（林木遗传育种专业论文）磷酸甘露糖异构酶基因选择标记遗传转化系统的研究.pdf

摘要 转基因植物是把外源基因整合到植物基因组中。转基因植物中，除整合有外源目的基 因序列外同时还整合有启动子，载体骨架序列和抗生素标记基因等非日的基因d n a 片 断。随着对转基因植物生物安全研究的不断深入，这些非目的基因序列的生物安全问题也 引起了广泛关注。 本论文从克隆甘露糖异构酶基因，构建含有g f p 基因的安全选择系统植物表达载体 和含有抗病基因的安全选择系统植物表达载体及对杨树的遗传转化等方面对抗病杨树的 安全选择标记系统进行了研究，主要的研究内容有以下几个方面： 1 本实验成功的克隆了编码6 - 磷酸甘露糖异构酶基因，将其作为选择基因，构建到 去掉选择标记基因的表达载体p m b i a l 3 0 1 一h y g 上，得到可在含有甘露糖的培养基上筛选 转化芽的植物表达载体p m b i a l 3 0 1 - m a n a 。 2 由美国n o v a r t i s 公司赠送的口n o v 2 8 1 9 植物表达载体在标记基因启动子的选择上 优于本实验室构建的p m b i a l 3 0 1 一m a r i a 。本研究利用p n o v 2 8 1 9 成功的构建了用于检测 甘露糖筛选体系转基因表达量的植物表达载体p n o v 2 8 1 9 - g f p ，用于抗病的表达载 p n o v 2 8 1 9 - n p l 和p n o v 2 8 1 9 g a f p - n p l ，这是首次尝试将双价抗病基因构建到甘露糖安 全选择标记基因的植物表达载体上。 3 通过对烟草和杨树甘露糖敏感性测验结果发现：烟草不能用此转化系统进行筛选。 杨树可以用并得到较适合的杨树筛选培养基：甘露糖8 e ；，1 和蔗糖2 2 9 ，l 。 4 以美洲黑杨x 小叶杨( p o p u l u sd e l t o i d c sxp s i m o n i i ) 优良无性系n l - 8 9 5 杨为受体材 料，通过根癌农杆菌e h a l 0 5 ( p n o v 2 8 1 9 - g f p ，p n o v 2 8 1 9 - n p l ) 介导进行转化。获得 了一批甘露糖筛选后的转基因芽。对其进行荧光检测，证明p n o v 2 8 1 9 - g f p 已转入杨树 中，且转基因分化芽能够在甘露糖培养基上生长。 关键词：6 磷酸甘露糖异构酶基因；选择标记；杨树；基因克隆；遗传转化 a b s t r a c t an e wm e t h o df o rt h es e l e c t i o no ft r a n s g e n i cp o p u l a rp l a n t sw i t h o u tt h eu s eo fa n t i b i o t i c so r h e r b i c i d e sh a sb e e nd e v e l o p e d a l t h o u g hm a n n o s ei t s e l f h a sn oa d v e r s ee f f e c t so np l a n tc e i l s ，i t 1 e a d st oa na c c u m u l a t i o no fm a n n o s e 6 p h o s p h a t e w h i c hd e p l e t e si n t r a c e l l u l a rs t o r e so f i n o r g a n i cp h o s p h a t e t l l i sr e s u l t si na l li n h i b i t i o no f p l a n tc e l lg r o w t h t h es e l e c t i o ns y s t e mn s e s t h ee s c h e r i c h i ac o l ip m ig e n et h a te n c o d e sp h o s p h o m a n n o s ei s o m e r a s er p m i ) t r a n s g e n i c p l a n t sc a r r y i n g t h e p m ig e n e c a r ld e t o x i f y m a n l o s e 6 - p h o s p h a t eb y c o n v e r s i o nt o f r u c t o s e 6 - p h o s p h a t e ，a l li m e r m e d i a t eo fg l y c o l y s i s ，v i at h ep m ia c t i v i t y t h e yd i f f e rf r o m c o n v e n t i o n a ls e l e c t i o nt e c h n i q u e sa st h e ya r eb a s e do ns u p p l e m e n t i n gt h et r a n s g e n i cc e l l sw i 也 am e t a b o l i ca d v a n t a g em t h e rt h a nk i l l i n gt h en o n - t r a n s g e n i cc e l l s i nm a n yc a s e s ，t h e s en e w s e l e c t i o ns y s t e m sh a v eb e e nf o u n dt ob es u p e r i o rt oc o n v e n t i o n a lm e t h o d s i nt h i sp a p e r , w ei n t r o d u c eo u rs t u d yo nt h ec l o n i n go ft h ep h o s p h o m a r m o s ei s o m e r a s e ( p m i ) g e n ea n dt h ec o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o r sc o n t a i n i n go fp n o v 2 8 1 9 - g f pa n d p n o v 2 8 1 9 - n p l t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s i t h ep h o s p h o m a n n o s ei s o m e m s e ( p m i ) g e n ef r o me s c h e r i c h i ac o l ih a sb e e nc l o n e da n d e o n s i t u t i v e l ye x p r e s s e di nv e c t o rp m b i a l 3 0 1 一h y g 2 t h ep m ig e n ew a st r a n s f e r r e dt on l 8 9 5b ya g r o b a c t r i n m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，w h i c h a l l o w e dt h es e l e c t i o no f t r a n s g e n i cp l a n t s 、i mm a n n o s ea ss e l e c t i v ea g e n t t h ei n t e g r a t i o na n d e x p r e s s i o no f t h et r a n s g e n ew a sc o n f i r m e db yt h eg f e 3 p o p l a ri sav e r yi m p o r t a n tf o r e s tt r e es p e i c e i no r d e rt oi m p r o v et h ea n t i d i s e a s ea b i l i t yo f p o p l a r , p n o v 2 8 1 9 - g f p , p n o v 2 8 1 9 - n p l w e r et r a n s f e r r e di n t ot h ep o p l a r h y b r i dc l o n e ( p o p u l u sd e l t o i d e sx 只s i m o n i i ) n l - 8 0 1 0 6b yi n f e c t e dw i t h a 。t u m e f a c i e n s 4 b l a c ky a n gxs i m o np o p l a ro fa m e r i c ao fi s r a e l ( p o p u l u sd e l t o i d e sxp s i m o n i i ) f i n e a s e x u a ld e p a r t m e n tn l 一8 9 5y a n gs e c e p t o rm a t e r i a l ，i si ti si ti si tt r a n s f o r mt og oo nt ol e a dt o l i eb e t w e e nt h r o u g hr o o tc a n c e ra g r i c u l t u r a lb a c i l l u se h a l 0 5 ( p n o v 2 8 1 9 一g f p ， p n o v 2 8 1 9 - n p i ) h a v eg o tt h et r a n s g e n i eb u da f t e rab a t c ho f m a n n o s e sa r es c r e e n e d c a r r y o nf l u o r e s c e n c em e a s u r et oi t ，p r o v ep n o v 2 8 1 9 - g f pc h a n g ep o p l a ro v e rt oa l r e a d y ，a n d t r a n s g e n o s i ss p l i tu pb u dc a l lag r o w sa tt h ec u l t u r ei nm a n n o s e k e yw o r d ：p h o s p h o m a n n o s ei s o m e r a s e ( p m i ) g e n e ；t r a n s f o r m a t i o n ；s e l e c t i v em a r k e r ； v e c t o rc o n s t r u c t i o n ；g e n e t i ce n g i n e e r i n gc a r n a t i o n 致谢 譬7 4 9 4 5 1 本论文是在导师诸葛强教授和黄敏仁教授的精心指导下完成的，我感谢两位导师三年 来在我的学习与生活中所给予的无微不至的关怀。导师治学严谨的态度以及为人正直而豁 达的胸怀无时不在影响着我，并将使我在未来的工作和学习中受益无限，导师的谆谆教诲 我将一生铭记在心! 并将一直激励我今后的工作，学习和生活! 我还要感谢本教研组的王明庥院士，王章荣教授，施季森教授，徐立安教授，徐进副 教授，潘惠新副教授，李火根副教授，王光萍副教授在我论文进行过程中所给予的热心指 导! 特别要感谢陈英老师、张博老师在我研究生期间对我实验的指导和热情帮助；在论文 进行的全过程中，倾注着陈英老师的心血和热心支持，在实验过程中给予了细心的帮助和 心理支持，提供了许多有益建议。张博老师在专业知识，实验技能和治学态度上给予了无 私的帮助和无形的影响。 本实验室的张新叶博士、张燕梅博士、袁坤博士、吴小平博士、陈志博士、李杰博士、 关亚丽博士、程强博士在实验中所给予的大力帮助。我的同级同学房丹、邓玉营、施翔、 郭佳、赵阿风、杨会勇在论文完成过程中参与部分实验或提出有利的建议，在此表示对他 们的衷心感谢! 实验能够顺利完成，也需要王永刚师弟和徐梁师弟的大力帮助，在我实验紧张的时候， 是他们拿出自己宝贵的时间帮我完成实验。何秋玲小师妹对实验室尽心尽责，直接间接的 帮我减轻了许多实验工作，在此对她表示感谢。还要对孙小燕、毕毓芳、程晓蕾、钟永达、 胥猛、赵景奎、许远、王鹏良、姜福星、郭传敏、府建、刘丽莎等师弟师妹的帮助表示感 谢。 在本论文进行过程中，一直得到王婕琛师姐和曾海涛师兄的鼎立相助，在实验中遇到 困难时，两位高手的指导帮我节约了很多时间，尤其是王婕琛博士在遗传转化方面的诚挚 指导及曾海涛博士在载体构建方面的无私指导，在此表示感谢。 感谢我的父母和亲人，感谢我的室友袁源，感谢在南京林业大学这7 年来的同学们， 师兄妹们，是他们增添了我生活的色彩，是他们让我永留这美妙的回味! 作者：续晨 2 0 0 5 年6 月 第一章文献综述 前言 林业是国民经济的基础产业，作为陆地生态系统的主体是重要的自然资源，一方面在 改善生态环境，维持生态平衡，实现可持续发展中具有不可替代的作用，另一方面也是重 要的工业原料和生活用材，具有巨大的经济价值。林木常规育种周期较长，见效慢，而且 可操作性差。应用基因工程进行林木育种有其显著的优越性。它可以大大地缩短育种周期， 在较短的时间内培育出优良的新品种：并在一定程度上克服常规育种的局限性，从基因水 平上进行定向改造，更具科学性和精确性，大大提高育种的目的性和可操作性。 林木基因工程的目的是获得具有优良性状的新品种，与农作物供人们直接食用不同， 林木主要作为工业原料，食品安全危险性要小得多。但转基因林木一旦释放，在生态环境 中可能会长期存在，转基因林木在环境生态方面存在着潜在的风险。第一棵转基因林木 1 9 8 6 年问世到现在还不到2 0 年的时间，有的林木的生长期就要4 0 年，目前对转基因林 木的安全性和风险认识主要是基于理论上的推测。因此，对于林木转基因植株的田间释放， 主要考虑大面积转基因人工林对自然环境的生态效应。 一转基因林木的生态安全性 1 基因流与转基因逃逸对近缘物种的潜在威胁及对策 1 1 基因流与转基因逃逸对近缘物种的潜在威胁 转基因林木的驯化程度低，几乎所有人工栽培的树种只能算是属于半驯化状态，不同 于完全驯化并有明显变异的栽培作物。绝大部分栽培树种在其种植区都存在同类的天然野 生种群，成为转基因漂流的通道。有许多树种在同一属内能发生种间杂交，这就使基因漂 流变得更为复杂。再加上树木的花粉可飞扬6 0 0 公里以外的地方，影响面极较广。树木是 多年生的，一经释放到野外，对周围环境的正反面作用都是长期的，持续的。 1 2 转基因杨树的生态安全性评估 我国现在商品化的转基因林木主要是转基因杨树，现有人工转基因杨树林将近1 万 亩。目前我国发展杨树存在的主要难题之一就是虫害严重，而采用常规方法选育抗虫的杨 树品种很难，因为缺乏抗源。解决杨树虫害问题比较好的办法就是将抗虫基因转入杨树。 目前，我国己获得了欧洲黑杨、7 4 1 杨以及美洲黑杨、小叶杨等杨树的转基因植株，有的 已进入田间释放或中间试验阶段。 卢孟柱研究发现，转基因杨树花粉与我国的乡土树种青杨存在杂交可能，但对毛白杨 杂交可能性非常低。转基因杨有可能存在花粉传播。但就我国现阶段的转基因杨来说，还 很难威胁生态。首先，杨树花粉虽有较强的传播能力，但在自然条件下授粉成功率非常低。 其次，我国北方普遍干早缺水，不像国外杨适生区的雨水、土壤条件好，这是自然的抑制 因素，使杨树种子的萌发、实生苗成活很不容易。杨树是雌雄异株，转基因杨树雌株本身 不产生花粉，这样只栽种雌株可进一步降低花粉传播的可能性。第三，转基因通过花粉的 传递能力很弱甚至于不传递，原因可能是转基因植株花粉的发芽力，花粉管伸长能力与受 精能力比非转基因植株的花粉要差，也可能是转基因插入到影响花粉活力的基因位点上。 第四，我们的转基因栽种在农村相对较差的耕地上，不是野生状态，放牧牛羊和农事耕作 会把可能萌发的小苗破坏掉。第五，我们批准对要求转基因杨树栽植要远离天然林。我国 真正的杨树天然林分布在西部，而转基因杨树的试验和推广被限定在东部平原，距离非常 远。 转基因林木周期长，转基因杨树的花粉传播能有多远，授粉可能性有多大，结实率有 多高，能否结籽长出幼苗，是否有潜在的威胁还需要进一步的研究。 1 3 防止花粉污染的对策 i ) 培育雄性不育的转基因树 通过研究杨柳树的m a d s 花发育盒，找出与树木生殖配子发育相关的基因后，采用 多种途径控制核雄蕊或雌蕊的发育达到树木不育的目的。其中一个途径是利用反义r n a 技术使花粉败育。另一途径则是通过导入类嵌合基因，它们可以特异地在花组织开启一 种自杀基因以抑制花的发育。 2 ) 只培育雌性转基因植株 对雌雄异株树( 如杨树) 仅在雌株上进行转基因，雌株没有花粉，也就不会有花粉扩 散了。 3 ) 使用叶绿体转基因的方法 由于叶绿体的遗传方式是母系遗传，外源基因整合入叶绿体基因组后，不会出现象核 基因组那样随花粉转移扩散到环境中，而且目的基因的表达具有叶片组织特异性，不会在 转基因植物的果实中大量积累。 2转基因林木对非靶标生物的影响 在大自然中存在着益虫和害虫，益虫以害虫为食或作为寄主，害虫的幼虫，蛹数量的 减少，无疑会威胁到这些益虫的生存与繁衍。1 9 9 9 年l o s e y 的报道，将b t 玉米花粉撒在 植物叶片上饲喂黑脉金斑蝶的幼虫后，其死亡率可达4 4 ，而对照组无一死亡。实验室 条件虽不能反映大田环境，转抗虫基因的林木对昆虫群落地影响还可能发生害虫寄主转移 现象。快速生长的转基因林木在短期内过度耗损土壤中的水分和养料，加剧林地生产力下 降和恶化：转除草剂基因林木可能漂移到杂草上导致抗药性杂草产生。转基因林木的根系 分泌物和残枝落叶在土壤中的残留，可能会对土壤和水中的微生物以及养分循环产生负面 影响。尽管有很多相关的报道，事实上，传统育种方法培育的新品种也会对某些微生物 天敌等产生影响。 3标记基因的安全性问题 转基因植物是把外源基因整合到植物基因组中。转基因植物中，除整合有外源目的基 因序列外，同时还整合有启动子，载体骨架序列和抗生素标记基因等非目的基因d n a 片 断。随着对转基因植物生物安全研究的不断深入，这些非目的基园序列的生物安全问题也 引起了广泛关注。 目前，大多数植物的转基因频率很低，有必要使用选择标记基因来筛选转基因植株。 它们具有抗生素抗性或除草剂抗性。而抗生素或除草剂能杀死非转基因细胞。但抗性选择 标记基因中也存在着一些问题； 第一，用于从未转化细胞中筛选少量的转化细胞的抗生素或除草剂，一般都会对细胞 的发育和分化产生负面的影响，可能会延迟转化过程中不定芽的分化。第二，当一个转基 因植物中已含有一个抗性基因作选择标记再导入第二个目的基因时就要选用不同的选择 基因。有许多人们感兴趣的性状和基因值得被导入到植物中，但能够被实际运用的选择标 记基因数量是有限的，人们想要对同一植物品种导入多个基因是很困难的。所以，人们期 望建立一个系统去除选择标记基因，以便通过重复转化来增加转基因的数目。第三，从健 康及安全性角度来看，选择标记基因及其产物被使用是有害的。有一种担心是，如果抗生 素类选择标记基因被应用于临床或兽医上，他们有可能被转移到微生物中，并且可能会增 加在人或动物消化道内的病原微生物的数量。第四，带有抗性标记基因的转基因植物可能 会变成有害的杂草：选择标记基因传播到野生亲缘种中，可能会使杂草获得这些基因而使 现有的除草剂无法将杂草杀掉；选择标记基因传播到其他生物体中，可能会破坏生态系统 的平衡。第五，虽然安全性评估部门已报道，使用n p t l l 作为选择标记基因不存在健康或 安全性问题，然而要对其他每一个选择标记基因及其产物进行安全性评价，将耗费大量的 物力财力和时间，这势必影响转基因植物投入市场。 此外，抗生素抗性基因是目前大多数转基因植物的选择标记基因，这些抗性基因在环 境中的逃逸是转基因植物生态安全的另一重要内容。由于越来越多的报道指出细菌可以获 得对多种抗生素的抗性，并且研究表明，田间转基因植物的d n a 在不同土壤中存活时间 有的可达数月，甚至两年，这就导致人们考虑转基因植物中的抗性基因是否能通过转化， 转导和结合转移等自然转化方式获得抗生素抗性基因的可能性，主要取决于自然环境中是 否存在足够量的具有活性的抗生素抗性基因和该种抗生索的选择压力，在通常情况下同时 具备这两种因素的几率是很小的，实验室的研究表明，某些细菌能吸收源于土壤的转基因 植物残留物的d n a ，但至今未有自然界中抗生素抗性基因从转基因植物向微生物水平转 移的证据。 4 解决使用选择标记基因存在的问题的方法有 4 i 完全避免使用标记基因 3 选择标记基因的目的是由于转基因效率低，必须对转基因植株筛选进行，当然如果能 直接获得不含选择标记基因的转基因植株最好。这在授粉的植物上已有报道( a z i z a n d m a c h r a y 。2 0 0 3 ) ，从烟草花芽中分离出来的小孢子用经过优化的离体培养方法让它成熟 为具有完整功能的花粉，然后原位授粉于去雄植物的柱头上，经过培养产生大量的种子。 用这种方法得到植株遗传转化的更稳定，拷贝数低，转化率高。同时由于实验中用的是小 孢子单细胞，所以很少有体细胞变异，时间短在1 5 个月就可以产生大量的转基因植株， 这种方法主要基于基因转化率高且转化稳定时，不需要使用选择标记，只需要简单的p c r 筛选就可以直接筛选出转基因的种子，具有较好的应用前景。 d e v e t t e n ( 2 0 0 3 ) 等采用直接p c r 分析选择转化细胞的方法在马铃薯中取得了成功。 他们在构建表达载体时，只将目的基因和启动子及终止子插入在t - d n a 的左边晃和右边 界之问。然后用农杆菌菌株a g l 0 浸染马铃薯外植体。由于a g l 0 菌株含有超强致病力 的农杆菌a 2 8 1 质粒的致病区域序列，转化效率较高。共侵染之后，每个外植体可以产生 1 - 2 个再生芽。再生芽培养成小植株后用特异的引物进行p c r 检测，结果发现5 次转化实 验的转化频率在1 3 5 6 之间，平均为4 5 。经p c r 检测为阳性的转基因植株，有4 5 的在表型上出现所需性状。避免使用标记基因的方法在马铃薯上实验成功，但必须基于高 转化率和大量的p c r 筛选，是否可以推广有待进一步的研究。 4 2 去除选择标记基因的方法 分子重组技术，作为一种新型的技术在植物基因工程研究中发挥着重要的作用。通过 各种分子重组的方法去除选择标记可以减轻载体的负担，又可以不影响下一个基因的转 入，理论上使利用同一选择标记进行无数次转入新基因成为可能。 4 2 1 共转化法 同时使用两个独立的d n a 载体对植物进行共转化，一个含有目的基因，一个含有选 择标记基因，二者共整台在染色体组的非连锁位点上。转化植株经过有性繁殖，发生交换 重组，两个基因在子代中符合孟德尔分离比进行分离，出现不含标记基因的转基因植株。 朱桢实验室用此方法转获得了无选择标记的水稻。 这种方法水稻中研究较多的。它要求共转化效率必须相对较高。育种周期短，种子繁 殖的植物。此外，此方法操作较繁琐非常耗时，对世代长的林木和无性繁殖的农作物也不 适合。 4 2 2 a c d s 转座系统 转座子是指一段特定的d n a 序列，它可以在染色体组内移动，从一个位点切除，插 入到一个新的位点。它一般由特定的蛋白质来识别某一种d n a 序列，识别位点之间的 d n a 片段被插入到另外的位点上去。把标记基因或目的基因和转座子相连，在转座子和 标记基因或目的基因一起移动的过程中，标记基因和目的基因分开，子代植株通过遗传分 离获得仅带目的基因的转基因植株。 4 通过玉米转座子的自动转座丢失的方法获得无选择标记基因的频率相当的低。大多数 插入了选择标记基因的转座子被切除后又重新插入到基因组中的其他位置，只有那些发生 转座失误的细胞才能发育为无选择标记基因的转基因植株。一般无选择转基因频率为只有 o 1 一0 5 。且很难控制转座酶的表达。 4 2 3 位点特异性重组系统 位点特异性重组技术，是指在重组酶介导下在特异的重组位点间发生重组，导致重组 位点间交互交换的一种精确重组形式，重组酶仅能催化特异性位点间的重组，位点特异性 重组具有特异性和高度保守性。目前，能够在植物中发生重组反应的位点特异性重组系统 主要有4 种：c r e l o x ，f l p f r t ，r r s ，g i n g i x ( 重组酶，重组位点) 。 四种位点特异重组的作用机理是相同的：整个重组过程中没有d n a 的合成和丢失， 只需重组酶和重组位点即可行使功能，不需能量。重组酶的识别并结合重组位点的反向重 复序列区，每一反向重复序列区结合一个重组。在重组酶的作用下，两个重组位点发生同 向联会。联会后两个重组位点的d n a 的一条连在重组酶的作用下断裂，并通过3 - p 0 4 与重组酶的t y r 的游离o h 相连。形成h o l l i d a y 结构，无须能量。另一链再断裂并与对 方的断裂链重接完成了重接过程，实现了交换。 四种位点特异重组系统中，研究最多的是c r e l o x 系统。主要用于在小鼠中功能基因 的时空特异性基因敲除的研究。就是通过位点特异性d n a 重组，实现靶基因结构部分或全 部破坏，使其产物不能正确表达，从而对基因功能的研究产生重大影响。 由于重组系统具有位点特异、时期特异、组织特异和高效重组的特点，它为转基因生 物工程研究提供有力工具。在去除选择标记的几种方法中，位点特异重组系统被认为是最 有前景的方法。位点特异性重组效率较高，再结合上特异性启动子便可以在一个世代去除 选择性标记，正好符合了林木的特性。比较成功的例子是：e b i n u m a 和e n d o ( 2 0 0 1 ) 构 建的s a f e n e r 诱导g s t - i i 2 7 启动子调控r r s 系统的表达：m a t 无选择标记植物载体系 统，及z u oj ，c h u a nn h ( 2 0 0 1 ) 构建的雌二醇诱导表达的c r e l o x 系统。这两种方法都 异曲同工的使用了诱导型启动子加重组系统，使得能通过一次转化去除标记基因。 诱导型启动子调控下的位点特异重组系统的优点是 1 ) 只需一次转化，不需有性杂交分离重组酶，可以大大缩短育种时间，减少劳动量，对 木本植物特别有用。 2 ) 夹在重组位点之间的重组酶被去除，从而消除了其长期，高水平的表达所带来的负面 影响。 3 ) 标记基因的去除受到严格控制，使研究者能够根据需要在适当时候将其去除。 4 ) 可以重复转化多个基因。 诱导型启动子调控下的位点特异重组系统的不足是： 1 ) 位点特异重组具有可逆性，影响重组效率：因为重组时，重组位点核心序列断裂和重 接极为准确，在重组交换前后重组位点仍保持着结构的完整性，所以重组酶仍能继续 识别并介导新位点问的反向重组。 2 ) 实验证明，存在假阳性：一些植物不能完全切除标记基因和重组酶基因。虽然表现出 标记基因丢失的所有可见迹象，但是在分子水平上一些细胞仍然带有标记基因和重组 酶基因。 3 ) 在去除选择标记的稳定性上还需要近一步的研究，由于整个基因组可能会重组，去除 选择标记基因可能效率低，。工作量会有所增加。在现阶段转基因效率还不够高的情况 下，由于重组的机理不同，则重组的效率也不同。 4 ) 重组元件还滞留在植物基因组中，若转基因是多拷贝的，很可能发生植物内部的基因 组重组，另一方面，在经过数次转基因后，每次都引入一个重组位点。重组位点间可 能发生重组。 总的来说，在诱导型启动子调控下利用位点特异重组系统去除标记基因是建立无选择 标记基因的转基因林木的较好方法。 4 2 4 利用位点特异性重组去除叶绿体d n a 中标记基因 由于叶绿体的遗传方式是母系遗传，外源基因整合入叶绿体基因组后，不会出现象核 基因组那样随花粉转移扩散到环境中，而且目的基因的表达具有叶片组织特异性，不会 在转基因植物的果实中大量积累，因此，人们把它作为一种安全的遗传转化系统。但最近 发现，每个细胞中含有5 5 0 0 1 0 0 0 0 个叶绿体基因组拷贝，如果都达到同质化水平，则有 可能导致大量的标记基因的表达。不管采用何种标记基因，它一旦在叶绿体中表达，其重 组蛋白约占表达总蛋白的1 0 左右，这不仅明显加重了植物的新陈代谢负担，而且对环 境也有潜在的危险，因此从叶绿体转基因植株中去除标记基因也有报道。h a j d u k i e w i c z ( 2 0 0 1 ) 和c o n e i l i cs ( 2 0 0 1 ) 同时采用c r e l o x 系统，获得了不舍抗生索标记的叶绿体 转基因植株，但其中出现了假l o x 位点，产生了不需要的染色体重排负效应，出现叶子皱 缩，养料减少，可能是c r e l o x 系统的插入使某个酶失活，结果导致对植物产生毒害。 4 3 筛选标记基因的失活 选择标记基因是在筛选转化细胞的时候起作用，在得到抗性小芽后，标记基因就是多 余的，它的表达可能有副作用，采用反义f n a 基因，核酸裂解酶基因或采用抗体基因等策 略使筛选标记基因在筛选后失活。但这些方法的缺点是没有去除筛选标记基因，仍存在基 因传播的可能性。 4 4 组织特异性表达选择标记基因 选择标记基因是在筛选转化细胞的时候起作用，在标记基因前加一种弱启动子或使用 诱导型启动子使标记基因可以在筛选转化细胞后不表达或弱表达。有关报道有，o z a c a n 等( 1 9 9 3 ) 采用a o p r l 启动子控制n p t l i 的表达，a o p r i 是来源于a s p a r a g u s o f t i c i a n l i s 的 6 诱导型启动子，由它驱动的基因n p t i 在烟草叶盘的愈伤部分充分表达，能有效的筛选转 化细胞。在成熟叶片组织中n p t l i 基因很少或根本不表达，但是，这种方法实际上并没有 剔除选择标记基因，也不能用同一选择系统进行多次转化。 4 5 有色基因 如果在遗传转化过程中，不使用选择标记基因就能筛选出只含有目的基因的转基因植 株，这应该是最经济和最有效的方法，具有不同表型可直接在芽中观察的色素基因就可以 作为安全的标记基因，例如彩色基因，转基因芽与未转基因芽在颜色上有很大的不同，直 接可以挑选出来。但彩色基因的应用并不普遍，找到一种特征表型，则更具普遍性。这种 方法就是使用绿色荧光蛋白基因g f p 。 绿色荧光蛋白g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ，g f p ，最早是由s h i m o m u r a 等在海洋生物水 母中发现的( c h a l f i e e t a l ，1 9 9 4 ) 。o f p 蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，可在紫 外光源下发出稳定的绿色荧光。o f p 的这种荧光发射无需外加辅助因子或进行任何特殊 处理，对它的检测不会影响对细胞生长和功能的检测。所以可以方便地进行活体和生长状 态的观察。转化的受体组织细胞和整个个体都可以用手持紫外灯观察，对亚细胞水平的观 察利用普通的荧光显微镜即可。作为报告基因和分子探针有很大的优越性，所以目前被广 泛地用于生化和细胞生物学的各个领域。 抗生素类基因可能对有些植物有毒，使转化芽不能成活或难生根。g f p 则可用于这 类植物。例如o f p 基因在马铃薯叶绿体转化系统中的应用克服了利用a a d a 基因作筛选标 记基因时存在的壮观霉素对马铃薯组织具有毒性作用的缺陷。 但由于g f p 不能使转化细胞有生长优势，而周围的非转化细胞的生长经常超过转化 细胞，因此筛选效率低。并且，转化细胞是发荧光的单个细胞，在显微镜下很难分离出纯 的转化细胞。另外，荧光强度的非线性性质使其定量非常困难，多数生物具有微弱的自发 荧光现象，并有着类似的激发和发射波长，影响某些g f p 的检测：新生g f p 通过折叠和 加工成为具有活性的形式，过程十分缓慢。g f p 选择系统可用于效率低的组织培养，转化 系统，顽固基因型的植物的转化。 最近发现绿色荧光蛋白与荧光激活的细胞分拣器( 或称流式细胞仪，f a c s ) 联用，可使 转化细胞的一步性实时检出成为可能。荧光激活的f a c s 是根据分离对象的光学性质的不 同，通过设置不同的参数而分离所需细胞群的。因此，无论是微生物或动植物细胞，因转化细 胞与野生型细胞之问存在较强的荧光差别，它们都可以在分拣器中被快速分离。就整株植 物而言，因转基因植物在3 9 5 n m 和4 9 0 r i m 下均能发出独特的绿色荧光，故能迅速分辨，可用 于监测转化基因是否已逃逸到其近亲植物或杂草中，从而防范其对环境与人畜安全产生的 危害于未然。 4 6 无争议的生物安全标记基因 不使用抗生素抗性或除草剂抗性标记基因，而是采用一些正向标记基因，这种标记基 7 因不会杀死非转化细胞，而是利用转化细胞的生理或生长方面的优势，提高其再生几率 与抗性标记相比，这类标记基因不会对植物产生消极影响，反而有助于提高转化率。 4 6 1 有关于激素代谢的基因 与激素代谢相关的选择标记基因包括( 异戊烯基转移酶) 基因、i a a h ( 碍l 哚3 乙酰胺水 解酶) 基因。i p t 基因从农杆菌t - d n a 中克隆而来，与i a a 代谢有关，编码异戊烯基转移酶。 e b i n u m a 首先以i p t 基因为选择标记基因，用c a m v 的3 5 s 启动子驱动该基因转化烟草， 获得形态异常的转基因芽，再用重组d n a 将i p t 基因去除，获得形态正常，无选择标记 基因i p t 的转基因植株。i p t 基因已广泛用作选择标记，与位点特异性重组的酶系统或转 座子系统相结合构建高效去除选择标记基因的安全转化系统。 除i p t 基因外，i a a h ( i n d o l e3a e e t a m i d e h y d r o l y s e ) 是另外一种与激素代谢相关的安全的 选择标记基因，也是通过调节植物体内激素代谢而使转化细胞与非转化细胞的生长与分 化造成一定差异，进一步达到筛选出转化细胞的目的。所有的与激素代谢相关的标记基因 作选择标记是都会造成激素的过量作用而使转化植株呈现畸形，因而它们最终都需要被 剔除或失活。 4 6 2 有关于糖类代谢的基因 离体培养的细胞不能进行光合作用，必须在培养基中添加一定浓度的碳源f 如蔗糖、麦 芽糖、葡萄糖等) 后细胞才能进行正常的生长分化，从而产生了3 种非抗生素标记基因，即 6 - 磷酸甘露糖异构酶基因，木糖异构酶基因和核糖醇操纵子。它们能分别使转化细胞利用 6 磷酸甘露糖、木糖和核糖醇为碳源，而转化细胞由于不具有这些基因，会产生碳饥饿而 不能正常生长，从而达到高效选择的目的。 ( 1 ) 6 - 磷酸甘露糖异构酶基因 甘露糖磷酸异构酶( p h o s p h o m a n n o s ei s o m e r a s e ，p m i ) 基因编码6 磷酸甘露糖转移酶， 其产物可催化6 - 磷酸甘露糖转变为6 磷酸果糖。在含甘露糖的培养基上，植物内源果糖 激酶催化甘露糖磷酸化为6 磷酸甘露糖，从而使植物体内能量供应源a t p 大量消耗。而 催化后的产物6 磷酸甘露糖不仅不能被植物细胞进一步利用，当其积累到一定程度时就 会对细胞的正常生长代谢起到抑制作用。只有转入了外源p m i 基因的转化细胞才能继续 代谢6 一磷酸甘露糖，避免了6 磷酸甘露糖的大量积累并生产出a t p ，为细胞正常生长提 供能量。因而利用这个原理可以把p m i 基因作为标记基因随同目的基因一同被转入植物 细胞，在含有甘露糖的培养基上只有转化细胞能正常生长，而非转化细胞将被淘汰悼。本 实验是使用此法。 ( 2 ) 木糖异构酶基因 木糖异构酶( x y l o s ei s o m e r a s e ，x y l a ) 基因作用原理与6 磷酸甘露糖异构酶基因的作用 原理类似。其编码木糖异构酶，其产物能催化d 木糖与d 木酮糖的相互转变。马铃薯、 烟草和番茄等植物的培养细胞可利用d 术酮糖但不能利用d 木糖作为主要碳源。在添加 d 木糖的筛选培养基上，转化细胞因能利用d 木糖作为碳源而获得优势生长，非转化细 胞因碳源缺乏生长被抑制，生长分裂旺盛的细胞团即为转化细胞团。结果表明，d - 木糖 筛选时马铃薯、番茄的转化率比卡那霉素筛选时显著增高，烟草的转化率虽比卡那霉素筛 选时降低，但也可以取得良好的筛选效果，而且d 木糖筛选的植株生长比较旺盛。 ( 3 ) 核糖醇操纵子 一般生物细胞不能利用核糖醇作为碳源。而大肠杆菌c 菌株却能在以核糖醇为碳源 的培养基上生长。这是因为c 菌株中有两个紧紧串联的操纵子，即a t l 和n l 从c 菌株分 别转到b 菌株和k - 1 2 两菌株中后，两菌株都能在以核糖醇为碳源的培养基上正常生长。 因此认为核糖醇操纵子可以作为一种非抗生素选择标记应用于植物遗传转化。 4 6 3 有关氨基酸代谢的基因 某些支链氨基酸( 赖氨酸，苏氨酸) 的合成都要经过天冬氨酸合成途径。其中赖氨酸 是由天冬氨酸激酶和二羟基吡啶二羧酸合酶催化合成的，两种酶都受到赖氨酸的反馈抑 制。细菌来源的这两种酶由于对赖氨酸不敏感，将克隆于大肠杆菌中的谷氨酸1 一半醛转 氨基因作为筛选标记基因。在含赖氨酸的培养基中转基因植株能成活，而非转基因植株则 因死亡而被淘汰。 叶绿素是植物光合作用的物质基础，如果植物中缺少叶绿素，那么植物将失绿，不能 正常地进行光合作用，从而影响植株的正常生长发育甚至导致植物死亡。植物体内叶绿素 生物合成的第一个中间产物是6 一氨基吖- 酮戊酸a l a ，它是由谷氨醛- 1 - 半醛在谷氨醛- i 一 半醛转氨酶的催化下形成的；然后两个a l a 分子在a l a 脱氢酶的催化下，生成胆色素 原( 3 丙酸基4 乙酸5 氨甲基吡咯) ；4 个胆色素分子再聚合在一起，最终在镁离于的参 与下形成叶绿素。只要该途径的任何一步发生中断，都会影响叶绿素的正常合成。最近， 正是利用这一原理发明了一种基于叶绿索合成的生物安全标记一谷氨醛1 一半醛转氨酶基 因。 3 氨基2 ，3 - 二氢苯甲酸( 3 - a m i n o 2 ，3 面h y d r o b e n z o i ca c i d ，g a b a c u l i n e ) 是一种植 物毒素，它能强烈地抑制g s a - a t 的活性使a l a 不能合成，从而导致叶绿索的生物合成 发生中断。然而若在培养基中加入a l a ，叶绿素的生物合成就可以正常进行。到目前为 止，己经分离出了许多抗g a b a c u l i n c 的突变体。其中有一个被命名为g r 6 的突变体携带 有h e m l 基因。与野生型相比，该基因所编码的g s a - a t 分别在5 、6 和7 位上缺失了丝 氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸，并且2 4 8 位上的甲硫氨酸被异亮氨酸所取代。进一步的研究表 明，这两处突变都是g a b a c u l i n e 抗性所必需的。作为一种选择标记基因，h e m l 与抗生素 或除草剂抗性基因的选择原理相似都是利用一种抗性基因使转化细胞具有某种抗性，从而 能够在含有该选择剂的培养基上正常生长，而非转化细胞由于缺少该抗性，生长受到抑制 甚至死亡。所不同的是，g r 6h e m l 不具有抗生素或除草剂抗性，从而避免了由于抗生素 或抗除草剂基因在转基因植物中存在而引起的争论。 二绿色荧光蛋白基因 g f p 基因不仅可以作为筛选标记基因使用，g f p 作为一种新型的报告基因正日益受到 科学工作者的青睐。 1与其余两种常用报告基因g u s 和l u c ； 1 | 比，g f p 具有极大的优越性。 ( 1 ) 荧光稳定：g f p r c j 光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；g f p 在p h 7 - 1 2 范围内 也能正常发光；对高温( 7 0 ) 、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶( 链霉蛋白 酶p r o n a s e 除外) 都有较强抗性。 ( 2 ) 检测方便：因为g f p 荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在这些物质可能 难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉 眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。 ( 3 ) 无毒害：从目前的研究结果来看，o f p 对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也 没有影响，转化后细胞仍可连续传代。 ( 4 ) 易于得到突变体：g f p 中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强了荧光 强度，适合在不同物种中专一性表达。 ( 5 ) 易于构建载体：f h t g f p 分子量较小，仅为2 7 3 0 k d ，编码g f p 的基因序列也很短，为 2 ，6 k b ，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 ( 6 ) 可进行活细胞定时定位观察：对活细胞中蛋自的功能研究，更能接近自然真实的状态。 通过0 f p 可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助于近来广泛使用的 激光扫描共聚焦显徼镜，结合强大的计算机软件，可进行三维显示。 ( 7 ) 共用性和通用性：首先表现在g f p 的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、 动物中都获得了成功的表达；其次是g f p 没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可 以表达发出荧光。 2g f p 监测转基因植物中选择标记基因的消除中的作用 此外利用g f p 可在活体上直接观察的优点，可视辅助标记，在对选择标记基因的去 除的检测上发挥着重要的作用：方便的检测选择标记基因的消除，检测消除了选择标记 基因的二次转化体可有效的表达目的蛋白( 贾洪革，2 0 0 4 ) 。 2 1 共转化中的监测 通过共转化在子代筛选