（物理学专业论文）泵浦糖蛋白底物选择非特异性的物理模型.pdf

原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得凼塞盘塞堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：! 丝竖指导教师签名；学位论文作者签名：! 垡鳖指导教师签名； 日期： 型翌：墨：堡 日期： 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即；内蒙古大学有权将 学位论文的全部内容或部分保留并向国家有美机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允 许编入有关数据序进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文 为保护学院和导师的知识产权作者在学期间取得的研究成巢属手内裴古大学。作者今后 使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内复古大学就读期间导师的同意；薯用 于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发袁。 学位论文作者签名；翌重竖 日 期：趔! ：呈：壅 指导教师签名：j 啦 日 期； 五：o ：出 2 拦 内蒙古大学硕士学位论文 泵浦糖蛋白底物选择非特异性的物理模型 摘要 肿瘤抗药性是目前医学研究的热点之一。传统理论认为肿瘤细胞有很高的 自发突变几率，随着时间的推移，自然就产生抗药的细胞。随着研究的深入， 又认识到另一种抗药机制，即泵浦糖蛋e t ( p u m p g l y c o p r o t e i n ，简称为p g p ) 的 作用。p g p 能将包括抗肿瘤药在内的多种底物排出细胞，进而减少与细胞内靶 点相互作用的药物分子数，从而产生抗药性。 关于p g p ，人们对它进行了大量的研究。利用x 射线衍射获得了分辨率为 0 3 8 n mp g p 结构图，结构表明p - g p 存在着使底物从磷脂双分子层进入到p g p 中心空腔的入口。p g p 的底物包括抗肿瘤药、抗生素等。底物被转运的机制主 要有三个理论模型。p h 依赖性模型解释了具有p h 依赖性结合的底物被排出的 实验；吸尘器模型解释了部分底物能从细胞质内被排到细胞膜外的实验，但这 两个模型对p g p 存在着底物入口结构的考虑不够充分。投掷模型成功的解释了 p g p 底物的广泛性以及不同脂溶性的底物被排出细胞的难易程度不一样的实 验，而且也考虑到入口结构，但对溶液离子强度对p g p 线度的影响，底物高效 进入入口的原因，排出一个底物消耗几个a t p 这些问题不能给出解释。本文针 对“投掷”模型所存在的问题，从生物分子之间最基本的相互作用是电性质的， 自由能的变化决定了反应进行的方向和限度的观点出发，运用德拜一休克尔理 论，对p g p 以及泵浦糖蛋白一底物系统的静电自由能进行了计算，得到了有意 内蒙古大学硕士学位论文 义的结果。 本文共分为三部分。第一部分介绍p - g p 的结构、底物的类型、工作机制、 抗凋亡作用、p g p 抑制剂及目前研究p g p 所用的实验方法，主要为后面给出的 p g p 的简化模型提供依据。第二部分介绍了德拜- 休克尔理论的理论背景、应 用意义及其推导过程，这部分内容是计算静电自由能的理论依据。第三部分是 本文的主要部分，给出了p g p 的简化模型及等效电荷分布，计算了p g p 本身的 静电自由能，研究了溶液离子强度和线度对p g p 静电自由能的影响，定量的评 估了溶液离子强度的减小对p g p 线度的影响程度。进一步计算了底物进入p g p 中心空腔的过程中系统静电自由能的变化值，找到了底物能高效进入p g p 中心 空腔的主要原因；给出了排出一个底物所需能量的下限，此下限与水解一个a t p 所提供的能量在同一个数量级。考虑粘滞力损耗等因素，能量的输入与输出大 体上是相符的，即排出一个底物需消耗一个a t p 。提出了间接抑制p g p 的两种 方法。 关键词：泵浦糖蛋白；泵浦机制；德拜一休克尔理论；静电自由能 l i 内蒙古大学硕士学位论文 ap h y s i c a lm o d e lo fn o n s p e c i f i c i t yi np g p s s e l e c t i o no fs u b s t r a t e s a b s t r a c t n o w a d a y s ，c l i n i c a lr e s i s t a n c et oc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g si sam a j o rp r o b l e mi n t h et r e a t m e n to ft u m o rc e l l s t r a d i t i o n a l l y , t u m o rc e l l sa r ec o n s i d e r e dt oh a v eah i g h s p o n t a n e o u sm u t a t i o nr a t e ，s od r u g r e s i s t a n c et u m o rc e l l sw i l le m e r g en a t u r a l l y a s t h er e s e a r c h e sg e tt od e e p n e s s ，an e wm e c h a n i s mh a sb e e nr e a l i z e d ，i nw h i c h p u m p g l y c o p r o t e i n ( p g p ) p l a y si m p o r t a n tr o l e p g pc a ne x t r u d eaw i d ev a r i e t yo f s u b s t r a t e si n c l u d i n ga n t i t u m o rd r u g so u to fc e l l s ，t h u sr e d u c e st h en u m b e ro fd r u g s w h i c hi n t e r a c tw i t hi n t r a c e l l u l a r t a r g e t s i nt h i sw a y , t h e s ec e l l s a r ec o n f e r e d m u l t i d r u gr e s i s t a n c e al o to fr e s e a r c h e sh a v eb e e nm a d eo np g p t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f p g pa to 38n mr e s o l u t i o ns h o w st h a tp g ph a sp o r t a l so p e nt ot h el i p i db i l a y e rf o r d r u ge n t r y p g p ss u b s t r a t e si n c l u d ea n t i t u m o rd r u g s ，a n t i b i o t i c s ，e t c t h e r ea r et h r e e i m p o r t a n tt h e o r e t i c a lm o d e l so nt h em e c h a n i s mo fp g p sp u m p i n ga c t i o n p h d e p e n d e n c em o d e le x p l a i n st h ee x p e r i m e n t si nw h i c ht h ei n t e r a c t i o no fp g p s i i l 内蒙古大学硕士学位论文 s u b s t r a t e sw i t hi n t r a c e l l u l a rt a r g e t si sp hd e p e n d e n t c l e a n e rm o d e le x p l a i n ss o m eo f p g p ss u b s t r a t e sa r ep u m p e do u to f c e l l sd i r e c t l y b o t hm o d e l sa b o v ed o n tc o n s i d e r a b o u tp g p s p o r t a l se n o u g h f l i p p a s em o d e lc o n s i d e r st h ep o r t a l s a n de x p l a i n s n o n s p e c i f i c i t yo fp g p s s u b s t r a t e sa n dt h ed i f f e r e n t i a lh a n d l i n go fi t ss u b s t r a t e s b a s e do nt h e i rl i p i ds o l u b i l i t ys u c c e s s f u l l y h o w e v e r , f l i p p a s em o d e lc a n te x p l a i n t h r e ep r o b l e m s ：( 1 ) t h ei n f l u e n c eo fi o n i cs t r e n g t ho np g p sd i m e n s i o n ( 2 ) t h em a i n r e a s o no fs u b s t r a t e se n t e r i n gt h el u m e no fp g pe f f i c i e n t l y ( 3 ) t h ec o n s u m p t i o n n u m b e ro fa t ph y d r o l y z e dp e rs u b s t r a t et r a n s p o r t e d t os o l v et h et h r e ep r o b l e m so f f l i p p a s em o d e l ，f r o mt h ep o i n to f v i e wt h a tt h eb a s i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nb i o l o g i c a l m o l e c u l e si se l e c t r i ca n dt h ec h a n g eo ff r e ee n e r g yd e c i d e st h ed i r e c t i o na n dl i m i to f a nr e a c t i o n ，t h ee l e c t r o s t a t i cf r e ee n e r g yo fp g pa n dt h es y s t e mp g p - - - s u b s t r a t ea r e c a l c u l a t e db a s e do nd e b y e h f i c k e lt h e o r y s o m es i g n i f i c a n tr e s u l t sa r eo b t a i n e d t h et h e s i si sd i v i d e di n t ot h r e ec h a p t e r s i nc h a p t e r1 ，p g p ss t r u c t u r e ，s u b s t r a t e s p a t t e r n s ，m e c h a n i s mo fp u m p i n ga c t i o n ，t h er o l eo fa n t i a p o p t o s i s ，p g p i n h i b i t o r s a n de x p e r i m e n t a lm e t h o d sa r ei n t r o d u c e d ，w h i c hp r o v i d et h eb a s i so ft h es i m p l i f i e d m o d e lo fp g p sp u m p i n ga c t i o n i nc h a p t e r2 ，t h eb a c k g r o u n d ，a p p l i c a t i o na n d d e r i v a t i o no fd e b y e h f i c k e lt h e o r ya r ei n t r o d u c e d ，w h i c ha r et h et h e o r e t i c a lb a s i so f t h ec a l c u l a t i o no fe l e c t r o s t a t i cf r e ee n e r g y c h a p t e r3i st h em a i np a r to ft h i sp a p e r a s i m p l i f i e dm o d e lo fp g p sp u m p i n ga c t i o na n de q u i v a l e n td i s t r i b u t i o no fc h a r g ea r e o b t a i n e d af o r m u l ao ft h ee l e c t r o s t a t i cf r e ee n e r g yo fp g pw i t h o u ts u b s t r a t e si s i n d u c e d ，w h i c hd e s c r i b e st h ei n f l u e n c eo fi o n i cs t r e n g t ha n dp g p sd i m e n s i o no nt h e e l e c t r o s t a t i cf r e ee n e r g yo f p - g p f u r t h e r m o r e ，t h ec h a n g eo f e l e c t r o s t a t i cf r e ee n e r g y i v 内蒙古大学硕士学位论文 i sa l s oi n d u c e di nt h ep r o c e s so fs u b s t r a t e se n t e r i n gt h el u m e no fp g p t h em a i n r e a s o no fs u b s t r a t e se n t e r i n gt h el u m e no fp g pw i t hah i g he f f e c t i v e n e s si sp r o p o s e d t h ee n e r g ym i n i m u mo ft r a n s p o r t i n gas u b s t r a t ei so b t a i n e d ，w h i c hh a st h es a m e o r d e ra st h ee n e r g yf r o mo n ea t ph y d r o l y z e d i ti si l l u s t r a t e dt h a to n ek 鼹n e e d st o b eh y d r o l y z e dp e rs u b s t r a t et r a n s p o r t e d t w oi n d i r e c tw a y sa r ep r o p o s e dt oi n h i b i t p 一辨 k e y w o r d s ：p u m p - g l y c o p r o t e i n ；m e c h a n i s mo fp u m p i n ga c t i o n ；d e b y e - h f i c k e l t h e o r y ；e l e c t r o s t a t i cf r e ee n e r g y v 内蒙古大学硕士学位论文 目录 弓i 言1 第一章泵浦糖蛋白研究进展的概述3 1 1 泵浦糖蛋白的结构3 1 2 泵浦糖蛋白的底物类型6 1 3 泵浦糖蛋白的工作机制7 1 3 1 p h 依赖性模型7 1 3 2 疏水真空吸尘器模型及其改进8 1 3 3 投掷模型8 1 4 泵浦糖蛋白的抗凋亡作用1o 1 5 泵浦糖蛋白抑制剂_ l o 1 6 泵浦糖蛋白研究的实验方法1 0 1 6 1 单层细胞模型法1 0 1 6 2 药物蓄积法与药物流出法1 1 1 6 3 偶联a t p a s e 活性实验一1 1 1 6 4 基因敲除动物模型法l l l 。6 5 亲和标记实验k 1 l 第二章德拜一休克尔理论介绍1 3 2 1 引言1 3 2 2 泊松方程和电势计算1 4 2 3 德拜一休克尔理论的推导1 5 第三章泵浦糖蛋白底物选择非特异性的物理模型18 3 1 泵浦糖蛋白的静电自由能18 3 2 泵浦糖蛋白底物系统的静电自由能2 3 3 3 结果2 3 。3 4 讨论2 5 参考文献2 7 致 射31 攻读硕士学位期间完成的学术论文3 2 v l 内蒙古大学硕士学位论文 己i 吉 丁i 目 抗药性是医学界面临的一个普遍问题。对癌症、艾滋病等恶性疾病已研制出许多药品， 但这些药品存在一个普遍的问题，用药初期疗效显著，越到后面效果越差，即抗药性。传统 的理论认为肿瘤细胞有很高的自发突变几率，随着时间的推移自然产生了抗药的细胞。随着 研究的进展，发现了另一种抗药机制，即p g p 的作用。 外排异物是细胞适应外界环境的主要机制，由此产生的多药耐药( m u l t i d r u gr e s i s t a n c e ， 简称为m d r ) 是肿瘤化疗失败的首要原因【l 3 1 。由p g p 的高表达导致药物外排增加是m d r 发生的主要机制。p g p 能将上百种结构差别很大的底物排出细胞，使底物来不及与细胞内靶 点相互作用。此外p - g p 还有抗细胞凋亡作用。因此对p g p 的研究成为生化领域的热点之一。 p g p 是跨膜蛋白，含1 2 8 0 个氨基酸，它所处的周围环境既要嵌入细胞膜，还要面对细胞 内外两个不同的空间。2 0 0 9 年3 月s t e p h e ng a 等人1 4 】利用x 射线衍射获得了p g p 高精度的 三维结构。可被p g p 作用的底物众多但差别很大。底物被转运的机制主要有三个理论模型。 p h 依赖性模型1 5 解释了具有p h 依赖性结合的底物被排出的实验；吸尘器模型 6 1 解释了部分 底物能从细胞质内被排到细胞膜外的实验，但这两个模型对p g p 存在着底物入口结构考虑不 够充分。投掷模型1 7 成功的解释了具有不同脂溶性的底物被排出细胞的难易程度不一样的实 验，而且也考虑到入口结构，但对溶液离子强度对p g p 线度的影响，底物高效进入入口的原 因，排出一个底物消耗几个a t p 这些问题不能给出解释。 在我国，从事p g p 研究的人员较多，对p g p 进行了深入的研究。大连理工大学的李燕等 人【8 】利用计算机技术，采用基于配体的药物设计方法，研究了类固醇、类黄酮等分子与p g p 相互作用的结构特征，建立了具有良好预测能力的数学模型。中国医学科学院的齐静等人 9 1 利用具有自主知识产权的抗p g p 单克隆抗体为模板，设计、合成了抗p g p 的十四环肽模拟物， 证实了该模拟物可以部分抑制p g p 的功能。中药对p g p 的影响引起人们较多关注。北京中医 药大学的胡凯文等人l lo j 的实验表明浙贝母主要成分中的浙贝母碱可抑制p g p 的表达。中山医 科大学的潘启超等人i l l l 研究发现防己、北豆根等的有效成分之一防己甲素具有钙拮抗作用和 膜调节作用，可以干扰p g p 的药物外排机制，在体内外均能逆转p g p 介导的m d r 。苦参是中 医常用的药物，其化学成分主要包括氧化苦参碱等。重庆医科大学的王驰等人【1 2 】研究表明氧 塑鍪查奎兰堡主兰篁堡苎 化苦参碱与维拉帕米有相似的作用，可以抑s u p g p 的表达。 生物分子之间最基本的相互作用是电性质的，自由能的变化决定了反应进行的方向和限 度。本文给出了p g p 工作的简化模型，从静电自由能的角度进行了一系列计算：给出了p g p 静电自由能表达式，研究了溶液离子强度和线度对p - 印静电自由能的影响，定量的评估了溶 液离子强度的减小对p g p 线度的影响程度；计算了底物进入p g p 中心空腔过程中系统静电 自由能的变化值，找到了底物能高效进入p g p 中心空腔的主要原因；给出排出一个底物所需 能量的下限，支持排出一个底物分子需消耗一个a t p 的结论，这些结果是从生化实验难以得 到的。 2 内蒙古大学硕士学位论文 第一章泵浦糖蛋白研究进展的概述 本章主要介绍p 一印的结构、工作机制、底物类型，这是研究底物选择非特异性的基础。 此外还简要地介绍了p g p 的抗凋亡作用及p g p 抑制剂，目的是对p g p 能有较全面的了解。 最后介绍了p - g p 研究的实验方法，以便对实验结果能更好的甄别和应用。 1 1泵浦糖蛋白的结构 p g p 于1 9 7 6 年在中国仓鼠的卵巢细胞对秋水仙碱的耐药株中首次被发现【1 3 1 。1 9 8 6 年，从 多药耐药的k b 癌细胞中分离出了编码p - g p 的m d r 基斟1 和15 1 。p - g p 是一种横跨膜蛋白，由 7 号染色体m d r 基因编码，由1 2 8 0 个氨基酸组成，分子量为1 7 0 k d ，可分为两部分【1 6 1 。每 一部分都由6 1 0 个氨基酸组成，包括六个疏水域，六个疏水域后紧跟一个a t p 结合域。p g p 的两部分间由6 0 个氨基酸连接。p g p 属于a t p 结合盒( a t p b i n d i n gc a s s e t t e ，简称为a b c ) 蛋白质家族。从结构上来看，p g p 包括胞外区、跨膜区、胞内区、a t p 结合区，不同的区域 有各自不同的功能【0 7 1 。 氨基酸序列分析表明每个p g p 分子在c 端和n 端形成两个对称的部分，且两部分氨基酸 顺序具有高度的同源性【1 8 19 1 。图1 1 所示为p - g p 的一级结构示意图【2 0 l 。每一部分有6 个跨膜 结构域，整个p g p 分子有1 2 个跨膜结构域，1 2 个跨膜区域最终折叠成桶状的构型。每个a t p 结合位点均含有几个保守片段：w a l k e ra 基元、w a l k e rb 基元、特征基序c ，但与a t p 结合 的氨基酸不明确。n 端和c 端的a t p 位点均有a t p 酶活性【2 1 也3 1 。 p g p 广泛分布于肝、肾及肠道的上皮细胞，脑、子宫、胎盘等的血管内皮细胞，造血干 细胞等细胞的细胞膜上。p g p 由m d r 基因编码，m d r 基因总共有3 类。人类m d r 基因 有：m d r i 和m d r 3 ，啮齿类动物有：m d r l 、m d r 2 、m d r 3 。人类m d 酣基因，小鼠m d r i a 基因表达产物与多药耐药有关，是当前研究最多的基因【2 睨5 1 。 m d r 基因表达随器官组织不同而异【2 6 1 。肾上腺髓质以及肾脏m d r l 基因表达水平非常 高，在大脑血液屏障表达也很高，肺、肝、小肠、结肠及直肠是中度表达，而皮肤、皮下组 织、骨骼肌、骨髓、食道、胃、卵巢及脊髓大部分组织中表达水平很低。重要的是，当底物 增加时，p g p 的表达量也会增加，从而增加抗药性。 3 内蒙古大学硕士学位论文 图1 1 人类p g p 结构示意图 f i g 1 1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h es t r u c t u r eo fh u m a n p g p p g p 属于跨膜蛋白，对其结构的实验研究难度很大。图1 2 【2 7 】是通过电镜分析试验获得 的p g p 在2 5 纳米分辨率时的结构。由于其图片不够清晰，具体结构还需借助计算机模拟手 段来还原其可能的空间构型。图1 2 中a 图表示从细胞膜外表面的角度看到的p g p 结构；b 、 c 、d 图则是分别将a 图绕纵轴旋转1 0 8 0 、1 3 2 0 和1 9 2 0 所得p g p 结构，即d 是从胞内视角 所示结构；图中的直箭头为研究者推测的a t p 结合区域，弯箭头则为p g p 中心空腔，该空腔 可能是脂相和水相的相互作用通道。 4 内蒙古大学硕士学位论文 图1 2 计算机辅助还原的2 5 纳米分辨率时p - g p 的三维结构图 f i g 1 2c o m p u t e rg r a p h i c a lr e p r e s e n t a t i o no ft h e3 d r e c o n s t r u c t i o no f p g ps t r u c t u r ea t2 5n n lr e s o l u t i o n 图1 3 1 2 7 1 q ba 、b 图分别是图1 2 中a 、b 图垂直于膜外表面的投影：磷脂双分子层构成的 细胞膜位置大致在两条横线之间。其中，p 处为p g p 蛋白开口在膜外表面的水相孔。t m d 为两拇指形区域，分别对应于p g p 的两跨膜区。n b d 是从内质表面突出的两个3 纳米大小 的圆裂片，分别对应于两核苷结合区域。箭头所对应的为一个非对称的开孔，该孔提供了一 个从i i 丰i i ! i 细胞内水相的通道。 一i 裁。；赠甏 ；。：筝1 南；弱 4 。魏 警。囊专雾絮 懑繁鬻j 一? ? 誓穗 a 图1 3p g p 的三维结构映射图 f i g 1 3p r o j c t i o n so f t h e3 d - r e c o n s t r u c t i o no fp g p 内蒙古大学硕士学位论文 2 0 0 9 年3 月份，s t e p h e ng a 等人【4 1 通过x 射线衍射获得了p g p 的高清晰度结构图，其三 维结构图解如图1 4 所示。此研究表明，p g p 在细胞膜中的部分存在着可以开放的入口，使 得底物可以从磷脂双分子层进入到p - g p 的中心空腔。 图i 4p - g p o 3 8 纳米分辨率时的三维结构图解表示 f i g 1 4s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h et h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f p - g pa to 3 8n l t lr e s o l u t i o n 1 2 泵浦糖蛋白的底物类型 能被p - g p 作用的底物达上百种之多，而且这些底物在结构上差别很大。表1 1 【2 8 1 列举了 一些代表性底物。 从表可看出这些底物种类繁多，从抗肿瘤药物一直到抗生素都有涵盖。使人们感到 困惑的是它们在尺寸上及化学性质上变化很大2 9 1 。一些科学家对此做了研究。a m b u d k a r 等人 t 3 0 1 提出p - g p 底物的特征结构应包括一个平面的芳香基团和延伸侧链上的氮原子；s e e l i g t 3 1 】研 6 内蒙古大学硕士学位论文 究发现通常的药效团结构特征应是在一个空间结构固定的分子中存在2 3 个电子供体基团； e k i n 等人【3 2 】在p g p 各种底物抑制剂中发现三维定量结构与活性之间的关系，而且描述了五 个药效团，其中都表现出多疏水性和含有氢结合受体的特征。大多数p g p 的底物呈弱碱性， 离解常数值7 - 8 ，在生理环境下带正电。p g p 能使许多对人体有很好疗效的药物产生抗药性， 所以如何逆转或者抑制这种抗药性就成为人们密切关注的事情。 表1 1 具有代表性的p - g p 底物 t a b l e1 1 r e p r e s e n t a t i v es u b s t r a t e so fp - g l y c o p r o t e i n 底物种类底物举例 抗肿瘤药物 免疫抑制药物 降脂药物 中枢神经镇痛药 抗抑郁药 类固醇 h i v 蛋白酶抑制剂 心血管药物 止泻药 抗痛风药 抗生素 阿霉素、柔红霉素、长春新碱 环孢素a 、f k 5 0 6 洛伐他汀 吗啡、哌替啶 西酞普兰、曲米帕明 醛l 司酮、地塞米松、氢化可的松 印地那韦、那非那韦、利托那韦 地高辛、奎尼丁 洛哌丁胺 秋水仙碱 红霉素 1 3 1 p h 依赖性模型 1 3 泵浦糖蛋白的工作机制 p h 梯度差可通过以下方式引起耐药：大部分p g p 底物是疏水弱盐f 3 3 1 ，与胞内靶点p h 依 赖性结合。p - g p 并不直接将药物泵出【5 1 ，而是作为一种质子或者氯化物泵来改变细胞内p h 值 或者细胞膜电位，进而影响药物的离子化，从而改变其与细胞内靶分子( d n a ，r n a ，微管等) 的亲和力以及药物囊泡的分泌作用，最终降低药物在细胞内的聚集及分布，由此产生抗药性。 7 内蒙古大学硕士学位论文 1 3 。2 疏水真空吸尘器模型及其改进 疏水真空吸尘器( h y d r o p h o b i cv a c u u mc l e a n e r ，简称为h v c ) 模型认为【3 5 1 ，当p - g p 识 别底物为外来的异物时，会直接与血浆膜上的底物结合，通过蛋白通道将它们泵浦到细胞外。 a t p 的结合与水解是p g p 功能行使的关键，而且排出1 个药物分子需要2 个a t p 分子参与。 p g p 对a t p 的消耗周期可能包括2 个循环过程，药物结合位点与a t p 结合位点协调作用而 使药物排出细胞膜外。第一个a t p 水解释放的能量使p g p 构象发生变化来将底物排出细胞 外，第二个a t p 水解释放的能量使p g p 恢复原来的构象。 对疏水真空吸尘器模型有人提出了改进 6 1 ，即膜置真空吸尘器模型，主要是把p g p 在a t p 酶水解时发生构象变化的情况考虑了进去。该模型认为p g p1 2 个对称的伍螺旋结构形成1 个跨膜外泵通道和2 个结合位点，其中一个位点与底物结合，另一位点与a t p 结合。a t p 水 解导致p g p 构象发生变化，这一变化使底物直接从细胞内被泵细胞外。之后原底物结合位点 与1 分子a t p 结合，原a t p 结合位点与底物结合，然后a t p 水解，底物被泵出。如此一个 外泵循环完成：1 个p g p 分子的2 个活性位点各外泵1 个底物分子，同时消耗2 分子a t p l 3 6 j 。 由于p g p 底物众多，吸尘器模型只能解释部分底物被排出的实验。 1 3 3 投掷模型 投掷模型认为p g p 在磷脂双分子层内与亲脂性的、平面型、带正电的底物相遇，底物可 从磷脂双分子层进入到p - g p 中心，然后被投掷到双分子层的外叶或直接投掷到细胞外阴。如 图1 5 所示【3 7 1 。 图1 5p - g p 工作的投掷模型 f i g 1 5f l i p p a s em o d e lo fp g pf u n c t i o n i n g 8 嗽r 鼢嚣躐 l n n e tl e a r l e l 堕鍪查奎堂堡主兰篁笙茎 该模型解释了为什么能被p g p 作用的底物很广泛。因为磷脂双分子层充当了一个二层识 别系统，p g p 的底物只需具有亲脂性的、平面型、带正电。该模型还解释了具有较高脂溶性 的底物要比脂溶性低的底物更容易被排出细胞的实验：后来得到低分辨率的p g p 结构表明处 于膜中的p g p 环出现了一个“缺口”，这一“缺口”为蛋白中心孔和脂质相之间提供了通道， 使得底物有可能直接从磷脂双分子层内部进入到p g p 中心1 3 8 1 。由于当时所得到的结构较为模 糊，所以并未引起人们足够重视。需要说明的是，在最初的投掷模型中，除了认为p g p 将底 物排到细胞外，还考虑到另外一种可能：底物被排到细胞膜的外叶，然后再被释放到细胞外。 更多的实验倾向于底物被直接排到细胞外，如图1 6 1 1 7 j 所示。 在图1 6 中，底物的排出需要p g p 跨膜区域与a t p 结合区域的协调配合。跨膜区5 、6 及 1 1 、1 2 是主要的药物结合域，对药物识别与转运起重要作用。p g p 的两部分被一个线性易变 区域隔开，当这个区域受到突变而缺失时，虽然细胞表面的蛋白表达与原蛋白相似，但丧失 了转运及药物刺激a t p 酶活性的功能。这时，如果用一个有足够柔韧性二级结构的多肽链替 换这个缺失的结构，p g p 分子的功能就会恢复。这些实验表明p g p 两个半球的相互作用是实 现分子功能的关键。s u r e s hv a 等人1 3 9 做过长春碱刺激的a t p 水解实验，该实验表明虽然 p g p 的两个a t p 结合位点都可以水解a t p ，但水解不可能同时发生，只能交替进行。此图中 出现有两个a t p 水解只是要说明两个区域都可各自结合并水解a t p ，但不能认为两个a t p 结合区域可同时水解a t p 。究竟排出一个底物需消耗几个a t p ，投掷模型并未给出明确说明。 一甜u 口 a 0 p + 雾a t pa t pa d p + p 图1 6 基于“投掷”模型的伴随有a t p 水解的底物排出示意图 f i g 1 6s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fs u b s t r a t ee f f l u xf o l l o w i n ga t ph y d r o l y s i sb a s e do nf l i p p a s em o d e l 内蒙古大学硕士学位论文 1 4 泵浦糖蛋白的抗凋亡作用 p g p 能成为生化领域的“明星蛋白”还有另外的原因。近年的研究表明，p g p 还可延迟 凋亡级联反应，并能保护细胞免于多种药物性或非药物性刺激诱导的凋亡，如阿霉素、镉、 肿瘤坏死因子、射线等诱导的凋亡【4 0 4 2 1 ，原发性急性粒细胞白血病细胞的自发性凋亡，受到 细胞因子激活诱导的初级t 淋巴细胞凋亡，也就是说p g p 还是一种抗凋亡蛋白。p g p 的抗 凋亡机制有以下五种1 4 3 ：( 1 ) 细胞的凋亡分为c a s p a s e ( 全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋 白水解酶) 依赖型和非c a s p a s e 依赖型两种，p g p 可抑制c a s p a s e 2 3 和c a s p a s e 2 8 的活化，从 而抑制c a s p a s e 依赖型细胞凋亡。( 2 ) p g p 可通过影响体积调节性氯离子通道的活性，间接 抑制凋亡的发生。( 3 ) p g p 表达的增加使细胞内p h 水平提高，从而影响肿瘤细胞的凋亡耐 受。( 4 ) p g p 可影响神经酰胺的生成和代谢，进而影响凋亡的进展。( 5 ) p g p 可能具有a t p 依赖性和a t p 非依赖性的凋亡抑制功能。 1 5 泵浦糖蛋白抑制剂 某些p g p 底物具有抑制p g p 泵浦功能，减弱或者逆转肿瘤细胞多药耐药性( m d r ) 的作 用，称之为p g p 抑制剂。近年来，文献报道的p g p 抑制剂数十种1 4 训。抑制剂的主要机理有 三种：( 1 ) a t p 的水解与结合是p g p 行使功能的关键，干扰a t p 的水解过程就可以来抑制 抗药性。槲皮素即可能足以某种类似干扰a t p 酶活性的机制而阻滞p g p 功能。( 2 ) p g p 抑 制剂竞争性、非竞争性或变构性地阻碍p 喀p 结合位点。一般的p g p 抑制剂都是通过阻碍p g p 底物结合位点而抑制其外排功能。( 3 ) 改变细胞膜脂质的完整性而发挥作用，药用辅料即这 种类型的p g p 抑制剂【4 引。但是这些抑制剂在使用时往往伴有严重的毒副作用。顽强的微生物 和癌细胞都使用a b c 家族蛋白质泵来逃避对其有毒性的药物，因此，研究这类泵的组成便可 合理地设计出对抗其耐药性的药物，a b c 转运子对于药物设计具有重大意义。 1 6 1 单层细胞模型法 1 o 泵浦糖蛋白研究的实验方法 单层细胞模型法是p - g p 泵浦功能体外研究中应用最广泛的方法m 1 ，可比较在p - g p 抑制 l o 塑鍪直查兰堡主兰篁堡茎 剂存在或不存在的情况下，某些p g p 底物如若丹明1 2 3 、地高辛与长春碱从基侧到顶侧透过 细胞的速率与从顶侧到基侧透过细胞的速率的比值，通过观察比值的变化即可初步判断化合 物的透膜过程是否有p g p 等外排泵参与。贴壁细胞培养需要大量人工，因此不适合高通量筛 选 1 6 2 药物蓄积法与药物流出法 药物蓄积法通过比较p g p 抑制剂存在及不存在的情况下，p g p 底物被细胞摄取的量来研 究p g p 抑制剂对p - g p 的抑制强度。在蓄积实验中，因为实验结果为细胞内底物平衡浓度， 所以在对结果进行动力学分析时须用不同数学模型对数据进行非线性回归，通过数据拟和来 进行动力学分析。但是数据拟和只能说明转运机制的倾向性，结果需要进一步验证。药物流 出法使用单层细胞膜或离体组织，可用于研究p g p 介导的药物逆流现象，定量分析较为困难， 操作要求十分严格。 1 6 3 偶联a t p a s e 活性实验 偶联a t p a s e 活性实验的根据是p g p 在转运底物的时会伴随a t p 的水解。该实验通过检 测a t p 水解产生的无机磷酸的量来研究p g p 对底物的转运作用。偶联a t p a s e 活性实验无法 对该化合物与p g p 之间作用的动力学进行研究，而且正常生理状态下细胞内a t p a s e 也会催 化a t p 产生无机磷酸，所以该方法的特异性较差。 1 6 4 基因敲除动物模型法 靶向破坏小鼠的m d r 基因，可得到m d r 基因敲除小鼠，此小鼠是研究p g p 抑制及其 对药物代谢动力学过程影响的最佳、最符合体内真实环境的实验动物模型，更容易研究某种 化合物对除p g p 之外的其它转运蛋白的抑制能力及其在化合物的整体抑制能力中的比例。虽 然该法优点很多，但因动物体内试验操作繁琐，且实验动物之间存在较大个体差异，所以它 不适用于研究p g p 抑制剂的高通量筛选。 1 6 5亲和标记实验 亲和标记实验的原理是将同位素标记的或可自身发光的化合物与p g p 共同作用，这些化 合物可以是p g p 底物或抑制剂，然后应用免疫沉淀等一系列方法对标记的p g p 或消化后的 塑鍪直奎堂堡主兰篁堡茎 p g p 片段进行分离，标记定量。p g p 与底物相互作用是一个由识别、结合、转运、释放等多 个环节组成的复杂过程，亲和标记实验是在化合物与p g p 结合这一个环节进行研究。所以， 亲和标记实验提供的动力学信息较为局限，另外，在亲和标记实验中的p g p 构象与转运底物 时p g p 构象可能存在差异，所提供动力学结果的准确性需要验证。 1 2 内蒙古大学硕士学位论文 第二章德拜一休克尔理论介绍 生物分子之间最基本的相互作用是电性质的，自由能的变化决定了反应进行的方向和限 度。大分子所携电荷之间的静电作用对其构象有很强的效应，水溶