（化学工程专业论文）催化氢化联合生物转化合成米格列醇工艺的研究探索.pdf

摘要 本文依据文献报道，研究化学生物组合法合成i i 型糖尿病原料药米格列醇( n 羟乙基 1 脱氧野尻霉素) 的工艺过程。合成工艺分三步进行，( 1 ) 葡萄糖与乙醇胺经还原胺化生成 n 羟乙基葡萄糖胺；( 2 ) n 羟乙基葡萄糖胺生物转化，合成6 脱氧6 羟乙基氨基山梨糖； ( 3 ) 6 脱氧6 羟乙基氨基山梨糖催化加氢合成米格列醇。论文研究各步反应的工艺条件及产 物测定；验证工艺过程的可行性。 还原胺化合成n 羟乙基葡萄糖胺过程中，在低压条件下探讨了r 小i 和p d c 催化剂、糖 胺配料比、p h 、温度及含水量对反应的影响，结果发现，两种催化剂效果相当，常压加氢还 原，反应起始吸氢速率高，后续加氢很慢，耗时过长，考虑后续可能催化剂失活。n 羟乙基 葡萄糖胺化优化合成工艺条件为催化剂用量1 0 ( 占葡萄糖物质的量) ；反应时间2 5 h ，葡萄糖 与乙醇胺的摩尔比取1 ：3 ；反应温度5 0 c ；反应p i l l l ；该条件放大到高压釜中其他条件不变， 压力为0 6 m p a ，时间根据吸氢结束点决定；经乙醇结晶分离获得熔程为1 3 1 - - 1 3 3 的结晶， 收率达8 9 ，通过红外光谱、熔点、质谱、元素分析测定证明为n 羟乙基葡萄糖胺。 生物催化转化条件为：p h 为5 0 的盐酸液中，底物浓度为2 0 8 0 9 l ，转化温度为1 2 1 5 。c ，干细胞量为8 9 l ；得到中间体6 脱氧6 羟乙基氨基山梨糖，经t l c 检测，进行催化加 氢，反应条件为：0 6 m p a 压力，室温2 0 ，1 0 p d c 催化剂用量为1 0 ( 相对反应物的量) ， p h 5 0 。产物经离子交换树脂吸附进行分离纯化，得到熔程为1 4 2 。c , - 1 4 7 c 的结晶，经 m a l d i m s 测定证明，生成了与米格列醇分子量相等的化合物，初步证明合成路线可行。 本文所探索的米格列醇合成路线，不仅选择了化学催化剂及其反应条件，亦证明了本实 验室筛选的氧化葡萄糖酸杆菌催化氧化反应的活力及其基础专一性，为工业制备原料药米格 列醇奠定了基础。 关键词：米格列醇还原胺化催化加氢生物转化葡萄糖酸杆菌 西北大学硕十学何论文 e x p l o r a t i o na n d r e s e a r c ho ft h es y n t h e s i so fm i g l i t o lb y c a t a l y t i ch yd r o g e n a t i o nc o m b i n e dw i t hb i o t r a n s f o r m a t i o n a bs t r a c t a c c o r d i n gt o t h ei n t e r n a la n de x t e r n a ll i t e r a t u r e ，t h i sa r t i c l ed i s c u s s e dt h e s y n t h e s i so fm i g l i t o lb yt h ec o m b i n a t i o n a lm e t h o d so fm i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o na n d c h e m i c a l n o wi th a sb e e nt h ef i r s tc h o i c ef o rt h et r e a t m e n to ft y p ei id i a b e t e s i ti s f o u n dt h a tt h ep r o c e s si n c l u d et h r e es t e p s ，( 1 ) g l u c o s ea n de t h a n o l a m i n e sr e d u c t i v e a m i n a t et on - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) g l u c a m i n e ；( 2 ) t h es u b s t r a t eo f n - ( 2 一h y d r o x y e t h y l ) g l u c a m i n ew a ss u c c e s s f u l l yc o n v e r t e db yg o x y d a n si n t o6 一( 2 一d r o x y e t h y l ) a m i n o 一 6 - d e o x y a - l - s o r b o f i u a n o s e ，t h ek e yi n t e r m e d i a t e o fm i g l i t o l ；( 3 ) m i g l i t o lw a s s y n t h e t i s e db yc a t a l y t i ch y d r o g e n a t i o n s t u d yt h ep r o c e s so ff e a s i b i l i t y ，i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no fp r o d u c t s r a n ia n dp d c c a t a l y s t ，t h em o l er a t i o e t h a n o l a r n i n ea n dg l u c o s e ，p h ， t e m p e r a t u r ea n dt h ei n f l u e n c eo fw a t e ro nt h er e a c t i o nu n d e rl o wp r e s s u r eh a v eb e e n s t u d i e di nt h er e d u c t i v ea m i n a t i o ns y n t h e s i sn - ( 2 一h y d r o x y e t h y l ) g l u c a m i n e i tw a s f o u n dt h a tt h ei n i t i a lh y d r o g e nr e a c t i o ni si n h i g hr a t e ，s l o wp r o g r e s s i o ni n t h e s u b s e q u e n tr e a c t i o n ，c o n s i d e r i n gc a t a l y s tm a yd e a c t i v a t i o n t h eo p t i m a lt e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n so fr e d u c t i v ea m i n a t i o ns y n t h e s i sw e r ea sf o l l o w s ：t h em o l er a t i oo fc a t a l y s t a n dg l u c o s ew a s1 0 ，t h em o l er a t i oe t h a n o l a m i n ea n dg l u c o s ew a s l ：3 ，t h er e a c t i o n t i m ew a s2 5 h ，t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s5 0 c ，t h ev a l u eo fp hw a s11 t h e s t r u c t u r eo fn ( 2 一h y d r o x y e t h y l ) g l u c a m i n ew a sc o n f i r m e db yi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y , e l e m e n t sa n a l y s i s ，m e l t i n gp o i n ta n dm a l d i m s ，a n dt h ep u r i t yw a s8 9 ，a n dt h e m e l t i n gr a n g ew a s1 3 1 。1 3 3 c t h es u b s t r a t eo f n ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) g l u c a m i n ew a ss u c c e s s f u l l yc o n v e n e d b yg o x y d a n si n t o6 一( 2 d r o x y e t h y i ) a m i n o - 6 一d e o x y - a - l - s o r b o f i u a n o s e ，t h ek e y 西北大学硕士学位论文 i n t e r m e d i a t eo fm i g l i t 0 1 t h eo p t i m a lc o n d i t i o no ft h eb i o - c a t a l y t i c a lo x i d a t i o n r e a c t i o ns y s t e mw a s ：t h es u i t a b l ei n i t a lp hi s5 0 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o ni s2 0 g l - - - 8 0g l ，t h eb e s tt e m p e r a t u r ei s1 2 。c - 。1 5 。c ，s t e mc e l li s8 9 l t h e nm i g l i t o l w a ss y n t h e t i s e db yc a t a l y t i ch y d r o g e n a t i o n ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o no ft h ec a t a l y t i c h y d r o g e n a t i or e a c t i o ns y s t e mw a s ：h i g hp r e s s u r es p r a y e ra tp r e s s u r e sb e l o w0 6 m p a ， t h es u i t a b l et e m p e r a t u r ei s2 0 。c ，t h ea m o u n to fc a t a l y s tw a s1 0 t h es t r u c t u r eo f c r y s t a lw a sc o n f i r m e db ym a l d i m s ，a n dt h em e l t i n gr a n g ew a s1 4 2 。c 1 4 7 c i t w a st h es a m em o l e c u l a rw e i g h to fm i g l i t o n ，b yp r e l i m i n a r yt e s t ，p r o v e st h a tt h e p r o c e s so fs y n t h e s i so fm i g l i t o li sr e a s o n a b l e t h er e s e a r c hw h i c hw eh a ds t u d i e dn o to n l ys e l e c t e do fr e d u c t i v ea m i n a t i o n c a t a l y s t a n dt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so fs y n t h e s i sb u ta l s or e v e a l e d c a t a l y t i c o x i d a t i o nr e a c t i o na c t i v i t ya n ds p e c i f i c i t yo fg o x y d a n s i th a v el a i e daf o u n d a t i o n f o rp r o p h a s ew o r ko fn e wd r u g so fm i g l i t o n sd e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：m i g l i t o l ：r e d u c t i v ea m i n a t i o n ；c a t a l y t i ch y d r o g e n a t i o n b i o t r a n s f o r m a t i o mg l u c o n o b a t e ro x y d a n s i i i 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：五盔：指导教师签名：乏垦兰兰 昭年多月日d s 年么月3 - 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：外籀 d 旷年歹月1 c 日 西北大学硕十学位论文 第一章文献综述帚一早义陬三示迎 1 1 研究问题的提出 糖尿病是最为常见的一种内分泌代谢失调引起的疾病，主要分为i 型糖尿病 ( 胰岛素依赖性糖尿病，i d d ) 和i i 型糖尿病( 非胰岛素依赖性糖尿病，n i d d ) 。其 中，又以i i 型糖尿病为主。随着人民生活水平的提高和营养结构的改善，糖尿病 作为慢性非传染性疾病正在呈流行趋势。z i m m e t 和m c c a n y 预计1 1 1 ，至l j 2 0 1 0 年，全 世界糖尿病患者的数量将从1 9 9 4 年的1 1 1 亿上升到2 3 9 亿。糖尿病患者数量的增 加主要集中在亚洲及非洲，据有关研究估计，至l j 2 0 1 0 年亚洲及非洲糖尿病患病率将 较1 9 9 4 年提高2 - - 3 倍。 目前糖尿病的治疗手段主要包括：饮食治疗、运动治疗、口服降糖药物及皮 下注射胰岛素等。常用的治疗i i 型糖尿病药物主要有【2 蝣l 酰脲类，双胍类，a 葡 萄糖苷酶抑制剂类、醛糖还原酶抑制剂类及噻唑烷基二酮类等，磺酰脲类主要是 刺激b 细胞释放胰岛素，但该类药物副作用较大，可引起低血糖、胃肠反应、腹 痛、肝损坏及严重的体重增加。双胍类主要是促进肌肉对葡萄糖的摄取和利用， 抑制糖异生作用，其对肝肾疾病患者易引起乳酸性酸中毒。a 葡萄糖苷酶抑制剂 类有多种药理活性，降糖效果显著，副作用小，是治疗i i 型糖尿病的高效、安全 药物。 作为一种新型a 一葡糖苷酶抑制剂，米格列醇( m i g l i t 0 1 ) 能竞争性抑制a 葡 糖苷酶，减少糖类化合物的代谢，降低糖类在小肠的吸收，从而稳定饭后血浆葡 萄糖浓度。该药物安全有效，且一般耐受性良好，已成为治疗i i 型糖尿病的首选 药物。我们通过对米格列醇等1 脱氧野尻霉素及其衍生物药理作用、药效及临床 应用的认识与研究，可以说明该课题的实际价值与广阔前景。 1 2 米格列醇的发现及其应用 米格列醇( n 羟乙基1 脱氧野尻霉素) 是从杆菌肉汤培养基中发现的b 们，是 1 脱氧野尻霉素的母体修饰物，结构与葡萄糖相似( 图1 ) 。作为第一个假单糖类a 葡萄糖苷酶抑制剂，因其明显的降糖效果、且安全有效、一般耐受性良好，己成 为治疗i i 型糖尿病的首选药物。 西北大学硕士学位论文 o h 图1 - 1 米格列醇的结构式 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fm i g l i t o n a 葡萄糖苷酶抑制剂 5 】首次在微生物代谢产物中被发现。1 9 6 6 年，在链霉菌 的发酵液首次中发现了野尻霉素( n o j i r i m y c i n ) ，四年后发现它对b 糖苷酶具有强 烈的抑制作用，成为第一个被发现的淀粉酶抑制剂。由野尻霉素还原得到的1 脱氧野尻霉素( 1 d e o x y n o j i r i m y c i n ) 及其一系列的衍生物同样具有糖昔酶抑制作 用，n 取代1 脱氧野尻霉素的降糖效果最为明显，米格列醇就是其中之一。 1 9 7 0 年，p a l u s 等人最早从微生物代谢产物中分离到一系列的寡糖酶抑制 剂。经w i l l i a m o l s s o n 等人对这些化合物进行广泛而深入的研究后发现，环己糖 醇及氨基糖构成这类化合物的活性部位，称a c a r v i o s i n e 。1 9 7 7 年德国拜耳公司由 放线菌的培养液中提取近似低聚糖( 寡糖) 的抑葡萄糖苷酶阿卡波糖( a c a r b o s e ) ， 成为拜尔公司研制开发的第一个用于临床的a 葡萄糖苷酶抑制剂。日本武田药业 于1 9 8 1 年从另一种放线菌的培养液中也提取出疑似胺糖的变形胺，经过化学结 构的改造开发出具有较强抑制活性的伏格列波糖( v o g l i b o s e ) 。 米格列醇【34 1 ( m i g l i t o n ) 是拜耳公司在1 9 9 7 年度上市的新型抗糖尿病药物。它 是从杆菌肉汤培养基中发现的种新型肠道a 葡萄苷酶抑制剂，是1 脱氧野尻 霉素的母体修饰产物，属于n 取代1 脱氧野尻霉素类型，结构与葡萄糖相似。 尽管用化学合成的方法能够制备米格列醇，但目前生产规模大多采用生物合成 来制备米格列醇。米格列醇的生物合成法据文献报道大致有二条路线：一是先由 野尻霉素或1 脱氧野尻霉素产生茵产生发酵，制备获得野尻霉素或1 脱氧野尻 霉素，然后再经过化学合成方法获得米格列醇，这是最原始的途径；二是应用 氧化葡糖酸菌转化制备米格列醇关键中间体n 取代1 脱氧野尻霉素，其主要通过 化学合成生物转化化学合成的方法来制备。 1 3 米格列醇的制备工艺 2 0 世纪7 0 年代，首次从桑树的根和树干种分离得到了1 脱氧野尻霉素，并命 2 西北大学硕+ 学位论文 名为m o m o l i n e t5 1 。同时，从链霉菌的发酵液中提取到了1 脱氧野尻霉素，并发现 它具有抑制哺乳动物肠道a 葡糖苷酶的药理活性【7 1 。随后发现枯草杆菌发酵也可 以产生1 脱氧野尻霉素，通过优化培养条件及诱变处理，发酵液中1 脱氧野尻霉素 的含量可以提高到4 5 倒引。据文献报道，米格列醇的制备工艺有化学合成和化 学合成组合微生物转化两种方法。 化学全合成法制备米格列醇的步骤较多，米格列醇分子中含有的四个手性中 一t h , 也给化学合成带来了很大的困难。对于后者，工艺过程主要是：先通过微生物 发酵或生物催化合成1 脱氧野尻霉素，再经过化学方法引入一系列的取代基，最 后得到米格列醇，此方法需要在合成过程中添加保护剂。 1 3 1 微生物转化与化学合成组合法 由于微生物酶的高效专一性，省略了化学合成过程中为达到专一地改造某个 目的基团必须进行的加入和脱除保护基团的步骤，大大简化了制备过程，提高了 反应收率。氧化葡糖酸杆菌用于转化特定底物制备1 脱氧野尻霉素及其衍生物具 有很多优点【加】：1 ) 转化液经离心除去菌体，无需分离纯化出中间体，就可进行下 一步合成。2 ) 无需基团保护，成本大大降低，且避免因去除保护剂而造成的回收 率下降。3 ) 中间体6 ( 取代胺基) 6 脱氧al 山梨呋喃糖具有较高的溶解度和稳 定性，不易被降解。但对于转化机理的报道还没有，可以肯定是，氧化葡萄糖酸杆菌 中含有参与该转化反应的生物酶或酶系。我们推测：( 1 ) n - - j 能细菌含有葡萄糖胺 酶，它可以专一性作用于底物葡萄糖胺，形成中间体。( 2 ) 细菌中的一些具有广 泛底物专一性的酶可能参与葡萄糖胺的生物氧化。目前米格列醇生产工艺是通过 化学合成组合生物转化来进行的。1 脱氧野尻霉素作为米格列醇合成的重要中间 体，生化制备工艺有了很大发展。 k i n a s t l l l ，1 2 】等人在1 9 8 1 年利用微生物转化，成功地获得了1 脱氧野尻酶素衍 生物如图1 2 所示，但是在进行生物转化前需要引入保护剂，而且氢化时需要大 量的催化剂，这些大大地增加了工艺的成本和难度。之后，他们在原有基础上进 行了改进，但仍然需要添加保护剂，如图1 3 所示。 g r a b n e r 【”】等发明了另一种更为简便的生物组合合成工艺，葡萄糖经还原胺 化生成烷基葡糖胺，经微生物特定氧化生成6 一( 取代胺基) 一6 脱氧a l 山梨呋喃 3 西北大学硕士学何论文 糖，然后氢化生成米格列醇，工艺简图如图1 - 4 所示。 h 。_ f k - - o p 靴1 0 ，。伽 广c h 2 ”0 h r m _ 器鲎骂盼 ，器2 0 u h g 。已， 卜o h、r j 儿ul 一7 己h 9 0 h o ho h 图1 2n 取代1 脱氧野尻霉素的合成方法一 ( r 一取代基，p 一保护) f i g 1 - 2t h ef i r s ts y n t h e s i so fn - s u b s t i t u t e d 一1 - d e o x y n o j i r i m y c i n pp r i o 葡一m 嚣羔m 瘩文m 崔争h o 葡萄糖h o 十o hj h o 十曼堕笪箜丝h o 十曼佣j 卜0 卜0 h卜0 h 蚕忆、u j l ， l 伽e 叫 e ohoho h l l l 0 归 图1 ，3n 取代1 脱氧野尻霉素的合成方法二 ( r 一取代基，p 一保护基) f i g 1 - 3t h e s e c o n ds y n t h e s i so fn s u b s t i t u t e d - 1 一d c o x y n o j i r i m y c i n 葡萄糖竺i 少、尸一丝塑r n 黼肌f 1 ，if 塑肛簧 r - r h 0 u n n 叫塾。) 卜n 一一r 哑o h h 0l 图1 4n 取代1 一脱氧野尻霉素的合成方法三 ( r 一取代基) f i g 1 - 3t h et h i r ds y n t h e s i so fn - s u b s t i t u t e d 一1 一d e o x y n o j i r i m y c i n 4 o声叫 西北大学硕十学位论文 1 3 2 微生物转化法特点 常用的微生物转化体系包括以下几种：分批转化法、连续转化法、静息细胞 转化法、干细胞转化法、固定化细胞转化法和固定化酶转化法等【1 4 】。静息细胞制 备方法简便，浓度可人为调节，可简化加入效应剂己达到最佳转化状态，且在4 下能保存一定的期限，简化了实验程序。由于静息细胞是不再生长的完整细胞， 在转化过程中除底物外不用加入营养成分，且静息细胞处于缓慢代谢状态，只形 成少量的代谢产物，可减少其它成分对转化产物的分离提取过程的干扰。因而， 本研究以其作为转化体系，利用静息细胞转化法进行转化反应。 本研究采用微生物转化与化学合成相结合的方法，探索了有效利用微生物 细胞内高效专一的酶解决制备药物米格列醇及其同系物中间体关键步骤的一些 难题，并得到了有显著降血糖作用的a 葡萄糖苷酶抑制剂米格列醇和n 甲基1 一脱氧野尻霉素的关键中间体。近年来，在欧洲一些国家用于临床治疗i l 型糖尿 病的药物米格列醇，显示出其降血糖效果显著、副作用小等特点，已得到广泛的 认可，但尚未进入国内市场。如何以快速简便的方法制备和分析药物米格列醇是 我国米格列醇新药开发的一个急需解决的问题。本研究所建立的米格列醇及其同 系物的关键中间体的制备及分析方法，为我国米格列醇新药开发的前期工作奠定 了基础。 1 3 3 化学合成法 在化学合成中通常是先得到1 脱氧野尻霉素，再将其修饰后引入不同的取代 基，以获得所需的目的产物。1 。脱氧野尻霉素分子中具有4 个手性中心，推测与 其相关的立体异构体多达1 5 种，所以在合成中控制其绝对和相对立体构型十分 重要，关键中间体1 脱氧野尻霉素的制备有多种方法。典型方法有 6 - 9 1 ：以l 山梨糖或d 葡萄糖为起始原料的化学合成方法，该法中为提高产率，尽量引入 较少的保护基团，常采用叠氮化合物取代引入氮原子，并经过立体选择性氢化引 入第四个手性中心，该合成方法收率可达5 1 。以非葡萄糖、非山梨糖为原料的 化学合成方法，先经6 步反应得到七元环内酯，在此基础上再经一系列反应可得 到n 羟乙基1 脱氧野尻霉素。以d 甘露醇为原料，经双环氧化合成，得到1 脱氧野尻霉素，再经多步反应可得产物。 5 西北大学硕+ 学f 节论文 1 4 氧化葡萄糖酸杆菌研究现状 氧化葡萄糖酸杆菌( g l u c o n o b a c 纪ro x y d a n s ) 是_ - - 种专性好氧的g 菌1 1 5 】，属于 醋酸杆菌科似c e 幻蚰c 耙r 盘c e 口e ) 。在麦芽汁琼脂和酵母膏葡萄糖琼脂上的菌落呈圆 形，乳白到微黄色，有时中央变褐或周围带黄色。在酵母膏葡萄糖酸琼脂上生长 良好，形成或不形成5 酮基葡萄糖钙结晶。在含酵母膏、乙醇、c a c 0 3 的琼脂上 生长良好，并产生乙酸，溶解c a c 0 3 ，平板上呈透明圆圈。他们通常生长在加有 酵母膏或酪蛋白胨，含糖量或多羟基化合物很高的培养基中，这种菌也可以生长 在没有氨基酸而以铵离子为氮源的完全培养基内。然而大多数菌株能生长在 p h 3 7 以下。葡萄糖酸氧化杆菌能够在p h 恒定在2 5 的复合培养基内很好地生 长，其生长最适温度2 5 - 3 0 ，最适p h5 5 - - - 6 0 ，在弱碱性培养基中稍有生 长。该菌生长方式和适应极端培养条件下方面都很特别。这一特性使它成了微生 物工业上的理想菌种。近几年，日本科学家对氧化葡糖酸杆菌中数十种关键酶基 因进行了克隆和测序，并分别在大肠杆菌、醋酸杆菌和氧化葡萄糖杆菌中得到了 表达，构建了几株有发展前景的基因工程菌1 1 8 】。 1 4 1 氧化葡萄糖酸杆菌的特性 1 4 1 1 氧化葡萄糖酸杆菌的不完全氧化底物的特性 需氧的微生物通常把碳源彻底氧化成c 0 2 和h 2 0 ，在碳源的降解过程中， 产生了能量和生物合成所需要的中间代谢产物。只有在特别情况下，底物的氧化 有的是不完全的。( 例如，过量的碳源、不正常的生理状况或者有抑制物) 。相反， 一些微生物甚至在正常的生长条件下，也是不完全氧化底物，该菌有不完全氧化 多种碳水化合物和醇类的能力。几乎有相当量的产品( 醛、酮和有机酸) 完全排 放到培养基中。在大多数情况下，反应是由与呼吸链相连的脱氢酶来催化的。因 为酶的活性中心位于细胞膜的周质空间内，所以底物没有必要运到细胞内，产物 也不用运出来，因此在培养基中能迅速地积累不完全氧化产物，氧化率很高，这 一特性使它成了微生物工业上的理想菌种。已引起广大学者的广泛兴趣。该菌能 以乙醇为底物生产乙酸，产量是很高的，并且对糖的氧化活力更加高，像l 一山 梨糖、6 一氨基一l 一山梨糖，这样的发酵生产，都运用了该菌，其它的重要的产 物还有二羟基丙酮、葡萄糖酸、酮基葡萄糖酸等。 6 西北大学硕士学位论文 1 4 1 2 氧化葡萄糖酸杆菌的生长特性 该菌另一个显著的特点是在特定生长条件下，茵体的生长量是很低的。例如， 在含有1 0 0 r a m 葡萄糖，氮源为限制因子的恒化器内通入1 摩尔0 2 ，才有不到 1 6 9 干细胞生成，菌体的产量是很低的。发酵生产葡萄糖酸氧化杆菌细胞是用含 d 山梨醇的酵母膏盐培养基中进行，也可以用像甘油这样的氧化底物，用d 山 梨醇在3 0 m 3 规模上发酵生产葡萄糖酸氧化杆菌细胞的典型过程，所得菌体量很 低：每升5 9 细胞干重。具有很少的d 山梨醇被葡萄糖酸氧化杆菌用作碳源，大 约9 5 的底物被氧化为山梨糖，并排放在培养基中。相应地，像葡萄糖酸氧化杆 菌这样的不易生长的菌株，通过发酵时，呼吸系统很低，大约0 1 5 左右。像文 献上报道【1 6 1 的那样，进入静息状态的葡萄糖酸氧化杆菌的专一氧化活力最高 1 1 7 , 1 s ，因此，当d 山梨醇底物被用完后，菌体量不再增加时，应把细胞从培养基 中分离出来，冷冻储存。 1 4 1 3 氧化葡萄糖酸杆菌整体细胞作为生物氧化剂的稳定性问题 在静息条件下，葡萄糖酸氧化杆菌的失活限制了它们的再利用，也限制了发 展固定化生物催化剂的可能性。经过一个转化过程，葡萄糖酸氧化杆菌细胞丢失 了大约一半的专一活力1 1 9 】。成功的固定化也妨碍了氧的传递和底物的传递，这样， 就不能满足氧的高需求量和底物的巨大流量。文献中已多次报道了用固定化葡萄 糖酸氧化杆菌细胞氧化d 山梨醇为l 山梨糖的实例 1 9 - 2 2 】。 1 4 2 氧化葡萄糖酸杆菌的代谢 氧化葡萄糖酸杆菌具有巨大的氧化能力。各种多羟基化合物和糖、醇都能被 氧化。b h 2 3 】原理陈述了与初级醇基团相邻的具有d 型构型的两个次级羟基中的 一个反式结构的多羟基化合物被区域选择性地氧化成酮，分子的其余部分的大小 和结构对该菌的氧化能力没有或有很小的影响。所以，从甘油到七醇和八醇具有 不同碳链长度的多羟基化合物被转化为相应的酮。而且，环多醇和化学修饰过的 戊糖醇和己糖醇都能被不完全氧化。【2 4 】不能被葡萄糖酸氧化杆菌氧化的多羟基化 合物的例子很多，虽然这些物质具有适合的b h 型构型，这些物质有d 葡萄糖 的二甲基醛缩醇【2 5 1 、d 甘露糖的二乙基醛缩醇【2 6 1 、d 阿拉伯糖、d 葡萄糖和 d 半乳糖的1 ，1 二乙基二硫代醛缩醇，还有d 邛可拉伯糖的1 ，1 联苄基二硫代醛 7 西北大学硕十学位论文 缩醇【2 7 】，这些结果表明与多羟基化合物的直链氧化有关的还有另外的因素。从d 山梨醇工业化大规模地生产l 山梨糖是合成v c 过程的一部分。工业上生产l 山梨糖是用在d 山梨醇上培养的葡萄糖酸氧化杆菌进行发酵生产的【2 8 1 。然而，n 甲酰基1 氨基1 脱氧d 山梨醇不能以同样的方式被氧化。在酵母膏盐培养基中 加入这一物质，而不加入d 山梨醇时，这一被修饰过的多羟基化合物不能促进葡 萄糖酸氧化杆菌的生长。当使用其他保护基时，得到了同样的结果。当n 甲酰 基1 氨基1 脱氧d 山梨醇混合在一起时，n 甲酰基1 氨基1 脱氧d 山梨醇甚 至抑制葡萄糖酸氧化杆菌的生长。 氧化葡萄糖酸杆菌与其它微生物相比，它的最大的特点就是该菌能不完全氧 化多种碳水化合物、醇类和相关的化合物。资料表明：糖类、醇类和多羟基化合 物的氧化是通过两个途径。在这些菌中发现了两类能够催化脱氢反应的酶系统。 。这两类酶在细胞中位置和作用都是不同的。所谓的直接氧化途径包括糖、多羟基 化合物、脂肪族的和环状的醇类无磷酸化氧化作用，得到几乎同量的氧化产物。 反应是由位于细胞膜与呼吸链相连的脱氢酶催化的。这些酶的活性中心是朝向细 胞的周质空间的。于是用作能量的物质只通过细胞的外层细胞膜，不用运到细胞 内。氧化产品很容易通过革兰氏阴性菌的外层细胞膜的孔道被释放到培养基中。 对于第二类型的酶系。底物需要进入细胞内。这些底物是被依赖n a d p + 的酶催 化氧化的，反应生成的中间代谢产物都被磷酸化，并且进一步通过戊糖磷酸途径 进行的代谢。细胞膜上的脱氢酶负责催化生物技术上重要的底物的氧化。可溶的、 依赖n a d p + 的酶参加生物体合成需要的前体物质的合成。并且在细胞处于静息 状态时，参与维持细胞的形态。 正如上面提到的，一些底物被氧化后，随后又进行磷酸化，相应地，葡萄糖、 葡萄糖酸、果糖、甘油和二羟基丙酮激酶的活力在葡萄糖酸氧化杆菌细胞中进行 了检测。而且对戊糖磷酸途径的酶也进行了鉴定。相反，葡萄糖酸氧化杆菌中明 显没有完整的e m 途径和三羧酸循环途径。大多数早期的研究与基因工程得到的 数据是一致的。对3 0 0 0 个o r f 进行破译后，表明编码戊糖磷酸途径的酶是有的。 这一途径可能是把糖和多羟基化合物的磷酸化合物降解为c 0 2 的主要途径。另 一方面，在葡萄糖酸氧化杆菌基因组中，未发现编码磷酸果糖激酶和琥珀酸脱氢 酶的基因，表明e m 途径没有起作用。柠檬酸循环也是不完全的，只是为生物合 8 西北人学硕十学位论文 成提供一些前体。早期的研究发现在a c e t o b a c t e r 和葡萄糖酸菌中，用e d 途径 合成了纤维素。因此，编码6 一磷酸葡萄糖酸脱水酶。k d p g 醛缩酶等所有蛋白 质的基因在葡萄糖酸氧化杆菌基因组中已被发现。而且机体有一高效的与细胞膜 相连的呼吸链。然而，关于电子传递系统的组成仍是一个问题。有些资料报导葡 萄糖酸氧化杆菌有细胞色素c 和s ，但没有细胞色素d 和a 。而且有证据表明， 在葡萄糖酸氧化杆菌中有a a 3 型的细胞色素氧化酶，相反，m u t s u s h i t a 等研究认 为葡萄糖酸氧化杆菌没有细胞色素c 活力。近年来，对葡萄糖酸菌产生的些氧 化酶已作了鉴定。然而，还没有完全弄清楚代谢途径中的许多酶和反应过程中涉 及的一些蛋白质。葡萄糖氧化杆菌6 2 1 h 基因组的资料将能帮助解决这些矛盾。 总之，对葡萄糖酸茵基因库的分析将有助于阐明新脱氢酶的性质和在目前将 来工业生产上的应用。 1 4 3 氧化葡萄糖酸杆菌的应用 氧化葡萄糖酸杆菌迅速不完全地氧化碳源底物的特性已被广泛利用 2 9 1 。该菌 种的最大优点是对底物区域性的和立体选择性的进行氧化。这一特性已被利用到 生物技术和化学法相结合合成糖衍生物的过程中，如果不用该方法，就必须进行 复杂的化学基团保护才能得到。目前，氧化葡萄糖酸杆菌广泛应用于维生素c ， 1 脱氢野尻霉素，d 葡糖酸，2 羟基丙酮等工业化生产，也是国内外生物合成维 生素c 前体2 酮基l 古龙酸( 2 一k g a ) 的关键菌种，具有非常高的工业价值。 我国科学家发明的二步混菌发酵法生产维生素c 前体化合物2 酮基l 古龙 酸的方法中，氧化葡萄糖杆菌g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s 是重要的产酸菌种，而 s d h ( l - 山梨糖脱氢酶1 是g l u c o n o b a c t e ro x y d a n s 转化山梨糖为2 - k g a 代谢途径 中的关键酶之一【舻3 1 1 ，对该酶的研究是目前维生素c 发酵基础理论研究热点领 域之一。近几年，日本科学家对氧化葡糖酸杆菌中数十种关键酶基因进行了克隆 和测序，并分别在大肠杆菌、醋酸杆菌和氧化葡萄糖杆菌中得到了表达，构建了 几株有发展前景的基因工程菌【5 1 。 1 5 氧化葡萄糖酸杆菌在米格列醇的合成中的应用 1 一脱氧野尻霉素是植物和蛾中的一种自然成分。它的结构与d 一葡萄糖相 似，在碳链的第四个碳原子有相同的立体构型，然而，在六元环中n 原子取代 9 西北人学硕十学位论文 了氧，由于结构的相似性，1 脱氧野尻霉素能够和a 葡萄糖苷酶相互作用，是 这类酶的强抑制剂。这些药品是人体肠道a 葡萄糖苷酶的可逆抑制剂，因此， 能够抑制多聚糖的消化。结果，抑制了葡萄糖的利用，食物吸收以后，抑制了过 高的血糖浓度。米格列醇是( n 羟乙基一1 脱氧野尻霉素) 是n 取代的1 脱氧野 尻霉素的类似物，并具有商用价值。这一新药品是用来治疗无胰岛素依赖的糖尿 病。1 9 8 1 年，k i n a s t 建议用生物技术和化学法相结合合成1 脱氧野尻霉素的想 法引起广泛的兴趣，所示，这一合成途径是根据h u d s o n 在1 9 3 8 提出的利用 葡萄糖酸氧化杆菌具有高效的区域和立体选择性地氧化多羟基化合物得到的。 口葡萄糖苷酶抑制剂的工业化生产是生物技术和化学法相结合应用于大规模生 产上的又一例证。氨基葡萄糖衍生物的生物氧化是1 一脱氧野尻霉素和米格列醇 合成途径中的关键一步。把整个葡萄糖酸氧化杆菌细胞用作催化剂，来区域选择 性的氧化1 氨基1 脱氧d 山梨醇为6 氨基一6 脱氧l 山梨糖。这一生物转化过程 包含了四个化学反应，即d 葡萄糖通过还原氨基化作用生成1 氨基1 脱氧d 山梨醇到6 氨基6 脱氧【广山梨糖通过还原作用形成环，这样就形成了1 脱氧野 尻霉素。这一合成策略与p a e l s e n 提出的最初合成途径相似，都是利用d 葡萄 糖为起始物质，d 葡萄糖在2 ，3 ，4 三个c 原子上具有立体异构体，在c 1 原子 上引入n 原子，c 5 羟基被氧化和通过还原作用形成闭合环。利用葡萄糖酸氧化 杆菌的多羟基脱氢酶的选择性氧化1 氨基1 脱氧d 山梨醇，不用化学保护基团 保护。关于最后立体选择性环的闭合和还原步骤是根据p a u e s e n 的研究得知 的，即微生物氧化产物6 氨基6 脱氧l 山梨酸以哌啶的形式在碱性的溶液中存 在，像硼氢化钠这样的适合的还原剂很容易使之还原，形成1 脱氧野尻霉素。 关于米格列醇的合成是利用了1 氨基1 脱氧d 山梨醇的n 羟乙基衍生物， 氨基多羟基化合物不能被转化为中心代谢的中间代谢物，也不能促进葡萄糖酸氧 化杆菌的生长。于是生物转化用两个过程来进行。第一步，在含d 一山梨醇的培 养基上培养氧化葡萄糖酸杆菌，以产生所需要的菌体，第二步，用葡萄糖酸氧化 杆菌的静息细胞氧化n 羟乙基1 氨基1 脱氧d 山梨醇为相应的【广山梨糖的衍 生物。在这一过程中，必须进行强通风和把p h 调到微酸性。在这样的条件下， 葡萄糖酸氧化杆菌静启、细胞能够彻底氧化d 山梨醇、n 甲酰基1 氨基1 脱氧一d 山梨醇或者其他多羟基化合物。电子从底物转移到氧产生的能量没有完全用到细 1 0 西北大! 学倾十学位论文 胞代谢过程中，产生部分热量。不存在呼吸功能是用悬浮在水中的静息细胞进行 工业化规模的生物转化的先决条件。葡萄糖酸氧化杆菌对单糖的未配对脱氧是 k e i h a n e k 等提出来的。在这样的条件下，在发酵时间不到1 6 小时内用约每 m 3 2 5 k g 干细胞的菌体浓度，每m 3 2 5 0 k g 底物能够被大量氧化。这一专一氧化活 力可达到每g 细胞干重在一小时内氧化5 0 m m o l 的底物。 1 6n 烷基葡糖胺合成工艺进展 n 烷基葡糖胺是合成米格列醇的前体化合物，早在1 9 3 5 年杜邦公司就采用 n i 、c u 或c o 金属载体型催化剂，在葡萄糖与n h 3 、脂肪族伯、仲胺或芳胺存在下， 于8 5 氢压1 3 7 8 m p a 下，制备了葡糖胺及其衍生物【3 2 。3 3 1 。后来，h o l l y 等发现在 使用雷尼镍为催化剂，与液胺反应时，液胺中必须加入3 的水才能得到较高收 率( 5 5 6 ) 及较好的纯度的产物【川。 6 0 年代l o n g 和b o l l e n b a c k 采用经改进后的氨甲醇体系得到了良好的结果， 产品质量均高于以往的方法，反应后粗产品可直接用于其他合成反应。 早在6 0 年代，技术刚改进时所进行的合成实验：在4 5 l 不锈钢釜中，加入 8 7 9 d 葡萄糖，2 l 甲醇，5 0 0 m l 含8 7 9 r a n e yn i 的甲醇溶液。然后立即用足量甲 醇充满反应釜，密闭反应器，以1 0 3 m p a 氢气通过进料管置换出2 5 l 甲醇，釜 内大约剩余8 0 0 m l 甲醇。将反应釜加氢至0 1 7 m p a ，开始搅动，内部冷却管通冷 水。加入8 2 3 9 液氨后，关闭冷却水，氢压调至8 2 6 m p a 。加热至7 4 - 7 7 并保 持5 h ，其间氢压维持在9 6 5 - - - 1 0 3 4 m p a ，使反应完全，然后将反应釜冷至室温 并减压。 9 0 年代后，专家们开始使用在高温高压反应釜中采用在水体系和非水体系 即含羟基溶剂体系两种方法进行试验，得到良好效果，使反应物转化率得到明显 提高。近些年来，业内人士试图将反应条件改为低温低压，以节省成本，研究也 得到了很好的进展，但所需反应时间特别长，给工业生产带来很大的不便。 9 0 年代后，国内外对合成n 烷基葡糖胺的报道多属专利，主要用葡萄糖、 烷基胺、氢气在催化剂的存在下制备。 现在以合成n 甲基葡糖胺为例来说明国外合成n 烷基葡糖胺的方法及工艺 条件【引，该反应可通过两步来完成： 西北大学硕十学位论文 甲胺与葡萄糖的醛基进行加合反应生成葡萄糖亚胺，反应式如下： h o h ， o h h o h ， o h h o h o ho h i - i c h 3 n h 2 一 h ，o 上述反应比较容易进行。加合反应中甲胺与葡萄糖的配比不超过7 ：1 ( 摩 尔比) ，加合过程一般需要0 5 - - - 2 0 h ，时间长短主要取决于反应温度的高低，反 应温度一般小于8 0 。反应原料在羟基溶剂中