（分析化学专业论文）磁性纳米印迹聚合物的制备及其在生物分离中的应用.pdf

南开大学硕士学位论文中文摘要 中文摘要 本文以超顺磁性纳米f e 3 0 4 粒子为核，采用“牺牲空间法 分子印迹技术合 成表面具有模板分子印迹位点的核壳型磁性纳米印迹聚合物，用于生物小分子 以及蛋白质大分子的分离识别。 本论文共分为三个章节。 第一章综述分子印迹技术的基本理论，介绍分子印迹聚合物的主要制备方法， 研究现状和应用。简要介绍磁性材料的基本性能及应用领域，介绍二氧化硅修 饰磁性纳米材料在生物分离领域的应用。 第二章合成了以雌酮生物小分子为目标分子的磁性纳米印迹聚合物，并针对目 标分子及其相似物分别进行分离识别研究。实验分为，第一步，通过共沉淀法 合成超顺磁性纳米粒子，用4 乙氧基硅烷修饰其表面，并用t e m 、v s m 、f t - i r 对其形貌、结构及磁饱和强度进行表征。第二步，模板分子雌酮与3 ( 3 乙氧基 硅基) 丙基异氰酸酯以共价键结合反应生成e s t s i 。第三步，将硅烷化的f e 3 0 4 与e s t s i 反应即合成雌酮超顺磁性纳米印迹聚合物。第四步，热反应使共价键断 裂，洗脱模板分子即得到含有雌酮印迹孔穴的磁性纳米聚合物，并用t e m 、 f t - i r 、v s m 对其形貌、结构及磁饱和强度进行表征。用h p l c 考察聚合物对模 板分子的吸附效果，结果表明磁性纳米印迹聚合物对目标分子有较高的选择识 别性能。 第三章合成以蛋白质为模板分子的超顺磁性纳米印迹聚合物，同样预先用共沉 淀方法合成f e 3 0 4 超顺磁性纳米粒子并将其表面用3 氨基丙基三乙氧基硅烷化 修饰上氨基基团，利用戊二醛双醛基特性将其连接到f e z 0 4 纳米粒子表面，而另 一端醛基则与蛋白质的氨基以亚胺键键合，再利用两种硅烷化试剂正丙基三甲 氧基硅烷和氨丙基三甲氧基硅烷进行聚合，合成表面具有印迹位点的核壳型超 顺磁性纳米蛋白质分子印迹聚合物球，通过t e m 、v s m 研究了印迹纳米球的表 面形态和磁饱和强度的变化，并考察了磁性印迹聚合物纳米球对模板蛋白的吸 附特性。 关键词：f e 3 0 4 超顺磁性分子印迹雌酮蛋白质 a b s t r a c t t h et h e s i si n t r o d u c e sa s y n t h e s i s m e t h o do fac o r e s h e l l m a g n e t i c n a n o i m p r i n t e dp o l y m e r t h ec o r ei st h ef e 3 0 4n a n o p a t i c l ea n ds h e l li st h em o l e c u l a r i m p r i n t e dp o l y m e r t h et e c h n o l o g ym a d eab r i d g eb e t w e e nt h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e a n dt h em o l e c u l a ri m p r i n t e d ，i tc o n c e n t r a t e st h ea d v a n t a g eo ft h et w ot e c h n o l o g i e st o o n ep o i n t i tc a l lb ea p p l i e di n t ot h et e c h n o l o g yo ft h eb i o s e p a r a t i o n t h et h e s i sc o n t a i n st h r e ec h a p t e r s i nt h ec h a p t e r1 ，i n t r o d u c et h eb a s i st h e o r yo f m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n o l o g y a n dt h ea p p l i c a t i o no fm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s i nt h ec h a p t e r2 ，w es y n t h e s i z e df e 3 0 4m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sc o a t e de s t r o n e - i m p r i n t e dp o l y m e rw i t hc o n t r o l l e ds i z e su s i n gas e m i - c o v a l e n ti m p r i n t i n gs t r a t e g y i n t h i sp r o t o c o l ，t h es i l i c am o n o m e r - t e m p l a t ec o m p l e x ( e s t s i ) w a ss y n t h e s i z e db yt h e r e a c t i o n3 - ( t r i e t h o x y s i l y l ) p r o p y li s o c y a n a t ew i t he s t r o n e , w h e r et h e t e m p l a t ew a s l i n k e dt ot h es i l i c ac o a t i n go nt h ei r o no x i d ec o r ev i aa t h e r m a l l yr e v e r s i b l eb o n d t h e r e m o v a lo ft h et e m p l a t eb yas i m p l et h e r m a lr e a c t i o np r o d u c e ds p e c i f i ce s t r o n e r e c o g n i t i o ns i t e so nt h es u r f a c eo fs i l i c as h e l l t h er e s u l t i n ge s t r o n e i m p r i n t e d p o l y m e rc o a t i n gf e 3 0 4m a g n e t i ch y b r i dn a n o p a r t i c l e se x h i b i tam u c hh i g h e rs p e c i f i c r e c o g n i t i o na n ds a t u r a t i o nm a g n e t i z a t i o n t h eh y b r i dn a n o p a r t i c l e sh a v eb e e nu s e d f o rb i o c h e m i c a ls e p a r a t i o no fe s t r o n e i nt h ec h a p t e r3 ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n go fb o v i n eh e m o g l o b i no ns i l i c ac o a t e d s u p e r p a r a m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e si sd e s c r i b e du s i n gac o v a l e n f l yb o n d e dt e m p l a t e m e t h o d m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw a sp r e p a r e db yc h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o na n d s i l a n i z e da p t e s a m i n o p r o p y l s i l a n z e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw a sf i r s t a l d e h y d e f u n c t i o n a l i z e dw i t hg l u t a r a d e h y d ea n dt h e nr e a c t e dw i t hb h b b yac o v a l e n t l yb o n d ， t w ok i n d so fo r g a n i cs i l a n e ( n p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e ：p t m sa n d3 - a m i n op r o p y l t r i e t h o x y s i l a n e ：a p t e s ) w a sm a d eu s ef o rp o l y m e r i z a t i o n a f t e rt h et e m p l a t ew a s r e m o v e db yn a o h ，t h eb h b i m p r i n t e dm a g n e t i cp o l y m e rw a so b t a i n e d a d s o r p t i o n e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m p r i n t e dm a g n e t i cn a n o c o m p o s i t ep o l y m e rh a d i i ae n o u g hs a t u r a t i o nm a g n e t i z a t i o nw h i c hc a nb es e p a r a t e du n d e rt h em a g n e t i cf i e l d ， a n da l s oh a dah i g hs e l e c t i v eb i n d i n gf o rt h et e m p l a t eb h b t h a no t h e rp r o t e i n s k e y w o r d s ：m a 萨e t i ch y b r i dn a n o p a r t c l e s ；i m p r i m e dp o l y m e r ；e s t r o n e ；p r o t e i n ； c o v a l e n t - b o n di m p r i n t i n g ；b o v i n eh e m o g l o b i n i i i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的e r j ) 昂l j 本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年 月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 南开大学硕士学位论文 第一章 第一章绪论 1 1分子印迹技术的概述 1 1 1 分子印迹技术的起源和概况 分子识别在自然界的生物进化过程中常常起着决定性的作用。其最典型的 特征就是对分子的特殊选择性。天然的分子识别，例如酶和底物、抗原和抗体、 激素受体的分子识别反应都具有很强的特异性【l 】。分子印迹理论基础是2 0 世纪 4 0 年代免疫学中的抗体形成学说，著名的诺贝尔奖获得者p a u l i n g 在1 9 4 0 年前后 首次提出，抗体在形成时其三维结构会尽可能地同抗原形成多重作用位点，抗 原作为一种模板，就会“铸造在抗体的结合部位。这一学说为分子印迹理论 的产生奠定了基础。1 9 7 2 年，德国的w u l f ! f 开究小组首次报导了人工合成的分子 印迹聚合物，这项技术才逐渐被人们所认识【4 】。1 9 9 3 年瑞典科学家m o s b a c h 等在 ( ( n a t u r e ) ) 杂志上发表了有关茶碱分子印迹聚合物的研究报告，分子印迹技术才 得到了蓬勃的发展【5 j 。分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，m i t ) ， 是制备对特定目标分子( 模板分子也称印迹分子) 具有特异预定选择性的高分 子化合物一分子印迹聚合物( m o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) 的技术u 。j 。 分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r , m i p ) 即一种人工合成的新型 功能高分子，它具有形状与底物分子相匹配的孔穴，而且有着特定排列的功能 基团可以与底物分子产生识别作用。近1 0 年来，随着超分子化学、高分子化学 和生物化学等学科的发展，分子印迹技术包括印迹机理、印迹聚合物的制备、 印迹技术的应用及其热力学、动力学等方面的理论研究取得了长足的进展。分 子印迹聚合物以其优越的分子识别性能被广泛应用于分离领域，包括高效液相 色谱( h p l c ) 、固相萃取( s p e ) 、毛细管电色谱( c e c ) 以及生物传感器、 模拟抗体、模拟酶等方面。并有望在生物工程、l 隘床医学、环境监测、天然药 物、食品工业等领域形成产业化规模的应用。被印迹的分子包括药物分子、杀 虫剂、氨基酸、肽、核苷酸、甾族化合物及糖等 6 - 1 1 ；金属和其它离子也可用作 模板；而体积较大的分子如蛋白质 1 2 - 1 6 】的印迹也已经有报道。分子印迹技术之 南开大学硕j 学位论文第一童 所以能得到如此快速的发展，是凼为其具有效预定性，特异识别性以及实用性。 预定性即模板分子和功能单体形成的这种自组装结构是在聚合之前预定形成 的，人们可以按照自己的日的制各不同的，以满足各种不同的需要；诎别性是 指按照模板分子的结构定做，它具有能泌别该模板分子的特定识别空腔结构和 识别位点，因而其特异性识别作用很强；实用性是指稳定性好，不受高温、酸 碱的影响，同天然生物分子识别系统，如酶和底物、抗原和抗体、受体和激素 相比能够抵御比较恶劣的环境影响，而且贮存条件温和，能够长时问的保留识 别性能。 2 分子印迹技术的原理 分子印迹技术可以看作是“人工模拟酶”，它是一种获得空间和结合位点上 与某一分子( 模板分子、印迹分子) 完全匹配的聚合物的制备技术。由p a u l i 础 抗体形成理论出发，当模板分子与聚合物单体接触时会尽可能地同学体形成多 重作用点，再通过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结”f 柬，当模板分子 除去后，聚合物中就形成了与模板分子在卒m 和结合位点上匹配的具有多重作 用点的空穴，这样的空穴对模板分子只有选择件。 藏一a蒋一四 叫t e m p 4 m 星固 例1 1 分子印迹原理罔 如图11 所示分子印迹技术的原理旧：模板分子与功能单体在合适分散介质 南开大学硕士学位论文 第一章 中依靠相互作用力，如共价键、氢键、离子键、范德华力、疏水作用以及空间 位阻效应等，形成可逆结合的复合物：再加入交联剂，在光、热、电场等作用 以及引发剂和致孔剂辅助下形成既具有一定刚性又具有一定柔性的多孔三维立 体功能材料，并且将模板分子有规律的包在其中；合成后用一定方法把模板分 子去除，即可获得与模板分子互补且有特异识别功能的三维孔穴，该孑l 穴可特 异性识别模板分子。 1 i 3 分子印迹的分类 分子印迹聚合物与模板分子之间的结合作用主要是孔穴内固定排列的结合 基团与模板分子间的相互作用。按照聚合过程中结合基团与模板分子或离去基 团的作用力以及识别结合目标分子过程的作用力的类型，可以把分子印迹分成 自组装体系分子印迹和预组装分子印迹两种类型，其中预组装型的分子印迹就 是我们通常所说的的共价型分子印迹；自组装的分子印迹包括非共价型的分子 印迹和络合型的分子印迹。 1 i 3 1 非共价键分子印迹 非共价键印迹由瑞典的m o s b a c h 在2 0 世纪8 0 年代后期创立( 图1 2 ) h8 。1 9 】。首先 是模板功能单体依靠氢键相互作用形成复合物，然后经交联剂交联进行自由基 聚合，形成高度交联的刚性聚合物；反复洗涤除去模板分子，就在聚合物中留 下对模板分子有高度亲和性的作用位点，由此制得对模板分子具有选择性的 m i p 。在这个制备过程中以b o c - p h e n y l a l a n i n e 为模板，m a a 为单体。首先是模板 功能单体依靠氢键形成复合物，然后经e g d m a 交联进行自由基聚合，形成高 度交联的刚性聚合物；反复洗涤除去模板分子，这样就在聚合物中留下对 b o c - p h e n y l a l a n i n e 有高度亲和性的作用位点，由此制得对b o c - p h e n y l a l a n i n e 具有 选择性的m p 。 1 1 3 2 金属鳌合作用印迹 金属络合作用通常是通过配位键产生的。这类键的优点是其强度可通过实 验条件控制，聚合时有固定的相互作用，不需要过量的结合基团，且模板分子 3 南开大学硕士学位论文第一章 与聚合物的结合速度较快，这种方法有望用于蛋白质的识别分离中【2 0 1 。 1 1 3 3 共价键分子印迹 图1 2 非共价键分子印迹过程 共价键法由w u l 蜀陆2 0 世纪7 0 年代初期创立 2 卜2 2 1 。在共价分子印迹过程中， 模板分子与单体以共价键相互连接，再交联聚合，之后在一定条件下水解，使 共价键断裂除去模板分子，从而得到分子印迹聚合物。图1 3 以q d 甘露吡喃糖 苯苷为模板分子，4 乙烯基苯硼酸为单体，利用糖的两个相邻的羟基和硼酸基酯 化形成共价复合物，在交联剂存在下自由基聚合，产生大孔聚合物，然后在碱 性条件下用水或甲醇处理可以除去模板分子，获得具有特异性识别模板分子的 手性印迹聚合物。 目前，已使用共价结合作用制备了对糖类及其衍生物、芳香化合物、腺嘌 呤等具有分离作用的分子印迹聚合物。所使用的结合基团主要包括硼酸、西佛 碱、缩醛和缩酮类掣2 3 1 ，其中最具代表性的是硼酸酯。制备m i p s 时要从结合速 度和选择专一性两方面综合考虑，通常都只采用一个功能基团，结合速度是考 4 南开大学硕士学位论文 第一章 虑的首要因素。因为共价键的结合作用一般都很强，方向性也较好，选择的专 一性也较好。共价分子印迹聚合物在制备过程中，需要经过共价键的形成和断 裂，所需能量较高，而且模板分子和单体之间的作用为可逆共价键，因此使其 应用受到限制。但是共价型m 口可以在聚合物中留下均匀的、结合强度单一的作 用位点以及在空间精确固定的结合基团，有利于产生高选择性的印迹聚合物。 鼍。6 9 d + 戈h 图1 3 共价键分子印迹过程 近来又发展了一种称之为“牺牲空间法”的分子印迹技术。该法实际上是 把分子自组装和分子预组装两种方法结合起来形成的方法( 图1 4 ) 。首先，模 板分子与功能单体以共价键的形式形成单体模板分子复合物，这一步相当于分 子预组装过程，然后交联聚合，使功能基固定在聚合物链上，除去模板分子后， 功能基留在空穴中。当模板分子重新进入空穴中时，模板分子与功能单体上的 功能基不是以共价键结合，而是以非共价键结合，如同分子自组装。w h i t c o m b e 等【2 4 】用4 乙烯基苯基碳酸胆固醇酯为单体，合成分子印迹聚合物，水解使复合物 的碳酸酯部分断裂，放出c 0 2 ，并且将模板分子胆固醇洗脱下来。这样m i p 上便 产生了一个非共价型的识别位点，识别位点上的酚基可以通过氢键与胆固醇分 子再结合。p i l e t s k y - 等j k t 2 5 】以烯丙基胺( 单体1 ) 和乙烯基苯基硼酸( 单体2 ) 为 5 一 南开大学硕士学位论文第一章 功能单体，首先使模板分子硅酸和乙烯基苯基硼酸发生酯化反应，形成功能单 体2 模板分偶联物，然后该偶联物与另一功能单体烯丙基胺自发形成单体1 模板 分子一单体2 复合物，加交联剂后发生共聚合反应形成硅酸分子印迹聚合物，最后 脱去硅酸。当硅酸分子重新进入聚合物空穴后，两种功能单体都以非共价键与 硅酸分子结合。z i m m e r m a n 等人【2 6 】也将共价与非共价作用结合起来合成了对卟 啉有结合作用的印迹聚合物。 图1 4 “牺牲空间法”分子印迹过程 1 1 4 分子印迹聚合物的制备 1 1 4 1 模板分子的选择 根据所要识别分离的化合物的结构和性质，模板分子可以是低分子化合物、 低聚物、金属离子或金属络合物，也可以是分子聚集体。应用较多的模板分子 有糖类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、药物、激素、杀虫剂、染料等，酶或 辅酶、核酸、多肽、蛋白质等应用较少。一般认为，m 口的选择性与模板和功能 单体之间作用的功能基团的数目、作用强度及模板的形态和刚性有关 2 刀。此外 选择模板分子时往往还受到模板分子价格或者溶解度等其它方面的限制 2 s - 2 9 。 1 1 4 2 功能单体的选择 功能单体的选择主要由模板分子的结构特征决定，它首先必须能与模板分 子相互作用，且在反应中与交联剂处于合适的位置才能使印迹分子恰好镶嵌其 中，模板分子和功能单体之间作用的强度和取向是使m 口获得好的分子识别性能 6 南开大学硕士学位论文 第一章 的关键。功能单体的一端能和聚合物结合，而另一端能和模板分子结合，与聚 合物的结合应足够强，以使除去模板后孔穴内结合基团稳定。非共价键印迹的 功能单体【3 0 】中最常用的功能单体是q 甲基丙烯酸，共价型m i p 的功能单体应该 具有能与模板分子发生共价结合的基团，同时模板与功能单体之间的共价键应 该容易通过适当的方法断裂。通常使用的功能单体有4 乙烯基苯基硼酸、4 乙烯 基苯甲醛、4 乙烯基苯胺、4 乙烯基苯酚等。另外，利用西弗碱和缩酮可以分别 获得氨基酸衍生物或者酮的共价型。基于金属配位作用的功能单体如z n 2 + 一卟 啉，将是今后功能单体的一个发展方向 3 l 】。 1 1 4 3 交联剂的选择 m i p 应具有一定的刚性，这样聚合物在洗脱去模板后仍能保持孔穴原来的 形状和大小，即保持识别位点的稳定；同时，m i p 还需要有一定的柔性，以便于 目标分子进入孔穴，利于快速结合。基于以上两点考虑，交联剂的加入量既不 能太少，也不能太多。常见交联剂【3 2 】中乙二醇二甲基丙烯酸酯( e g d m a ) 是最 常用的交联剂，在制备m 口时常采用高比例e d g m a 用量以提高交联度，其目的 是能够使聚合物提供的孔穴很容易让目标分子接近，这是结合动力学所必需的， 可以使孔穴与模板分子的结合迅速达到平衡。同时还能使印迹聚合物具有一定 的刚性，能够保持洗去模板分子后孔穴的大小和形状，以使孔穴维持对模板分 子的再结合能力。但同时所制备的分子印迹聚合物的手性识别位点一般都较少， 结合容量较低。文献记载二乙烯基苯能够提供较大的交联度使聚合后的印迹聚 合物刚性很大，因此也常常使用。近年来有报道，使用含3 个或3 个以上乙烯基 的交联剂如三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 和季戊四醇三丙烯酸酯 ( p e t r a ) 制备的m 口对模板分子具有更好的柱容量和选择性【3 3 3 4 1 。 1 1 4 4 聚合物母体的选择 聚合物母体的结构对制备的分子印迹聚合物起着非常重要的作用。聚合物 母体应具备如下性能：足够的硬度，以便模板分子除去后印迹孔穴能够保持原 有形状而不变形；较高的柔性，以使其能与嵌入的底物迅速达到平衡；可制成 特定的形态，既有足够的交联度，又有良好的底物可近性；良好的热稳定性； 良好的机械稳定性，以便在高压或搅拌环境下使用。母体材料可以是有机聚合 物，也可以是无机载体和生物高分子。目前大量的工作仍集中在有机聚合物上。 7 南开大学硕士学位论文 第一章 交联烯类聚合物母体主要有凝胶型和大孔型网络结构两种。具有大孔型网络结 构的聚合物在实际中应用较多。 在固体材料( 如硅胶) 表面进行修饰是获得母体材料的一种行之有效的方 法 3 5 。3 7 】。这类母体材料的选择性取决于孑l 穴的形状和孔穴内功能基团的排列， 而与母体本身关系不大。通常用自组装体系进行无机固体表面的修饰，即首先 在硅胶或载体玻璃上吸附一层硅烷和修饰过的模板混合物，并用化学方法结合 成硅氧烷，然后用溶剂溶解除去模板。这样在硅烷分子的网络内就留下了孔穴。 这样的材料优先吸附模板分子，但对模板分子的类似物也有较强的吸附作用。 蛋白质和糖等生物高分子也可作为分子印迹聚合物的母体材料 3 8 1 。k e y e s 等将部分变性的蛋白质经模板修饰后制得带有新型酶活性中心的产物。k l i b a n o v 在大量外加的功能底物存在下，把溶解在水中的蛋白质冷冻干燥，然后再用有 机溶剂除去模板分子。所得的这些产物对模板分子都有较高的选择性。 1 1 4 5 模板分子的去除 模板的洗脱是否彻底直接关系到后续的分离和模板的检测。对于共价m i p ， 模板与聚合物母体之间以共价键相连，洗脱时需要采用水解或其它方法使模板- 功能单体之间的化学键断裂；对于非共价m p ，模板与聚合物母体间靠氢键、静 电等较弱的分子间作用结合，通过选用适当溶剂反复萃取即可除去模板。通常 采用乙腈、水、甲醇一乙酸( 或三氯乙酸) 、乙腈乙酸等高极性溶剂反复洗涤分 子印迹聚合物以彻底除去印迹分子。缺点是洗涤过程通常非常缓慢，需要耗费 大量溶剂。可以使用索氏提取器进行连续回流和萃取以加快洗脱过程。 1 1 4 6 分子印迹聚合物的制备方法 由于不同的应用领域对所用的m i p 要求不同，在实际操作中要综合分析研究 的对象和目的，选择最佳的合成方案。迄今为止，分子印迹聚合物主要有以下 几种制备方法： ( 1 ) 本体聚合 本体聚合是制备分子印迹聚合物最常规的方法。是将模板分子、功能单体、 交联剂和引发剂按照一定比例溶解在惰性溶剂中，移入玻璃或石英瓶中在光照 或热引发下进行聚合，形成棒状聚合物。再经粉碎、研磨、过筛等过程获得所 需粒径的粒子。其优点是制备条件易于控制，实验操作简单，是m i p 铝i j 备的主要 8 南开大学硕士学位论文 第一章 方法。但是后处理过程繁杂，而且粒子的不规则性严重影响了其选择性和柱效； 网络的交联度很高，模板分子的除去较为困难。许多印迹位点在合成过程中被 包埋在聚合物内部，利用率低，吸附量低。 ( 2 ) 原位聚合 原位聚合过程一般先将预聚合混合物溶液注入到空色谱柱或毛细管中，然 后两端用塞子塞紧，在水浴中热引发或光照引发聚合一定时间后，将色谱柱或 毛细管连接到色谱仪或电泳仪上，洗出聚合物中的模板，即得到了可直接用于 色谱或电泳分离的m i p 色谱柱或毛细管。此方法将m 口的制备与装柱一步完成， 实验过程得到大大简化。m a t s u i 3 9 】等首先采用原位聚合的方法在h p l c 柱中直接 得到了连续棒状的m 口。他们还采用原位聚合法以t f m a a 为功能单体，制备了 烟碱分子的m i p 色谱柱，成功地实现了烟碱与其结构类似物的分离1 4 0 。杨更亮和 陈义研究组以手性药物那格列奈为模板分子，采用原位聚合法制备了具有特定 识别性能和手性拆分能力的分子印迹聚合物，并用作高效液相色谱固定相实现 了那格列奈与其对映体的手性拆分【4 。结果表明，原位聚合法制备的棒状聚合 物固定相对模板分子及其对映体有很好的手性拆分性能。在原位聚合法中，为 了使色谱柱或毛细管有良好的通透性，制备时必须加入合适的致孔剂，最近有 文献报道【4 2 1 ，用低极性的甲苯和正十二醇混合溶剂为致孔剂，在不锈钢柱内制 备了对对映体分辨率高且通透性好的m i p 色谱柱。但总的来说，柱效低仍是原位 聚合法制备得到的m i p h p l c 柱的主要问题。 ( 3 ) 悬浮聚合 悬浮聚合法通常将单体、致孔剂和分散剂组成均匀的混合溶液，然后加入 引发剂，在搅拌下经自由基聚合反应产生球状不溶性聚合物。此法选用的分散 剂通常是水，但是水对印迹过程有干扰。s e l l e r g r e n 4 3 】提出了不稳定的悬浮聚合 法，近来，h o s a y 等 “】提出了两步膨胀法制备印迹颗粒，可制得有很大孔体积的 多孔穴粒子。此法由于水对分子印迹过程的干扰作用，其结果是在水中进行悬 浮聚合制备的分子印迹聚合物球粒的分子识别性能很差。为解决水的干扰问题， 提出了使用全氟化碳分散剂并使用氟化丙烯单体、2 烈乙基全氟烷基磺酰胺撑) 乙基丙烯酸盐和聚乙烯乙二醇丙烯酸盐共聚形成的稳定剂，经悬浮聚合制备球 状分子印迹聚合物微粒，避免了以水作分散剂时的干扰【4 5 】。 ( 4 ) 沉淀聚合 该方法与本体聚合法相似，只是印迹时加入了较大量的溶剂。y e 【4 6 】等人采 9 南开大学硕士学位论文 第一章 用沉淀聚合法成功地制备了茶碱和17 1 3 雌二醇的单分散分子印迹聚合物微球， 并将其用于放射性配体结合免疫分析，实验结果证明该法制备的m 口优于传统的 本体聚合。p u o c i 4 7 1 等以磺胺基水杨嗪为模板，用沉淀聚合法制备了球形的m i p 。 童爱军 4 8 】以乙腈为分散剂，采用沉淀聚合法合成了反乌头酸分子印迹聚合物微 球并通过振荡吸附法对聚合物的结合特性进行了评价，发现印迹聚合物微球对 模板分子的识别选择性优于块状印迹聚合物和非印迹聚合物。该方法的主要缺 点是，印迹时需要加入大模板分子。但其产物省去了本体聚合时研磨过筛的过 程。 ( 5 ) 乳液聚合 乳液聚合法即将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂中，然后将此 溶液转入水中，搅拌，使其乳化。然后加入引发剂交联聚合就可得到粒径较为 均一的球形聚合物。用这种方法得到的聚合物的粒径通常都在纳米级，比表面 较大，吸附能力较强。u e z u 4 9 】等报道了一种水油水乳液体系制备微球的方法。 聚合体系由带有功能基的单体、乳化剂、共聚单体等组成。采用的功能性单体 是两性物质，能与印迹分子在乳浊液的界面上形成配合物，并且在反应过程中 保持稳定，这种方法最成功之处在于它可以印迹水溶性的分子。 ( 6 ) 表面印迹 表面分子印迹其最初来源于硅胶的表面处理与衍生。这种方法是在一个已 经制备好的大孔固相载体的表面上，先通过接枝、鳌和或是弱相互作用等手段 引入含有丙烯酸类双键的单体，再以一定的方式将印迹分子、交联剂和引发剂 等混合或是沉积在这种经过化学修饰的表面上，最后引发聚合反应制备所谓的 表面分子印迹材料。采用的大孔载体本身往往已经具备所要求的结构形态，因 此本方法不再需要后继的粉碎处理。由于载体具有较高的孔度和表面积，因而 选择表面印迹方法可以使底物较易接近活性位点，这是表面印迹技术优于沉淀 聚合的一个方面。第一例有关印迹硅胶的报道是1 9 4 9 年d i c k e y l c s o l 用沉淀法制备 了印迹硅胶。后来，m o r i h a r a 等 5 1 】使用另一种不同的方法在硅胶和铝表面进行印 迹。r a t n m 等【5 2 】将蛋白质首先吸附到云母上，然后将一薄层的二糖分子包被在吸 附的蛋白质上，糖层与蛋白质通过氢键结合。接着在糖分子表面聚合上一层光 滑的荧光聚合物薄层。最后除去云母并溶解掉印迹蛋白质，即生成具有蛋白质 形状孔穴的聚二糖表面印迹聚合物。对该聚合物进行蛋白质吸附实验，结果显 示在混合蛋白质溶液中，b s a 、i g g 、r n a a s e a 矛t l 溶菌酶的印迹聚合物都特异性 一1 0 南开大学硕士学位论文第一章 地吸附相应的印迹蛋白质。h a y d e n 等【5 3 j 采用表面印迹技术实现了对细胞、病毒、 酶等生物体的在线检测。根据安息香醛容易与金属氧化物s n 0 2 、a 1 2 0 3 、z r 0 2 、 z i 0 2 等反应生成安息香酸盐，而安息香酸盐容易与氨气反应生成氰苯并可以洗 去，k o d a k a r i 5 4 1 研究小组以安息香醛为模板，以氧化锡为骨架，通过化学气相沉 积的方法，将硅醇固定在氧化锡表面，从而合成m i p 。s u l i t z k y 等【5 5 】最近报道了 一种新的基于硅胶表面修饰的m i p 制备方法，利用硅胶颗粒表面含有活泼自由基 团进行m i p 的薄膜表面接枝技术。利用这项技术制备了形状规整，厚度均一的l 苯基丙氨酰替苯胺的m 口，这种m p 能显著改善动力学性质，提高柱容量以及传 感器响应能力。h p l c 实验表明，这种m i p 多孔颗粒，柱效取决于接枝聚合物的 数量。他们制备的硅胶接枝聚合物薄膜( 薄膜平均厚度0 8 n m ) 平均孔径1 0 n m ， 在分离印迹对映体苯基丙氨酰替苯胺时显示了极高的柱效。同时实验还表明， 饱和吸附量远远大于用传统方法制备的块状m i p 的吸附量。清华大学童爱军【5 8 】 采用硅胶修饰技术，用3 一g l y c i d o x y p r o p y l d i m e t h y l e t h o x y s i l a n e 作为烷基化试剂修 饰微米级硅胶的表面，然后将引发剂4 ，4 a z o b i s ( 4 c y a n o p en t a n o i ca c i d ) 连接到 修饰硅胶的表面。选用z l p h e n y l a l a n i n e 为模板分子，a a m 为功能单体，e g d m a 为交联剂的聚合体系，在硅胶表面制备了分子印迹聚合物薄膜，将这种覆有分 子印迹聚合物薄膜的尺寸均一、分离富集功能优异的颗粒用于微分析芯片的在 线分离富集。表面印迹技术克服了传统m i p 传质慢的缺点，增加了结合位点的均 一性。 ( 6 ) 球形材料表面修饰 在聚合物或硅胶材料表面进行修饰也是获得球形材料的有效方法。g l a d 等 【5 9 】以表面含双键的t r i m 小球( 5 1 0 肛1 ) 为载体，将m i p 连接到这些小球表面，制 得了适用于h p l c 的分离介质。a r n o l d s 8 】用t r i m 聚合成一定大小的小球作为支 持物，由于t r i m d x 球上含有未被聚合的双键，可以在模板存在的情况下与功能 单体、e g d m a 共聚，从而在t r j m 小球表面形成薄薄一层分子印迹聚合物，发 现它比本体聚合得到的m 口有更快的传质速率。 1 1 5 分子印迹技术的应用 分子印迹聚合物对被分离物或分析物有较高选择性，同时还具有良好的物 理化学稳定性，能够耐受高温、高压、酸碱、有机溶剂等，容易保存，制备简 南开大学硕士学位论文第一章 单，易于实现工业化生产，因而在生物、医学、环境、药物、食品等领域得到 了广泛应用。 ( 1 ) 用于化学仿生传感器 与生物识别元件相比，分子印迹聚合物作为生物传感器专一性强，稳定性 好，不需使用动物，可大规模生产。目前用分子印迹膜传感器测定的对象有氨 基酸衍生物、吗啡、除草剂、有机溶剂、神经毒剂水解产物、金属离子等 5 9 捌】。 将分子印迹聚合物作为传感器的敏感部件，可定量分析各种小分子有机化合物。 ( 2 ) 用于固相萃取 分子印迹聚合物作为固相萃取的吸附剂具有特效的选择性和亲和性，稳定 性好，重复利用率高，可克服生物或环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不 利因素，为样品的采集、富集和分析提供了极大的方便，可用于医药、食品和 环境分析样品的制备，对于痕量分析有重要作用【6 2 弼】。m i p 既可以在有机溶剂中 使用，又可在水溶液中使用，与其它萃取过程相比，显示出独特的优点。 s e l l e r g r e n 6 4 】首次报道了将分子印迹技术用于固相萃取中，以戊脒为模板制备 p a m 分子印迹聚合物进行固相萃取，取得了很好的效果。b h i m 6 5 】等制备了以 硅胶键合的嗯唑酮的m i p 作为固相萃取剂，成功的识别了1 3 内酰氨抗生素类药 头孢菌素和青霉素。m u l l e r 和k o s t e r 等 6 6 - 6 7 】又将m i p 用于固相微萃取中，使其成 为一种在线测定生物体液中痕量物质的有效方法。本实验组 6 8 】有人利用m i p 分离 中药活性成分，以中药黄栌的主要成分非瑟酮为印迹分子，成功地分离了非瑟 酮及其相似物槲皮素。 ( 3 ) 用于色谱固定相 分子印迹聚合物最重要的用途就是作为色谱固定相用于分离领域。其最大 的优点是可预测选择性，通常分离因子在1 5 5 之间，目前研究成果中印迹分子 范围比较广阔，无论是小分子( 氨基酸、药品和碳氢化合物) ，还是大分子( 如 蛋白质) ，都已经被用于各种印迹技术中，并用于h p l c 、t l c 和c e 分离中。1 9 8 6 年w u l 蹲利用共价法成功地制备出聚苯乙烯m 口，分离了苯基甘露吡喃糖苷对 映体【6 9 1 。此外在非手性分子的识别分离方面也有了新的进展。s h e a k 等使用9 乙 基腺嘌呤为模板制得的印迹聚合物用于h p l c 固定相，对模板分子选择性极高。 m o s b a c h 等【_ 7 0 j 制备出分离n 乙酰基l 苯丙酰基l 色氨酸甲酯的m i p ，其分离系 数达到1 7 8 。p e t c u 等 7 l 】通过分子印迹方法建立了血液中2 ，6 二异丙基苯酚简便 快速和准确的色谱测定方法。 1 2 南开大学硕士学位论文第一章 1 1 6 分子印迹技术的新进展 1 1 6 1 水溶性小分子的印迹 非共价型印迹聚合物对印迹分子选择性识别的主要动力是分子间的氢键作 用，而识别过程主要在非极性或弱极性的介质中进行，这对于水溶性化合物的 印迹是非常不利的。因此以往的研究大都围绕低分子量、难溶于水的化合物进 行，对于水溶性分子印迹研究的相关报道很少。h a l l e 7 2 】等将水溶性分子核黄素进 行甲酯化和乙酯化制备四酯衍生物，分别以这些衍生物为模板，2 ，6 二丙烯酰 胺吡啶为功能单体，氯仿为制孔剂，p e t r a 为交联剂制备印迹聚合物，所得聚 合物不但能够识别模板本身，而且能够识别核黄素分子。这为水溶性分子的印 迹提供了一种新的思路。 1 1 6 2 蛋白质的印迹 印迹蛋白质较早使用包埋法，其制备工艺简单易行，但是手续烦杂并且模 板分子的包埋问题无法解决。r a c h k o v 。7 3 】根据抗原抗体结合原理提出新的印迹 方法。采用与蛋白质结构中暴露在表面的肽链( 抗原决定基) 相同的短肽作为 印迹分子，得到的大孔m i p 不仅可识别该肽，也可以识别整个蛋白质分子。b o s s i 7 4 等在水相介质中采用表面接枝的方法，合成了山葵过氧化酶、乳过氧化酶、血 色素等蛋白质的印迹聚合物。g u o 。7 5 】等也采用表面接枝的方法，以蛋白质血色素 为模板分子，以改性后的壳聚糖为基质，丙烯酰胺为功能单体，n ，n 亚甲基双 丙烯酰胺为交联剂，过硫酸钾为引发剂得到了可从血色素和牛血清白蛋白的混 合物中有效的分离模板血色素的球形聚合物。y a n g 7 6 】等将牛血色素固定在氧化 铝膜内的硅胶纳米孔的内壁上，然后在纳米孔内加入其他合成单体进行氧化引 发聚合。聚合完成后采用n a o h 溶液将氧化铝膜以及硅胶纳米管溶解除去即可得 到具有印迹效果的纳米丝材料。c h o u 等【_ 7 刀采用微接触法对c 反应蛋白进行印迹， 首先将蛋白质与功能单体混合后在盖玻片上形成一层单分子膜，然后与另一片 涂有交联剂与引发剂的玻璃接触，紫外引发聚合后，将上层盖玻片除去，即可 对印迹膜进行洗涤与评价。 1 1 6 3中草药有效成分的筛选 分子印迹的特异性和高选择性可以将一些含量很低的有效成分直接从粗提 - 1 3 南开大学硕士学位论文第一章 物中筛选出来。该技术在中药活性成分分离上具有较好的开发利用前景。x i e 等 u 驯以丙烯酰胺为功能单体，四氢呋喃为制孔剂合成聚合物用于萃取银杏叶中的 槲皮素；又以骆驼蓬种籽中具有抗癌作用的成分哈马宁、哈马灵以及它们的结 构类似物哈尔满作为模板制备了m i p s ，并作为h p l c 固定相，与大气压电离飞行 时间质谱联用，直接分离鉴定了甲醇粗提物中的两种活性成分【8 1 1 。z h u 等【。7 9 】从传 统藏药锦鸡儿中筛选了与模板相似的功效化合物。l a i 等 8 0 】以苦参碱为模板通过 悬浮聚合法合成了球状聚合物，萃取了中药苦参碱中的苦参碱和氧化苦参碱。 d o n g 等强2 j 采用类似的聚合方法，合成了麻黄碱分子印迹聚合物，用于固相萃取 筛选出了草药麻黄草中的l 麻黄碱。 1 1 7 硅胶表面分子印迹的新进展 1 1 7 1 硅球载体印迹小分子 传统m p 粒子制备过程中，粒子的形态结构以及结合位点的识别性能同时受 到溶剂、功能单体等因素的影响，而且欲得到所期望的形态结构所需条件往往 与获得高识别性位点的条件不一致。表面分子印迹是指在固体表面进行印迹聚 合的技术，其最初来源于硅胶的表面处理与衍生。硅胶表面具有大孔结构，而