（化学工程专业论文）β甘露聚糖酶基因测序、克隆表达及其工程菌的代谢通量研究.pdf

中文摘要 d 甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶，可应用于食品、医药、饲料、采油 等许多领域。本文以b 甘露聚糖酶的分子生物学研究为核心，利用基因工程和代 谢工程的方法开展工作，主要结论如下： 菌株鉴定：综合运用形态观察、生理生化实验及1 6 sr d n a 序列分析的方法 鉴定了实验室保藏的产p 甘露聚糖酶菌株的属种，结果表明：该菌株为枯草芽孢 杆菌，并命名为肋f 甜，螂s “6 f 玎括t j 一2 0 0 6 0 3 。 序列信息：利用简并p c r 的方法确定了肋c 讲螂s 甜6 f 玎括t j - 2 0 0 6 0 3p 一甘露聚 糖酶的保守序列，与砌c 讲螂s “6 脚括g 1 ( d q 3 0 9 3 3 5 ) 具有高达9 8 的同源性， 再经同源p c r 最终确定了p 甘露聚糖酶的完整序列，在线工具预测表明：o r f 包含11 0 4 b p ，编码3 6 7 个氨基酸，前3 1 个氨基酸为信号肽，后面3 3 6 个氨基酸 为p 甘露聚糖酶成熟肽，蛋白分子量为3 8 l a ，等电点为5 6 。氨基酸序列分析 表明：肋c 讲淞s “6 脚括t j 。2 0 0 6 0 3 甘露聚糖酶属于糖苷水解酶家族2 6 。目前，d 一 甘露聚糖酶序列已在向g e n b a n k 库提交中。 大肠杆菌中的克隆、表达：成功构建了重组克隆质粒p m m _ m a n ，实现了在 e ，fd h 5 a 中的克隆；成功构建了重组表达质粒p e t - 2 2 b m a n ，实现了在e c d z f b l 2 l ( d e 3 ) 中的诱导表达。s d s p a g e 表明：表达的重组蛋白分子量约为 3 8 0 0 5 k d a ，与预测值基本一致。蛋白主要集中在周质空间和胞内，含量分别为 3 6 0 3 g m l 和9 7 0 2 嵋m l ，酶活分别为4 8 u m l 和6 7 u m l 。 代谢通量分析：建立了大肠杆菌基因工程菌的代谢网络，利用代谢通量分析 的方法，对大肠杆菌工程菌产甘露聚糖酶的代谢途径进行了分析，并对其中5 个重要节点做了详细讨论。 热稳定性研究：基于已获知的b 甘露聚糖酶一级序列及同源模建得到的酶蛋 白高级结构，并利用羟基可与酶活性位点形成氢键而稳定高级结构的结论，筛选 酶蛋白的多羟基保护剂。山梨醇( 2 9 l ) 、蔗糖( 2 9 l ) 、壳聚糖( 2 9 几) 使p - 甘 露聚糖酶的相对酶活分别达到2 2 2 8 、2 0 1 3 、1 9 8 7 ；山梨醇( 2 班) 、壳 聚糖( 1g l ) 、蔗糖( 3 9 l ) 的复合保护剂使p 甘露聚糖酶的相对酶活达到最高， 为2 5 8 1 ；p 甘露聚糖酶的最适反应温度从原来的5 0 提高到6 0 ，6 5 下失 活速率常数k i 懈减小、半衰期t l 陀延长，均表明了保护剂对p 一甘露聚糖酶的稳定 作用。 关键词：p 一甘露聚糖酶，1 6 sr d n a ，序列，大肠杆菌，基因克隆，表达， 代谢通量分析，热稳定性 a b s t r a c t p m a n n a n a s ei sa ni m p o r t a n th e m i c e l l u l a s e ，w h i c hm a yb ew i d e l yu s e di nf o o d ， m e d i c i n e ，f e e da n d o i li n d u s 缸y i nm i st h e s i s ，p - m a n n a n a s em o l e c u l a rb i o l o g yw a st 1 1 e c o r eo ft h er e s e a r c h t h es m d yw a sc a 仃i e do u ta c c o r d i n gt og e n ee n g i n e e r i n ga n d m e t a b o l i ce n g i n e e r i n gm e t h o d s t h em a i nc o n c l u s i o n sp r e s e n t e di n t h i sw o r kw e r e s h o w na sf b l l o w s ： p r o d u c i n gs t r a i n i d e n t i f i c a t i o n ：t h es t r a i np r e s e r v e db yo u rl a b o r a t o 呵w a s i d e n t m e da c c o r d i n gt ot 1 1 em o 印h o l o g i c a l ，p h y s j o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a lc h a r a c t e “s t i c s a n ds e q u e n c i n go f16 sr 【) n a t h er e s u i ts h o w e dt h a tt h es t r a i nw a s 肋c 埘i 心s “6 掰括， n a m e d 鼬c 川甜ss 材6 f 甜西t j 2 0 0 6 0 3 s e q u e n c ei n f o r n l a t i o n ：t h ec o n s e n ，a t i v ep m a n n a n a s es e q u e n c eo fz 沏c 肼螂 j 动川括”一2 0 0 6 0 3w a so b 面n e db yd e g e n e r a t ep c r i th a d9 8 n u c l e o t i d eh o m o l o g y w i t hb 口c 以螂j 甜6 ，甜括g l ( d q 3 0 9 3 3 5 ) t h e nt h ew h o l es e q u e n c ew a so b t a i n e db y h o m o l o g o u sp c r a n a l y s i s 卸dp r e d i c t i o nu s i n go n l i n et o o l ss h o w e dt h a to r f i n c l u d e d1l0 4 b p ；3 6 7a m i n oa c i d sw e r ec o d e d ；t h ef i r s t3l 锄i n oa c i d st r a n s l a t e dt 0 s i g n a lp e p t i d e ；t h er e s tt r a n s i a t e dt om a t u r ep r o t e i np e p t i d ew h i c hh a d3 8 0 0 5 k d a m o l e c u l a rw e i g h ta n da5 6i s o e l e c t r i c p o i n t a m i n oa c i d s e q u e n c e s h o w e d ： p - m a n n a n a s eo fz 油c f 盯姗s “6 疗z 括1 1 - 2 0 0 6 0 3b e l o n g e dt og l y c o s y lh y d r o l a s ef a m i l y 2 6 a tp r e s e n t ，p m a n n a n a s es e q u e n c eo fz 勉c f 盯淞s 扰6 饼西t j - 2 0 0 6 0 3i ss u b m i t t i n gt o g e n b a n kd a t a b a s e g e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i n gi nec d 厅：a f t e rc o n s t m c t i o no fr e c o m b i n a n tc l o n i n g p l a s m i d p m d - m a n ，d m a n n a n a s ew a sc l o n e di ne z fd h 5 a ；a f t e rc o n s t r u c t i o no f r c c o m b i n a n te x p r e s s i n gp l a s m i d p e t - 2 2 b m a n ， p - m a n n a n a s ew a se x p r e s s e di n e ，fb l 2 1 ( d e 3 ) s d s - p a g er e s u l ts h o w e dt h a tt h ep r o t e i ne x p r e s s e di ne c d ，fw a s a b o u t3 8 l ( d a ，a g r e e dw i t ht h ep r e v i o u sp r e d i c t i o n t h ee x p r e s s e dp r o t e i nw a sl o c a t e d i np e r i p l a s m 觚dc e l l t h ec o n t e n tw a s3 6 0 3 岖r m la n d9 7 0 2 p g m lr e s p e c t i v e l y ，a n d t h ee n z y m ea c t i v i t yw a s4 8u m l 锄d6 7 u m lr e s p e c t i v e l y m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ：t h em e t a b o l i cn e 觚o r ko fp - m a n n a n a s es y n t h e s i sf r o m e n g i n e e r i n ge 疗w a se s t a b ji s h e d ，t h e nt h em e t a b o li cp a t h w a yw a s a n a l y s e da n df i v e i m p o r t a n tm e t a b o l i cn o d e sw e r ed i s c u s s e di nd e t a 订b ym e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s 7 r h e r n l o s t a b i l i t y ：b a s e do np - m a n n a n a s es e q u e n c e ，t h e3 ds t m c t u r ew a so b t a i n e d u s i n gh o m o l o g ym o d e l i n g w eg o tt h er e s u l tt h a tt h eh y d r o g e nb o n dw a sf o m l e d b e 觚e e ne n z y m ea c t i v er e g i o na i l dh y d r o x y l 1 1 1 eo p t i m a l p r o t e c t i v ea g e n t sw e r e f o u n db a s e do nt h ea b o v er e s u l t w h e ns o r b i t o l ，s u c r o s e ，a n dc h i t o s a nw e r ea d d e d w l t ht h ec o n s t a n tc o n c e n t r a t i o n ( 2 9 l ) ，t 1 1 er e l a t i v e a c t i v i t i e so f6 m a n n a n a s ew e r e i n c r e a s e dt 02 2 2 8 ，2 0 1 3 ，a n d19 8 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ec o m b i n a t i o no ft h e s e t h r e ea d d i t i v e s ，w h i c hw a ss o r b i t o lo f2 9 l ，c h i t o s a no flg l 粕ds u c r o s eo f3g l ， m a d et h er e l a t i v ea c t i v i 够o fp m a n n a n a s ei n c r e a s et o2 5 8 1 t h eo p t i m a lr e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，s h i r e df r o m5 0 0 ct o6 0 0 c ，t h ed e c r e a s e dk 岫ca n dt i l ep r o l o n g e dh a l fl i f e o fr e a c t i o na i lp r o v e dt h a tp m a n n a n a s ew a ss t a b i l i z e dw i t ha d d i t i v e s k e yw o r d s ： p m a n n a n a s e ，16 sr d n a ，s e q u e n c e ，e 纪g e n e c l o n i n g ，e x p r e s s i n g ， m e t a b o l i cn u xa n a l y s i s ，t h e 舯o s t a b i l i t ) ， 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得蠢洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：民伟唧 签字日期：泖暑年石月够日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 疼俨毋导师签名：c 布刍义 、嘭 、 签字日期：沙3 年多月够日签字日期：占年 占月多日 前言 - 工_ - j 一 月i j吾 半纤维素是自然界的第二大类多糖聚合物，作为木质素和纤维素中间的连接 物，广泛存在于植物细胞壁。半纤维素的降解产物有着特殊的生理活性，并具有 广泛的应用价值，因此，如何充分利用丰富的半纤维素资源成为研究的热点。 d 甘露聚糖酶( 1 ，4 b d m a n n a nm a 彻o h y d r o l a s e ，e c 3 2 1 7 8 ) 是一类能够 水解p 1 ，4 。d 甘露糖苷键连接的甘露聚糖( m a n n a n ) 、葡萄甘露聚糖 ( g l u c o m a n n a n ) 、半乳甘露聚糖( g a l a c t o m a n n a n ) 及半乳葡萄甘露聚糖 ( g a l a c t o g l u c o m a n n a n ) 的内切酶，在医药、食品、造纸、纺织印染、石油开采 及生物技术等方面已得到广泛应用。尤其是d 甘露聚糖酶水解p 甘露聚糖型植物 胶( 如角豆胶、瓜儿豆胶、槐豆胶、田箐胶和魔芋等) 可生成低聚甘露糖，引起 了国内外食品和医药界的极大兴趣。 早期对于d 甘露聚糖酶的研究多集中在产酶菌株的选育、发酵条件的优化、 酶的分离纯化、酶的理化性质、酶的复合诱变、酶的水解机理等方面。随着分子 生物学研究的不断深入与完善，越来越多的工作集中于酶的基因克隆和高效表达 方面，如：构建和筛选优良的高效基因工程菌株；基于酶结构与功能的关系，通 过定点诱变改变酶活性位点，从而实现催化功能的改变，以拓宽其应用范围等。 但如何理性改造酶的高级结构，提高酶的稳定性还需做进一步研究；此外，代谢 通量分析作为代谢工程中重要的分析方法已有广泛应用，但在产d 甘露聚糖酶大 肠杆菌基因工程菌的分析方面还未有报道。总之，利用基因工程、蛋白质工程、 代谢工程等领域的新技术、新方法研究p 甘露聚糖酶，是目前国内外研发的趋势， 而规模化生产高活性、高质量、高稳定性的d 甘露聚糖酶制剂则是生产企业追求 的目标。 基于上述研究背景，本文将以p 甘露聚糖酶的基因克隆表达为研究核心，系 统开展以下几方面工作：首先，进行生产菌株的鉴定，完成对p 甘露聚糖酶来源 的认识；其次，基于菌株鉴定信息测定p 甘露聚糖酶序列，并实现在大肠杆菌中 的克隆与表达；再次，运用通量分析方法，构建工程菌株的代谢网络，对代谢途 径和5 个节点进行分析，为进一步提高p 甘露聚糖酶的生物合成能力提供理论依 据；最后，基于p 甘露聚糖酶的一级序列，同源模建得到其高级结构，利用结构 和功能的关系进行酶蛋白热稳定性的实验与机理研究，为酶制剂的工业生产提供 理论参考。 第一章文献综述 第一章文献综述 p 甘露聚糖酶( p 一1 ，4 d m a n n a n a s e ；e c3 2 1 7 8 ) 是一类能够水解含p l ，4 - d - 甘露糖苷键的内切酶，它属于半纤维素酶类【l 】，可水解半乳甘露聚糖 ( g a l a c t o g l u c o m a n n a n ) 、葡萄甘露聚糖( g l u c o m a n n a n ) 、半乳葡萄甘露聚糖 ( g a l a c t o m a n n a n ) 和甘露聚糖( m a n n a n ) 。这些多糖为半纤维素中的主要组分，在 植物中含量丰富。酶解产物中有少量的单糖和2 1 0 个单糖分子构成的寡糖。 早在2 0 世纪初就有关于分解植物甘露聚糖的报道，但直到7 0 年代，p 甘露 聚糖酶的研究才逐渐深入。1 9 5 8 年c o u n o i s 等人1 2 】第一次报道了产生d 甘露聚糖 酶的真菌，1 9 6 0 年w i l l i 啪s 和d o e t s c h 【3 j 发现细菌也能产生p 甘露聚糖酶，1 9 6 5 年r e e s e 和s h i b a t a 【4 】提出了d 甘露聚糖酶的概念和定义，为以后的研究打下了基 础。之后d 甘露聚糖酶的研究开始逐渐深入，7 0 年代后，对p 甘露聚糖酶的基 本性质进行了研究，如：p 甘露聚糖酶产生菌株的筛选、诱变：培养基成分特别 是碳源对酶产生的影响研究；多糖结构的分析；许多不同来源d 甘露聚糖酶的分 离纯化等。p 甘露聚糖酶基因的分离和克隆开始于8 0 年代后期，目前n c b i 的 g e n b a n k 和e m b l 基因库中已列入近百种不同来源的p 甘露聚糖酶基因，随着 基因工程和蛋白质工程技术的广泛应用，d 甘露聚糖酶的研究工作越来越集中在 基因克隆、重组表达和酶活性工程的研究上，并取得了很大的发展。 1 1b 一甘露聚糖酶产生菌 1 1 1 b 甘露聚糖酶的来源 p 甘露聚糖酶的来源非常广泛。动物d 甘露聚糖酶主要来源于一些低等动 物，如海洋软体动物b l u em u s s e l ( 蛳掰淞p 幽纨) ，植物p 甘露聚糖酶主要存在 于植物的储藏器官，如豆类植物四棱豆、长角豆、瓜尔豆等萌发的种子，天南星 科植物魔芋( a m o r p h o p h a l l u sb l u m e ) 萌发的球茎【5 6 | ，番茄等。p 甘露聚糖酶的 另一种丰富来源途径是微生物发酵，很多微生物包括细菌、真菌和放线菌等都能 分泌d 甘露聚糖酶进而分解甘露聚糖作为自己的碳源或能源物质。如细菌中的芽 孢杆菌( 肋c 肼姗s p ) 、假单胞菌( 佻p 甜如聊d ，? 傩s p ) 、弧菌( 阳6 ，硒s p ) 和气单 胞菌( 彳p 加聊d ，2 伽s p ) 等；放线菌中的链霉菌( s 抛d 彬够p ss p ) 、酵母( y e a s t ) 以及真菌中的曲霉( 爿印p 嚼谢黜s p ) 、根霉( r 灰之o p 淞s p ) 和木霉( 乃纪办d 如删a s p ) 等均可分泌p 甘露聚糖酶。值得一提的是，一些极端环境下的微生物，如 第一章文献综述 嗜碱芽孢杆菌( a l k a l o p h i l i c 肋c 池岱s p ) 、嗜热茵( 尺矗d 咖砒r 朋淞聊钟砌淞) 、那不 勒斯栖热胞菌( 砀p r m o f o 彤玎p 卿z 妇砌5 0 6 8 ) 及嗜热真菌( 砀p 删d 删 伽昭伽d s 螂) 等也可产生p - 甘露聚糖酶，并且以其特有的酶学性质( 如耐热性) 拓宽了p 一甘露聚糖酶的应用领域。 1 1 2 b 甘露聚糖酶产生菌的筛选 筛选p 甘露聚糖酶生产茵的方法，主要是基于p 甘露聚糖酶的以下特性：p 甘露聚糖酶是一种可诱导的胞外分泌酶，它可以分泌到菌体外的培养基中，作用 于底物，使底物降解产生2 1 0 个分子的寡糖和单糖。常用的筛选方法有刚果红 染色法p 】( 也有称透明圈法或水解圈法) ，降解物着色法【8 】。 刚果红染色法是根据生长在含有甘露聚糖的固体培养基上的细菌被诱导产 生p 甘露聚糖酶，从而分解菌落周围的甘露聚糖。刚果红能同多聚糖结合，而不 与纤维二糖和葡萄糖结合，用其染色后，则在菌落周围产生透明环。这种方法可 以比较直观的看出细菌的产酶情况。 此外，还可直接从主成份为甘露聚糖的槐豆胶、角豆胶、瓜儿胶、魔芋粉上 生长的菌群中分离鉴定产生p 一甘露聚糖酶的菌种【9 1 。 1 1 3b 甘露聚糖酶产生菌的鉴定【l o 】 现代细菌分类学有两个目的，一是为了实用需要，建立各种细菌的信息存取 系统，以便查考、认识和利用各种细菌；二是为了讨论细菌的系统发育，建立反 映细菌进化关系的自然分类系统，以揭示各种细菌的本质特征，以及它们的内在 联系和区别。细菌的分类学一直处于不断发展和完善之中，经典的细菌分类方法 主要依据细菌的形态学、生理学和生态学等特征对细菌进行初步分类，但因细菌 形体微小，结构简单，易于传播等特点，常常有相似的表型特征，仅靠传统方法 很难准确鉴别分类。因此，在寻找和研究新的分类特征的过程中，对于细菌的分 类逐渐建立了化学分类法、遗传分类法、分子遗传学分类法、核酸分类法等方法。 一、经典分类法：( 1 ) 表型分类法，即根据细菌的形态学特征( 包括群体形 态特征、个体形态特征) ，生理生化特征来进行鉴定；( 2 ) 生态学特征分类法， 即根据细菌在自然界中的存在及其与其他生物的相互关系，如与其他生物的共 生、寄生的关系，致病性，对噬菌体的敏感性等做为细菌分类的依据或参考；( 3 ) 血清学分类，即依据细菌细胞组分具有的抗原性和依据抗原抗体反应的专一性， 区分细菌的不同类型，主要适用于抗原物质结构同源性程度较高的细菌；( 4 ) 化 学分类学，主要是通过对细菌的脂质，脂多糖，胞外多糖脂多糖( l p s ) 和酶等 成分进行化学分析比较，以不同种类细菌在化学成分上的差异性及规律性作为细 第一章文献综述 菌分类鉴定的依据j 。 二、遗传分类法：( 1 ) g + c 含量分析：不同生物d n a 的碱基组成和排列顺 序不同，有严格的种的特异性，通常用g + c m o l 来表示d n a 的碱基组成。每 种生物的d n a 都有特定的g + c m 0 1 ，亲缘关系相近的生物，其g + c m 0 1 也应 该相近，反之，亲缘关系疏远。g + c m o i 作为一项基本特征用于细菌分类，对 于细菌科、属和种的分类有重要的作用。( 2 ) d n a d n a 杂交：利用d n a 的变 性和复性，使来自同一或不同菌株的d n a 变性后的单链复性时在其同源序列之 间互补形成双链。细菌的同源性越高，杂交率也就越高。很多实验结果表明，同 源性在6 0 以上可认为是同一种的细菌，2 0 6 0 为同属不同种，低于2 0 为不 同属。d n a d n a 杂交主要应用在属以上水平。( 3 ) d n a r i 酬a 杂交：其原理 与d n a d n a 杂交一样，不同菌株d n a d n a 的杂交率很低时，用d n a r r n a 杂交仍然可能显示出较高的杂交率。因此，d n a r r n a 杂交有助于进一步研究 d n a d n a 杂交率低或不能杂交的菌株之间的相关性。( 4 ) 1 6 sr i a 在细菌系 统分类学中的应用：细菌的1 6 sr r n a 的可变区序列因不同细菌而异，恒定区序 列基本保守，可以利用恒定区序列设计引物将1 6 sr l 州a 片段扩增出来，利用可 变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。较其它方法而言，1 6 s r i 矾a 序列测定分析更适用于确定属及属以上分类单位的亲缘关系，不同菌属的 1 6 sr r n a 同源性为7 0 9 5 ，通过同源性比较，可以了解不同菌属、菌种在遗 传进化方面的距离。 本文研究中，对课题组保藏的产p 甘露聚糖菌株采用了经典表型鉴定法与 1 6 sr d n a 序列分析相结合的方法确定了该菌株的属和种。 1 2b 一甘露聚糖酶的分子生物学研究 1 2 1b 甘露聚糖酶的克隆与序列特点 1 9 8 9 年，a k i n o 【l2 l 首次报道从芽孢杆菌中克隆得到p 甘露聚糖酶基因。到目 前为止，己有大约3 0 多个物种的d 甘露聚糖酶基因得到克隆，其中有8 个物种 来源于真刮1 3 ，1 4 】。己报道的克隆b 甘露聚糖酶基因的方法有：( 1 ) 鸟枪法：随 机切割供体基因组d n a ，转化受体基因组，根据转化子的表型特征，找出所需 目的基因；( 2 ) 构建c d n a 文库，利用蛋白质的氨基酸序列或根据同源物种的 保守序列合成寡核甘酸探针，筛选出目的基因；( 3 ) 基因组步移p c r 法：( 4 ) 根据n 一末端的氨基酸序列设计简并引物p c r ，r a c e 技术克隆目的基因。 对芽孢杆菌所产d 甘露聚糖酶的克隆研究已有很多报道。国外方面：a k i n o 等【1 2 】首次克隆了嗜碱b 口c 肌螂s p a m 0 0 1 包含有p 甘露聚糖酶的基因片段，插入 4 第一章文献综述 片段约为2 4 k b ，表达出分子量为5 8 和4 3 i a 两种d 甘露聚糖酶：m e n d o z a l l 5 j 等用鸟枪法克隆了肋c 讲淞s 材6 f 以，n m 3 9 的b 甘露聚糖酶基因，基因序列长度 为1 0 8 0 b p ，编码3 3 6 个氨基酸成熟蛋白和2 4 个氨基酸信号肽，表达蛋白的分子 量为3 8 k d a ；l a n o n g n u c h 等1 1 6 j 用鸟枪法从& 配硼淞印5 h 中克隆出p 甘露聚糖 酶的基因，插入片段为1 6 3 0 b p ，o r f 包含1 0 8 6 b p ，得到编码3 6 2 个氨基酸的p 甘露聚糖酶，表达蛋白的分子量为3 8 k d a ；k w e u n 掣1 7 】克隆表达了肋c f 刀凇s 动耐西 w l 7 p 甘露聚糖酶的基因，长度为10 8 6 b p ，编码3 6 2 个氨基酸，表达蛋白的分 子量为3 8 k d a 。国内方面：y a n h em a 等【1 8 】用鸟枪法克隆出碱性肋c 肌淞踞n 1 6 5 p 甘露聚糖酶，插入片段约为2 0 k b ，具有d 甘露聚糖酶的活性，测序得知该基 因为2 0 5 8 b p ，o r f 包含1 4 7 9 b p ，编码3 2 个氨基酸的信号肽和4 6 1 个成熟蛋白， 表达蛋白的分子量为5 5 1 a ；中国农业科学院饲料研究所乔宇等【l9 j 克隆了 肋c 埘淞s 甜6 f 加中的陟甘露聚糖酶基因，片段大小约1 o k b ，表达蛋白的分子量 约4 0 i a ；李雅榭2 0 】开展了芽孢杆菌p 甘露聚糖酶新基因的快速筛选、克隆和 表达研究，得到两个b 甘露聚糖酶新基因m a n b 4 8 和m a n b 4 9 ，与已报道的最 高相似性为6 2 左右；张学文等【2 l 】人通过设计简并引物的方法从肋c 肼螂s 动“凰 a 3 3 中克隆出p 甘露聚糖酶的核心区，片段长度为9 9 3 b p ，表达的融合蛋白的分 子量约为4 2 k d a ；张清霞等【2 2 ：1 人从占白c 以淞s 甜6 饼括z 2 中克隆出p 甘露聚糖酶的 基因，基因序列长度为10 8 0 b p ，编码3 3 6 个氨基酸成熟蛋白和2 4 个氨基酸信号 肽，表达蛋白的分子量为3 8 i a 。王正祥纠2 3 】人根据已报道的d 甘露聚糖酶的 保守片段从召z f c 办p 疗咖删如c i c i m 2 8 2 0 0 4 中克隆出部分p 甘露聚糖酶的基因， 分析比对后利用b z f c 办p 删白瑚西d s m1 3 设计引物克隆出全长，o r f 包含1 11 0 b p ， 编码由3 3 2 个氨基酸组成的甘露聚糖酶成熟肽，表达蛋白的分子量为3 8k d a 。 对细菌、植物等其它来源的p 甘露聚糖酶的克隆研究也有许多报道：c a n n 等 人1 2 4 j 从砀秽朋d 伽卯加6 口魄，f “聊即舾卯幽伽，纪甜m 中克隆出d 甘露聚糖酶m a n a 基因，o r f 包含3 2 9 l b p ，共编码1 0 9 7 个氨基酸，分子量为1 1 9 6 2 7 k d a ；王和平【2 5 j 采用r t p c r 的方法从乃而砌d 出册口尺p 口船乒r u tc 3 0 中克隆出甘露聚糖酶编码的成 熟肽c d n a ，插入片段为1 2 k b ，表达蛋白的分子量约为5 1 l a 。陈小兵【2 6 j 也采用 同样的方法从疗砌。如m 口阳嚣e fr u t c 3 0 中克隆出p 甘露聚糖酶的成熟肽 c d n a ，长度为1 2 3 3 b p ，编码4 1 1 个氨基酸，表达的融合蛋白分子量为6 6 k d a ，而 原始菌株的b 甘露聚糖酶的分子量为5 3 k d a ；y o s h i d a 等【2 7 j 从心讲螂c 讹甜肠础 k 1 克隆出d 甘露聚糖酶基因，0 r f 包含1 5 5 1 b p ，所编码的蛋白质分子量为 5 5 2 4 2 k d a ，重组蛋白经s d s p a g e 显示分子量为6 2 k d a ；陈小玲例利用r t p c r 和r a c e 技术获得硫色曲霉p 甘露聚糖酶基因的c d n a 序列，全长l3 4 5 b p ，o r f 为11 5 2 b p ，编码3 8 4 个氨基酸，表达蛋白分子量约为4 3 k d a ；b e w i e y 等1 2 9 j 从萌发 第一章文献综述 的番茄种子克隆了第一个编码b 甘露聚糖酶的基因l e m a n l ，成熟肽蛋白由3 4 6 个 氨基酸组成，分子量为3 8 9 k d a ；m a r r a c c i n i1 3 0 j 等人从咖啡种子中克隆到两个编 码b 甘露聚糖酶的c d n a ( m a n a 和m a n b ) ，m a n a 基因的o r f 包含1 2 8 4 b p ，编码 的b 一甘露聚糖酶分子量为4 8 k d a ，m a n b 基因的o r f 包含1 2 5 1 b p ，编码的p 一甘露聚 糖酶分子量为4 6 k d a ；s u n n a 掣3 1 】用基因组步移法从胁6 卯讲螂盯砒啪m 胛s 中克隆出一段含4 5 6 7 b p 的核酸序列，该序列包含3 个o r f ，其中o r f 2 编码p 一甘露 聚糖酶，其基因从序列上的6 2 0 b p 到3 4 1 2 b p ，共编码9 3 0 个氨基酸；x u 等m 1 从b l u e m u s s e l ( m 删“sp 幽船) 中克隆出完整的b 一甘露聚糖酶的c d n a 序列，o r f 包含 i l0 4 b p ，共编码3 6 8 个氨基酸。 b 甘露聚糖酶分子生物学的研究进展较快，到目前为止已有多种微生物、动 物和植物的p 甘露聚糖酶基因被先后克隆和表达。表1 1 列出了已报道的甘露聚 糖酶的序列结构，由表可以看出甘露聚糖酶是一种胞外酶，每个基因都含有一个 外泌的信号肽，信号肽的长度在2 0 4 0 个氨基酸，信号肽酶切位点多数在丙氨酸 ( a l a ) 处，仅有部分基因带有自己的启动子和核糖体结合位点，其中枯草芽孢 菌的甘露聚糖酶基因较短约3 6 0 个氨基酸。如表1 1 所示。 表1 1 已报道的甘露聚糖酶序列特点 7 r a b l e1 - l s e q u e n c ec h a r a c t e r i s t i c so fm a n n a n a s er e p o r t e dt od a t e 启叩讲淞5 “6 f 甜括t 1 、g t c aa g g a g g3 6 02 4 。s a e t2 6 1 5 】 n m 3 91 a t aa g t b 口c 讲淞s p a m 0 0 1 g a g g a g g4 8 7 2 6 ，m s s e 2 6 【1 2 】 尸s p 材豳肌o 珊 g a g a g g a4 1 8 3 l ，h a a n 2 6 【3 3 1 嚣l l o r e s c e n s b 口c f z z z 岱s p nl6 5 t g t g a c tg g a g g a g4 9 3 3 2 ，e a s s 2 6 【1 8 1 t g t a a a r a c p 肌，汤，面却d 疗缸淞 4 8 62 2 ，s a c g 2 6 【蚓 彳g 口r 把姗6 驴d ，淞 t a t a a a a8 4 7 1 9 ，m a 2 6 【3 5 】 c 口，d d c p ，“朋a a g a g g g3 4 63 8 ，g a a t2 6 【3 6 1 s q c c h a m l y t c u m娲 一一 尸，而彬陀，s p 6 0 6 1 9 ，s - k 2 6 【3 7 】 c 0 叩。粗七嬲m a n 5 a 4 3l 2 7 ，g l 5 【3 4 】 c ( 矽d 疗记z 格m a n 5 b 5 9 42 5 ，l a - g f 5 跚 6 第一章文献综述 h e n r i s s a t 【4 0 j 在1 9 9 1 年根据氨基酸序列同源性和疏水氨基酸簇将甘露聚糖酶 分为两个家族，糖苷水解酶家族5 ( g l y c o s y lh y d r o l a s ef a m i l y5 ，g h 5 ) 和糖苷水 解酶家族2 6 ( g l y c o s y lh y d r o l a s ef a l i l y 2 6 ，g h 2 6 ) 。一般来说，g h 2 6 都起源于 原核生物，而g h 5 来自细菌和真菌。h o g g 在2 0 0 3 年以纤维弧菌属( c e l l v b r i o j a p o n i c a s ) 为靶标，对这两个家族的结构和功能进行了比较研究，结果表明，这 两个家族的甘露聚糖酶的作用是不同的，g h 5 包含碳水化合物结合域 ( c a r b o h y d r a t e - b i n d i n gm o d u l e ，c b m ) ，可以结合晶体多糖，因此这个家族酶的 功能可能是以甘露聚糖为靶标，而这些甘露聚糖是植物细胞壁的组成部分。g h 2 6 的甘露聚糖酶，不含有碳水化合物结合域，能够以储藏的甘露多糖和甘露寡糖为 靶标，迅速将多糖或寡糖水解释放出甘露糖。 甘露聚糖酶基因可以分布在功能域的c 末端、n 末端，也可以整个功能域 行使甘露聚糖酶功能。已报道的甘露聚糖酶序列中，有些只包含单独的甘露聚糖 酶结构，有些与p r o t e i nd o c k i n gd o m a i n 或其它纤维素结合域连在一起，如表1 2 所示。 表1 2 已报道的细菌和真菌的甘露聚糖酶序列 t 曲l e1 2b a c t e 州a la n df u n g a lm a n n a n a s es e q u e n c e sr e p o r r t e dt od a t e 菌株来源蛋白功能域 其它功能域 文献 【j h 2 6 肋c 讲搬s p a m 一0 0 l m 眦 m a l l b 尸心 阳拓讹m 砌缸d 缸b 4m a n n a n a s e 肋c 玎，淞s 甜6 f 船n m 3 9m 踟锄a s e p s e t l c l o m o n 口sf l t l o r e s c e n sm 勰a 尸肋叼慨嚣s p m 锄a m a n b m a n c nt e m m a l u 1 1 l 【o w n e n i r e e n i r e e n i r e e n i r e nt e m l i n a l p l i o t e i l ld o c k i n gd o m a i n nt e n n i n a lp r o t e i nd o c 蜘gd o m a m nt e m i n a lp r o t e i nd o c k i n gd o m a i n m m m m m m 第一章文献综述 c e l t v 溺r i 0j 口p o n i c t l s c a t d o c e l l u m s 口c c 肠阳咖记绷r t 8 b 4 d i c l ) ) o g l o m t t s 砌p 册印矗玎绷r t 4 6 b 1 b 口c t e r 、d i 妇sr t l m i n i c o l n g h 5 p 阳蛔r y o t i c c e t l v 汤r i oj 叩o n i c l l s s i c c 妇r o t y t i c u m 玢6 r 幻s p m a - 1 3 8 c q l d i c e l l u l o s i 眦p t o r s n c c h n r o l y l i c l l s c 1 0 s t r i d i l l mc e h n l o v o r d n s s i c c h 口r d l y “c 粥 c l o s t r i d i l l mc e l l u l o v o r r 口毪s c e l t u i o m o 口s 奔m i e u 勋秽o t i c a s p e r g i l l 懈n c t l | e a t 粥 t r i c h o d e r m nr e e s e i a g n r i c t l sb i s p o r u s 玲c o p e i s c o n e s t l l e n t l l m f t o t n n t o ) b n c i t l t l ss t e n m t h e r m o p h t l t l s m 甜1 2 6 be n i r e m a n act e m m a lu 1 1 i m o 、v i l m a n 5 a m a n 5 b m 锄5 c m a n a m 锄a m a n a e n i r e nt e r m i n a l nt e r n l i n a lc b m l o nt e 册i n a lc b m l oa n dc b m 2 a ct e r n l i n a lc b m 5 锄dc b m l o nt e h n i i l a ic b da n d e n d o g l u c 锄a s e e n t i r e nt e m i i l l a l ma i 】bc t e m i n a l m a n ac t e 蕊i n a l m a n 2 6 ant e m l m a l m 柚1 m a n l c e l 4 m a l l e n t i r e nt e 硼i n a l c t e n l l i i l a l e m i r e e n d o g l u c 醐a s e m a n n a n _ b i n d i l l g m o d u l e c b d c b d f 3 4 】 1 4 4 】 【4 5 1 【4 6 】 【3 4 1 【3 4 】 【3 4 】 【“1 【4 7 】 【4 4 】 【4 8 】 【4 9 1 【5 0 】 【5 l 】 1 3 8 1 f 5 2 】 【2 9 1 m a n fnt e 邗n i n a lu n k n o w n 【3 9 】 1 2 2 0 甘露聚糖酶的表达 到目前为止，不同来源的p 一甘露聚糖酶基因己分别在原核表达系统和真核表 达系统中进行了表达。在大肠杆菌表达系统中表达的p 一甘露聚糖酶，由于表达产 量低，蛋白易形成包涵体，使后续的纯化过程复杂，产业化生产困难大，因此也 8 第一章文献综述 出现了其他的表达系统，如毕赤酵母表达系统，表达的p 一甘露聚糖酶的产量和酶 活都相对大肠杆菌表达系统而言比较高，但总体来说，酶的表达量仍较低，达不 到工业生产的要求。表1 - 3 中列出了国内外通过基因工程手段表达d 甘露聚糖酶 的一些数据。从表中可以看出，不同的基因来源、表达载体和宿主菌，所表达的 p