（化学工程专业论文）基于纳米材料的新型生物传感器的研究.pdf

。_ 。一 n o v e lb i o s e n s i n gt e c h n o l o g yb a s e do nn a n o m a t e r i a l s l i ux i a o f e i b s ( s i c h u a nn o r m a lu n i v e r s i t y ) 2 0 0 9 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro f e n g i n e e r i n g c h e m i c a le n g i n e e r i n g i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a n u n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rj i a n gj i a n h u i ，p e n gx i n k a i m a y ，2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 一 作者签名：刘d ，莒日期：7 , 0 1 1 年多月 ；j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 1 保密口，在一年解密后适用本授权书。 2 不保密l l 。 ( 请在以上相应方框内打 ) 作者签名：参，) ，) ，考 导师签名： 日期： 7 , 0 1 1 年多月多，日 日期：伽f f 年r 月 工程硕士学位论文 摘要 纳米材料由于其独特的体积效应、表面效应以及量子尺寸效应，使得纳米材 料在光学、电学、力学、磁学等各方面的性能发生了惊人的变化，已广泛应用于 化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域。化学生物传感器是纳米 材料最有前途的应用领域之一，纳米材料由于特殊的光学、电学和催化特性及良 好的生物相容等性质，可提高传感器的响应性能，目前已成为当前研究的热点。 本文利用碳纳米管和纳米金颗粒两种常见的纳米材料，建立一种新的分析方法或 建立一种新型的传感器。其主要内容如下： ( 1 ) 碳纳米管( c n t s ) 作为理想的准一维纳米材料，以其独一无二的结构具 有导电性强、比表面积大和吸附性强以及易于生物修饰等优点，因而在生物传感 技术领域有着十分广泛的应用。本文利用单壁碳纳米管的荧光淬灭能力，建立了 一种新型的末端保护分析方法。中间标有异硫氰酸荧光素( f i t c ) 末端标有生物素 的d n a 链缠绕在s w c n t 上，f i t c 的荧光猝灭，当e x o i 存在时发生酶切反应， f i t c 的荧光恢复；当溶液中有链霉亲和素存在时，基于生物素与链霉亲和素的特 异性结合，能够阻止酶切反应。这种的末端保护分析方法和一般文献报道的蛋白 质与特定序列的d n a 结合后用于保护分析的方法不同。末端保护分析对d n a 序 列没有要求，可以采用任意序列的单链d n a ，然而文献报道的保护分析方法是蛋 白质必须和特定序列的d n a 结合。因此，这种和d n a 序列无关的末端保护分析 方法有望成为研究小分子和蛋白质相互作用的通用的平台。( 第2 章) ( 2 ) 纳米金作为零维纳米材料，比表面积大，表面自由能高，可在颗粒表面 固定大量的生物识别分子或信号分子，因此纳米金作为生物标记物或者固定生物 分子的优良载体在食品安全、临床诊断和环境监测等领域中应用非常广泛。本文 利用纳米金作为表面增强拉曼( s e r s ) 的活性基底，实现对丙二醛的快速灵敏检测。 相对于传统的紫外、荧光检测方法，该方法具有良好的特异性能排除其他醛类物 质的干扰。另外该方法对丙二醛浓度1 0 0n m 到1 0 0l am 宽范围内都具有良好的 线性响应。( 第3 章) 关键词：碳纳米管；纳米金；末端保护分析；丙二醛；表面增强拉曼光谱 1 a bs t r a c t n a n o m a t e r i a l sb e c a u s eo fi t su n i q u ev o l u m ee f f e c t ，q u a n t u ms i z e ，e x c e l l e n t s u r f a c ee f f e c ta n du n i q u eo p t i c a ls p e c i a l i t y , h u g ec h a n g e sh a v et a k e np l a c ei ni t s e l e c t r i c a l ，m e c h a n i c a l ，o p t i c s ，m a g n e t i c sa n do t h e ra s p e c t s t h e yh a v er e c e i v e dm u c h a t t e n t i o nf o rt h e i rp o t e n t i a lw i d ea p p l i c a t i o n si nt h ef i e l do fc h e m i c a l ，f o o d ，b i o l o g i c a l m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n tm o n i t o r i n g ，m e d i c i n ea n dm i l i t a r y n a n o t e c h n o l o g yo f f e r s u n i q u eo p p o r t u n i t i e sf o rc r e a t i n gh i g h l ys e n s i t i v ei n n o v a t i v eb i o s e n s i n gd e v i c e sa n d u l t r a s e n s i t i v eb i o a s s a y s b i o l o g i c a lc h e m i s t r ya so n eo ft h em o s tp r o m i s i n gf i e l do f a p p l i c a t i o n ，r e s e a r c h a b o u ti th a sb e c o m et h eh o t s p o t t h i sa s s a yu s ec a r b o n n a n o t u b e sa n dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) t w oc o m m o nn a n o m a t e r i a l s ，b u i l d i n ga n e wm e t h o do fa n a l y s i so re s t a b l i s han e wt y p eo fs e n s o r t h ed e t a i l sa r es u m m a r i z e d a sf o l l o w s ： ( 1 ) c a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) a s i d e a lo n e - d i m e n s i o n a ln a n o m a t e r i a l h a v e v a l u a b l ea p p l i c a t i o n si nc h e m i c a lb i o s e n s o r sd u et ol a r g ea s p e c tr a t i o ，e x c e l l e n t e l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t ys p e c i a lb i o l o g i c a la f f i n i t ya n dh i g he l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t y t a k i n ga d v a n t a g e o ft h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ga b i l i t yo fs i n g l e w a l lc a r b o n n a n o t u b e s ( s w c n t ) ，t e r m i n a lp r o t e c t i o no fs m a l l - m o l e c u l e - l i n k e dd n a v i as e l e c t i v e c a r b o nn a n o t u b ea s s e m b l yh a sb e e nc o n s t r u c t e d t h es m a l l - m o l e c u l e l i n k e ds s d n a w i l lb eh y d r o l y z e ds u c c e s s i v e l yi n t om o n o n u c l e o t i d e sf r o mt h e3 7 e n db ye x oi w h e n s s d n ai sb o u n dt ot h e p r o t e i nt a r g e t ( s t r e p t a v i d i n ，s a ) t h r o u g h t h e s m a l l m o l e c u l e ( b i o t i n ，b t ) m o i e t y , e x oif a i l st oc a t a l y z et h es t e p w i s eh y d r o l y s i so f t h es m a l l m o l e c u l e 1 i n k e dd n a ，l e a v i n gt h es s d n ai n t a c t t h i st e r m i n a lp r o t e c t i o n ，i n c o n t r a s tt ot h o s em e d i a t e db yt h ei n t e r a c t i o no fp r o t e i n sw i t hs p e c i f i cd n as e q u e n c e s i ss e q u e n c e i n d e p e n d e n tw i t hn oi n t e r a c t i o nb e t w e e nd n aa n dp r o t e i n s ，b e c a u s ei t m e r e l yi n v o l v e st h eb i n d i n go ft h es m a l lm o l e c u l em o i e t yt oi t sp r o t e i nt a r g e t s ot h i s t e r m i n a lp r o t e c t i o ni se x p e c t e dt oe s t a b l i s hap l a t f o r mf o rt h ei n t e r a c t i o no fs i n a i l m o l e c u l ea n dp r o t e i n ( i nc h a p t e r2 ) ( 2 ) i m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e sw i t hg n p sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n t h e c o n s t r u c t i o no fb i o s e n s o r s d u et ot h e i rl a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e aa n dh i g hs u r f a c e f r e ee n e r g y , e a s yc o n ju g a t i o nc h e m i s t r y , g o o dc o n d u c t i v i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t y ，u s i n g r i 工程硕士学位论文 g n p sa ss u b s t r a t e sf o rb i o m o l e c u l ei m m o b i l i z a t i o nc a ne f f e c t i v e l yr e t a i nt h ea c t i v i t y o fb i o m o l e c u l e s ，e n h a n c ei m m o b i l i z a t i o nr e s u l t s ，i m p r o v et h es t a b i l i t yo fb i o s e n s o r s a n df a c i l i t a t et h ee l e c t r o nt r a n s f e r e f f i c i e n c y f u r t h e r m o r e ，e n o r m o u ss i g n a l a m p l i f i c a t i o nc a na l s ob ea c h i e v e db yl i n k i n gt h eb i o r e c o g n i t i o nu n i tt on a n o p a r t i c l e c a r r y i n gm u l t i p l es i g n a lt r a c e r s i nt h i sw o r k ，w eu s eg n p sa ss e r sa c t i v es u r f a c e ， p r e s e n tt h es t u d yo fs e r sd e t e c t i o no fm d a ，w h i c hi sa l s ob a s e do nt h et b a m d a a d d i t i o n r e a c t i o n c o m p a r e dt r a d i t i o n a l f l u o r e s c e n c ea n d u v - v i s i b l e ( u v - v i s ) s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d s ，t h em a i nf o c u so f t h i ss t u d yi st oe x p l o r et h et b a - m d a s e r ss e n s i t i v i t ya sw e l la si t sm o l e c u l a rs p e c i f i c i t y o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a to u r s e n s o rh a saf a v o r a b l el i n e a rr e l a t i o n s h i pt o w a r dm d a r a n g ef r o m10 0 pmt o10 0n m ( i nc h a p t e r3 ) k e yw o r d s ：c a r b o nn a n o t u b e s ( c n t ) ；g o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) ；t e r m i n a l p r o t e c t i o n ；m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) ； s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n s c a t t e r i n g ( s e r s ) i v 基于纳米材料的新型生物传感器的研究 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论l 1 1 生物传感器概述1 1 1 1 生物传感器的工作原理和特点l 1 1 2 生物传感器的分类2 1 2 纳米生物传感器3 1 2 1 纳米生物传感器类型及特性3 1 3 纳米材料在生物传感器中的应用3 1 3 1 碳纳米管4 1 3 2 纳米金6 1 4 本研究工作构思。1 0 第2 章基于碳纳米管淬灭荧光探针的末端保护分析l l 2 1 前言1 l 2 2 实验部分一1 2 2 2 1 仪器与试剂1 2 2 2 2 制备d n a 修饰的s w n t 1 2 2 2 3p r o b e1 s w n t s 的稳定性13 2 2 4s w n t s 对p r o b el 以及p r o b e2 的淬灭效率1 3 2 2 5 酶切实验1 3 2 3 结果与讨论1 3 2 3 1 基于碳纳米管淬灭荧光的末端保护分析方法1 3 2 3 2p r o b e s w n t s 淬灭效率和稳定性1 4 2 3 3 实验机理验证1 6 2 3 4 荧光各向异性对实验结果进行表征1 7 2 3 5 应用模型体系考察传感器的性能1 8 2 4 小结2 0 第3 章基于表面增强拉曼光谱的m d a 检测2 1 3 1 前言2 l 3 2 实验部分：2 3 v 工程硕士学位论文 3 2 1 试剂与仪器2 3 3 2 2 合成3 0 n m 纳米金颗粒2 3 3 2 3 紫外吸收光谱定性检测纳米金粒径2 3 3 2 4m d a 的表面增强拉曼光谱检测2 3 3 2 5 干扰试验2 4 3 3 结果和讨论2 4 3 3 1 基于表面增强拉曼光谱的m d a 检测2 4 3 3 2 纳米金对实验产物拉曼光谱增强的验证2 5 3 3 3 实验原理的验证2 6 3 3 4 它几种醛类的干扰验证2 8 3 3 5 基于s e r s 的m d a 分析方法的响应特性2 9 3 4 小结31 结论3 3 参考文献3 4 附录a 攻读学位期间发表的学术论文4 l 至炙 谢一4 2 v i 工程硕士学位论文 1 1 生物传感器概述 第1 章绪论 生物传感器概念来源于c l a r k 关于酶电极的描述，关键是传感器的构成中分 子识别元件为具有生物学活性的材料乜1 。目前被广泛接受的概念“生物传感器是一 种精致的分析器件，它结合一种生物或生物衍生的敏感元件与一只理化换能器， 能够产生间断或连续的数字电信号，信号强度与被分析物成比例。 口 生物传感器的发展可以划分为三个阶段： 第一阶段( 2 0 世纪6 0 7 0 年代) 为起步阶段，以c l a r k 酶电极为代表。 第二阶段( 2 0 世纪7 0 年代末8 0 年代) ，大量的学科交叉出现各种不同原理和 技术的生物传感器，尤其是8 0 年代中期是生物传感器发展的第一个高潮时期，其 代表之一是介体酶电极，它不仅开辟了酶电子学的新研究方向，还为酶传感器的 商品化奠定了重要基础。 第三阶段( 2 0 世纪9 0 年代以后) ，有两个象征：一是生物传感器的市场开发获 得显著成绩；二是生物亲和传感器的技术突破，以表面等离子体和生物芯片为代 表，成为生物传感器发展的第二个高潮。 生物传感器作为分析生物技术的一个重要领域，是一个典型的多学科交叉的 产物，结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学及其相关技术，能够对所 需要检测的物质进行快速分析和追踪。生物传感器的出现，是科学家的兴趣和科 学技术发展及社会发展需求多方面驱动的结果，经过3 0 多年的发展，已经成为一 个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创新活力的领域。 1 1 1 生物传感器的工作原理和特点 生物传感器的传感原理如图1 1 表示，其构成包括两部分：生物敏感膜和换能 器( 又称一次仪表) 。被分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生 生物学反应，产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转变成可定量和 可处理的电信号，再经二次仪表( 检测放大器) 放大并输出，便可知道待测物浓 度h 。5 1 。生物敏感膜又称分子识别元件，是生物传感器的关键元件，直接决定传感 器的功能与质量。以生物敏感膜所选材料不同，其组成可以是酶、核酸、免疫物 质、全细胞、组织、细胞器或它们的不同组合。换能器的作用是将各种生物的、 化学的和物理的信息转变为电信号。 基于纳米材料的新型生物传感器的研究 潜 懈嗲 西 西f 地 非 图1 1 生物传感器的工作原理 生物传感器具有以下主要特点： ( 1 ) 多样性。根据生物反应的特异性和多样性，理论上可以制成测定所有生物物 质的酶传感器。 ( 2 ) 操作简便，快速、准确，易于联机。 ( 3 ) 成本远低于大型分析仪器、作用范围广，便于推广普及。 1 1 2 生物传感器的分类 生物传感器分类方法较多且不尽统一，主要有以下二种方法，即分子识别元件 分类法和器件分类法呵1 ，如图1 2 ： j 分子识别 l 元件分类法 1 一一 光生物传愍器 | 热生物传感器 l 声波生物传感器 电导生物传感器 醒件分类法 图1 2 生物传感器的分类 一 噼藩霪谗藩 一 嘞，。撕 工程硕士学位论文 依据生物传感器的特性还有一些其他的分类。如尺寸在微米级甚至更小的生物 传感器称为微型生物传感器、纳米生物传感器，如本文研究的纳米生物传感器具 有重要的意义。 1 2 纳米生物传感器 生命科学和纳米科学是2 l 世纪研究的前沿方向，在生命科学中引入纳米材料 与技术，为生物传感器的研究提供了丰富的发展空间。总的来说，纳米粒子可以 广泛地用于：生物分子标记( 以用于信号的检测和放大) ；生物分子的固定；促进 氧化还原蛋白与电极之间的电子转移；待测物质的富集和浓缩等。碳纳米管和导 电聚合物的微纳米管既可以用于分子的固定，也可以用于纳米器件的设计。生命 科学与纳米科学相结合，在理论研究上，将为医学诊断、环境分析、药物发明与 检验和卫生防疫等提供新的方法和手段。 1 2 1 纳米生物传感器类型及特性 广义地，纳米生物传感器包括4 种类型： ( 1 ) 用纳米材料作为普通生物传感器的标记、辅助信号增强，或生物敏感元件 的载体，如：纳米胶体金、量子点、纳米磁性颗粒、纳米电子传导材料，纳米薄 膜等； ( 2 ) 在宏观基质上制备成纳米结构的换能器，如锥型光导纤维传感器、纳米悬 臂梁等经修饰生物分子成为纳米生物传感器； ( 3 ) 单分子传感器，如分子信标； ( 4 ) 生物体内的各种天然传感器和分子机器( m o l e c u l a rm a c h i n e ) ，它们许多 是纳米级结构，如生物分子马达、d n a 错配修正分子机器等。 纳米生物传感器的一般特性包括：测定所需要的样品量极少，适合于珍贵样品 测定；一般采取分子自组装的办法制备单分子生物敏感层，分子扩散阻力小，传 感器速度快，适合于检测生物分子动力学测定；响应灵敏度很高，结合其他技术 方法，可以实现单分子测定。 1 3 纳米材料在生物传感器中的应用 纳米是一个长度计量单位，1n m 指的是十亿分之一米( 1 0 柚m ) ，纳米材料指 的是颗粒尺寸为1 1 0 0n m 的粒子组成的新型材料。纳米材料由于平均粒径微小、 表面原子多、比表面积大、表面能高，因而其性质既不同于单个原子、分子，又 不同于普通的颗粒材料，显示出独特的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应等 特性阳q 0 1 ，具有许多常规材料不可能具有的性能，包括：表面性能、光学性能、热 性能、磁性能、力学性能和化学性能等，使得相同化学组成的原料可以在加工后 基于纳米材料的新型生物传感器的研究 产生不同的功能。 纳米材料由于其超凡的特性，在生物传感领域展现出引人注目的应用前景 n 卜”1 。纳米技术的介入，提高了生物传感器的检测性能，使得生物传感器的灵敏 度、检测限和响应范围等性能指标得到了很大的提升，并促发了新型的生物传感 器，为生物传感器的发展提供了无穷的想象空间。传感器是纳米材料最有前途的 应用领域之一。纳米材料有很多种分类方法，按照维数可以分为零维材料、一维 材料、二维材料、三维材料n 4 1 。零维材料，空间三维尺度均属于纳米尺度的材料， 如纳米颗粒，原子团簇等；一维材料，指在空间尺度有两维处于纳米尺度的材料， 如纳米管，纳米线；二维材料，指在空间尺度有一维是纳米尺度的材料，如超薄 膜，多层膜等；三维材料，指由零维、一维和二维材料为基本单元构成的块状材 料，其空间尺寸均不在纳米尺度。在应用于生物传感器的纳米材料中，零维和一 维材料占相当重要的地位n 5 。1 6 1 。纳米材料在这些生物传感器中所起的作用主要有 催化作用、电子传导作用、增加响应界面以及作为分析标记物等。此外，在某些 体系中，纳米材料还可以作为载体，起到吸附和支撑的作用，有的甚至参与反应。 本文就是分别利用碳纳米管和纳米金作为载体，建立的新型传感器。纳米材料、 特别是新型的纳米生物材料和纳米复合材料由于其特殊的结构层次，具有很强的 吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性，为生物传感器的研究和应用开辟了一 个广阔的天地。 1 3 1 碳纳米管 自从1 9 9 1 年i i j i m a n 刀发现碳纳米管以来，碳纳米管以其独一无二的结构、电 学和机械特性而备受关注。纳米管近几年来被广泛开展于生物化学领域的研究， 通过化学修饰和生物功能化的方法可以在碳纳米管上结合蛋白质，碳水化合物或 者核酸，开辟了一个新的研究方向，有着广泛的应用前景。 1 3 1 1 碳纳米管的结构 碳纳米管又称巴基管，属于富勒碳系，是一种纳米尺度的具有完整分子结构 的新型碳材料。它是由六元环构成的类石墨平面卷曲的纳米级中空管，其中每个 碳原子通过s p 2 杂化与周围3 个碳原子发生完全键合，各单层管的顶端有五边形 或七边性参与封闭( 如图1 3 ) 。碳纳米管的直径在几纳米到几十纳米之间，长度 可达微米级，因此具有较大的长径比。按碳纳米管管壁的层数不同，碳纳米管可 分为单壁碳纳米管( s w n t ) 和多壁碳纳米管( m w n t ) ，单壁碳纳米管由一层石墨片 卷曲而成，管径一般为1 6n m ；多壁碳纳米管由多层同轴柱状碳管构成，层数在 2 5 0 之间不等，层与层之间的距离一般为0 3 4n m 。 碳纳米管作为理想的准一维材料，除了具有一般纳米材料的性质以外，还具 有独特的电磁学、力学和化学性能。首先，碳纳米管的顶端很锐，导电性良好， 可作为扫描隧道显微镜的探针、场发射电子源、电子材料等；其次，机械强度高， 可作为高强度纤维的首选材料和增塑材料；再次，比表面积大和吸附性强，可用 作储氢材料和生物分子固定化材料等n 引。 1 3 1 3 碳纳米管的制备 目前常用的碳纳米管制备方法主要有：电弧放电法、激光烧蚀法、催化热解 法、辉光放电法和气体燃烧法等以及聚合反应合成法。其中催化热解法由于具有 反应过程易于控制、适用性强、制备方法简便、产品纯度高等优点，而被广泛应 用于制备碳纳米管。 1 3 1 4 碳纳米管在生物传感器中的应用， 碳纳米管是一种新型的纳米材料，而传感器是纳米材料可能利用的最有前途 的领域之一。目前，在国内外，碳纳米管在生物传感领域的应用研究成为热点， 吸引了越来越多的研究者，在理论和实践研究中已取得显著的进展，充分显示了 碳纳米管的应用前景。 近年来，随着对碳纳米管性质研究的深入，越来越多的将碳纳米管应用于传 感器领域。目前碳纳米管的应用主要有以下三个方面： ( 1 ) 碳纳米管作为一种新型的电极材料，广泛用于传感器中修饰电极的研究 1 9 - 2 2 】。碳纳米管修饰电极除了具有电化学窗1 ：3 宽等碳电极的特点以外，还具有表 面化学丰富、电子转移速率快和生物相容性的优点。这是由碳纳米管这种新型纳 米材料的本身性质所决定的，碳纳米管具有良好的导电性、催化活性和较大的比 表面积，尤其对过电位的大大降低及对部分氧化还原蛋白质的直接电子转移，同 时能加快电化学反应过程中电子传递速率等。 ( 2 ) 利用碳纳米管固定生物分子【2 3 。2 4 1 ，由于碳纳米管的中空管状结构具有较 大的比表面积，可以吸附固定生物分子：经酸处理后的碳纳米管具有更多活性位 基于纳米材料的新型生物传感器的研究 点，表面的羧基容易与蛋白质分子上的氨基共价键合，因而将碳纳米管用于生物 分子的固定，可以增加固定的分子数量，从而增强反应信号，提高了传感器的灵 敏度。 ( 3 ) 由于碳纳米管新奇的一维管状结构、高比表面积和良好的导电性乜5 。冽，抑 制了载流子的背散射效应，单壁碳纳米管( s w n t s ) 具有半导体性质，常被用作 场效应晶体管中的沟道材料，发展一种s w n t s 场效应晶体管新型生物传感器。所 谓场效应晶体管就是利用电场效应来控制输出电流大小的半导体器件。s w n t s 场 效应晶体管生物传感器主要把s w n t s 的场效应特性和生物分子间特异的识别功能 结合起来用于生物分析检测，即当固定在s w n t s 侧壁的生物功能分子与待测物质 接触时，发生特定的反应，从而导致场效应晶体管电位的改变，指示出待测物质 的量乜7 。2 们。s w n t s 场效应晶体管生物传感器作为生物传感器的一个重要分支，集 场效应管器件易于集成化、微型化和生物传感器高灵敏度、高选择性等两者的优 点于一体，使它在智能化、在线、实时以至在体分析等方面显示出较大的优势。 1 3 2 纳米金 纳米金( g o l dn a n o p a r t i c l e s ) 有时也称为胶体金，是指金粒子直径在1 1 0 0n m 之间的金材料。作为人们研究最多的重金属纳米材料之一，纳米金从首次发现到 作为免疫标记物而得到大规模研究经历了四百多年。大约在1 6 0 0 年，中世纪杰出 医生p a r c e l s u s 用一种植物的醇提取物还原氯金酸制备“饮用金 ，这就是纳米金。 1 8 5 7 年，m i c h a e lf a r a d a y 是第一个发现纳米金和金具有不同性质的人，并对纳米 金作了大量系统的科学研究，发现加入少量电解质可使纳米金由红色变成蓝色， 最终凝集为无色，而加明胶等大分子物质后便可阻止这种变化。他的重大发现奠 定了纳米金应用的科学基础。在过去的半个世纪里，人们对纳米金做了大量的有 意义的研究，对纳米金有了比较全面系统的认识。 纳米金除了具有纳米材料所具有的小尺寸效应、表面效应、量子效应和宏观 量子隧道效应外，它的导电性和生物相容性也非常好，并且具有独特的光学效应。 纳米金在紫外可见光区具有较强的吸收谱带，这一吸收谱带又叫表面等离子共振 ( s p r ) ，是当入射光子的频率和纳米粒子的传导电子的整体振动发生共振时产生 的，这一特性使纳米金表现如下特征：对不同波长的光选择性地吸收，并且具有 很高的摩尔消光系数；高效的共振瑞利散射；纳米粒子表面电磁场增强。并且， 研究证明，s p r 光谱的最大消光波长和吸收强度依赖于粒子的尺寸、形状、粒子 间距和周围环境的介电性质。一般说来3 0n m 左右的球形金纳米颗粒的s p r 吸收 峰位于5 1 8n m 左右。纳米金的摩尔吸光系数很大，为1 0 8 1 0 1 0l m 0 1 c m ，比普通有 机分子增强了两到四个数量级，因此提高了基于纳米金的生物传感器的灵敏度。 由于纳米金具有良好的稳定性、光学效应、电学效应以及特殊的生物亲和效应， 在许多领域表现出潜在的应用价值，引起了人们浓厚的研究兴趣，在分子生物学 工程硕士学位论文 领域的研究和应用已经受到广泛关注，成为一种强有力的分析工具。 1 3 2 1 纳米金的制备方法 制备纳米金有多种方法，分为物理法和化学法。物理法是利用各种技术将块 状固体金分散为金纳米颗粒，例如辐射法、真空蒸镀法、电分散法和激光消融法 等，化学法包括微乳液法、晶种生长法、微波法、模板法和氧化还原法等。但目 前实验室最常用的方法是经典的f r e n s 柠檬酸钠还原法口引，在加热煮沸的条件下以 柠檬酸三钠为还原剂，将氯金酸还原为纳米金。我们观察到在沸腾的氯金酸溶液 中加入柠檬酸钠后，溶液很快由淡黄色变为灰色，继而转变为蓝黑色，大约1 5r a i n 后逐渐变为稳定的红色。将制得的纳米金溶胶置于玻璃瓶中4 保存，很长时间 内都不会发生团聚。该方法操作简单方便，原料价格便宜易得，可以合成5 2 5 0 n l r n 不同粒径，单分子分散效果很好的纳米金。根据氯金酸溶液和柠檬酸三钠的不同 比例可合成不同粒径的纳米金，纳米金的尺寸得到了很好的控制。 1 3 2 2 纳米金标记 作为现代四大标记技术之一的纳米金标记技术( n a n o g o l dl a b e l l i n gt e e h i q u e ) ， 与传统的标记方法相比，具有以下优点：即使是少量的溶液也能进行检测；不需 要大型仪器；可以获得较高的灵敏度等。纳米金标记生物分子，一种常用的方法 是对生物分子进行修饰使其具有氨基或巯基，利用a u 与氨基或巯基的共价键合作 用，使a u 纳米粒子固定在是生物分子上；另一种常用的方法是将纳米粒子表面功 能化，使纳米粒子表面具有可反应的功能基团。 1 3 2 3 纳米金在生物传感分析中的应用 ( 1 ) 纳米金用于d n a 检测分析 2 1 世纪里有关d n a 的研究是生命分析科学的重要基础，在基因学，病理学， 医药学，食品安全等众多其它领域都有广大地需求。d n a 的杂交和检测在研究基 因缺损与异常、病变机理以及疾病的诊断、预防、治疗，药物筛选和法医鉴定中 被广泛应用，尤其是单核苷酸多态性和突变的灵敏检测是一个具有挑战性的研究 课题。目前，利用纳米金胶体的化学性质、高稳定性以及独特的生物活性，在d n a 的识别与检测技术方面取得了很有价值的成果。 美国西北大学m i r k i n 教授领导的研究小组在纳米金与d n a 片段之间相互作 用方面作了大量深入细致的工作。他于1 9 9 6 年首次口将d n a 修饰的1 3n n l 纳米 金颗粒组装为宏观光谱材料，发表论文。将标有巯基的d n a 单链通过一s h 链接 与纳米金结合在一起，再将另一与纳米金上单链的互补链通过杂交结合到纳米金 上。由于d n a 双链在加热条件下解链，这种组装过程在热交性条件下可逆，可以 基于纳米材料的新型生物传感器的研究 用于测定d n a 序列也可以通过d n a 反应的特异性去控制不同粒径及组成的粒子 间的反应，应用于光学、电子学和与胶体链接的结构和性质等研究领域。( 如图 1 4 ) u m 描鲫铀喃雌 o l 咖l d 带暇o w i t h，、 m o d i f i c a t i o nw i t h f f - t h i o i - t q a 3 僻f $ a g t c g t t t - 3 - i t _ 0 ：j 氏懒硝i 眦l 叼洲 鱼叫皑 a ；p 删蕊；t c 触c m f a f i 篡裟 图1 4d n a 修饰的1 3n m 纳米金颗粒组装为宏观光谱材料m 1 2 0 0 0 年m i r k i n 研究小组用纳米胶体金标记的巯基化的寡聚核苷酸探针用于分 析组合d n a 芯片幻( 如图1 5 ) 。对靶寡聚核苷酸进行纳米金标记能显著改变芯 片上d n a 的变性图谱。如果存在基因突变，在标准的杂交条件下，标记的靶d n a 就难以与芯片上的d n a 杂交，因此观察不到信号。由此可以对单碱基突变进行鉴 别。灵敏度比常规的荧光法高3 倍。此外如果结合采用纳米颗粒介导的银还原法， 灵敏度可提高2 个数量级。此后，m i r k i n 做了大量的关于纳米金在d n a 方面的研 究，取得了重大的突破3 3 们。 工程硕士学位论文 卜嚣篙落麓 一至毯 图1 5 纳米金标记的寡聚核苷酸探针用于分析组合d n a 芯片m 3 ( 2 ) 金属纳米粒子在免疫分析和生物染色方面的应用 1 9 7 1 年，f a u l k 口朝等将胶体a u 与蛋白质结合制成用于电子显微镜的a u 探针， 是纳米a u 粒子应用于免疫细胞和组织化学的重要里程碑。基于纳米粒子的良好的 光学性能，从此纳米a u 粒子逐渐应用于免疫化学，常用作生物染色剂和免疫标记 物，可在电子显微镜甚至光学显微镜水平上对抗原、抗体进行定位、定向直至定 量研究。在免疫分析中用纳米金粒子标记的方法相比于早期的实验橡胶微球凝集 反应有几个优点：1 ) 纳米粒子的比表面积大，吸附力强，可固定的免疫亲和分子 多，灵敏度高；2 ) 它在凝聚反应中的背景吸收比橡胶微球要低，具有较低的检出 限；3 ) 溶液中胶体纳米粒子比微球粒子稳定。纳米粒子用于细胞染色和发光生物 标记比普通的荧光或有机探针也具有明显优势，这是由于：1 ) 它们的尺寸小，能 充分与细胞或组织结合；2 ) 通过对纳米粒子表面修饰不同亲和性的物质，可实现 对不同部位定向染色：3 ) 纳米粒子在显微镜下的衬度差别大，比普通的染色剂有 更高的分辨率。 ( 3 ) 利用纳米金作为载体在生物分析检测中的应用 由于纳米金大的比表面积，可同时在纳米金表面固定信号分子和生物识别分 子，需特别注意的是在满足反应的前提下应使信号分子占的比例尽可能高，以达 到信号放大的目的。将纳米金和其它检测技术结合起来，如表面等离子体共振、 石英晶体微天平、表面增强拉曼光谱等技术p 3 射，用于生物检测分析能显著提高 鼢 y 基于纳米材料的新型生物传感器的研究 分析性能，提高生物传感器的检测性能。 目前最常用的利用纳米金作为载体的应用之一，就是利用金溶胶常作为表面 增强拉曼光谱( s e r s ) 活性基底。由于纳米金具有表面粗糙和大部分溶于水溶液 的性质，在溶液体系中对可溶性的吸附分子开展生物化学、痕量分析等领域的研 究。一般来说，纳米颗粒的形状、大小以及表面形貌均会对s e r s 增强效果产生很 大的影响。将纳米标记和表面增强拉曼结合，从而发展一种利用拉曼技术进行检 测分析的方法。 1 4 本研究工作构思 近年来，生物传感器发展迅速，在医药、食品、环境和军事等领域具有广阔的 应用发展前景。纳米材料由于其超凡的特性，在生物传感领域展现出引人注目的 应用前景。鉴于纳米材料的诸多优异特性，如制备简单、性能稳定、比表面积大、 导电性和生物相容性好，此外还具有独特的光学效应等，纳米材料是构建生物传 感的最普遍的一类材料。本文拟利用碳纳米管和纳米金两类纳米材料，建立一种 新的分析方法或构建一种新型的传感器。具体内容如下： ( 1 ) 碳纳米管具有新奇的一维管状结构、高比表面积、易于生物修饰以及荧光猝 灭等特性。利用碳纳米管独特的性质，标有荧光基