 3 9 年，美国医生凯斯布林霍斯证实了血友病患者的凝血因子有缺陷。后来他 把它称之为抗血友病因子，现在叫凝血因子【10 1 。公元1 9 6 4 年，p o o l t l l 】首先发现血浆冷 沉淀中富含f ，从而开创了凝血因子替代疗法的新纪元。公元1 9 8 4 年，f 基因克隆成 功【1 2 】，并在哺乳动物细胞中得到表达，使其基因及蛋白质分子结构的研究取得很大成就， 为其临床应用和血友病甲的治疗奠定了基础。 1 4 2 国内外凝血因子市场概况 目前人均消耗的f v i ，德国大约3 4 5 国标单位( i u ) 、瑞典2 9 5 i u 、芬兰2 5 3 i u 、加拿 大2 4 5 i u 、美国2 3 i u 、英国2 i u ；w f h 统计2 0 0 6 年国际市场( 6 9 个国家) 的f 总用量已超 过5 1 2 亿i u 【1 3 】；预计国际市场用于h a 治疗的f 销售额 3 0 亿美元，而人口为世界7 0 的亚洲却仅占世界p d f v h i 市场的1 1 ，我国f 的消耗仅相当于世界f 市场的1 t 1 3 ，1 4 1 。 中国人均仅为o 0 4i u ，可见国内f 市场的潜力十分巨大。但目前我国血源是有限的， 所以提高f 的收率有很大的社会效益和经济效益。 1 4 3 国内凝血因子的生产现状及应对措施 2 0 0 6 年我国f v l 的产量为4 8 9 0 万i u ；2 0 0 7 年我国面临了f 短缺的严峻形势仅生产 3 3 4 0 万i u ( 包括7 0 万的捐赠) ，2 0 0 8 年则更严峻。f v i 产量的骤减导致了临床供应的紧 张，国家食品药品监督管理局认为最主要的原因还是原料血源供应不足，国家食品药品 监督管理局为此采取了一系列紧急措施，其中包括开启“绿色通道”，加快f 制品的审 评和审批速度，优先受理、优先审评、优先检测，一切优先安排；加强政策引导，鼓励 和支持企业提高血源综合利用率；开展冷沉淀试点工作；加快对注册申请的审批，批准 了拜耳重组凝血因子( r e c o m b i n a t ef a c t o r ，r f ) 制品的进口注册；要求具有资质生 产f v m 的企业优先安排生产f 制品【1 4 】。 1 5 凝血因子临床应用及有效性 1 5 1 甲型血友病 治疗甲型血友病的关键在于使患者血浆f v l l l 浓度提高从而止血。要根据患者出血情 6 第一章文献综述 况、输注f 替代品种类与半存留期，决定输注剂量、间隔时间和维持时问。下列公式 可供参考。输人f 剂量( i u ) = 血浆容量( m 1 ) 宰 期望f 到达的水平一原有f 的水平 1 【1 5 】。 当血中f 浓度为正常的3 0 4 0 时，止血就正常【1 6 】。如不能精确计算输入单位时， 可按体重粗略估算需要注射f 的剂量。可参考的剂量为1 5 2 0 单位k g 体重，这样可保 证病人在4 8 h 不发生自发性出血。一般来说，成人患者输注4 单位k g 体重，可增力h f v $ 的 水平1 0 ，儿童输注l 单位k g 体重可增加f 的水平2 【1 7 】。输人的剂量能否达到治疗要 求，最主要的还是看临床效果。 1 5 2 血管性血友病( v w d ) v w d 患者除缺乏凝血因子外，还有与v w f 合成减少或质量异常【1 5 】，导致血小板和 血管壁的功能异常，产生出血症状。在冷沉淀中含有v w f ，v w f 半衰期为2 4 h 。一般认 为治疗v w d 病人的剂量为每1 0 k g 体重输一袋，每日输一次，维持3 4 d 。手术病人发生迟 发性出血时，应维持治疗7 1 0 d ，维持f 的水平直到伤口愈合为止。严重出血时，应用 肾上腺皮质激素、止血敏、止血环酸等辅助治疗，以缓解出血症状。如系血小板型血管 性血友病患者，输注血浆冷沉淀无效，而应输注浓缩血小板才能达到止血效梨1 8 】。 1 5 3 获得性f 缺乏症 对于获得性f 缺乏症患者在大量输血后血液稀释时有出血倾向，就可按每1 0 k g 体 重输血浆冷沉淀l 一袋。每2 3 周输一次就能达到止血目的【1 8 】。 1 5 4 获得性f 抑制物所致疾病 对于获得性f 抑制物所致疾病，必须输注高纯度f v $ 浓缩物才有效。因为只有高纯 度和高浓度的f 能中和血循环中的凝i 血i f v $ 抑制物，以更好的发挥f v $ 的作用【2 0 1 。 1 5 5f 临床应用的有效性 a f 的药理作用 在内源性凝血过程中，在c a 2 + 和磷脂存在的情况下，f v $ 为f i x 的辅因子，与激活的 f i x 参与激活f x 的激活酶原，形成凝血活酶，从而使凝血过程得以延续。患者按每始 体重输注l i uf 可使被输注者血循环中f v $ 的水平提升2 。2 0 0 5 年，w f h 发布的血 7 凝血因子的纯化 友病治疗指南推荐了各种类型出血的f 用量【2 l j 。 b 药物代谢动力学 经研究表明，f v l l l 浓缩物在加热处理f j 后的药代动力学参数相似2 2 1 ，s d 法+ 干热法 ( s d h 法) 双重病毒灭活对f 的活性无明显影响f 2 3 t2 4 】；l 项双盲交叉试验对比研究也 显示，单步病毒灭活和经s d h 法双重病毒灭活处理的f v i 浓缩物其药代动力学特征无显 著性差异【2 3 ，2 4 1 。w o l f 等 2 5 】评价了1 种经s d h 处理的f 制品的临床药代动力学，平均半 衰期1 1 9 h ，平均回收率提高2 3 i u k g - 1 。 为了避免输注f 制品后在h a 患者中传播h i v 、h b v 等灾难的发生，目f j 在所有制 备f r i l l 浓缩物的工艺中都加入了二步病毒去除灭活步骤。以b e r n t o r p 2 6 j 在对高纯f 的临 床综述性评价中的观点作为总结：尽管f v m 高纯浓缩物存在理论上的优势，但也无有效 数据能清楚地显示出不同f 浓缩物之间在临床有效性上存在任何差异。 1 6 凝血因子结构与功能 1 6 1 凝血因子的蛋白分子结构特点 f 为单链糖蛋白辅因子，在内源凝血途径中可以加速因子i x a x 寸因子x 的激活过程。 在血循环中，f 以非共价方式与v w f 形成复合物，这曾使f v m 的分离提纯非常困难，并 一度认为v w f 是f v m 的一部分。随着f 纯品的问世及基因和c d n a 的克隆，f 的结构和 功能已有了比较全面的了解。从f v m 的c d n a 可以推测f 前体含有2 3 5 1 个氨基酸，其中 含有1 9 个氨基酸残基的疏水前导肽( t g n q 信号肽) 在f 的分泌过程中被切除，成熟的f r y 分子含有2 3 3 2 个氨基酸残基，相对分子量约2 6 4 x1 0 3 d a 。对氨基酸序列分析表明，f r y 有6 个结构域，有3 个a 区：臣o a i ( 1 。3 3 6 ) 、a 2 ( 3 7 5 7 1 9 ) 、a 3 ( 1 6 9 1 2 0 2 5 ) ，l i b 区( 7 4 1 1 6 4 8 ) ， 和2 个c 区：即c 1 ( 2 0 2 6 2 1 7 2 ) 和c 2 ( 2 1 7 3 2 3 3 2 ) ，各约1 5 5 个氨基酸，其排列顺序为 a 1 a 2 b a 3 c 1 c 2 ，a 1 一a 2 b 构成f v j 的重链，a 3 一c 1 c 2 构成f 的轻链。f 的几个功 能区内部存在同源性。其中a l 区( 1 3 2 9 ) ，a 2 区( 3 8 0 7 1 1 ) 和a 3 区( 1 6 4 9 2 0 1 9 ) 之间的氨基 酸同源性约为3 0 ；c 1 ( 2 0 2 6 2 1 7 2 ) 区和c 2 ( 2 1 7 3 2 3 3 2 ) 区之间的氨基酸同源性约为3 7 。 此外，a 功能区与血浆铜蓝蛋白和f v 的序列有很大的同源性。分析铜蓝蛋白结合c u 2 + 的氨基酸残基在f