（预防兽医学专业论文）人白细胞介素18基因的克隆与表达.pdf

中文摘要 白细胞介素1 8 ( i n t e r 】e u k i n l8 ，1 l 一】8 ) 是一种新发现的具有多种活性的细胞因子，在结构 上与】l 1 相似，在功能上与j l 一1 2 相似，其昂具特征的活性是诱导y 一干扰素( 1 f n 叫) 的产生， 促进t 细胞和自然杀伤( n k ) 细胞的增殖，同时增强n k 细胞的杀伤力，并具有抗肿瘤和抗微 生物感染等多种疾病的作用，这些特性预示l l 1 8 可做为一种治疗因子，因此对该因子的克隆与 表达在实际应用于临床之前有重要的意义。本研究应用现代分子生物学的研究手段和方法研究了 如下内容： 1 人白细胞介素1 8 基因的克隆及序列分析从正常人肝脏组织中提取r n a ，然后反转录成 c d n a ，应用逆转录多聚酶链式反应( r t - p c r ) 技术，自行设计并合成一对特异性引物，成功地 扩增出h i l - 1 8c d n a 基因，并定向插入p g e m - t 载体中，然后经p c r 鉴定及限制性内切酶双酶 切鉴定，鉴定正确的质粒进行序列测定，用d n a s t a r 软件将所测得的序列与原预期基因序列比 较，核苷酸序列基本一致，表明所构建的人白细胞介素1 8 基因序列是正确的。 2 人白细胞介素1 8 基因在大肠杆菌中的表达及其多克隆抗体的制备在获得人白细胞介 素1 8 基因重组质粒p g e m t _ h i l 一1 8 的基础上，成功地构建了重组表达质粒p e t _ 2 8 a h i l 1 8 ，将 阳性重组质粒转化表达受体菌b l 2 ，( 陇3 ) 感受态细胞中，经i p t g 诱导表达，进行表达产物的聚 丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 检测。结果表明，表达的蛋白带位于约2 0k d a 处，h l l 1 8 基 因获得高效表达。表达的蛋白经透析袋电洗脱法纯化后，对獭兔进行常规免疫，应用e l i s a 检 测到较高的多克隆抗体效价( 】：2 5 6 0 0 ) ，表明此蛋白具有良好的免疫原性。w e s 乜m b l o t 结果显 示，利用纯化包涵体制各的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合。 3 人白细胞介素1 8 基因与报告基因p e c f p c l - h l l 1 8 的构建利用r t _ p c r 方法扩增人白 细胞介素1 8 基因片段，克隆至p 0 e m - t 载体，鉴定和测序正确的人白细胞介索1 8 基因亚克隆 入带有绿色荧光蛋白的真核表达载体p e c f p - c 1 的多克隆位点e c 0 ri 和勋fi 之间，成功构建融 合有报告基因的人白细胞介素1 8 基因真核重组表达载体d e c f p 。c l _ h i l 一1 8 。 本研究获得了人白细胞介素1 8 基因、原核表达载体以及融合有报告基因p e c f p - c 1 的真核 表达载体，并且获得了该基因在大肠杆菌中的高效表达。为i l l 8 生物学特性及其应用奠定了基 础。 关键词：人白细胞介素1 8 ；自细胞介素1 8 结合蛋白：克隆；原核表达：细胞因子 a b s t l 翟c t i n t e r l e u k j n 一1 8 ( 1 l - 1 8 ) w a sac y t o k i n e ，i d e m 访e dr e c e n f l y ，j th a sm 锄yb i 0 1 0 9 i c a lf u n c t i o n s 1 l 1 8 j ss t n l c t u 删j yh o m o l o g o u st ol l 一1a n ds h 引sb i o l o 舀c a lp m p e r t i e sw i t hi l 1 2 i l - 1 8p l a y s 柚 i m p o r t a i l tr o l ei ni n d u c i n gt h ep r o d u c o no f i f n ya n dp m m o t i n gt h em u l t i p l i c a t i o no f t 锄dn kc e l l s ， s i m u l t a 工1 e i t yb o o s tu pn kc e l l s e x e c u t i o n ，i l l8a l s op l a y sa ni m p o n a n tr o l ei nh o s td e f e n c ea g a i n s t t u m o ra n di n f e c t i o n s o ，i ti sw o r t h yr e s e a r c h i n gi nf u t u r e t h e s ec h a r a c t e s t i c si n d i c a t ei l - 1 8m a yd o o n ek i n do f t r e 釉e mf h c t o r ，t h i sr e s e a r c ha p p l i c a t i o nm o d e mm o l e c u l a rb i 0 1 0 9 ym e t h o dh a v es t u d i e d 出ef 0 j j o w i n gc o n 衙l t ： c l o i go fh i l ，1 8g e ea n di 协s e q u e c ea n a b ，s i s w i t l lr e f e r e n c et ot h eh u m a ni n t e r l e u k i n - 1 8g e n ei ng e n e b a r 止d a a b a s e ，ap a i ro fd n ap r i m e r s w a sd e s i 印e da n ds y n t l l e s i z e d a4 引b p 舳g m e n tc o n t a j n i n gh i l - 1 8g c n ew a ss u c c e s s f u ya i n p l i n e d b yu s i n gr 1 二p c ra n dt h e nc l o n e di n t op g e m tp l a s m i d ，e i l z y m ed i g e s t e db y 髓o rla n d & ，i i n d i c a t e dt h a tt 1 1 e r ej so n en u c l e o t i d ed i 脏r c n tf 如m 曲ep u b l i s h e dh i l 一1 8c d n as e q u e n c e t h e s e q u e n c ea 1 1 a l y s i si n d i c a t e dt 1 1 砒i nt 1 1 es c q u e n c eo fp g e m t - h i l - 18c o n 诅i n sa 廿1 ec o d i n gs e q u e n c e f o rm a t u r ep r 0 e no f h i l - 18 e i p r e 鳃i o no f h 几一1 8g 蛐ei ne c n 盱a dp n 呻n 6 帆0 f 瓶叠n t i b o d y r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i dp e t 2 8 a - | l i l - 18w a sc o n s t n l c t e d a c c o r d i n gt or e c o m b i n 删 p l a s m i d p g e m t - h i l - 1 8 t h e n t h er e c o m b i n a n t w a s 仃a n s f o h l l e d i n t o t h e h o s t e c 。疗s 仃a i n b l 2 1 ( d e 3 ) ， 柚dl h e nj n d u c e db yi p t ga t3 7 ，s d s - p a g es h o w e dt h a tt l l er e c 0 埘由i n 觚tp m t c i nh a dam o l e c u l a r w e i g h ta p p r o x i m a t e l yt o2 0k d a ，t h er e c o m b i n a mh i l - 1 8w a se x p r e s s e de f f i c i e n t l yi nf o n i lo f i n c l u s i o nb o d yw t 1 1t 1 1 ey i e l d ，a c c o u n 蛀n gf o r4 0 o ft d t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s t h ei n c l u s i o nb o d yw a s d e n a c u r e db y8 m o l 几u r e a a 船rp f i e d b ye i e c n 佻1 u t j o ni nd i a l y s i sb a g s ，t h eh i l - 1 8p r o t e i nw a su s e d t oi n d u c et h ep r o d u c t i o no fp o l y c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tr a b b 洒a n de l i s ad e t e c t i o ns h o w e dt h e a 1 1 t i g e n i c i 母o ft h eh l l - 1 8p r o t e i nw a ssa t j s f 砬t o r 弘w e s t e mb l o ts h o w e dt l l a tt h ea n t i s e n l mr a i s e d a g a i n s tt 1 1 er e c o m b i n 锄tp r o t e i ni nr a b b j t sc o u l dr e a c tt ot h ep r o t e i ne x p r e s s e ds p e c m c a y t h ec o n s t 讯c t i o no f h i i 广1 8 炉ea n d 代p o n e r 妒n ep e c f p - c l _ h i l l 8 n eh i l 一1 8g e n e w a sc l o n e da n d t h ec l o n ev e c t o r p g e m - t h i l 1 8 w a sc o n s t n l c t e d a n d t i i e n t l l e h i l 一1 8g e n ew a ss u b c l o n e di n t ot h em u l t i c l o n es 沁so ff e p o n e rg e n ep e c f p c e t w e e nt h es t e so f 髓d r ia f l d 曲，it oc o n s t r u c t t h ee u k a r y o t i ce x p r e s s j o n v e c t o r o f h l l - 1 8g e n e w i t hr e p o r t e r g e n e ，eo b t a i n e dh i l - 1 8g e n e ，c o n s t r u c t e dp e t 2 8 a - h i l 1 8a n dp e c f p c l h 。1 8 a n dh l l 1 8w a s e x p r e s s e di ne 疗o u rr e s u l t sl a i das o l i df o u n d a t i o na l dp r e p a r e de x p c m e n t a im a t e r i a lf o rt h e f u t u wo f b j o a c t m t yo f i l 一1 8 1 畸w o r d s ：h i l 一1 8 ；l l - 1 8 bp ；c l o n i n g ；p m k a i y o t j ce x p r e s s i o n ；c ”o k n e 英文缩写词表 i l i o p d o n h o p h e n y l e n e - d l 啪i n e 邻苯二胺 p b s p h o s d h a t eb u f f 酐e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 p b m cp e r i d h e 川b 1 0 0 dm o n o n u c l e a rc e l l s外周血单核细胞 p c r p o l y m e m ec h a i nr c 积i o n 聚台酶链反成 p g e 2 p r o 咖g l 卸d i ne 2 前列腺素e 2 r p m r c v o l u t j o n 3p e rm i n u t e每分钟转数 r t r e v e r s e 忙a i l s c 打口t a s e反转录 r 1 ：p c r r e v e r s e 仃a n s c r i p t i 衄p o l y m e r a s ec h a i nr e a c “o n 反转录聚合酶链反应 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 卜二二烷基硫酸钠 s d s p a g es d sp o l y a c r y l a m j d eg e ie i e c t r o p h o r e s j ss d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 t e丁r j s - e d t a n a c jb u 仃e r t s e d t a - n a c i 缓冲液 t g f - pt r 锄s f o t l t l i “g 铲o hf a c t o rb e t a转化生长因子p t n ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子 t e m e d n ，n ，n ，n - t e l r a m e i h y le t l l y i e n e d i 蜘i l l e n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 t n f1 h m o rn c c m s i sf a n o r 肿瘤坏死因子 州s t r i s ( h y d r o x y m 曲y 1 ) 哪i n o m e n l 粕e三羟甲基氨基甲烷 独创性声明 ￥8 8 2 7 2 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八一农垦大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：乡山丽两 时问： 矗胛z 年月，# 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解黑龙江八一农垦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八一农垦大学可以用不同方式 在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签 导师签名 名：钇历而 ：诊士多套 时间：帅z年；月，多日 时间：砌易年彳月r 角 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 引言 引言 自1 9 5 7 年1 s a a c s 和l j n d a i l m a n n 发现干扰素以来。许多新的细胞因子随后被不断发现。1 9 7 4 年，s t a i 】j e vc o h e n 首次创立了“细胞因子”的概念，此后为免疫学和生物医学界所，1 泛承认和 使用。自细胞介素1 8 ( i n c e r l e u k i n ) ，是近年发现的前炎症细胞因子( p r o l n n a m m a l o f yc y t o k i n e ) ，最 初被命名为l f n 吖诱导因子( j g l f ) 。】9 9 6 年，曰本研究者u s h i o 等从正常人肝细胞c d n a 文库 得到人i g i f 基因克隆，将其正式命名为l l 1 8 。 细胞因子是由多种细胞产生的一类能够调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症发生和 创伤愈合的激素样( 微量而高效) 可溶性多肽类物质。根据细胞因子的生物活性。大致可将其分 为两类；一类为经典的细胞因子，包括淋巴毒素( i j ) 、肿瘤坏死因子( t m n o rn e c r o s j sf k t o r ， t f n ) 和干扰素( i m e r f e r o f l ，i f n 等：另一类为对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子， 其代表为自细胞介素( i n t e r l e u k j n ，1 l ) 和集落刺激因子( c 0 1 0 n ys t i m u l a t j n gf a c t o r ，c s f 等，其 作用是以调节免疫应答为主；此外，还有多肽生长因子，如表皮生长因子、血小板衍生因子、成 纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子等，这些多肽生长因子类细胞因子的主要功 能是促进细胞增殖，与免疫调节的关系较小。 研究发现，大多数细胞因子是免疫细胞间相互作用的调节信号，在细胞免疫和体液免疫的传 入和传出支中都起重要作用。在传入支中活化淋巴细胞，调整淋巴细胞和其它细胞的生长和分化， 以增强或抑制免疫应答：在传出支中能增强炎症细胞和非炎症细胞的代谢和功能。因此，细胞因 子既显示了调节淋巴细胞的功能，又能增强炎症细胞排除异物的活性。细胞因子在机体内除了可 以单独发挥作用外，更重要的是通过细胞因子间的相互诱生，以及产生的生物学效应间的相互影 响，构成了一个巨大的细胞因子网络系统，在免疫应答中发挥着重要作用。 细胞因子的发现和研究在经历了细胞生物学时期和蛋白质化学时期之后，随着分子生物学技 术的e 速发展，细胞因子前研究己取得了很大进步。研究者们不仅克隆到多种细胞因子的基因， 而且还得到大量高纯度的重组细胞因子蛋白，从而为细胞因子的进一步研究和应用提供了有利条 件。由丁细胞因子含量极微，用常规方法难以制各及纯化，难以获得足够的数量和纯度，而分子 生物学技术将细胞因子研究引向了黄金时代，通过克隆各种细胞因子的基因，人们可以获得高纯 度的重组细胞因子。虽然对细胞因子在体外的效应进行了大量的研究，积累了丰富的经验和知识， 但对各神纽胞因子在生物体内的生物学特性了解甚少，为了深入解决这些阃题，科学家们正在不 懈地努力，应用重组细胞因子、特异性细胞因子的单克隆抗体、转基因动物表达的细胞因子以及 缺乏特异性细胞因子的动物和基因剔除等技术进行研究。因此，发现新的细胞因子的结构与生物 学功能以及探讨细胞因子的应用便成为研究细胞闲子的重点。 迄今为止，科学家们己从各自的研究领域描绘出了一百多种细胞因子。据不完全统计，目前 已被基因克隆成功的细胞因子分别有：人和啮齿动物3 6 种，牛2 3 种，羊2 0 种，猪1 9 种，猫和马1 1 种，禽1 6 种，鱼4 种。由于i l 一1 8 作为种具有多种免疫学功能的细胞因子，自发现以来，研究者 f j 一直对它进行着不懈的研究，并取得了显著的成果。目前多种动物的i l 1 8 基因己成功克隆并 表达，其中人和小鼠i l 1 8 的分子结构、信号转导、生物学功能等特性已初步确定，在人类医学 中，j l j 8 可作为治疗剂直接应用于多种疾病的治疗或作为免疫佐剂在疾病的预防中发挥作崩， 尤其是在抗肿瘤免疫方面具有重要的潜在应用价值。日前，利用基因工程技术方法生产有活性的 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文 引言 细胞因子，用丁二治疗或预防疾病己深入开展。在国内外，i l 2 、干扰素( 1 f n ) 、粒细胞巨噬细胞 一集落刺激因子( g m c s f ) 和红细胞生成素( e p o ) 等细胞因子的基因工程产品已获准生产和 上市，用于感染性疾病、肿瘤、器官移植、血细胞减少症、超敏反应和自身免疫病的治疗。宋文 纲，陈宪锐等”1 通过实验表明l l 18 能够促进c d 4t 细胞、c t l 和n k 细胞的活化，也有助于t h l 型 细胞因子的分泌，从而促进树突状细胞( d e n d f n i cc e l l s ，d c ) 融合瘤茁的抗肿瘤免疫效应，明显 延缓肿瘤生长。 本研究依据g e n b a n k 中h i l 1 8 基因，设计一对特异引物，r t - p c r 扩增、克隆h i l 1 8 基因， 并构建h i l 1 8 基因的原核和真核重组表达质粒，为研究重组h i l - 1 8 的生物学活性和分子佐剂的 应用奠定了基础。 2 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第章白细胞介素1 8 发其结合蛋白研究进展 第一章白细胞介素1 8 及其结合蛋白研究进展 1 1 白细胞介素1 8 研究概况 1 1 - li l 1 8 的发现与分布 h y o g o 医学院细菌系o k 锄u m 等”。1 9 9 5 年对感染疮疱棒状杆菌( p m p j o n i b a c t e r i na c n e s ) 小鼠 肝脏提取物用脂多糖( l p s ) 加强刺激，可诱导出使i f n l 高水平表达的因子。最初把该因子称作 i f n 叫诱导因子( i g l f ) 。日本研究学者u s h i o 等1 9 9 6 年用小鼠i g i fc d n a 作探针，从正常人肝 细胞c d n a 文库得到人i g i f 基因克隆，此种i g i f 结构类似于i l 1 家族，其氨基酸序列与t l - l a ， l l 1 b 有同源性，最初有学者建议将i g i f 命名为l l 一】y ，但进一步研究发现其生物学作用在很多 方面与i l 1 均不同，且缺乏与i l 1 受体结合的证据，因此将i g l f 命名为i l 1 8 。 l l 1 8 最初是在中毒性体克小鼠的肝脏中获得的，以后的研究发现它主要由活化的单核巨噬 细胞产生，属于单核因子( m o n o k i n e s ) ，但它在其它组织和细胞中也广泛表达，如枯否氏细胞、 t 细胞、b 细胞、树突状细胞、成骨细胞、角质细胞、小肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、肾上 腺皮质细胞、星型细胞和神经小胶质细胞“”。在成年大鼠的脑中也发现有i l 1 8 和i l 1 8 r 存 在”。许多组织中可表达i g i fm r n a ，胰腺、肾脏、骨骼肌中i l 1 8m r n a 含最丰富，在肝、肺 组织中也有发现。鼠的l l 1 8 由鼠肝脏的巨噬样细胞产生。通过r t - p c r 发现4 0 个不同的人类 细胞系表达i l 1 8m r n a ，在单核一巨噬细胞中高度表达，而在t 、b 细胞很少或几乎不表达，说 明人类1 l 1 8 象鼠的i l 】8 一样，也主要由巨噬样细胞产生。此外，大量研究得出，角化细胞也 是i l 1 8 的一个重要来源”1 。由此说明i l 1 8 可能是一种在免疫系统与内分泌系统和神经系统 的互相联系间发挥着重要作用的神经免疫调节因予。恧且与1 0 1 8 不同，在瓤鲜分离的正常人外 周血单个核细胞( p b m c ) 中已有l l 】8 m r n a 的表达”。，说明其在正常生理情况下就具有免疫 调节功能。 1 1 2i 卜1 8 的分子结构特征 鼠1 l 一1 8 ( m l l 1 9 ) 前体蛋白由1 9 2 个氨基酸组成，n 末端有一 结构特殊的3 5 个氨基酸组成的信号序列，无n 端糖基化位点，没 有亲水信号肽。成熟蛋白由15 7 个氮基酸组成，分子量1 8 3 k d ， 等电点p i = 4 9 ”1 。人白介素18 ( h i l l8 ) 基因编码l9 3 个氨基酸前体 蛋白，与m 1 l 1 8 有6 5 同源性，n 端也有类似的信号序列，亦无 n 端糖基化位点和亲水信号肽位点。其n 端有3 6 个氮基酸前导序 列，在i l 一1 d 转换酶( i c e ) 酶切下，成为含1 5 7 个氨基酸残基的成 熟有活性的蛋向，分子量为1 8 k d ”1 。m 1 l 1 8c d n a 是从内毒素休 克小鼠肝脏中克隆获得，用它作为探针，从人肝细胞c d n a 文库 图1 1 h i i ，1 8 结构图 中克隆出h l l 一1 8 c d n a ，测序证实二肴闻至少有6 5 镌同渌洼。它 f i g l ls t 帆t u f c0 f h i l 1 8bd l 们的核苗酸序列均为l l k b ，与l l 1 8m r n a 完全匹配。 已有的研究发现证明【l 1 8 属于l l 一1 家族成员。h i l 1 8 和! n i l 1 8 均具有i l 1 特征样结构 f x ( 1 2 ) f x s - x ( 6 ) f l ( x 表示任意氨基酸，阿拉伯数字表示氨基酸的个数) 。与i l 1 家 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章白纲胞介素1 8 及其结合蛋白研究进展 族相似，i l 1 8 包含1 2 个b 折叠链形成的三叶型p 折叠。此外，己证实i l 一1 8 首先是以无活性的 前体分子形式被合成，i l - 1 8 前体分子与i l - l b 前体一样都缺乏典型的信号肽，需要在c a s p a s e - 1 ( 以前称i l 1 b 转换酶) 的切割作用f 去除其前导序列后才可变为有活性的成熟形式“”1 。现已 克隆到多种动物i l 1 8 的c d n a 。如小鼠l l 1 8 基因片段大小为5 8 0 b p “，s p f 鸡i l 1 8 基因序列 全长5 0 0 b p n ”，犬脾细胞l l 1 8 基因序列全长6 8 6 b p 1 ，猪i l 1 8 基因序列全k5 7 9 b p 等。 1 1 3i l 1 3 受体与信号转导 l l - 1 8 r 是由连接链j l 1 8 r n ( i l 1 8 r r p ) 和信号链1 l 1 8 r p ( a c p l ) 组成，属于i l - l r 家族。1 9 9 7 年t 0 r i 9 0 e 等采用针对人何杰金病细胞系l 4 2 8 的抗体纯化到一种分子量为6 0 1 0 0k d a 的蛋白。序 列比较发现，其氨基酸序列与以往发现的i l 1 受体相关蛋白( i n t e r l e u k i n 1r e c e p t o rr e l a l e d p m t e i n ， i l 1 i 却) 的同源性为l o o 。用i l 一1 r 叩c d n a 转染c o s - 1 细胞并表达后，i l - 1 8 能与之结合并诱导 核转录因子1 c b ( n u c l e a r f a c l 0 卜k b ，n f k b ) 活化。抗i l 一1 r r p 的抗体可以抑制i l 1 8 活化，提示i l 1 鼢p 是i l 一1 8 r 的配体结合部分。然而，受体结合分析发现，i l 1 8 与l 4 2 8 细胞表面受体相结合的解离 常数( i ( d 值) 明显低于一般的具有生物活性细胞因子的k d 值”“，由此推断i l 1 8 r 复合物中还应另 有其它结台链的存在，以确保i l 1 8 r 形成细胞因子受体信号特征性的高亲和力复台物。 b o m 等应用探针从小鼠e l 4 6 1 细胞系的c d n a 文库中，筛选到一条全长c d n a 序列。对该 序列的开放读码框进行分析发现，该序列为i l 1 r 家族成员。由于该蛋白与i l 】受体辅助蛋白 ( i n t e r i e u l ( i n - 1r e p t o ra c c e s s o r yp r o l e i n ，i l 一1ra c p ) 具有同源性，因此将其命名为辅助蛋白样 ( a c c e s s o r yp m t e i n 。1 i k e ，a c p l ) 蛋白。与i l 1 ra c p 相似，a c p l 不能与i l 1 8 结合，但其表达是 i l 1 8 诱导n f 一心和c j u nn 末端激酶活化时必需的，缺乏胞浆结构域的a c p l 突变体可特异性 的阻断i l 1 8 的信号转导。a c p l 虽然不与l l 1 8 结合，但却能与j l 1 8 和i l 1 r r p 形成的复合物 结合。l l - l r 师与a c p l 可能形成一种异二聚体，此异二聚体可能对i l 1 8 具有高亲和性”“。由 于人们通常把组成复杂形式受体的配体结合部分分别称为n 链和d 链，故将i l 1 i u p 与a c p l 分 别命名为i l 一1 8 r d 与i l 1 8 r b 。 i l - 1 8 - j l 1 8 r 系统和i l 1 i l 1 r 系统有相似性。l l 1 p 转化酶( i l 1 pc o n v e r t i n ge n 巧m e ，i c e ) 分别作用于m l l 1 8 和h i l 1 8 前体n 端第3 5 位a s p 和第3 6 位a s n 位点，使其裂解为1 5 7 个氨基酸的活性多肽，形成成熟的i l 1 8 。由此表明i l 1 8 与i l 1 的结构和加工酶相似，进一步 提示它们来源于共同的祖先。 l l - 1 8 r 在许多细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、n k 细胞、内皮细胞、平滑肌细胞中表达。 i l 1 2 上调i l - 1 8 r 复合物在裸t 细胞、t 辅助细胞、t h l 细胞和b 细胞中的表达。研究表 明i l 一1 8 r 只在极化的t h l 细胞上高水平表达，而在t h 2 细胞上则不表达。因此，i l 1 8 r 可以作为 区分t h l 细胞和t h 2 细胞的有效表面标志。现已发现小鼠体内很多组织都可表达l l 1 8 r 的m r n a ， 如胸腺、脾、肝、肺、小肠、结肠、胎盘、前列腺、心脏等。i l 1 8 r n 在卵巢和睾丸中也有微量 表达，但在大脑、肾、骨骼肌和胰腺中却没有发现i l 1 8 r n m r n a 表达”“。因此。l l 1 8 r m r n a 的表达虽然很广泛，但并不是普遍表达。至今还不明确究竟有哪些类型细胞可表达l l 】8 r ，并且 在这些可表达l l - 1 8 r m r n a 的组织中i l 1 表达的调节机制仍不明确。 a c p l 为蛙近发现的l l 1 8 r 复合物的新的亚单位，为介导i l 1 8 信号转导所必需，也是i l 1 r 家族中的成员之一。目前己知，1 l l r 家族包括：i 型i l 1 r 、l i 型i l 1 r 、l l 1 r 辅助蛋白 ( 1 l l r a c p ) 、i l - 1 r 印及t 1 s t 2 等。其。pi 型i l 一1 r 及i i 型1 l 1 r 均能与i l 。l 、i l 一1 b 及 4 黑此江八一农垦大学硕士学位论文第一章白细胞介素1 8 及其结台蛋白研究进展 i l _ i r d 结合：i i 型l l l r 缺乏胞浆结构域，使其成为一种“诱捕”( d e c o y ) 受体，具有下调r l - 】 反应的作_ ； j 。i l 1 的信号转导需要i 型i l 1 r 和l l 1 r a c p 的共同表达。研究发现，i l 一1 r a c p 不与i l 1 直接结合，但其能增加i l 1 r 与i l - l 的亲和性，i l 1 r a c p 还与募集( r e c m i t ) l l - 1 r 激活的激酶( 1 r a k ) 有关。i l 1 r 坤和t 1 s t 2 不与i l 一1 结合，但当其胞浆结构域与i l 一1 r 细 胞外及跨膜区嵌合表达于细胞表面时，能对1 l 1 的刺激产生反应。有趣的是，i 型i l 1 r 、i i 型 l l 1 r 、i l 】r 邛及t 1 ，s t 2 均定位于2 号染色体，提示这些受体可能来源丁共同的祖先基因。 图1 2i l 1 8 分子主要调制器 f i g i2 d o m i n a n ts o l u b i e m o d u i a l o r s o f i n d i v i d u a i i l 一1 8 m o i e c u l e s 1 1 4i i 广1 8 生物学作用 研究发现，大多数细胞因子是免疫细胞间相互作用的调节信号，在细胞免疫和体液免疫的传 入和传出支中都起重要作用，在传入支中活化淋巴细胞，调整淋巴细胞和其它细胞的生长和分化， 以增强或抑制免疫应答；在传出支中能增强炎症细胞和非炎症细胞的代谢和功能。因此，细胞因 子既显示了调节淋巴细胞的功能，义能增强炎症细胞排除异物的活性。i l 1 8 作为种细胞因子 同样也具有许多重要的生物学作用。 1 1 4 1 诱导i f n 叫的产生 细菌脂多糖( l p s ) 能诱导动物体内产生i l 1 8 i l 1 2 ，诱生大量l f n 叫。1 9 8 7 年o k u m 发现 分枝杆菌b c g 感染的小鼠经l p s 处理_ j 亓，其血清加入i l 一2 培养，可诱导正常小鼠脾细胞产生l f n y l p s 和i l 一2 均可诱导痤疮丙酸菌预处理的小鼠腹腔渗出液产生i f n - 丫。1 9 8 9 年n a i ( a m u r a 发现牛加入 抗l l - 2 r 单抗可抑制该血清诱导产生i f n y ，以上结果均表明存在一种血清可溶性物质，该物质在 不含巨噬细胞的脾细胞培养中联台i l 一2 麸同诱导i f n 叫产生，这就是最早鉴定的m 1 8 。 t 酞a m a s a ”“等实验表明李氏杆菌o ( l l o ) 诱导的鼠脾细胞也可产生i f n 叫。l l o 是李氏菌 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章白细胞介素1 8 及其结台蛋白研究进展 属单核细胞基因细胞溶解性毒力囡子，i l 一1 8 和i l 1 2 诱导巨噬细胞、n k 细胞产生i f n 丫，l l o 不仅可作为一种细菌毒力网子，还可以作为一种细菌组件在寄主免疫中发挥作用。 i l 一1 8 可诱导外周血单核细胞( p b m c s ) 产生l f n 叫。hs h i k o 川等在1 2 位健康者和2 6 位 特异反廊型病人实验中发现：i l 1 8 或i l 1 2 刺激其p b m c s 在不同的血清i g e 水平产生一种细胞 因子即1 f n y ，并发现l l 一1 8 ( 或i l 1 2 ) 刺激病人p b m c s 产生i f n y 是通过不同的信号传导途 径发挥作用。 1 1 4 2 与i l i 2 的仂同作用 i l 1 2 和i l 1 8 协调作用下，可诱导多种细胞分泌i f n 叫，在疾病治疗方面起一定作用。 o t a n j ”等人研究了诱导i f n 叶产生的不同的淋巴器官和组织，发现在c 5 7 b l 恬鼠的实验中， i l 1 8 和i l 1 2 主要诱导肝脏n k l l + 、c d 矿、c d 8 + 细胞及脾c d 3 + 细胞产生i f n 吖，并首次表明 了i l 1 8 ，i l 】2 诱导产生i f n 叫在表型水平对肿瘤、变态反应和传染性疾病中的治疗机制。 c h i k a n o ”“等研究发现；i l 1 8 与i l 】2 协同诱导产生的j f n 叫可导致b a l b c 鼠的肠膜炎症和脂 肪肝。y o s h i m o t o i ”1 等人报道，i l 1 8 与i l 1 2 联合应用能诱导c d 4 0 活化的b 细胞生成i f n 吖， 从而抑制i l 一1 4 依赖性i g e 和l g g l 的生成，并能在不抑制b 细胞增殖的条件下促进i g g 2 t 的生 成。将i l 1 8 和i l 1 2 混合液注入抗i g d 免疫的小鼠，能诱导i f n 吖生成，抑制i 西的生成，而 且活化的b 细胞所分泌的l f n 吖在体内、外对i g g l 、i g g 2 t 及i g e 的调节反应不同。此外，l p s 刺激巨噬细胞产生i l - 1 2 和i l 1 8 ，在体内通过c d 3 抗l l l 2 r b t 细胞抑制i g e 的生成。因此i l 1 8 在抗寄生虫、抗超敏反应中具有潜在的应用价值。n a k a n i s h p 。等研究发现，i l - 1 2 单独应用时有 一定的抗小鼠黑色素瘤效果，i l 1 8 单独应用时抗瘤效果不明显，但将i l 1 2 和i l 1 8 合并应用 时，其抗小鼠黑色素瘤的作用显著提高，说明i l 1 2 和i l ，1 8 具有显著的协同作用。 1 1 4 3 对t 细胞的增殖作用 o k a i i l u r a ”“报道，i l 1 8 可能参与n l 细胞的发育，同时能增强脾t 细胞的增殖。1 l 1 8 使经 抗c d 3 单抗刺激后的人富集t 细胞增殖的程度较仅用抗c d 3 单抗不用l l 1 8 刺激的t 细胞增殖 相对较多，且呈荆量依赖关系中和抗i l - 2 抗体完全抑制低浓度i l ，1 8 诱导的t 细胞增殖，但 不能完全阻断高浓度i l - 1 8 诱导的t 细胞增殖。i l 1 8 增强经刺激后t 细胞增殖的同时，也提高 了培养t 细胞中l l 2 的含量，而且i l 1 8 使t 细胞表达c d 2 5 的百分比达到最大。作为对照的 多克隆抗i f n 吖抗体不能明显抑制i l 1 8 诱导的t 细胞增殖，提示l l 1 8 利用i l - 2 促进t 细胞增 殖。 有实验表明4 ，i l 1 8 对t h l 和1 h 2 细胞的作用机制是不同的。用i l 1 2 预刺激的t 细胞 能持续表达t l 1 8 rm r n a ，然而当t 细胞进一步分化为t h l 和t h 2 ，在抗c d 3 和i l 1 2 的刺激 下只有t h l 细胞表达i l - 1 8 rm r n a ，h 2 细胞不能表达i l ，1 8 rm r n a ，也不能诱导i l 1 8 产生 l f n - v 。 1 1 4 4 增强t h l 细胞及对n k 细胞的细胞毒活性 t 0 m u r a ”“等发现i l 1 8 与其它细胞因子( 如l l 2 或i l 1 2 ) 协i 司作用可促进n k 细胞的增殖。 1 l 1 8 还可通过不同的途径促进n k 细胞的杀伤作用。 n k 细胞，不同于t 、b 免疫效廊淋巴细胞，可存在于许多器官如肝脏。t s u l s u i 1 等通过实 验建立了b a l b c 裸鼠肝淋巴细胞的l l 一2 依赖性n k 细胞克隆并进行孵育，这些克隆的n k 细胞 通过断裂的d n a 表达f a s l 并特异性杀伤f a s 激活的靶细胞。实验结果表明这f a s ，f a s l 介导 6 黑龙江八一农垦大学硕士学位论文第一章白细胞介素1 8 及其结合蛋白研究进展 的杀伤作用是由枯否氏细胞产生的细胞因子i l - 1 8 起作用的，而不是枯否氏细胞产生的其它细胞 因子i l 1 2 ，i l 一1 b 和t n f - n 起作用。 l l 1 8 可呈剂量依赖性提高脾n k 细胞的活性，与1 l 一1 2 共刺激可进一步提高这一作用。 y a s u l ( oh 等研究了i l ，1 8 增强n k 细胞杀伤活性的分子机制，是通过增强穿孔素介导的n k 细 胞的细胞毒作用。i l 一1 8 r 在s c l d 鼠脾细瞧表达，这种鼠缺少t 细胞、b 细胞，但有完整的n k 细胞，从联合免疫缺陷鼠( s e v e r ec o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c ym i c e ，s c i d ) 鼠脾细胞分离的n k 细胞 表面表达i l 1 8 r ，i l 1 8 不能提高穿孔素m r n a 表达，然而伴刀豆蛋白a 预处理的鼠脾细胞完 全抑制i l 1 8 对n k 细胞活性的增强作用，说明i l 1 8 不能增强穿孔素缺陷鼠脾细胞n k 活性。 i l 1 8 能增强t h i 细胞上功能性胁l 的表达，选择性的扩增胁l 介导的t h i 细胞的细胞 毒作用。由巨噬细胞产生的i l 一1 8 在c a s p a s e 1 蛋白酶或l l ，1 b 转化酶( i m e r l e u k j n 1 pc o n v e r t i n g e n z y m e ，t c e ) 作用r 变为有活性的前体蛋白。由i l 一1 8 参与的一个关键的生物反应就是与i l 1 2 协同作用刺激t h l 细胞分化和参与免疫反应。1 l 1 8 在t h l 细胞f a s 配体的上调下可能提高 f 配体表达细胞的凋亡。如图l _ 3 所示。i c e 是一个半胱氨酸蛋白酶，是哺乳类动物促凋亡基 因，i c e 的过度表达可引起细胞凋亡。当i l 1 8 作用于n k 细胞时，n k 细胞