（化学工程与技术专业论文）产黄头孢霉cefg基因的克隆、表达与抗体制备的研究.pdf

摘要 产黄头孢霉c e 船基因的克隆、表达与抗体制备的研究 摘要 p 内酰胺类抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并破坏已有细 胞壁而起到杀菌的作用。目前，p 内酰胺类抗生素的全球销量已达 到1 5 0 亿美元，占着半合成抗生素市场的6 5 。这其中又以青霉素 类( p e n i c i l l i n s ) 和头孢菌素类药物( c e p h a l o s p o r i n s ) 为主导产品。 头孢菌素类药物以其低毒、耐酸、可修饰位点岁1 1 等优势正日益成 为抗生素市场的主流。目前头孢菌素类药物的销售额占到整个抗生 素市场的4 成，美国达到4 5 ，而日本甚至达到4 9 3 4 。 头孢菌素类抗生素多是以头孢菌素c ( c p c ) 为原料得到7 氨 基头孢烷酸，在此基础上再经过化学修饰，得到各种半合成头孢菌 素药物。c p c 是顶头孢霉属的代谢产物，在它的生物合成中，最后 一步反应是由脱乙酰头孢菌素c ( d a c ) 经乙酰转移酶催化变成 c p c t 2 1 ，这个过程被证实是c p c 生物合成的限速步骤p 1 ，其原因是 乙酰转移酶的表达量太低。目前国内针对乙酰转移酶及其编码基因 c 邪的研究并没有太多报道。 根据n c b i 上的查询结果，产黄头孢霉的c e f g 基因是一条含两 个内含子的基因序列，无法从基因组直接扩增。本文采用体外合成 的方法可以得到去掉内含子的c e f g 基因。以n c b i 报道的来源于菌 株a j 4 0 4 7 3 7 的c e f c 序列作为模板，去掉内含子，设计3 8 条首尾互 北京化t 人学硕j ：学位论文 补的引物，通过a s s e m b l yp c r 拼接成一条完整的d n a 片段，经测 序发现有3 个位点发生碱基缺失。通过定点突变的方法对缺失部分 逐一修改，并通过竞争性p c r 检验突变是否成功。每突变一个位点 都经过引物设计、p c r 扩增、d p ni 消化、转化、验证和测序几个 步骤，最终得到与n c b i 上所登录的完全匹配的c e f g 基因。 为了得到较高产量和纯度的乙酰转移酶蛋白，用于抗体制备、 免疫印迹检测，本实验构建了p e t 3 0 c e f g 表达质粒，3 7 。c 下诱导表 达出大量重组蛋白，且都是不溶的包涵体。将重组菌超声破碎后， 不溶部分用不同浓度尿素做梯度洗脱，最后用8 m 尿素溶解沉淀， 所得乙酰转移酶包涵体纯度达到9 6 以上，达到抗体制备或免疫印 记实验要求。 将纯化后的包涵体免疫6 周龄的b a l b c 雌鼠，约1 个半月后 取尾血得到抗血清。通过抗原包被的酶联免疫分析技术( e l i s a ) 检测，所得抗体效价达到8 0 0 0 以上，完全满足实验需要。利用所得 抗体，本文先绘制出乙酰转移酶标准曲线以确定抗原最适检测浓度， 然后在大肠杆菌中检测了乙酰转移酶与菌体生长的关系，证明所制 备抗体能够用于体外检测乙酰转移酶。 为了使克隆的c e f g 基因能与产黄头孢霉基因组进行重组并顺 利表达，本实验利用威斯康辛大学d c u l l e n 教授馈赠的质粒p d h 2 5 构建了真核表达质粒p d h 2 5 c e f g 。同时制备产黄头孢霉原生质体， 研究了原生质体对潮霉素b 的耐受性，确定其最低耐受浓度为 6 9 9 - m l 。最后尝试在不同电压下用电转化方法将重组质粒导入产 摘要 黄头孢霉原生质体。 本研究探讨了采用e l i s a 法，快速、高效、精确地检测乙酰转 移酶含量，在头孢菌素生产菌的基因工程改造工作中取得了阶段性 成果，为进一步研究c e f g 基因在头孢菌素生产菌中的克隆与表达奠 定了基础。 关键词：产黄头孢霉，头孢菌素c ，c e f g 基因，抗体制备，e l i s a i i i 北京化工人学硕：t = 学位论文 c l o n i n g ，r e c o m b i n a n te x p r e s s i o na n da n t i b o d y p r e p a r a t i o no fc e f gb ya c r e m o u i u mc h r y s o g e n u m a b s t r a c t 1 3 - 1 a c t a ma n t i b i o t i c s ，c a nb eu s e df o rd i s i n f e c t i o nb yi n h i b i t i n gt h e s y n t h e s i so fb a c t e r i a lc e l lw a l la n dd e s t r o y i n gt h ef o r m e dc e l lw a l l c u r r e n t l y , 1 3 - 1 a c t a ma n t i b i o t i c s g l o b a ls a l e sh a v er e a c h e d15b i l l i o nu s d o l l a r s ，w h i c hi s6 5 o ft h es e m i s y n t h e t i ca n t i b i o t i c s a m o n gt h e s e a n t i b i o t i c s ，p e n i c i l l i n sa n dc e p h a l o s p o r i n sa r et h ed o m i n a n tp r o d u c t s w i t ha d v a n t a g e ss u c ha sl o wt o x i c i t y , a c i dr e s i s t a n c ea n dm u l t i p l e m o d i f i c a t i o n s i t e s 1 1 ，c e p h a l o s p o r i n s a r ei n c r e a s i n g l yb e c o m i n gt h e p r e f e r a b l ea n t i b i o t i c s r e c e n t l y , s a l e so fc e p h a l o s p o r i n sa r ea c c o u n t i n g f o r4 0p e r c e n to ft h ew o r l d w i d ea n t i b i o t i c sm a r k e t ，w h i l et h en u m b e r s f o ru n i t e ds t a t e sa n dj a p a na r e4 5 a n d4 9 3 4 r e s p e c t i v e l y c e p h a l o s p o r i nc ( c p c ) w a s u s e da sr a wm a t e r i a l ，a n di tw a sf i r s t t r a n s f e r r e dt o7 一a m i n oc e p h a l o s p o r a n i ca c i d ( 7 - a c a ) ，t h e n c h e m i c a l l ym o d i f i e dt os e m i s y n t h e t i c ，c e p h a l o s p o r i n sw a ss y n t h e s i z e d i nf o l l o w i n gt h i sp r o c e s s a sam e t a b o l i t eo f a c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m ， c p cw a sp r o d u c e db yd e a c e t y l a t i o no fc e p h a l o s p o r i nc ( d a c ) w i t h a c e t y l t r a n s f e r a s ew h i c hw a st h el a s tr e a c t i o no fi t sb i o s y n t h e s i s 【2 】a n d w a sa l s ot h er a t e 1 i m i t i n gs t e pf o rb i o c p cs y n t h e s i s 3 1 i t sp r o v e dt h a t i v 摘要 t h el o wr e a c t i o nr a t ew a sd u et ot h ed e f i c i e n c yo fa c e t y l t r a n s f e r a s e c u r r e n t l y , t h er e s e a r c ha b o u ta c e t y l t r a n s f e r a s ea n di t se n c o d i n gg e n e c e f gw a sr a r e l yr e p o r t e d a c c o r d i n gt on c b i ，t h ec 班g e n eo fa c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m c a n tb er e p l i c a t e df r o mg e n o m ed i r e c t l yb e c a u s et h e r ea r et w oi n t r o n s i ni t sd n as e q u e n c e i nt h i sp a p e r , t h ec e f gg e n ew i t hn oi n t r o ni s s y n t h e s i z e di nv i t r ob ya s s e m b l yp c rf r o m38p r i m e r s ，w h i c ha r e c o m p l e m e n t a r yh e a da n dt a i l t h et e m p l a t eo ft h eg e n ei s f r o mt h e a j 4 0 4 7 3 7s t r a i n r e p o r t e d i nn c b i i tw a sc o n f i r m e db yd n a s e q u e n c i n gt h a t t h e r ew e r en u c l e o t i d ed e l e t i o n sa t3s i t e si nt h e s y n t h e s i z e d c e f g g e n ec e f g c e f g i s r e s t o r e d b y s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i s m e t h o da n dv e r i f i e d b yc o m p e t i t i v ep c rt e s t t h e r e s t o r a t i o no fe a c hm u t a t i o ns i t ei s t h r o u g hp r i m e r sd e s i g n ，p c r a m p l i f i c a t i o n ，o p n i d i g e s t i o n ，t r a n s f o r m a t i o n ，v a l i d a t i o n a n d s e q u e n c i n g ，a n da tl a s tt h ec e f gg e n em a t c h i n gt h er e p o r to fn c b ii s g o t i no r d e rt og e tt h ea c e t y l t r a n s f e r a s ew i t hh i g h e ry i e l da n dp u r i t yf o r a n t i b o d yp r e p a r a t i o n o rw e s t e r nb l o t t i n g ，t h e e x p r e s s i o np l a s m i d p e t 3 0 一c e f gw a sc o n s t r u c t e di nt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t ，w h i c hal a r g e n u m b e ro fr e c o m b i n a n t p r o t e i n sw e r ee x p r e s s e du n d e r3 7 。c m o s to ft h e r e c o m b i n a n tp r o t e i n sa r ei n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d i e s t h er e c o m b i n a n t b a c t e r i ai sd i s r u p t e db yu l t r a s o n i c ，a n dt h e nt h ei n s o l u b l ep a r ti sw a s h e d v 北京化工大学硕上学位论文 w i t hd i f f e r e n t - c o n c e n t r a t i o nu r e a f i n a l l yt h ep r e c i p i t a t i o ni sd i s s o l v e d w i t h8 mu r e a ，i nw h i c ht h ep u r i t yo fa c e t y l t r a n s f e r a s ei sm o r et h a n9 6 ， t h a ti sa v a i l a b l et o a n t i b o d yp r e p a r a t i o n o rw e s t e r n b l o t t i n g e x p e r i m e n t s t h ep u r i f i e di n c l u s i o nb o d i e sa r ev a c c i n a t e di n t o6 - w e e ko l d b a l b cf e m a l em i c e a b o u to n em o n t ha n dah a l fl a t e r t a i lb l o o di s c o l l e c t e dt oo b t a i na n t i s e r u m t h et i t e ro fa n t i b o d yt e s t e d b y e n z y m e l i n k e di m m u n o a s s a y ( e l i s a ) i sm o r et h a n8 0 0 0 ，w h i c hs h o w s t h a tt h ea n t i b o d yc a nm e e tr e q u i r e m e n to ft h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t s f i r s t ，c a l i b r a t i o n c h iv eo ft h e a c e t y l t r a n s f e r a s ec o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b yu s i n g t h e a n t i b o d y s e c o n d ，t h et i m e c u r v eo f a c e t y l t r a n s f e r a s ed u r i n g t h ef e r m e n t a t i o no fe c o l iw a s d r a w n a c c o r d i n g l y t h e s e w o r k s p r o v e t h e a n t i b o d i e sc a n d e t e c t a c e t y l t r a n s f e r a s ei nv i t r o e u k a r y o t i ce x p r e s s i o no fp l a s m i dp d h 2 5 一c e f gi sc o n s t r u c t e dw i t h p d h 2 5 ，w h i c hw a sp r e s e n t e db yp r o f e s s o rd c u l l e ni nt h eu n i v e r s i t y o fw i s c o n s i na sag i f t ，i no r d e rt or e c o m b i n ec e f gi n t oa c r e m o n i u m c h r y s o g e n u mg e n o m e f o r e x p r e s s i o n a f t e r w a r d s ，p r o t o p l a s t s o f a c r e m o n i u mc h r y s o g e n u ma r ep r e p a r e da n dt h em i n i m u mi n h i b i t i o n c o n c e n t r a t i o no fh y g r o m y c i nbi sd e t e r m i n e da s6 1 x g m l l a tl a s tt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d sa r et r i e dt ob et r a n s f o r m e di n t oa c r e m o n i u m c h r y s o g e n u mp r o t o p l a s t sb yl e c t r o p o r a t i o n 、a td i f f e r e n tv o l t a g e v i 摘要 i nt h i s p a p e r , r a p i d ，e f f i c i e n t a n da c c u r a t ed e t e c t i o no f a c e t y l t r a n s f e r a s eb ye l i s aw a ss t u d i e d ，a n di n i t i a lr e s u l t sa b o u tt h e w o r ko f g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dm i c r o o r g a n i s m f o r c e p h a l o s p o r i n p r o d u c t i o ni sa c h i e v e d i ti sb a s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nc l o n i n ga n d e x p r e s s i o no fc e f gi nc e p h a l o s p o r i np r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s m k e yw o r d s ：a c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m ，c e p h a l o s p o r i nc ，c e f g ， a n t i b o d yp r e p a r a t i o n ，e l i s a v 符号说明 7 a c a a 6 0 0 a m p c p c c l 廿 d a c d a o c e b e d t a e l i s a i p t g k a n l b t r i s s d s f ，a g e 符号说明 7 氨基头孢霉烷酸 菌液在6 0 0 n m 波长下的吸光度值，用于标志菌液浓度 氨苄青霉素 头孢菌素c 小牛肠碱性磷酸酶 脱乙酰头孢菌素c 脱乙酰氧头孢菌素c 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附分析 异丙基硫代d d 一半乳糖苷 卡那霉素 l u r i a - b e r t a n i 培养基，一种常用的细菌培养基 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 v l t l 北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：焦墨垒日期： 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名： 焦亟 导师签名：遗绰 日期：兰! ! ! ：巨= 日期：塑! ! ：堡：仝 第一章绪论 第一章绪论 1 1 1 3 内酰胺类抗生素与头孢菌素类抗生素 1 1 11 3 内酰胺类抗生素的发展f 4 】 p 内酰胺类抗生素是目前临床应用最为广泛的一类抗生素，其特点是分子中都 含有四元b 内酰胺环。 1 9 2 8 年英国人f l e m i n g 在研究葡萄球菌的时候，发现点青霉( p e n i c i l l i u m n o t a t u m ) 代谢物具有抑制金葡萄球菌生长的作用。c l u t t e r b u c k 于1 9 3 1 年证实该物 质是青霉素，具有明显的抗菌活性。1 9 4 2 年k e m b a l ib i s h o p 有限公司和英国帝国化 学工业有限公司开始小规模工业生产青霉素，揭开抗生素时代的序幕【5 】。 随着青霉素及其他抗生素的广泛使用，耐药性、过敏反应等不良现象也随即出 现，并严重制约了青霉素的持续发展。药物化学家开始寻找在临床上能够对付耐药 性并能提高疗效的新型药物。其中一个主要研究方向就是对原有的抗生素进行结构 改造。由此b 内酰胺类抗生素的发展进入半合成抗生素时代。 最早的半合成青霉素是由英国的c h a i n 于1 9 5 9 年合成的甲氧苯青霉素。他利用 大肠杆菌酰胺酶裂解青霉素g 得到6 氨基青霉烷酸( 6 一a m i n op e n i c i l l a n i ca c i d ，简 称6 - a p a ) ，并以此为母核进行半合成。 牛津大学的l o d e r 等人受此启发，于1 9 6 1 年将低活性的头孢菌素c 经弱酸催 化得到了7 氨基头孢霉烷酸( 7 a m i n oc e p h a l o s p o r a n i ca c i d ，简称7 - a c a ) ，并进 一步得到n 苯乙酞基衍生物一一种具有强抗菌活性的产物。自此，半合成抗生素 走向黄金时期。 自上世纪9 0 年代以来，投放市场的b 内酰胺类抗生素约有1 8 种，其中头孢菌 素类占1 4 种，碳青霉烯2 种，另外还有青霉烯和p 一内酰胺酶抑制剂复合剂各1 种。 2 0 0 0 年，b 一内酰胺类抗生素销售额达1 5 0 亿美元，占世界抗生素市场份额的6 5 【6 】。 1 1 2 头孢菌素类抗生素 头孢菌素类药物( c 印h a l o s p o f i n s ) 又名先锋霉素，与青霉素一样，属于b 内酰 胺类广谱抗生素。由于头孢菌素具有过敏反应小、耐青霉素水解酶、可修饰位点多 等青霉素不具备的特点，自2 0 世纪6 0 年代投入工业化生产至今，已逐渐与青霉素 北京化工人学硕士学位论文 一起占据抗生素市场，并成为p 一内酰胺类抗生素的主导产品。按其发明年代的先后 以及抗菌性能、药理活性的不同而依次分为第一、二、三、四代头孢菌素【7 1 。 1 1 3 头孢菌素c 头孢菌素c ( c e p h a l o s p o r i nc ，简称c p c ) 是头孢菌属代谢产物，由a b r a h a m 和n e w t o n 研究顶头孢霉( c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o m i u m ) 时发现。头孢菌素c 本身的 抗菌活性较低，但经过化学裂解后得到的7 氨基头孢霉烷酸( 7 a c a ) 具有3 位和 7 位的活性位点，是半合成p 一内酰胺类抗生素的三大母核之一，在抗生素工业中 具有重要地位【8 】oc p c 和7 - a c a 结构见图1 3 和图l - 4 。 o o 止c 1 3 e 0 0 h 图1 - 3 头孢菌素c f i g 1 - 3c e p h a l o s p o r i nc 1 1 4 头孢菌素c 的生产菌 脚“一oo-o 。且c 心 c 卜一n 、尹八 。土l ， oi v 、一n ， 图l - 47 氨基头孢霉烷酸 f i g 1 - 47 - a m i n oc e p h a l o s p o r a n i ca c i d 头孢菌素c 是头孢菌属( c e p h a l o s p o r i u mc o r d a ) 的次生代谢产物。它们属于 半知菌亚门m ，硒却p 咖c 疗) ，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科( 如_ ，z f 肠c 力【9 1 ，常见的 如顶头孢霉( c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o n i u ma s ) 、产黄头孢霉( a c r e m o n i u m c h r y s o g e n u m ) 等。1 9 4 5 年，b r o t z u 在撒丁岛海岸边的污水出口分离得到顶头孢霉 的原始菌株【1 0 】，这是最早的头孢菌属菌株的报道。 1 1 5 头孢菌素c 的生物合成 研究认为：l 广半胱氨酸( l - c y s ) l - a 一氨基己二酸( l - a a a a ) 和l 缬氨酸( l 广v 砒) 这3 个氨基酸在p 内酰胺类抗生素的生物合成中具有关键作用。所有的d 一内酰胺类 抗生素的生物合成都由它们开始，而且它们在头孢菌素c 的合成调控中也起重要作 用。目前公认的合成途径见图1 - 5 4 1 所示： 2 第一章绪论 吼譬一+ y 辙+ n 螋瓠 c o o - 、 h 键已二奠 k 糕媳嘲赚 l 云：一 l 1 脚r 介髓胃一 蠹乙瞵羹罗瞧麓鬃c 、潦孢弱囊c 台成群 、| 爿 脚饼丑q 图1 1 5 头孢菌素c 的合成途径 f i g 1 - 5t h eg e n e r a ls y n t h e s i z er o u t eo fc c o h a l o s p o r i nc 1 三个氨基酸：l - a 氨基己二酸，【广半胱氨酸和l 缬氨酸，在a c v 合成酶( - - 肽 合成酶) 的作用下缩合形成6 ( l 0 【氨基己二酸) l 半脱氨酸d 缬氨酸( l l d a c v ) 三肽。 2 该三肽经异青霉素n 合成酶作用环化形成异青霉素n ( i p n n ) ； 3 在去乙酰氧头孢菌素c 合成酶( 扩环酶) 的催化作用下，异青霉素n 的五元噻 唑烷环扩环生成六元二青噻唑环，异青霉素n 变成乙酰氧头孢菌素c ( d a o c ) ； 4 经乙酰基头孢菌素c 合成酶( 羟化酶) 催化，乙酰氧头孢菌素c 在c 3 位甲基 上羟基化生成去乙酰基头孢菌素c ( d a c ) ； 北京化工人学硕十学位论文 5 d a c 在头孢菌素c 合成酶( 乙酰转移酶) 的作用下生成头孢菌素c 。 以上各步骤里的每种酶都有各自的基因编码，在产黄头孢霉中各酶对应的编码 基因见表1 1 表1 - 1 产黄头孢霉中各个酶和编码基因 t a b l e1 - 1e n z y m ea n di t sc o d i n gg e n ei na c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m 酶编码基冈 a c v 合成酶 异青霉素n 合成酶 扩环酶 羟化酶 乙酰转移酶 p c b a b p c b c c e f e f c e f e f c e i l 3 1 1 6 乙酰转移酶编码基因c e f g 头孢菌素c 生物合成的最后一步反应，是将乙酰c o a 的乙酰基转移到去乙酰 基头孢菌素c ( d a c ) 的羟基上，这步反应由乙酰转移酶催化完成。编码该酶的基 因被命名为c e f g 基因【1 1 , 1 2 , 1 5 】。 早期研究发现，在编码双功能酶扩环酶羟化酶的基因c e f e f 周围，存在一个开 放阅读框( o r f ) ，编码这段阅读框的基因片段与乙酰转移酶缺陷的顶头孢霉变异株 m 4 0 互补，据此推测这段d n a 有可能就是编码乙酰转移酶的基因。后来通过在不 能产生的乙酰转移酶的黑曲霉中表达这段d n a ，生产出乙酰转移酶，从而证明了这 段d n a 的功能，也就是c e f g 基因。 m a t s u d d 忆j 等利用克隆的c e f g 基因部分序列进行顶头孢霉c e f g 破坏实验，将潮 霉素抗性基因通过同源重组插入到c e f g ，得到乙酰转移酶缺陷型顶头孢霉。变异的 顶头孢霉不能产生头孢菌素c ，并且在发酵液中积累c p c 的前体d a c i l 3 】。 经过c d n a 序列测定表明，c e f g 基因含有两个内含子，其转录方向与c e f e f 基 因相反。两基因中间序列为它们的启动子区城，m a t s u d a 的研究认为这段区域是 111 4 b p ，g u t i o - r e z 1 4 】报道为9 3 8 b p ，m a t h i s o n 1 5 1 报道为1 0 7 7 b p ，因此该段区域的确 切长度还有待研究。 因为c e f g 基因属于内源性基因，它的启动子非常弱，相对于c p c 合成过程中 的其它基因，c e f g 基因的转录活性非常低，是c p c 生物合成过程的一个瓶颈。而 基因的拷贝数与转录的强度与c p c 的产量有直接的联系，因此它编码的乙酰转移酶 也是c p c 合成过程的限速酶【1 5 】。 4 第一章绪论 截止到2 0 0 9 年，n c b i 上报道了有四种从不同来源的产黄头孢霉菌株中克隆并 测序的c e f g 基因序列( 表l 2 ) 。 表l - 2 不同米源的c 班基因 t a b l e1 - 2c e f g d i f f e r e n ts t r a i n s 1 2 酶联免疫分析技术 1 2 1 酶联免疫分析特点 酶联免疫分析是以生物酶为标记物的标记免疫分析法，它将抗原抗体反应的特 异性与酶的高效催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗 原一抗体反应的特异性，因而极大地提高了灵敏度【l 6 。 抗原抗体的相互作用是所有免疫化学技术的基础，这种相互作用可发生于体内 也可发生于体外。基于抗原一抗体反应的检测技术主要应用于以下几个方面： 1 用已知抗原检测未知抗体； 2 用已知抗体检测未知抗原； 3 定性或定量检测体内各种大分子物质； 4 用已知抗体检测某些药物、激素等各种半抗原物质。 由于抗体主要存在于血清中，所以体外抗原抗体反应也称为血清学反应。 1 2 2 常用酶联免疫分析方法 根据对酶催化反应产生的检测方法的不同，可以将酶联免疫分析方法分为光度 酶联免疫分析( e l i s a ) 、化学发光酶联免疫分析、荧光酶联免疫分析、电化学酶联 免疫分析等。 5 北京化工大学硕士学位论文 1 2 3 光度酶联免疫分析方法 光度酶联免疫分析常被称为e l i s a 法，即酶联免疫吸附分析( e n z y m e 1 i n k e d i m m u n e s o r b e n ta s s a y ) 。最早由e n g v a l l 和p e r l m a n n j 与v a nw e e m e n 和s c h u u r s 恺1 同时建立，并用于医学研究。它利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的 催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特 异性，因而极大的提高了灵敏度。 从建立到现在的三十多年里，e l i s a 技术已经日趋成熟。根据试剂的来源和标本的 性质以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法【1 9 2 0 1 。比如双抗体夹心法、 间接法、竞争法、异种动物双抗体夹心法、竞争性抑制法、双夹心法、抗原直接包 被法等。这里介绍下最经典的双抗体夹心法和本实验用到的间接法。 1 - 双抗体夹心法 双抗体夹心法( d o u b l ea n t i b o d ys a n d w i c he l i s a ) 是目前最经典的e l i s a 技术， 由c l a r k 和a d 锄s 【2 l 】于1 9 7 7 年建立。它的原理及操作如下： a将特异性抗体吸附到同相载体上，孵育后洗涤除去未吸附的抗体，封板洗涤； b加入含有待测抗原样品，使之与吸附于固相载体上的特异性抗体反应，孵育后 洗涤除去未反应的样品； c加入酶标记的特异性抗体与抗原反应； d加入底物溶液，生成可显色的产物，检测。 该法的灵敏度高，特异性强，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术强，成本 较高。本法之适用于二价或二价以上的大分子抗原的检出和定量分析，而不能用于 半抗原等小分子的测定。 2 间接法 间接法( i n d i r e c te l i s a ) 是检测抗体最常用的方法，也常用于定性检测抗原。 它的原理及操作如下： a将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质， 封板洗涤； b加稀释的受检血清，血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体 复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性行抗体，其他免疫球蛋白及血清中的 杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去； c加酶标记抗免疫球蛋白( 酶标抗抗体) ，它与固相复合物中的抗体相结合，从而 使该抗体间接的标记上酶，清洗后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 6 第一章绪论 间接法只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相 应的抗体。如果采用商品化的酶标抗抗体，则能很大提高实验效率。 当抗体的加入量一定时，显色产物的量就与固相载体上联结的抗原的量成比例， 因此这个方法也适用于抗原的定性检测。 1 3 论文的目的与意义 1 3 1 论文的目的 本工作采取将头孢菌素c 生物合成关键酶的编码基因c e f g 基因整合到产黄头 孢霉的染色体上，以增加c e f g 基因拷贝数，从而提高乙酰转移酶的表达量，消除乙 酰转移酶表达数量不足的瓶颈，提高头孢菌素c 的转化速率和产量，节约发酵时间 和成本，为头孢菌素c 基因工程菌的构建提供有效途径，进而提高头孢菌素c 的产 量，实现工业价值。 1 3 2 论文的创新点 本课题具有以下创新点： 1 、本文通过a s s e m b l yp c r 的方法，获得不含内含子的产黄头孢霉的c e f g 基因序 列，经测序与n c b i 上报道的一致。 2 、本文构建了p e t 3 0 c e f g 质粒，其用于在大肠杆菌中诱导表达，蛋白产物可以通 过梯度尿素进行分离纯化。产物用来免疫小鼠，用于e l i s a 法检测c e f g 基因的 表达。 3 、将纯化的包涵体用于免疫小鼠，获得的抗体经测试效价可以用于e l i s a 。在大 肠杆菌里检测了乙酰转移酶遂菌体生长的表达曲线，进一步证明制备的抗体的 活性。 4 、本文构建了p d h 2 5 c e f g 质粒，此质粒可以在原核细胞中构建，用于将c e f g 基 因整合在顶头孢霉染色体上并表达。可以增加乙酰转移酶的表达量，消除乙酰 转移酶表达数量不足的瓶颈。 1 4 论文的研究内容 本论文拟从以下几个方面进行研究： 1 通过a s s e m b l yp c r 的方法，获得不含内含子的产黄头孢霉的c e f g 基因序列， 修改错配碱基，最终得到与n c b i 上报道的一致的基因片段。 7 北京化工人学硕：i ：学位论义 2 构建p e t 3 0 c e f g 质粒，并在大肠杆菌d h 5 a 中诱导表达，并分离纯化。 3 将纯化的包涵体用于免疫小鼠，获得的抗体用于e l i s a 。 4 构建p e t 3 0 c e f g 质粒，用于转化顶头孢霉，表达乙酰转移酶蛋白。 5 摸索并优化了产黄头孢霉原生质体制备、再生和转化的方法，找到了一种操作 简便，制备速度快，再生效率高的原生质体制备、再生和转化的方法。 8 第二章材料、试剂与方法 第二章材料、试剂与方法 本章详细介绍本实验用到的材料与试剂的来源、性质和使用方法。在以后的章 节用到这些材料时将不再赘述。 2 1 材料与试剂 2 1 1 质粒 本文所用到的原始质粒以及本文自行构建的质粒总结至表2 1 表2 - 1 本论文涉及到的原始质粒以及成功构建的质粒 t a b l e2 - 1p l a s m i d su s e di nt h i sp a p e r 2 1 2 菌株 本文所用到的原始菌株及重组菌株总结至表2 2 。 9 北京化工大学硕一 ：学位论文 表2 - 2 本论文涉及到的原始菌株 t a b l e 2 - 2o r i g i n a ls t r a i n su s e di nt h i sp a p e r 2 1 3 培养基【2 3 1 l u r i a b e r t a n i ( l b ) 液体培养基： 蛋白胨l ，酵母粉o 5 ，氯化钠1 ，p h7 0 ，1 2 1 高温蒸汽灭菌1 5 m i n ，室温 或4 保存。 l b 固体平板： 上述培养基中加入琼脂粉( 1 5 ) ，灭菌条件相同，4 。c 冷藏。 p d a 培养基( p o t a t od e x t r o s e a g a rp d a ) ： 取去皮马铃薯2 0 0 克，切成小块，加水1 0 0 0 毫升煮沸3 0 分钟，滤去马铃薯块，将 滤液补足至1 0 0 0 毫升，加葡萄糖2 0 克，琼脂1 5 克，溶化后分装，1 2 1 高温蒸汽 灭菌1 5 m i n ，4 。c 保存。 蔗糖液体培养基： 蔗糖2 0 9 ，蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，k 2 h p 0 4l g ，p h6 8 ，加水稀释至1 0 0 0 m l ， 1 2 1 高温蒸汽灭菌1 5 m i n ，室温或4 1 2 保存。 蔗糖固体培养基： 上述培养基中加入琼脂粉( 1 5 ) ，灭菌条件相同，4 。c 保存。 液体再生培养基： 蔗糖2 0 9 ，蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，k 2 h p 0 4l g ，山梨糖醇3 5 9 ，加水至1 0 0 0 m l ， 1 2 1 高温蒸汽灭菌1 5 m i n ，室温或4 保存。 固体再生培养基： 1 0 第二章材料、试剂j ；b - 法 上述培养基中加入琼脂粉( 1 5 ) ，灭菌条件相同，4 0 保存。 2 1 4 抗生素 本实验经常利用抗生素作阳性克隆筛选，所用的抗生素有氨苄青霉素 ( a m p i c i l l i n ) 简称为a m p 或a + ，卡那霉素( k a n a m y c i n ) 简称为k a n 或k + ，抗生 素的贮存液及其工作浓度如表2 3 所示。 表2 - 3 氨苄青霉素号忙那霉素的配制与保存 2 1 5 工具酶 d n a 聚合酶见表2 - 4 ，各种限制性内切酶、t 4d n al i a g a s e 购自t a k a r a ( 大 连) 公司。 表2 - 4 本论文用到的d n a 聚合酶 北京化工人学硕卜学位论文 2 1 0 试剂盒与试剂 质粒小量提取试剂盒、普通d n a 产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶d n a 回收试 剂盒均购自百泰克生化科技有限公司。其他化学试剂详见附录2 。 2 2 实验方法 分子生物学于生物化学操作方法均参照分子克隆实验指南 2 4 】和生物化学 实验技术【2 5 1 ，本文中用到的比较重要的分子生物学与生物化学操作方法如下： 令真核生物d n a 提取方法参照附录3 ； d n a 琼脂糖凝胶电泳方法参照附录4 ； 夺a s s e m b l yp c r 原理及操作方法参照附录5 ； 感受态细胞的制备及质粒( 连接产物) 转化参照附录6 ； 令蓝白斑筛选方法参照附录7 ； 夺质粒快速鉴定法筛选重组菌株参照附录8 ； 令菌落p c r 方法参照附录9 ； 质粒小量提取方法参照附录1 0 ； 夺定点突变原理及方法参照附录1 1 ； 夺d n a 凝胶回收纯化方法参照附录1 2 ； 夺蛋白s d s p a g e 凝胶电泳方法参照附录1 3 ； 夺考马斯亮兰法( b r a d f o r d 法)