循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用.doc

武汉友芝友生物制药有限公司循环肿瘤细胞检测及临床应用中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。关键词：循环肿瘤细胞 富集 检测 临床 Abstract: Circulating tumor cells come from the primary tumor proliferation,andproliferation, and then enter into the blood or lymphatic system. Circulating tumor cells are rare in the blood. Generally, circulating tumor cells should be enriched first, and then detected. A variety of cell enrichment and detection technologies have been developed. This paper reviews the research progress in CTCs enrichment and detection techniques, as well as analysis of CTCs in clinical and research.Key words: Circulating tumor cells enrichmentcells detectionenrichment detection clinical 癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡1。1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念2。从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移3。由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌4，、前列腺癌5，、结直肠癌等6。基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的Cell Search技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。Cell Search技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。大多数常规的癌症治疗方法在治疗转移性癌症方面难以成功，CTCs的可能促进肿瘤的临床研究。CTCs在血液中极其稀少，数十亿的外周血细胞也阻碍了对CTCs的分离和分子鉴定。现在已经开发了大量的技术用于富集和检测CTCs，其中有些已经成功的用于测试或者临床评估。本文主要综述CTCs的富集和检测技术的研究进展，以及对CTCs的在临床分析和研究上应用。1 CTCs富集技术为了从大量血液细胞中捕获数量稀少的CTCs，富集分离技术必须足够敏感性，可重复性，可靠，、快速，、便宜，并且所需获取血液量要尽量少，方便实现过程自动化，方便下游分析。此外，富集分离的CTCs要能够保持他们的活性，在富集分离的过程受到的干扰要尽量小，因为这可能改变CTCs的状态和表型7。CTCs富集的技术有很多种，这些技术使用多个性能参数评估(即捕获效率，纯度，细胞活力，富集速度，血液样本容量等)，然后通过检测临床样本进行验证。最佳的富集分离方法可能需要之间的性能参数的折衷，而且可能依赖于下游的应用。CTCs的富集技术主要根据免疫亲和性，物理性质和直接分析分为三类。1.1 免疫亲和性(Immunoaffinity)以免疫亲和性为基础的CTCs富集主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs靶抗原(如EpCAM)之间的高度特异性。基于EpCAM抗体的富集技术有很多种，主要区别在于捕获的方法有所不同。抗体捕获的方法主要有以下几种。1.1.1免疫磁珠法(Magnetic beads)免疫磁珠法富集CTCs主要是利用捕获抗体(如EpCAM抗体)和CTCs抗原(如EpCAM)之间的高度特异性反应，免疫作用促使抗原与耦合到磁珠的抗体发生特异性的结合，然后抗原-抗体复合物被置于磁场作用之下，通过磁场对磁珠固定从而使CTCs与其他血液细胞分离，产生富集效果。Cell Search系统是免疫磁珠方法应用的典型代表。在该方法中，经过密度梯度离心富集的外周血被收集到含有防凝剂的收集管中，然后被放置到一个自动化的制备系统。该系统利用免疫磁珠富集EpCAM阳性的细胞。捕获效率主要与EpCAM的表达水平有关。有研究表明在EpCAM高表达的细胞中，有大约75%的捕获效率，而在EpCAM低表达的细胞中，大概只有42%的表达捕获效率。在检测的过程中，富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。标记的细胞被CellTrack Analyzer 计数和分析，最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。系统的这种半自动特征使得样本的检测非常迅速，而且具有很好的重复性8。磁铁清扫装置(magnetic sweeper device)是新开发出来的技术，磁铁清扫装置提高被磁珠包被的EpCAM抗体的捕获能力。这种技术的可以达到62%的捕获效率，51%的纯度，9ml/L的通量9。用这种磁珠清扫设备用RT-PCR的方法从30个转移性乳腺癌病人中的21个病人的血液中检测出了CTCs10。磁性筛装置(magnetic sifter device)，通过微阵列的形式在磁场孔边缘产生极高的磁性区域，在富集过程中使用垂直流动构造，可以增强捕获效率到91.4%，提高了处理速度，最优达到10ml/h11。AdnaTest(Adnagen AG， Langenhagen， Germany)是一个商业化的设备，它采用了磁珠与各种癌症(如乳腺癌，直结肠癌，前列腺癌，卵巢癌)的特异性抗体进行鸡尾酒式结合，并用多重RT-PCR的方式检测CTCs，这套实验装置已经真是可用于转移性乳腺癌，卵巢癌。比较研究发现，Adna Test breast cancer装置从55个转移性乳腺癌病人中的29个病人血液中检测出了CTCs，而Cell Search装置只从26个检测出了CTCs12。Fig 1 Cell Search富集检测CTCs流程1.1.2CTC-chipCTC-chip是一种基于免疫亲和以及芯片的CTCs检测技术，在970mm2的表面上，排列了78000个被EpCAM抗体包被的硅微柱，用于捕获CTCs。通过抽气产生压力使血液样品以1-2ml/h的速度不间断的从芯片表面通过。这种缓慢的流速可以保证CTCs吸附在EpCAM包被的微处理器上。而这种硅微柱提供了大量的表面积用于接触，从而使EpCAM表达高或者低的CTCs的捕获效率差别不大，捕获效率超过60%，纯度大约50%。用癌症患者和健康人体的血液样品经过CTCs-chip检测，从116个患者中的115个患者身上检测到了CTCs，而20个健康人体没有检测到CTCs，敏感性达到了99.1%，特异性为100%。同时，检测到的CTCs数目与病人的病情相关13。一种类似的微柱是在”geometrically enhanced differential immunocapture”微芯片上连接前列腺特异性膜抗原(PSMA)，这种微芯片的捕获效率为85%，纯度为68%，并且从20个前列腺病人中的18个检测到了CTCs14。最近，Ozkumur等开发了”CTC-iChip”，该装置可以用于以阳性EpCAM抗体的CTCs筛选，也可以用于以大小为基础的富集步骤后对白细胞的消除。据报道，他们的捕获效率达到了98.6%，纯度为0.02-42%。CONG 42个转移性癌症病人中的37个身上检测出了CTCs，而Cell Research仅从29个病人身上检测到CTCs15。Fig 2 CTC-chip 富集检测CTCs流程1.1.3纳米结构底物(Nanostructured substrate)Wang等利用纳米结构底物，以非常高的接触比表面积进行免疫亲和，用EpCAM抗体结合纳米柱，获得捕获效率95%，通量为1ml/h。用这个方法从26个前列腺癌中的20个病人身上检测到了CTCs16。该芯片又被进一步修饰为以静电聚合物纳米纤维为底物，并与激光捕获显微切割联用，分离单个前列腺癌症CTCs，然后可用于扩增或全基因组测序17。Fig 3 纳米结构底物富集CTCs流程1.1.4微纤维(Microtubes)Hughes等用仿生的方法模拟血管选择素接到的细胞粘附过程进行CTCs捕获。选择素包被的围观外观？诱导细胞附着和卷曲，促进CTCs与抗EpVAMEpCAM抗体和PSMA抗体，在4.8ml/h，这个装置的捕获效率为50%，纯度为66%，并且从14个测试病人的血样中全部能够检测到CTCs，而Cell Search中质中只检测到9个18。1.1.5 体内采样(In vivo sampling)Saucedo-Zeni等开发了一种体内采样的方法，将医学导线与EpCAM抗体连接，医疗导线通过插管注射到患者静脉30分钟，以润徐允许大体积的血液(1.5-3L)直接连续采样。这个方法成功的在24个乳腺癌或者肺癌病人中的22个病人身上腹肌富集到了CTCs19。1.1.6白细胞消除(Leukocyte depletion)使用白细胞抗原(如CD45，CD14等)的单克隆抗体，以减少造血起源的细胞。一些策略包括抗体标记白细胞标记，通过免疫磁珠分离去除白细胞，这些方法都能够有很好的恢复率和对CTCs的最小干扰，但可能降低样品的纯度20。1.1.7 小结抗原-抗体反应的特异性是使CTCs的分离具有非常高水平的特异性。然而，CTCs的富集结果将严重依赖于所实用使用的特定抗体的性能。目前还有没已知的理想CTCs抗原靶，点可已可以将所有的CTCs捕获而对所有的造血细胞排斥。最近的报告表明，抗EpCAM的方法可能错过不表现上皮表型的CTCs，这可能由于EMT和EpCAM在一些上皮细胞CTCs的可变表达21。使用鸡尾酒式的抗体组合，可能会增加捕获效率，但也可能会降低特异性和样品的纯度。白细胞消除方法的好处是在分离过程中不会干扰CTCs的表型，但也可能会使附着在白细胞或者与白细胞相互作用的CTCs丢失。白细胞消除法会导致CTCs的纯度比阳性免疫亲和方法获得的CTCs纯度降低。一般来讲，免疫亲和方法需要长时间的孵育和反应时间，来富集更多地CTCs，这也可能成为加快速度的瓶颈。对于用阳性筛选的免疫亲和方法而言，将CTCs从免疫亲和标签上分开也可能是个挑战。1.2 物理特征物理特征也可用于有效的地将CTCs从外周血中分离出来。以下的一些技术主要是利用CTCs与其他细胞在密度，、大小，、变形性和电离特征等方面的差异进行分离的。1.2.1 密度梯度离心(Density gradient centrifugation)密度梯度离心是一种分离CTCs的低成本有效的方式，依据密度的不同可以把单核细胞从血液中的红细胞和粒细胞中分离出来。Weitz等使用聚蔗糖溶液的密度梯度离心来分离CTCs，用RT-PCR方法检测CK20的表达，发现在1ml血液中有1个CTCs，并且在58个结直肠癌患者中的24个患者血液中检测出了CTCs22。OncoQuick是一种将密度梯度离心和按大小分离结合的一种技术。Muller等使用OncoQuick从5/60的原发性乳腺癌患者血液中，25/63的乳腺癌患者中检测到了CTCs23。1.2.2 微孔过滤(Microfiltration)微孔过滤的原理是，让小的红细胞白细胞通过微孔，而稍大的CTCs被阻挡不能通过。Vona等开发了ISET技术，该技术使用了中间有8m直径的圆孔的随机径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，用于CTCs的富集和细胞检测。这种有微孔的滤膜比Cell Search设备更加敏感，使用微孔过滤从57/60转移性乳腺癌病人身上检测到了CTCs，而使用Cell Search只从42/60的转移性乳腺癌病人身上检测到了CTCs24。zheng等改进了这种微孔滤膜，他使用对二甲苯聚合物制成了圆形或椭圆的微孔滤膜使捕获效率提高到了89%25。这种对聚二甲苯滤膜从51/57的癌症患者身上检测到CTCs，而用CellSearch技术只从26/57的癌症换证身上检测到CTCs。Zheng等接着研发了3D的微孔滤膜，包含了两层的聚对二甲苯，同时在顶部和底部层具有微制造限定的孔，这两个层之间的空隙，通过光刻精确限定。这个装置的而重要特征就是，底部膜的孔位置从顶膜孔的位置偏移，如果肿瘤细胞被截留在顶部膜的孔，底部的膜可以提供直接反作用力，减少张力对CTCs细胞膜的作用，张力的减少适用于细胞进入孔的动态过程。每个滤膜片具有上面36个9m直径的孔，底部37个8m直径的孔。它还通过在顶部和底部膜形成的间隙允许更小的细胞通过的同时阻断大细胞，这样可以有效的充当过滤过程中的第三临界尺寸，确保对CTCs富集的高效率高纯度26。Fig 4 3D Microfiltration技术富集CTCs示意图1.2.3 微流体(microfluidics) 微流体装置是以大小和变形性为基础的富集CTCs的方法。Tan等设计了有5微米缝隙宽度的月牙形陷阱阵列，从血液中富集CTCs，捕获效率和纯度都达到了80%以上。这种微型装置成功的从转移性肺癌患者的1-3ml的血液中检测到了CTCs27。更高通量的微流体运用惯性流分离的水动力去选择不同大小的细胞，原理是通过制定收缩和膨胀的微水池检测CTCs。这些装置极大地提高了通量，并且能够处理较大体积的样品，但也可能降低白细胞中的CTCs的富集和回收效率28。Sun等开发了双螺旋微流体通道流体动力学使用拖拽力分离CTCs，能从稀释的血液中富集到88.5%的CTCs29。1.2.4电场流分离(Dielectrophoresis)CTCs的带电特性可被利用来从血液中分离，通过电泳现象施加一个非均匀电场。Becker等利用叉指金电极分离白血病和乳腺癌细胞。由电极产生的电场由阳极吸引肿瘤细胞，而其他细胞会流过。除去电厂电场的肿瘤细胞可以被富集，捕获效率可以达到95%30。Gupta等开发了ApoStream仪器，从血液中捕获CTCs的效率大于70%31。Fig 5 ApoStream 富集CTCs流程示意图1.2.5 小结利用物理特征分离CTCs的方法简单易行，并且不受CTCs表面抗原表达的影响。因此，他们不容易被抗原表达的变化或者由于EMT导致的表面生物标志的缺失影响，并且捕获效率常常大于80%。密度梯度离心是一个强大的技术，作为富集的第一步非常有效。白细胞消除分离是一种很有前途又较为侵入性的方法，允许更多地血液采样，提高患者的检测灵敏度。密度梯度离心法的CTCs纯度不足，需要进一步的富集纯化，否则会影响下游的继续分析。微孔过滤法能够实现高通量的富集，能够在几分钟内处理满管的血液。但是CTCs与大的白细胞之间存在大小分布重叠，是富集分离样品的纯度低于10%，此外，较小的CTCs或CTCs片段可能会漏掉。改进的微流体方法是获得CTCs的纯度超过80%，但同时也会是通量降低到1ml/h。用水力驱动的微流体管可能能够实现高通量，但同时也会降低捕获效率或纯度。应用电泳的DEP技术是一种比较新颖的技术，获取的CTCs活力很强，也不会影响对CTCs的捕获。但DEP技术还没有在临床上进行彻底的评估，因此其临床利用价值还需要进一步的评估。1.3 直接分析另一种分离稀少的CTCs的方法是对血液中的全部细胞实现高通量的分析。1.3.1 光纤阵列扫描(Fiber-optic array scanning)Krivacic等开发了一种高通量的“光纤阵列扫描技术”，能够每秒分析300000个细胞32。血液首先处理使红细胞裂解，然后将所有剩下的细胞铺在载玻片上。红细胞裂解主要是使用红细胞裂解缓冲液(ELB)，主要成为有NH4Cl，KHCO3和EDTA等。光纤阵列扫描技术已经被证实能够有效地计数乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌和卵巢癌的CTCs。1.3.2 微霍尔效应传感器(Micro-Hall sensor)Issadore等应用微霍尔效应传感器检测CTCs，通量可以达到大约每分钟107个细胞。CTCs可以纳米磁珠标记连接各种感兴趣的抗体(如EpCAM，HER2，EGFR，MUC1)，接着从有传感器阵列的表面流过，传感器阵列可以测量由每一个标记细胞的磁流诱导产生的霍尔电压。这种技术已经被证实比Cell Search系统的敏感性更好33。1.3.3 小结通过直接分析检测CTCs只需要对红细胞裂解，不需要对血液中的CTCs进行富集，减少了富集中的细胞损失。光纤扫描可以通过高质量图像和光学分析对CTCs进行有效检测。简单的芯片上的利用霍尔效应的电子检测并不需要光学仪器，因此具有便携性和个人护理的巨大潜力，不过该方法仅仅只能用于对CTCs进行计数。2 CTCs检测经过富集分离的CTCs还需要进一步的检测，常用的检测方法主要分为免疫检测和分子检测两种。2.1免疫检测 2.1.1免疫组织化学技术(Immunohistochemistry)免疫组织化学技术是利用显色剂标记的单克隆抗体与肿瘤细胞上的抗原结合并使其显色， 进而对肿瘤细胞进行定位定量定性分析。Sloane等1980年首次采用ICC方法检测乳腺癌患者骨髓中瘤细胞34。上述CellSearch系统和CTCs-chip富集CTCs后的检测即为免疫组织化学检测。其过程为富集的细胞与CD45，CK的抗体孵育，然后用DAPI染色。CK和CD45分别用PE和APC荧光标记，然后，EpCAM阳性的CTCs被anti-ck-PE抗体标记，而白细胞被anti-CD45-APC抗体标记。最终，CTCs是CK+/DAPI+/CD45-，而白细胞是CK-/DAPI+/CD45+。尽管一些用于CTCs捕获的抗体也能用于不同的癌症类型的免疫检测，如EpCAM用于乳腺癌，肺癌，结直肠癌和其他的表皮肿瘤，癌症特异性的抗体也可能会适用，如PSMA或PSA用于前列腺癌检测。免疫组织化学方法的优点是简便，直观，肿瘤细胞未被破坏，可以进行后续形态学鉴别或核酸特征分析。 2.1.2 上皮细胞免疫斑点技术(Epithelial immunospot，EPISPOT)EPISPOT是一种基于抗体的方法对活的CTCs进行量化检测。其基本流程是，富集的CTCs在培养基中能够分泌特异性蛋白，使用荧光标记的分泌蛋白抗体，与CTCs孵育，使抗体与蛋白特异性结合，然后将孵育的液体平铺在载玻片上，通过荧光显微镜观察，每个斑点就代表一个CTCs35。Alix-Panabires C等通过免疫磁珠去除CD45+细胞，再通过CXCR4+细胞富集CTCs后，用EPISPOT检测乳腺癌CTCs 释放的特异蛋白质，如cathepsin-D(半胱氨酸蛋白酶)和Mucin-1，检测到的CTCs具有转移潜能。EPISPOT以Mucin-1和CK19作标志物检测乳腺癌CTCs，表现出较高的敏感性和特异性36。Fig4 EPISPOT 检测CTCs流程示意图2.1.3 流式细胞术(Flow cytometry)流式细胞技术是在CTCs经过富集后，运用标记荧光物质的单克隆抗体与CTCs特异性的标志物结合，使CTCs染色，然后用流式细胞仪进行测量分析。流失细胞技术的优点主要是可以再免疫放大检测CTC的s同时对CTCS的形态进行定量测定，而且测量速度迅速，检测数据较精确。流式细胞技术还可以进行多参数测量，并对细胞进行分析与分选。最近几年已经有多种改进的流式细胞仪用于CTCs测定，例如光声流式细胞仪37，光热流式细胞仪38，多色流式细胞仪39，光纤多光子流式细胞仪40，多参数流式细胞仪41。Watanabe等研制了一种以流式细胞仪为基础的细胞捕获平台，利用On-chip技术，组成了一种新颖的配备了一次性微流控芯片的流式细胞仪，能够对血液中的循环肿瘤细胞进行检测，捕获和分子特性分析42。2.2分子检测RT-PCR是CTCs分子检测中应用最广泛的技术。RT-PCR检测CTCs是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常， 这些mRNA不表达于正常外周血细胞， 所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提示CTCs的存在。为了提高准确度，一般会同时检测几个标志物。这种技术的敏感性能够达到1-10个CTCs/ml血液，相当于从每106-107个外周血细胞有1-10CTCs即可被检测出来42。在目标基因被RT-PCR扩增以后，可以通过凝胶电泳和southern杂交进行半定量分析，样品也可以与健康对照衡量目的基因的表达水平，建立临界值。另外ELISA法也可以与RT-PCR联用，与凝胶电泳相比，可以提高检测的灵敏度，并且PCR 产物可以半定量光学检测43。近年来，人们又发展出巢式PCR，荧光定量RT-PCR等技术，提高了检测的敏感度和特异性，而且可以对样本进行定量分析。荧光定量RT-PCR可以对mRNA的拷贝数进行定量。荧光定量RT-PCR也比RT-PCR更加敏感，可以在107-108个单核细胞中检测到1个CTCs44。3 CTCs的临床应用分析现在已经开发了很多分析方法，分析CTCs的细胞和分子特征，以开发CTCs的在临床疗效上的潜在影响。这些分析方法与CTCs的富集技术相结合，因为每个下游的应用都会对CTCs有自己的要求，比如敏感性，样品纯度，细胞活力，浓缩后恢复细胞的能力。不同的分离技术可能会更适合下游的特殊应用。在医疗样品中，通常建立一种新的方法是和CellResearch结果进行比较。3.1免疫表型分析(Immunophenotyping) 免疫组织化学染色是CTCs检测和计数的标准技术，这种标准由FDA批准的CellSearch系统树立。这种检定CTCs的标准包括:(1)CK的阳性表达;(2)白细胞抗原CD45的阴性表达;(3)细胞核的阳性染色。癌症特异性的标记也可以用来阳性CTCs鉴定，比如在前列腺癌中使用PSA或者PSMA。CTCs的免疫表型可以直接用于临床医疗，直接影响治疗选择。通过检测CTCs的数目，可以判断患者的病情45。3.2 检测基因拷贝数变化在很多的癌症患者的癌症相关基因拷贝数发生了变化，可以通过FISH的方法来检测。Meng等利用FISH技术分析了乳腺癌患者的CTCs的致癌基因HER2的拷贝数，发现在原发肿瘤和CTCs中，HER2存在一定的非一致性46。用IF技术和RT-PCR技术的研究也证实了这一情况。这表明，一个HER2阴性疾病的癌症患者经过一定的过程后，CTCs可能发展成HER2阳性。CTCs分析提供了一个通过微创途径反复筛选染色体异常的途径。有趣的是，CTCs的HER2扩增的筛选已经成功的应用于原发性乳腺癌患者。3.3 检测致癌基因转移致癌基因的转移也是一种重要的癌症的致病机制。TMRPSS2-ERG的转移发生在30-70%的前列腺癌患者身上。运用FISH技术分析CTCs，在CTCs中检测出了TMRRSS2-ERG融合47。在最近的研究中，应用FISH技术，在非小细胞肺癌患者CTCs中检测到了ALK基因重排48。3.4 致癌基因突变分析富集分离CTCs的一个主要应用就是检测致癌基因的突变。致癌基因的突变，常常用来预测肿瘤的恶化，疾病的发病原因，预测药物的敏感性。使用微芯片分离的CTCs，运用位点特异性的PCR技术可以有效地检测到EGFR的突变49。这种EGRF T90M突变赋予的药物抗性，也在接受EGFR激酶抑制剂的患者身上检测到了。等位特异性的PCR是一种快速和低成本的方法检测特定的基因突变。对于致病基因的突变，可以从CTCs的基因组DNA 或者cDNA中扩增致病基因，并进行测序。Gasch等运用全基因组扩增和突变特异性PCR方法从结直肠癌患者的CTCs中检测到了KRAS和PIK3CA基因的突变50。3.5 基因组分析 现在已经开发了单细胞基因组测序技术，可以通过对CTCs基因组的测序，与正常细胞对比，分析CTCs基因组的基因突变，基因缺失，基因拷贝数变化，基因的转移等。单一的CTCs的测序 可能彻底改变我们队转移性癌症的认识，提高临床护理的潜力。3.6 CTCs基因表达谱分析通过对CTCs表达谱分析，可以找到CTCs中特异表达基因，可以进一步应用于CTCs临床检测和癌症发病机理等研究。Smirnov等从一个转移性结直肠癌，一个转移性前列腺癌，一个转移性乳腺癌患血液里，富集超过100个CTCs，通过对CTCs富集的样品RNA和CTCs消除的样品RNA进行表达谱分析，找到了一系列癌症特异性基因，CTCs特异性基因，并通过进一步的验证，确定AGR2，FABP1等对于CTCs检测具有重要作用51。Powell等用生物标记数字PCR(BioMark digital PCR)对免疫富集后的单个CTCs的基因表达，表达谱表明，CTCs间存在高度的异质性，同时也发现了转移性乳腺癌和乳腺癌细胞系之间存在较小的一致性。3.7 RNA测序Yu等用微流体芯片分离了胰腺癌患者的CTCs，然后用RNAseq技术对单个CTCs进行了RNA测序，测序结果表明，在CTCs中，WNT通路信号激活，而这种信号可能是导致肿瘤转移的原因52。4 总结癌症是世界上三大死亡率最多的疾病之一。CTCs检测的价值已经在乳腺癌前列腺癌结直肠癌Error! Reference source not found.中被证实，除此之外，在肺癌胃癌膀胱癌等肿瘤中CTCs检测的工作也在开展。Cell Search是目前唯一被FDA批准商业应用的体外CTCs检测设备。经过多年的研究发展，人们逐渐开发了多种CTCs的富集和检测技术，这为研制新的CTCs检测设备，更好的研究应用CTCs提供了巨大的技术支持。有了这些技术积累，在不远的将来，必然会有更多的CTCs检测设备会研制成功，投入商业应用，从而可以帮助人们更好的进行早期临床诊断，判断患者预后评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗。参考文献1 Hanahan, D,Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell.2011, 144:646674.2 Ashworth, T. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Aust Med J .1869,14: 1461493 Thiery, J. P. Epithelialmesenchymal transitions in tumour progression. Nat Rev Cancer 2002,2:4424544 Hayes, D. F., Cristofanilli, M., Budd, G. T., Ellis, M. J., Stopeck, A., Miller, M. C., et al.Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin Cancer Res. 2006,12: 42184224.5 Danila, D. C., Heller, G., Gignac, G. A., Gonzalez-Espinoza, R., Anand, A., Tanaka, E., et al. 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