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北京化工大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：呈壁至丛 日期： 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 权书。 作者签名：粪缉旌 别帷名：j 卜 e l 期：型：叠：堑 日期： 2 碰：益：! 墨 i ， 北京化工大学硕上学位论文 学位论文数据集 中图分类号q 8 1 2学科分类号 1 8 0 7 1 论文编号 eoo o f 0 0l - 1 密级 学位授予单位代码 1 0 0 10 学位授予单位名称北京化工大学 作者姓名吴世根学号 2 0 0 8 0 0 1 1 7 1 获学位专业名称化学工程与技术 获学位专业代码 课题来源研究方向基因工程与代谢调控 论文题目富马酸基因工程菌的构建 富马酸，草酰乙酸，苹果酸，丙酮酸羧化酶，富马酸酶，乳酸脱氢酶， 关键词 质粒p p i c 3 5 k ，保守序列，r t p c r ，毕赤酵母，重组菌，发酵 论文答辩日期 2 0 1 1 0 5 2 3 论文类型应用研究 学位论文评阅及答辩委员会情况 姓名职称工作单位学科专长 指导教师王芳教授北京化工大学生物化工 评阅人1邓利副教授北京化工大学生物化工 中科院微生物 评阕人2 徐家立研究员生物化工 所 评阅人3 评阅人4 评阅人5 答辩委员会主席谭天伟教授北京化工大学生物化工 答辩委员1苏海佳教授北京化工大学生物材料 生物化工和化学生物 答辩委员2罗施中副教授北京化工大学 学 答辩委员3邓利副教授北京化工大学生物化工 答辩委员4张栩副教授北京化工大学生物化工 答辩委员5 征：一 四 论文类型：1 基础研究2 应用研究3 开发研究4 其它 中图分类号在中国图书资料分类法查询。 学科分类号在中华人民共和国国家标准( c b t1 3 7 4 5 - 9 ) 学科分类与代码中 查询。 论文编号由单位代码和年份及学号的后四位组成。 2 摘要 富马酸基因工程菌的构建 摘要 富马酸是一种重要的化工原料和精细化工产品，在医药、化工、 树脂等领域有着非常广泛的应用前景，其生物生产方法已经受到了广 泛的重视，如微生物发酵法。本文以毕赤酵母作为出发菌株，研究考 察米根霉富马酸酶基因、毕赤酵母丙酮酸羧化酶基因在毕赤酵母细胞 中的过表达对富马酸胞质途径的影响，以及敲除副产物乳酸代谢过程 中的关键酶乳酸脱氢酶基因，使得更多碳源流向富马酸胞质途径。 本实验克隆了毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i sg s l1 5 ) 中编码丙酮酸羧 化酶的基因( p c ) ，在毕赤酵母中进行了强化表达，以研究p c 基因 在毕赤酵母中的过量表达对t c a 还原途径碳源分流及草酰乙酸、l 苹果酸生产的影响。为此，研究构建了表达载体p p i c 3 5 k p c ，并转 化了毕赤酵母g s l1 5 。转化子经过表型鉴定，p c r 分析和g 4 1 8 浓度 梯度筛选获得了高拷贝的重组子( p a s 0 1 ) 。甲醇诱导表达后，经 s d s p a g e 分析及p c 活性检测，发现酶活提高了3 倍，说明p c 在 毕赤酵母中获得了成功表达。以p p i c 3 5 k 转化菌为对照，对该重组 子进行了草酰乙酸、苹果酸的发酵研究，结果显示草酰乙酸产量 ( 1 7 7 4m g l - 1 ) 提高了1 0 9 6 ，l 苹果酸的产量( 1 2 7 4 5m g l 1 ) 提 高3 3 7 ，菌体生物量提高1 5 7 ，表明p c 的过量表达有助于l 苹 果酸、草酰乙酸的积累，并且对菌体的生长有一定的促进作用。 为克隆米根霉细胞中的富马酸酶基因，本实验先后更换了二十对 引物，尝试通过逆转录聚合酶链式反应( r t p c r ) 扩增富马酸酶基 l 北京化t 大学硕十学位论文 因片段，未果。随后根据米根霉富马酸酶基因的保守序列设计引物， 扩增得到2 5 0 b p 长度的保守序列，与模板相比同源性只有7 6 ；说明 目前所使用的这株米根霉3 2 6 8 6 细胞中的富马酸酶基因序列与1 9 5 9 年以色列学者报导的模板序列具有较大差异，该菌中的f u m r 是一个 新的基因。 克隆了毕赤酵母中编码乳酸脱氢酶的基因l d h ，同时也克隆了 博来霉素抗性基因z e o c i n ，构建了l d h 敲除载体p m d l 8 - t - l d h u p z e o c i n l d h d o w n ，其中上游同源臂有9 0 0 b p 左右，下游同源臂包含 5 0 0 b p 大小的序列，通过同源重组敲除l d h 基因。 关键词：富马酸，草酰乙酸，丙酮酸羧化酶，富马酸酶，乳酸脱氢酶 l l a b s t r a c t p r o d u c t i o no ff u m a i u ca c i db yr e c o m b i n a n t b a c t e 砌a a b s t r a c t f u m a r i ca c i di sa n i m p o r t a n tc h e m i c a lr a wm a t e r i a l sa n df i n e c h e m i c a l p r o d u c t s ，h a s a v e r y w i d e r a n g e o f a p p l i c a t i o n s i n p h a r m a c e u t i c a l s ，c h e m i c a l s ，r e s i n sa n do t h e rf i e l d s ，a n di t sb i o l o g i c a l p r o d u c t i o nm e t h o d sh a v er e c e i v e dw i d ea t t e n t i o n ，s u c ha sm i c r o b i a l f e r m e n t a t i o n i nt h i sp a p e r , w et o o kp i c h i a p a s t o r i sa st h es t a r t i n gs t r a i n a n di n v e s t i g a t e di n f l u e n c eo ft h e e x p r e s s i o n o ff u m a r a s eg e n ef r o m r h i z o p u so r y z a ec g m c c 3 2 6 8 6a n dp y r u v a t ec a r b o x y l a s eg e n ef r o m p i c h i ap a s t o r i so nt h e c y t o p l a s m i cp a t h w a yo ff u m a r a t e w ea l s o k n o c k e do u tl a c t a t ed e h y d r o g e n a s eg e n e ，w h i c hi sak e ye n z y m ei nt h e m e t a b o l i s m o fl a c t i c a c i d ，t om a k ew a yf o rm o r ec a r b o nf l o wo f c y t o p l a s m i cf u m a r a t e i nt h i ss t u d y , w eo v e r e x p r e s s e dp cg e n ei np c h ap a s t o r i sg s 115 ， a n di n v e s t i g a t e di t si n f l u e n c eo nt h ed i v e r s i o no fc a r b o nt ot h er e d u c t i v e t c a p a t h w a ya n dt h ey i e l d so ft h eo x a l o a c e t a t ea n dl m a l i ca c i d t h e e x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 3 5 k p cw a sc o n s t r u c t e d ，a n dw a si n t r o d u c e di n p i c h i ap a s t o r i sg s115 ah i g h - c o p yr e c o m b i n a n t ( p a s 一01 ) w a ss c r e e n e d 北京化工大学硕上学位论文 o u tf r o m3 0p o s i t i v et r a n s f o r m a n t sb yp h e n o t y p i ci d e n t i f i c a t i o n ，p c r a n a l y s i sa n dg 4 18c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s e l e c t i o n a f t e rm e t h a n o l i n d u c t i o n ，r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a sa n a l y s e db ys d s p a g ea n dp c a c t i v i t yw a sd e t e c t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tp cw a so v e r e x p r e s s e di nt h e p i c h i ap a s t o r i s ，a n dt h ea c t i v i t yw a si n c r e a s e d3 - f o l d s c o m p a r e dt ot h e c o n t r o l ( p p i c 3 5 kt r a n s f o r m a n t ) ，o x a l o a c e t a t ep r o d u c t i o n ( 17 7 4m g l _ 1 ) o ft h er e c o m b i n a n t ( p a s 一01 ) w a si n c r e a s e db y10 9 6 ，l m a l i ca c i d p r o d u c t i o n ( 1 2 7 4 5m g l - 1 ) i n c r e a s e db y3 3 7 a n dc e l lb i o m a s s i n c r e a s e db y10 t h r o u g ht h ef e r m e n t a t i o n t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t o v e r e x p r e s s i o no fp ci sp r o p i t i o u st ot h ea c c u m u l a t i o no fo x a l o a c e t a t e a n dl - m a l i ca c i d ，w h i c ha l s op l a yas i g n i f i c a n tr o l ei n p r o m o t i n gt h e g r o w t ho fs t r a i n i no r d e rt o c l o n ef u m a r a s e g e n e f r o m r h i z o p u so r y z a e c g m c c 3 2 6 8 6 ，i nt h i se x p e r i m e n tw ed e s i g n e dt w e n t yp a i r so fp r i m e r s a n dt r i e dt oc l o n ef u m a r a s eg e n eb yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) ，b u tf a i l e d s u b s e q u e n t l y , a c c o r d i n gt ot h e c o n s e r v e ds e q u e n c eo ff u m a r a s eg e n ef r o mr h i z o p u so r y z a e ，w ed e s i g n e d ap a i ro fp r i m e r sa n da m p l i f i e d2 5 0b p l e n g t hc o n s e r v e ds e q u e n c e ， c o m p a r e dw i t ht h et e m p l a t ei so n l y7 6 h o m o l o g y ；t h a tt h i ss t r a i ni s c u r r e n t l yu s e db yt h ec e l l so fr h i z o p u so r y z a ec g m c c3 2 6 8 6t h eg e n e s e q u e n c eo ff u m a r a s e 19 5 9t e m p l a t e s e q u e n c ei s r a e l i s c h o l a r sh a v e r e p o r t e dl a r g ed i f f e r e n c e si nt h ef u m rb a c t e r i ai san e wg e n e 1 1 a b s t r a c t t h el d h g e n ew h i c he n c o d e sl a c t a t ed e h y d r o g e n a s ew a sc l o n e d ， a n dt h eb l e o m y c i nr e s i s t a n c eg e n ez e o c i nw a sa l s oc l o n e d a tt h es a m e t i m e ，t h e k n o c k o u tv e c t o ro fl d hw a s c o n s t r u c t e d ，n a m e d p m d 18 一t - l d h u p z e o c i n - l d h d o w n ，w h i c hh a s9 0 0 b pu p s t r e a m h o m o l o g o u sa lm a n da b o u t5 0 0b pd o w n s t r e a mh o m o l o g ya i mi no r d e rt o k n o c k o u tt h el d hg e n e sf r o mt h e g e n o m eo fp i c h i ap a s t o r i sb y h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n k e yw o r d s ：f u m a r i ca c i d ，o x a l o a c e t i ca c i d ，p y r u v a t ec a r b o x y l a s e ， f u m a r a s e ，l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e n i 目录 目录 第一章文献综述。1 1 1 富马酸的概况1 1 1 1 富马酸的理化性质1 1 1 2 富马酸的用途2 1 1 3 富马酸的生产方法【8 珈】2 1 2 草酰乙酸及苹果酸的概况3 1 2 1 草酰乙酸的概况3 1 2 2 苹果酸的概况4 1 3 富马酸的代谢分析4 1 3 1 富马酸的代谢网络4 1 3 2 富马酸的代谢分析5 1 3 3 富马酸代谢路径中的关键酶6 1 3 3 1 丙酮酸羧化酶( p c ) 。6 1 3 3 2 富马酸酶( f u m ) 6 1 3 4 乳酸脱氢酶( l d h ) 7 1 4 毕赤酵母表达系统8 1 4 1 毕赤酵母的生物学特性8 1 4 2 毕赤酵母的载体8 1 4 3 毕赤酵母宿主菌8 1 5 富马酸基因工程菌的研究9 1 5 1 富马酸基因工程菌构建的相关研究进展9 1 5 2 丙酮酸羧化酶的研究进展9 1 6 研究计划部分1 0 1 6 1 课题的创新之处1 0 1 6 2 课题的构建思路l o 1 6 3 论文选题的立论、目的和意义1 l 1 6 4 课题的主要研究内容1 1 第二章米根霉富马酸酶基因的克隆1 3 北京化t 大学硕上学位论文 2 1 引言1 3 2 2 材料与方法1 3 2 2 1 菌株与质粒1 3 2 2 2 实验试剂及实验设备13 2 2 3 培养基l4 2 2 4 实验方法l4 2 2 4 1r n a 提取前的准备工作1 4 2 2 4 2 试剂盒t r i z o l 法提取总r n a 1 4 2 2 4 3 改进的t r i z o l 法提取总r n a 14 2 2 4 4 热苯酚法提取总r n a 15 2 2 4 5 琼脂糖凝胶电泳检测总r n a 1 5 2 2 4 6 总r n a 纯度和完整性及产量的测定1 6 2 2 4 7 两步法逆转录聚合酶链式反应( i m p c r ) 扩增目的基因f u m r 1 6 2 2 4 8 琼脂糖凝胶电泳回收f u m rd n a 片段1 7 2 2 4 9 目的基因f u m r 与t 载体的连接1 8 2 2 4 1 0 大肠杆菌d h 5 a 化学转化法感受态细胞的制备。1 8 2 2 4 1 1f u m r p m d l 8 t 重组载体的化学转化1 9 2 2 4 1 2f u m r p m d l 8 t 重组予阳性克隆的筛选1 9 2 2 4 1 3p c r 产物的序列分析2 0 2 2 4 1 4 巢式p c r 扩增f u m r 基因片段2 0 2 2 4 1 5r t - p c r 扩增f u m r 片段中的保守区域。2 l 2 3 结果与讨论2 2 2 3 1 米根霉( r h i z o p u so r y z a ec g m c c3 2 6 8 6 ) 总r n a 的提取2 2 2 3 2 总r n a 纯度和产量的测定一2 3 2 3 2r t - p c r 扩增f u m r 。2 3 2 3 3t 载体重组子的鉴定2 3 2 3 4 米根霉基因组的提取2 5 2 3 5 以米根霉基因组为模板扩增f u m r 序列2 5 2 3 6f u m r 保守区域的扩增2 6 2 4 小结2 7 第三章丙酮酸羧化酶基因在毕赤酵母中的过量表达2 9 3 1 引言2 9 3 2 材料与方法。2 9 i i 3 3 2 2t 载体重组质粒的酶切验证。4 0 3 3 3p c 基因的序列分析4 l 3 3 4 重组表达质粒p p i c 3 5 k p c 的构建4 l 3 3 4 1p p i c 3 5 k p c 重组子的菌落p c r 鉴定4 l 3 3 4 2p p i c 3 5 k p c 的酶切鉴定。4 l 3 3 4 3p p i c 3 5 k p c 测序分析4 3 3 3 5p p i c 3 5 k p c 毕赤酵母重组子h i s + m u t + 表型的筛选4 4 3 3 5 1h i s + 表型重组子的筛选4 4 3 3 5 2h i s + m u t + 表型毕赤酵母重组子的筛选4 4 3 3 6h i s + m u t + 表型重组子的p c r 分析鉴定4 5 3 3 7 重组丙酮酸羧化酶的诱导表达4 6 l l i 北京化工大学硕上学位论文 3 3 7 1 蛋白浓度标准曲线的绘制4 6 3 3 7 2 目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间的确定4 7 3 3 7 - 3 重组蛋白的诱导表达4 7 3 3 8 重组丙酮酸羧化酶的酶活测定4 8 3 3 9 重组菌的生长曲线4 9 3 3 1 0 标准曲线的绘制4 9 3 3 1 0 1 富马酸标准曲线的绘制4 9 3 3 1 0 2 草酰乙酸的标准曲线的绘制5 0 3 3 1 0 3l 苹果酸标准曲线的绘制5 1 3 3 1 0 4 乙醇标准曲线的绘制。5 2 3 3 1 1 富马酸、苹果酸、草酰乙酸发酵生产5 3 3 4 _ 、结5 4 第四章乳酸脱氢酶基因l d h 敲除载体的构建5 7 4 1 引言5 7 4 2 材料与方法5 7 4 2 1 菌株与质粒5 7 4 2 2 实验试剂和仪器设备5 7 4 2 3 培养基5 7 4 2 4 实验方法5 8 4 2 4 1 毕赤酵母g s l1 5 基因组的提取5 8 4 2 4 2 毕赤酵母g s l1 5 乳酸脱氢酶基因l d h 的克隆5 8 4 2 4 3p c r 扩增博来霉素基因( z e o c i n ) 5 9 4 2 4 4 敲除载体p m d l 8 t - l d h u p z e o c i n l d h d o w n 载体的构建5 9 4 3 实验结果与讨论5 9 4 3 1l d h 乳酸脱氢酶基因的克隆5 9 4 3 2p c r 扩增z e o c i n 编码基因6 l 4 3 3z e o c i n 编码基因的克隆6 1 4 3 3 1 菌落p c r 的分析6 1 4 3 3 2 酶切鉴定重组质粒p m d l8 - t - z e o c i n 6 2 4 3 4 敲除质粒p m d l8 t - l d h u p z e o c i n d o w n l d h 的构建6 2 4 4 j 、结6 3 第五章实验总结与建议6 5 i v v 6 5 6 5 6 7 。7 5 。7 7 7 9 第一章文献综述 1 1 富马酸的概况 1 1 1 富马酸的理化性质 第一章文献综述 富马酸外观为白色无臭针状、片状或者单斜菱状结晶，有水果味，无毒、可 燃，并且在空气中非常稳定，它又叫反丁烯二酸，在细胞的t c a 循环中通常称为 延胡索酸，是一种重要的精细化工产品，广泛用于食品、医药、化工涂料树脂等 领域。其酸度为柠檬酸的1 5 倍，密度1 6 3 5g c m 3 ，熔点2 8 7 ，可溶于水和乙醇； 2 5 时，水中溶解度为6 3g ；1 0 0g 乙醇中可溶解5 7 6g ，不溶于氯仿和苯，其他 的性质如下表t 1 所示【1 2 】： 表1 1 富马酸物化性质 t a l b e 1 1t h eq u a l i t yo ff u m a r i ca c i d 飞 白色粉末或结晶状固体。有酸味。溶于乙醇，微溶于水，不溶于氯仿。 化学名称反丁烯二酸 分子式 c 4 h 4 0 4 | h c c - 壬i 跆构式 i h c - - c o o h 性； 汾子量 1 1 6 0 7 状； 镕解度 ( g 1 0 0 9 ) 2 5 水0 7 1 0 0 。c 水 9 8 3 0 。c 乙醇 5 7 6 鎏o 二甲苯 b 0 3 北京化工大学硕士学位论文 1 1 2 富马酸的用途 富马酸是一种重要的有机化工原料和精细化工产品，工业级的富马酸主要用 于生产不饱和聚酯树脂和醇酸树脂f 3 】。富马酸可与苯乙烯生成共聚物用于生产玻 璃钢，与乙酸、乙烯的共聚物是一种优良的黏合剂【4 1 。在医药领域，富马酸可用 于生产解毒药二硫基丁二酸钠等，富马酸钠与硫酸亚铁的置换产物富马酸铁广泛 应用于治疗人体小红血球贫血病【5 】。富马酸作为一种重要的四碳平台化合物，目 前全世界富马酸的主要用途如图1 1 。富马酸与碳酸钠作用可以生成一种食品的 风味增强剂，食品级富马酸纯度高于9 9 时作为酸味剂口味非常纯正。此外，富 马酸的脂类衍生物还可以作为防霉防腐剂，诸如富马酸顶二脂【6 】。 图1 1 富马酸应用的研究现状7 】 f i g 1 - 1c u r r e n ta p p l i c a t i o n so ff u m a r i ca c i dp r o d u c t i o n 1 1 3 富马酸的生产方法1 8 - 1 0 i 富马酸的生产方法主要有化学合成法和生物法。化学合成法主要是通过苯的 催化氧化进行生产，苯经过氧化生成马来酸，然后异构化转化成富马酸。生物法 生产富马酸的主要方法包括酶催化法和微生物发酵法；酶催化转化法是2 0 世纪 9 0 年代中期生物法生产富马酸的主要方法，采用马来酸为底物，在马来酸异构 2 第一章文献综述 酶催化作用下生成富马酸。化学法制备富马酸面临的主要难题是由于化石资源引 起的生产成本的增加及对环境造成的严重污染。石油是一种不可再生资源，其储 存量是有限的，由于石油资源的短缺世界石油市场供需失衡，石油价格也因此价 格猛涨，从而导致了石油基大宗化学品的价格大幅上涨。 微生物发酵可以利用糖质原料直接发酵制备富马酸，如霉菌、酵母及细菌。 其中根霉菌( r h i z o p u s ) 由于具有营养要求简单、环境适应能力强以及生长迅速等 特点，被广泛应用于富马酸的发酵生产研究。 1 2 草酰乙酸及苹果酸的概况 1 2 1 草酰乙酸的概况 草酰乙酸( o x a l o a c e t i ca c i d ) 既是一种0 【酮酸也是一种1 3 一酮酸，其结构如图 1 2 所示，它同时具有两种官能团的性质，分子量为1 3 2 0 7 ，熔点1 6 1 ，可溶于 水。作为a 酮酸，其酮基碳可受亲核进攻，例如：草酰乙酸发生c a 转氨基作 用，得到天冬氨酸；草酰乙酸与乙酰c o a 缩合，得柠檬酸。作为d 一酮酸，草酰乙 酸稳定性不强，易脱羧。例子有：苹果酸在苹果酸酶催化下经过草酰乙酸，发生 氧化脱羧生成丙酮酸；糖异生中，草酰乙酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶作用下 转变为磷酸烯醇式丙酮酸；丙酮酸在丙酮酸羧化酶催化下转化为草酰乙酸，这是 三羧酸循环的一个重要回补途径【1 1 1 ，该反应需要生物素作辅酶，消耗一分子a t p 。 0 o h o0 图l - 2 草酰乙酸结构式 f i g 1 - 2t h es n u c t i l r eo f o x a l o a c e t a t e 洲 i l c o o h 愀 图1 _ 3l 苹果酸结构式 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r eo fl - m a l a t e 北京化工大学硕士学位论文 1 2 2 苹果酸的概况 苹果酸( m a l i ca c i d ) ，又名2 一羟基丁二酸，结构如图1 3 所示，在大自然中苹 果酸存在三种形式，即：d 苹果酸、l 苹果酸和混合物d l 苹果酸。在微生物细 胞中主要以l 苹果酸：l 一苹果酸t 密度1 5 9 5 ，熔点1 0 0 ，分解点1 4 0 ， 比旋光度2 3 0 ( o 0 8 5 9 m l 一，溶剂水) ，易溶于水、甲醇，不溶于苯【1 2 】。l 苹果酸是生物体三羧酸的循环中间体，广泛应用于酒类、饮料、果酱、口 香糖等多种食品中，并有逐渐替代柠檬酸的势头，是目前世界食品工业中用 量最大和发展前景较好的有机酸之一。l 苹果酸是一种重要的有机酸在医 药、食品、化工等行业得到广泛的应用。l 苹果酸是第二大食用有机酸，使用量 为柠檬酸的十分之一；广泛用于制药和化妆品， l 苹果酸可通过发酵或富马酸 的酶法转化生产得到富马酸通过水合作用形成苹果酸，l 苹果酸生产方法主要可 分两大类即发酵法和转化法，而转化法主要包括固定化酶和固定化细胞转化【1 3 】。 2 0 世纪8 0 年代末以来无论是对固定化酶还是对固定化细胞转化工艺的研 究都获得突破，并成功应用于工业化生产。而发酵法生产l 苹果酸的研究还未有 重大进展，目前正在研究开发的发酵法生产l 苹果酸的工艺主要有三类，一是糖 质原料一步发酵法，即用霉菌直接发酵生产l 一苹果酸：二是两步发酵法，即采用 两种不同功能的微生物，其中之一先将糖质或其他原料转化生成富马酸，另一 种微生物将富马酸转化成l 苹果酸，三是以富马酸为原料的直接发酵法【1 4 】。 1 3 富马酸的代谢分析 1 3 1 富马酸的代谢网络 w r i g h t 等通过c 1 4 同位素追踪获得了米根霉细胞中葡萄糖的代谢模型【1 5 】，见 图1 5 ，米根霉细胞中富马酸的主要带些通路有两条：其一，在t c a 循环中，琥 珀酸在琥珀酸脱氢酶作用下生成富马酸，富马酸通过其自身的转运机制进出线粒 体，可在富马酸酶的催化作用下生成l - 苹果酸；其二，在细胞液中丙酮酸在丙酮 酸羧化酶作用下可以与c 0 2 发生反应，生成草酰乙酸，然后经过苹果酸脱氢酶的 作用生成苹果酸，最后在富马酸酶的催化作用下转化成富马酸，其过程如下： 黼a t p 。, c o o h i o 鬯少洲k h _ h o o c o o h 4 1 3 2 富马酸的代谢分析 富马酸胞液途径：理论得率远远大于线粒体途径，为富马酸的主要合成途径， 为提高实际得率应尽可能地增大胞液途径的代谢流分布；线粒体途径：合成富马 酸的次要途径，得率较低，代谢分析过程见表1 2 【l6 1 ，主要为细胞生长和合成物 质提供能量；尽可能增大胞液途径的代谢通量，需兼顾细胞生长和物质合成所需 能量的供应。 表l - 2 线粒体途径与胞液途径分析 t a b l e 1 2a n a l y s i so f m e t a b o l i s mi nm i t o c h o n d r i o na n dt h a ti nc y t o s o l 线粒体途径 施液途径 理论反应方程式 能量守但( 假设葡萄薷完全 进入线粒体或胞液途径) 理论摩尔得牢 理论质裳得率( ) c 6 v l l 2 0 + 3 0 2 。_ 。- c h 1 0 + 2 c 0 2 + 4 h 2 0 c 6 h l d 6 2 c o 亨- 2 c h o + 2 如o 共有糖酵解过穗共产生2 啪la l p 和2 r a o ln a d h li d o l 丙酮酸经过曼羧骏循 环共产生lm o l a t p 、lt o o l n 刖阱挖和3 m o l n a d h 折 算为it o o ! 葡籀糖a t p 产 能2 4 m 0 1 1 6 4 4 lm o l 丙酮酸生成富马艘需 要lm o tn a d h 稠lm o ! a t p 折算为lt o o l 葡萄塘， 耗能与糖群解的产毙抵滑 2 1 2 9 0 北京化工大学硕士学位论文 1 3 3 富马酸代谢路径中的关键酶 1 3 3 1 丙酮酸羧化酶( p c ) 丙酮酸羧化酶( p c ，e c6 4 1 1 ) 是一种生物素依赖性多功能酶，在中间代 谢途径中具有重要的作用，它催化丙酮酸转化为草酰乙酸，期间伴随a t p 的分解， 催化生成的草酰乙酸主要参与糖异生途径，t c a 还原途径，同时需要参与回补 t c a 循环【1 7 】。各种丝状真菌如根霉属( r h i z o p u s ) ，在液体培养基中能够积累富 马酸、l 苹果酸或者草酰乙酸等有机酸，最重要原因之一就是细胞质中p c 的存 在，并且具有较强的活力；而在哺乳动物细胞、植物细胞及大部分的真核细胞胞 质中不存在p c ，它们的p c 只存在于线粒体中【l 引，所以正常情况下这些细胞不会 积累有机酸，只有当哺乳动物细胞在病理状态下，突变体的真核细胞才可能会积 累富马酸、l 苹果酸、草酰乙酸【1 9 】，其结构示意图见图1 - 6 所示【2 0 1 。 鲥坩s i t ed 棚 图1 _ 6 丙酮酸羧化酶的反应结合位点 f i g 1 - 6s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h ea c t i v es i t ec l e f to fo n es u b u n i to fp y r u v a t ec a r b o x y l a s es h o w i n g t h eb i o t i np r o s t h e t i cg r o u pa c t i n gt oc a l t yt h ec a r b o x y lg r o u pf r o mt h es i t eo fr e a c t i o nt ot h a to f r e a c t i o n 1 3 3 2 富马酸酶( f u m ) 富马酸酶通过可逆的水合作用催化富马酸转化成l 苹果酸，富马酸酶有两 种类型，i 型富马酸水合酶在氧存在条件下不稳定，有两个相同的亚基构成，含 有这种酶的微生物主要有大肠杆菌e s c h e r i c h i ac o l i ，小眼虫e u g l e n ag r a c i l i s ，以 6 第一章文献综述 及嗜热脂肪芽孢杆菌b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 。而在其它微生物细胞中主要存 在i i 型富马酸酶，它是一种具有稳定结构四聚物。在大肠中，有三种编码富马 酸酶的基因，其中有两种属于i 型，f u m a 和f u m b ，剩下一种属于i i 型， f u m c 【2 1 1 。在酿酒酵母s c e r e v i s i a e ，老鼠和人的细胞中富马酸酶是由一个基因编 码的，而且富马酸酶同时分布在胞质及线粒体中。一个新的模型假定酿酒酵母可 以积累l 苹果酸至2g l ，但是不能积累富马酸，富马酸酶翻译的起始位置只 有一个5 端的a u g ，因此只会产生一种转录产品【2 2 1 。 1 3 4 乳酸脱氢酶( l d h ) 乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶。在发酵过程中，乳酸脱氢酶将丙酮酸转化成乳 酸，一般的新陈代谢和运动中乳酸会不断产生，但浓度一般不会上升【2 3 】。它的 同功酶有五种形式，即l d h 1 ( h 4 ) 、l d h 2 ( h 3 m ) 、l d h 3 ( h 2 m 2 ) 、l d h 4 ( h m 3 ) 及l d h 5 ( m 4 ) ，可用电泳方法将其分离。l d h 同功酶的分布有明显 的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。正常人血清中 l d h 2 ) l d h l 。如有心肌酶释放入血则l d h l ) l d h 2 ，利用此指标可以观察诊 断心肌疾病【川。 l h o - p - - o l o o l | 1 1 0 p 。0 l 0 隔| 曩。巾一o 一 ， o ， 麓薅l ， 图1 - 7 乳酸脱氢酶的结构 o l p 一0 翟 8 ，e o 珏o e 麓黪 f i g 1 - 7t h es t r u c t u r eo fl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e 7 n h 奢 一0一 。砖呻；|o 鼢 北京化工大学硕上学位论文 1 4 毕赤酵母表达系统 1 4 1 毕赤酵母的生物学特性 毕赤酵母的生物学特性之一就是可以把甲醇当做唯一碳源。a o x l 和a o x 2 是两种编码醇氧化酶的基因，有9 2 的同源性，其蛋白及特异性的催化反应位点 具有较高的同源性，a o x l 编码的蛋白在氧化过程中起主要作用【2 5 1 。a o x l 转录 水平比a o x 2 要高，所以在利用甲醇生长的细胞中，5 的p o l y a + r n a 由a o