（物理化学专业论文）6羟甲基78二氢喋呤磷酸化酶的分子对接和分子动力学模拟研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要围绕h p p k 酶及其复合物、突变体进行了理论计算方面的研究， 主要包括分子对接和动力学模拟两个部分；另外，对定量结构一活性，性质关系 这一方法进行了部分改进，概述如下： 第一部分主要是使用d o c k 4 0 程序基于h p p k 酶进行了分子对接研究。 首先从受体表面的表征方法( c o n n o l l y 、d i n s ) 、活性部位的大小来看对对接结 果的影响，发现在合适的活性部位大小，调整各种重要的参数条件下，使用 c o n n o l l y 受体表面表征方法得到的对接结构比较稳定，而且晶体结构的重现性 较好，r m s d 为2 9 3 a ，接近2 a ，但仍没有达到2 a 以内，仍然没有达到进行数 据库的参数标准。 然后保留活性部位的金属镁离子，加入其参数，对h p p k 复合物晶体结构 进行分子对接研究，以h p p k 和含有金属离子m 9 2 + 的h p p k 为受体，底物h p 的类似物为配体进行了分子对接，同时并考虑了活性口袋的大小。发现活性部 位对对接结果有一定的影响，而金属离子m 9 2 + 在h p p k 中是主要的催化中心， 通过形成配位复合物，将底物与酶结合在一起，从而使酶蛋白的构象稳定于催 化活性形式，在对接中起着非常重要的作用，使晶体结构的重现性r m s d 值在 2 a 以内，加入金属镁离子的参数可以进行数据库对接。 最后使用c o n n o l l y 受体表面表征方法、加入金属镁离子参数等调整好的参 数文件基础上进行了m d l 数据库a c d 3 d 子库的对接。发现在合适的活性口袋 下金属离子的加入不仅提高了对接的准确度同时提高数据库筛选的命中率，通 过对m d l a c d 3 d 对接结果的分析，发现对h p p k 具有抑制活性的化合物的共 同的结构特征，其中几个化合物有待购买后进行相应的药理测试。因此基于 h p p k 受体结构的合理药物设计为设计新的h p p k 抑制剂提供有益的指导。 第二部分主要对h p p k 及其复合物、突变体进行了动力学模拟研究。首先 探讨了h p p k 在溶液、加入行衡离子的水溶液环境下的动力学行为，并加入在 真空环境下的计算进行对比，结果发现无论从r m s d 、回旋半径、二级结构的轨 l l 迹图还是从表征动力学模拟过程中运动形式的c 口协方矩阵分析，h p p k 在水溶 液特别是加入抗衡离子的水溶液的环境下的模拟与真实情况更相符。 然后使用柔性分子对接和动力学模拟方法对h p p k 与底物h p 、a t p 的复合 物结构进行了模建，同时考虑活性部位金属镁离子和配位水分子，共四个体系。 将h p p k 与h p 复合物模拟的平均构象与对接构象、h p p k 与底物类似物的复 合物晶体结构对比，发现模拟构象更加合理、稳定。比较四个体系，从能量、 相互作用、模型稳定性等方面分析比较发现，加入金属镁离子和配位水分子的 模型合理，说明镁离子和配位水分子起着重要的作用，这为分子对接和分子动 力学模拟提供了一些信息。对“结构水”和金属离子的研究有一定的参考价值， 同时为h p p k 提供了合理的复合物模型，为基于h p p k 的药物设计给与有意的 指导。 最后对h p p k 及其突变体进行了动力学模拟，从而发现残基a r 9 8 2 、a r 9 9 2 和8 4 8 9 在h p 、a t p 与h p p k 结合形成复合物过程中的重要作用，这几个残基 在环区l o o p 2 和l o o p 3 上，结合底物过程中发生开合现象的主要残基，对底物的 包裹起着关键作用，另外对f i p p k 催化磷转移的机理进行了定性的探讨，对磷 转移机理的进一步深入研究提供了思路。 第三部分主要使用定量结构一活性，性质关系这一方法对几个体系进行了 初步研究。包括二维和三维。二维的构效关系中主要是提取了有用的静电势参 数用于二取代苯化合物的疏水性研究上，可藉此来预测化合物的疏水性能，而 不用具体考虑极性基团间的相互作用；还有应用分子静电势参数并结合指示变 量，可获得良好的溶剂软度与其分子结构间的定量关系，利用这一关系，可以 对未知溶剂的软度进行预测。 三维的构效关系，主要是使用比较分子场分析( c o m f a ) 对乙酰胆碱酯酶 抑制剂、1 肾上腺素受体拮抗剂等进行y - 维构效关系研究，并在常规c o m f a 基础上进行了平动和转动的全空间搜索，从而获得好的构效关系模型。 关键词：6 羟甲基7 ，8 一二氢喋呤磷酸化酶( h p p k ) ，分子对接，分子动力学模 拟，金属镁离子，定量构效关系，比较分子场分析，抑制剂 浙江大学博士学位论文 a b s t r c t a b s t r a c t i l l t h et h e s i si sa b o u tm o l e c u l a rd o c k i n ga n dm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n t h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o no n6 - h y d r o x y m e t h y l - 7 ，8 一d i h y d r o p t e r i np y r o p h o s p h o k i n a s e ( h p p k ) ，c o m p l e x sa n dm u t a t e s i na d d i t i o n ，s o m ei m p r o v e m e n t sh a v eb e e nd o n eo n t h eq u a n f i t i v es t r u c t u r e a c t i v i t y p r o p e r t yr e l a t i o n s h i t p t h e r ea r et h em a i np a r t s ： i nt h ef i r s tp a r t ，m o l e c u l a rd o c k i n gs t u d i e sh a v eb e e np e r f o r m e db a s e do n h p p k b yu s i n gd o c k 4 0s o f t w a r e f i r s t l y , t w om e t h o d s ( c o n n o l l ya n dd m s ) w e r e u s e dt oc r e a tt h er e c e p t o rs u r f a c e ，i nt h es a m et i m e ，d i f f e r e n ta c t i v es i t es i z e sw e r e a l s oc o n s i d e r e dt op e r f o r mt h ed o c k i n gc a l c u l a t i o n w ef o u n dt h a ti nt h ep r o p e r a c t i v es i t e ，t h ed o c k i n gr e s u l t sc a l c u l a t e db yc o n n o l l yw e r es m o o t h e rt h a nt h o s eg o t b yd m s ，a n dt h ec o m p l e xs t r u c t u r e sw e r em u c hc l o s e rt ot h ex r a ys t r u c t u r e s t h e r m s dv a l u e sw e r ec l o s e rt o2 a ，b u tt h ep a r a m e t e r sw e r es t i l ln o tu s e df o rt h e d a t a b a s es c r e e n i n g t h e n ，t h em g ”c a t i o n sw e r eh e l di nt h ea c t i v ep o c k e t m o l e c u l a rd o c k i n g s t u d i e s0 1 1t h ei n t e r a c t i o n so fh p p kw i t ht h es u b s 奸a t ea n a l o g u r e sh a v eb e e n p e r f o r m e d p a r t i c u l a r l y , t h ee f f e c to ft h ei n t r i n s i cm e t a li o nu p o nt h ed o c k i n gh a s b e e ne x a m i n e d i th a sb e e ns h o w e dt h a tt h ei n c o r p o r a t i o no fm 矿c a t i o ni nt h e m o l e c u l a rd o c k i n gp r o c e s s e sp l a y s 鲁n 妇单o r t a n tr o l en o to n l yi no b t a i n i n gr e l i a b l e d o c k i n gr e s u l e sb u ta l s oi ni m p r o v i n gt h e h i tr a t i oi nt h e “i ns i l i c o ”d r u gs c r r e n i n g - f i n a l l y , t h em d l a c d 3 dd a t a b a s ed o c k i n gi n t oh p p kw e r ep e r f o r m e db y u s i n gc o n n o l l ym e t h o da n dc o n s i d e r i n gm 矿+ c a t i o n s a n a l y z i n gt h ed o c k i n gr e s u l t s ， w ef o u n dt h a ts o m ec o m p o u n d sh a v ei n h i b i t o ra c t i v i t yo nh p p ko nt h e o r e t i c a l ， w h o s es i m i l a rs t r u c t u r e sw e r ea l s of o u n d ，t h ec o m p o u n d ss h o u l db ed o n et h e p h a r m a c o l o g i c a le x p e r i m e n t a lt op r o v et h ea c t i v i t y t h u s ，t h ed o c k i n gs t u d ym a y p r o v i d es o m eh e l p f u li n f o r m a t i o nf o ro u rd e s i g n i n gn e wa n t i m i e r o b i a la g e n t sb a s e d o n h p p k i nt h es e c o n dp a r t , t h ef o c u si st h em o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o no nh p p k , t h ec o m p l e xa n dm u t a t e s f i r s t l y , m o l e c l a rd y n a m i c sc a l c u l a t i o n sw e r ep e r f o r m e d o n h p p k ，w h i c hw e r ei nv a c u o ，w a t e r , a n dw a t e ra d d i n gt h ec o u n t e ri o n sr e s p e c t i v e l y , i ts h o w nt h a tt h em o l e c u l a rd y n a m i c so fh p p ki nt h ew a t e ra d d i n gt h ec o u n t e ri o n s w a sm o s tc l o s et ot h ee x p e r i m e n tf r o mt h et r a j e c t o r yo fr m s d ，t a d u so fg y r a t e ，t h e s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，e i g e n v e c t o r s ，a n dt h ec o tc o v a r i a n c em a t r i x t h e n ，h pa n da t pw e r ed o c k e di n t oh p f kw i t ho rw i t h o u tt w om 9 2 + i o n sa n d t h r e ec o o r i d n a t e dw a t e rm o l e c u l e s ，u s i n gt h ef l e x i b l ed o c kp r o g r a m ( f l e x i d o c k ) 2 0 0 0p sm o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n sw e r ec a r r i e do u tt or e f i n et h ef o u rd o c k e d c o m p l e xs y s t e m s t h es i m u l a t i o ns h o w st h es t a b i l i t ya n dv a l i d i t yo ft h ec o m p l e x s t r u c t u r e t w om g ”i o n sa r eb o t ho c t a h e d r a lc o o r d i n a t i o n o n em 9 2 + i o ni sc h e l a t e d w i t ha l lo x y g e na t o mo fh p , w h i c hi sf a v o r a b l et ot h et r a n s f e ro fp y r o p h o s p h o r y l f r o ma t pt oh p , a n dn e u t r a l i z e st h en e g a t i v ec h a r g es oa st os t a b i l i z et h e c o n f o r m a t i o no ft h ec o m p l e s ( h p p k - h p - a t p ) t h et h r e ew a t e rm o l e c u l e s c o o r d i n a t ew i t ht w om 9 2 + a n do t h e rr e s i d u e sa r ea l s os t e a d yd u r i n gm o l e c u l a r d y n a m i c ss i m u l a t i o n ，w h i c ha r et h e r e f o rt e r m e d “s t r u c t u r a lw a t e r a n dc o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t 0t h es t a b i l i t yo fb i o m a c r o m o l e c u l e sa n dp l a yac r u c i a lr o l ei n m o l e c u l a ra s s o c i a t i o n i no r d e rt om a k ec l e a rt h ef u n c t i o no fr e s i d u ea r 9 8 2 ，a r 9 9 2 ，a n d8 4 8 9d u r i n g h pa n da t pb i n d i n gt oh p p k ，m o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n sw e r ed o n eo nh p p k a n dm u t a t e s w ef o u n dt h a tt h er e s i d u ea r 9 8 2 ，a r 9 9 2 ，a n d8 4 8 9a r ei nt h ef l e x i b l e l o o p 2a n dl o o p 3 d u r i n gt h eh pb i n d i n g t oh p p kp r o c e s s ，t h el o o p 2a n dl o o p 3h a v e l a r g ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g ea n dm o v e d i n t ot h ea c t i v es i t et ob i n dw i t hh pa n da t p i na d d i t i o n ，m e c h a n i s mo fh p p k c a t a l y z e dp y r o p h o s p h o r y lt r a n s f e rw a sd e v i n i n g q u a l i t a t i v e l yf r o mt h ex - r a y s t r u c t u r ea n dm o d e l s i nt h el a s tp a r t ，t h eq u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c f i v i t y p r o p e r t yr e l a t i o n s h i p m o d e l sw e r eb u i l tb yu s i n g2 - d i m e n s i o n a la n d3 - d i m e n s i a lm e t h o d s a bi n i t i o h f 6 3 1 g 4o p t i m i z a t i o na n de l e c t r o s t a t i cp o t e n t i a l sh a v eb e e nc o m p u t e df o ra a b s t l t a c tv n u m b e ro fd i s u b s t i t u t e db e n z e n e s ，ag o o ds i x - p a r a m e t e rc o r r e l a t i o nb e t w e e nl o 驴 a n dt h ec o m p u t e dd e s c r i p t o r s f o rat r a i n i n gs e to fr e p r e s e n t a t i v ed i s u b s t i t u t e d b e n z e n e si sp r e s e n t e d t h ei n f l u e n c eo fg r o u p g r o u pi n t e r a c t i o n so nt h el o g pv a l u e s o fi s o m e r sh a sb e e ni n v e s t i g a t e db yt r e a t i n gt h eo r t h od i s u b s t i t u t e db e n z e n e s s e p a r a t e df r o mt h eo t h e r s i ts h o w st h a tt h ei n f l u e n c e so fi n t e r a c t i o n sb e t w e e nt w o n e i g h b o u r i n g s u b s f i t u e n t g r o u p s a l e b a s i c a l l yt h o u g h t t ob er e l e v a n tt o h y d r o g e n - b o n d i n ga n dr e p r e s e n t e dm a i n l yb yv a r i a t i o n so ft h ev m m ，v s m “a sw e l la s p s av a l u e so f i s o m e r s 4 6i n i 玎o o p t i m i z a t i o n a th f 6 3 1 g + l e v e la n de l e c t r o s t a t i c p o t e n t i a l c a l c u l a t i o n sh a v eb e e np e r f o r m e df o rag r o u po f1 2 1s o l v e n tm o l e c u l e s h i 曲一l e v e l c o r r e l a t i o no fs o l u b i l i t i e so ff u l l e r e n c e ( c 6 0 ) i no r g a n i cs o l v e n t sw i t ht h et h e o r e t i c a l d e s c r i p t o r so fs o l v e n t sh a v eb e e no b t a i n e d t h er e s u l t ss l s od e m o n s t r a t et h a tt h e s o l u b i l i t i e so ff u u e r e n c ec a nb ep r e d i c t e db e t t e rw i t ht h es d e c f i v ep a r a m e t e r s ，a n d t h er e s u l t so b t a i n e db yn e u r a ln e t w o r ka r es u p e r i o rt ot h a tb ym u l t i p l er e g r e s s i o n b yu s i n gc o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ( c o m f a ) m e t h o d ，q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pm o d l e sh a v eb e e nb u i l tf o rt h ei n h i b i t o r so f a c e t h y l c h o l i n e s t e r a s ea n das e r i e so f p h e n o x y a l k y l a m i n e s 1 一a d r e u o c e p t o ra n t a g o n i s t ( d d p ha n di t sa n a l o g u e s ) ，g o o dm o d e l sw e r eo b t a i n e d t h ep r o g r e s s e s ( r o t a t i o na n d t r a n s l a t i o nb a s e do nt h ec o n v e n t i o n a lc o m f a ( m o d e l ) h a v ei m p r o v e dt h ep r e d i c t e d p o w e ro f t h em o d e l s k e y w o r d s ： 6 - h y d r o x y m e t h y l - 7 ，8 一d i h y d r o p t e r i np y r o p h o s p h o k i n a s e( i - i p p k ) ， d o c k i n g ，m o l e c u l a rd y n a m i c ss i m u l a t i o n ，m 9 2 + ，q u a n t i t a t i v es t u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p ( q s a p ) ，c o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ( c o m f a ) ，i n h i b i t o r s 第一章绪论 第一章绪论 1 1 文献综述 抗生素的广泛应用已使细菌感染的疾病基本得到控制，对人类的健康发挥 了巨大的作用，但最近二十年来细菌的耐药性逐年增加，致使一些抗生素的疗 效降低，甚至无效，这造成了全世界的医疗健康危机“”，因而寻找具有新结构 和新的抗菌作用机制的新抗生素成为药学家和化学界备受关注的研究课题【4 ，5 j 。 叶酸【6 】( 维生素m ，维生素b c ) 化学名称为n 一【4 一 ( 2 一氨基一4 一氧代- l ，4 - 二氢- 6 - 蝶啶) 甲氨基】苯甲酰基 - l 一谷氨酸，亦称蝶酰谷氨酸。新鲜蔬菜、肉类、豆类、 谷类均含有叶酸，但新鲜蔬菜中含量高，主要在小肠上部吸收。1 小时血中浓 度大高峰，随皿流分布全身各组织。在肝内被叶酸酶还原为四氢叶酸( f h ) ， 四氢叶酸是叶酸的活性形式，是一碳单位的传递体口 ，参与体内嘌呤、胸腺嘧 啶核苷酸的合成，进一步合成d n a 和r n a ，参与甘氨酸和丝氨酸之间、组氨 酸和谷氨酸之间、半胱氨酸和蛋氨酸之间的相互转化，同时参与许多重要物质 的合成，如血红蛋白、肾上腺素、胆碱、肌酸等 8 l 。可见，叶酸对生物体非常 重要。哺乳动物包括人类虽然不能够合成叶酸，但有活性运输系统可以从日常 摄食中获取叶酸；相反，绝大多数的微生物和细菌由于缺少叶酸运输系统而必 须“从头合成”( d en o v os y n t h e s i s ) 【9 】叶酸，因此针对叶酸生物合成过程的药物 将得到毒副作用小的新的抗菌素、抗疟药抗生素类药物。 叶酸的生物合成是个非常复杂的过程，如图1 1 所示。有关合成叶酸过程 中的酶的三维结构、生物功能、动力学实验f 1 2 ，以及抗叶酸的抑制剂的选 择性”1 、结构一活性性质关系 1 4 , 1 5 1 都有大量的研究报道，同时，许多抗叶酸的 化合物已经用于临床作为抗菌药、抗疟药以及抗癌药等，例如，现在仍然使用 的磺胺类药物抑制d h p s ( d i h y d r o p t e m a t es y n t h a s e ) ；二氢叶酸还原酶盼2 1 ( d i l l v d r o f o l a t er e d u c t a s e ，d i - i f r ) 是叶酸合成过程中研究最多的酶，它催化生成 重要的四氢叶酸( t h f ) 辅酶，同时也是研究抗癌和各种传染病的好的靶标， 三 墨= 童堕丝 早在1 9 5 0 年到1 9 6 0 年十年间就有许多药物2 2 1 的问世。但到目前为止，叶酸的 生物合成过程仍然是生物学家、药学家和化学家的研究焦点【2 34 4 。 圈1 1 叶酸的生物合成的部分过程 6 羟申基一7 ，8 二氢喋呤磷酸化酶( 6 - h y d r o x y m e t h y l 一7 ，8 - a i h y d r o p t e r i n p y r o p h o s p h o k i n a s e ，h p p k ；e c2 7 6 3 ) 最早于1 9 6 4 年在大肠杆菌中识别 4 5 1 ，大 肠杆菌中的h p p k 与其他生物体中的h p p k 有较高的同源性( 3 3 5 6 ) 。1 9 6 9 年部分地纯化“1 ，1 9 9 1 年纯化h ”，1 9 9 2 年h p p k 基因表达并被克隆出来【4 8 】， 有关h p p k 的性质，包括酶催化反应功能( 磷转移) 、底物的k m 值测定，以及 金属m 孑+ 的活化作用都有相关报道。h p p k 也是叶酸合成过程中的一个重要催 化酶，催化焦磷酰从三磷酸酰酐( a t p ) 转移到6 一羟甲基一7 ，8 一二氢喋呤 ( 6 h y d r o x y m e t h y l 7 ，8 - d i h y d r o p t e r i n ，i i p ) 。h p p k 具有1 5 8 个残基，约1 8k d a ， 热稳定性好，是一个比较小的单体蛋白，二级结构折叠成6 个p 和4 个d 螺旋 p l o l l p 2 p 3 一口2 弘，p 5 3 6 一“3 - a 4 ) 。目前还没有h p p k 的抑制剂的报道，由于 第一章鳍论 抑制h p p k 的活性可以达到抗菌的目的，因此h p p k 被认为是基于结构进行合 理药物设计、发展新抗生素的理想靶标。近年来，有关h p p k 的晶体结构陆续 被y a nh g 、j ix h 4 9 巧印等人用x 衍射测定出来，包括a l s o h p p k 、突变体、与 底物类似物结合的复合物或者与a t p 类似物结合的复合物，同时溶液中h p p k 与a m p p c p ( ，p - m e t h y l e n e a d e n o s i n e5 - t r i p h o s p h a t e ，a na t pa n a l o g ) 相结合的结 构【5 7 1 也已经被核磁共振( n m r ) 检测出来，表1 1 中列出了晶体和核磁结构在 p d b ( p r o t e i nd a t a b a n k ) 中的登陆号以及组成。突变体( i i m 6 、i k b r 、1 g 4 c 、 1 r t z 、1 r u i 、i r u 2 ) 的晶体结构提供了重要氨基酸，特别是r 8 2 、r 9 2 、v 8 3 ， 与h p 、a t p a m p c p p 的相互作用信息。n m r 测得的结构为我们提供了溶液中 h p p k 组氨酸的质子化存在形式，晶体结构提供了大量的有关h p p k 与底物h p 或者a t p 的相互作用信息，明确地找到活性部位是一个2 6 a 、l o a 、l o a 的谷 带，同时在结合i - i p 、a t p 的过程中伴随着柔性环区的构象闭合现象，针对于此 构象变化。对于研究h p p k 在结合底物的过程和焦磷酰的转移机理都十分重要。 表1 1 有关h p p k 的晶体和核磁结构p d b 库登陆号和组成 c o d en a m e c o m p o n e n t s 1 h k a a p o - h _ p p k l i m 6 a p o h p p k ( r 8 2 a 1 c 1 l k b r a p o h p p k 限9 2 a ) c 1 i g 4 c h p p k ( r 9 2 a 1 ，m g c im g 1 i u z h p p k f v 8 3 g a 8 4 - 8 9 )c l m gg o l 1 e q o h p p k h p m g a m p c p p ( n m r 、 a c p a p cc lh h pm g 1 q o nh p p k 弹m g a m p c p p a c p a p c c l h h p m g i f 9 y h p p k h p o ，h p o l m g a m p c p p a c p a p cc 1h h p m g i h q 2h p p k ( r 8 2 a ) - h p - m g a m p c p p a c p a p cc ih h pm g 1 f 9 h h p p k ( r 9 2 a 、h p m g a m p c p p a p cc ih h pm g 1 r u l h p p k ( v 8 3 g a 8 4 - 8 9 ) h p m g a m p c p p a p cc ih h pm g 1 r u 2 h p p k ( v 8 3 g a 8 4 8 9 ) h p m g a m p c p p a p cc ih h pm g l r a o h p p k a m p h p p pa mh p p p l r b 0h p p k h p p ph p p p 1 e x 8h p p k m o h p 4 a h p 4 a m g 1 d y 3h p p k - 8 7 y m g a r p8 7 y a t p m g 1 e q m h p p k m g a d p a d pp 0 4m g l c b kh p p k h p 2 r o is 0 4 浙江大学博士学位论文 三 塑二雯堡堕 动力学实验 5 8 - 6 5 】测定了底物( h p ) 和a t p 与h p p k 的结合过程，h p p k 催 化焦磷酸从a t p 转移到h p 上需要四步，并测定发现产物h p p p ( 6 h y d r o x y m e t h y l - 7 ，8 一d i h y d r o p t e r i np y r o p h o s p h a t e ) 释放是限速步骤( 如图1 2 所示) 。只有i - i p p k 结合h p 、a t p 时活性i = 1 袋是闭合的，仅结合i - i p 、a t p 其 中一个或者没有结合底物时是开放的，并且环区3 ( 1 0 0 p 3 ) 对于底物结合影响 最大，当突变l 0 0 1 ) 3 上的r 8 2 、r 9 2 残基时，h p 的分解常数比正常蛋白增加了 1 0 0 倍；而删除残基时，限速步骤的速度常数降低了约1 1 1 0 5 倍。说明l o o p 3 对于h p 、a t p 的结合起着重要作用。 。：愈0 r h 箬 n v c h 2 0 p p n h 6 一h y d r o x y m e t h y l t 8 一d i h y d r o p i e r 叫h p ) ：搿潞徽 品嗣时m 叫”m h p p k + a t p h p p k a t p + h p h p p k a t p h p h p p k a t p h p p ka t p h p h p p k a m p ，h p p p h p p k a m p h p p p j 江一h p p k + a m p + h p p p 图1 2i t - p p k 催化反应式以及动力学反应机理( m g 抖参与反应) 关于i - i p p k 的实验( 晶体、核磁结构、动力学) 很多，然而理论研究比较 少，仅c o v e hd g t 6 6 1 等人对h p p k 的四个晶体结构。包括a p o - h p p k 、与不同核 苷酸或喋呤类似物结合的复合物进行理论计算，为功能与动力学关系，以及配 体结合构象变化提供了一些信息。令人惊讶的是，h p p k 与h p 、a t p 结合的结 构( 晶体、核磁) 都没有测出来。 新药的寻找至今仍是一件耗资巨大而效率低下的工作，据国际上近年来的 焱 2 一一k一一kb 第一章绪论 统计，研制成功一种新药，平均需要花费1 0 1 2 年的时间，耗资2 0 3 5 亿美 元，而且这一费用仍然在快速增长。造成这一状况的一个重要原因就是缺乏深 入的理论指导；高通量药物筛选技术是在2 0 世纪8 0 年代后期随着多学科的发 展和多种技术的进步而形成的综合性高新技术，它为筛选药物先导化合物缩短 了时间、节约了大量经费，并产生巨大的经济效益和社会效益。目前为止，h p p k 的抑制剂尚未见报道，因此基于h p p k 酶的数据库筛选工作是十分有意义的， 本文以h p p k 酶为靶标使用各种分子对接方法对m d l 公司的a c d ( a v a i l a b l e c h e m i c a l sd i r e c t o r y ) 数据库进行了筛选。 尽管对于h p p k 的催化作用机理从晶体结构得到一些合理的假设，然而有 关h p p k 酶与底物以及抑制剂具体的作用机制仍然不确定，所以进一步的研究 是非常必要的。近年来，应用各种理论计算方法和分子模拟技术，应经成为国 际上十分活跃的研究领域。理论计算和计算机辅助药物分子设计方法可以研究 受体生物大分子上药物结合部位的结构与性质、药物受体复合物的构型和立体 化学特征、药物与受体结合的模式和选择性、药物分子的活性基团和药效关系 等，为改进现有的生物活性物质的结构、设计新的药物，提供理论上的指导。 由于药物和受体相互作用在空间结构的严格互补性，确定药物分子起作用时的 药效构象对探讨药物和受体相互作用的机理及寻找设计薪的药物具有十分重要 的作用。本文主要使用分子对接和动力学模拟方法对单体、复合物和突变体进 行研究，希望得到底物与h p p k 的相互作用信息，初步探讨了焦磷酸的转移机 弹。 第一章绪论 1 2 研究方法 2 0 世纪7 0 年代初期h a n s c h 等t 6 6 , 6 7 人首先定量地研究化合物结构和生物活 性之间的关系( q u a n t i t a t i v es 咖c t i l r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ，q s a r ) ，从而迈出了计算 机辅助药物分子设计( c m p u t e r - a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) 的第一步。但由于这种 方法在理论方面的局限，例如得到的数理统计模型的外推性值得怀疑，二维参 数的真实理化意义不太明确，尤其它没有基于受体结构出发去设计互补的配体 小分子，所以很难将其应用于设计新结构类型的先导化合物方面。 2 0 世纪8 0 年代末分子生物学、大分子晶体学和多维核磁技术的发展，对 受体结构、功能关系和对受体( 或受体一配体复合物) 结构解析的研究不断深 入，在此前提下，利用分子力学( m o l e c u l a rm e c h a n i c s ) 、分子动力学( m o l e c u l a r d y n a m i c s ) 、量子化学( q u a n t u mc h e m i s t r y ) 的计算方法，结合图形学显示系统，研 究配体和受体之间本质的分子相互作用力模式，从而指导药物设计，已成为当 今药物化学发展的前沿领域。由此产生了以受体结构为基础的药物分子设计方 法( s t r u c t u r e - b a s e dd r u gd e s i g n ，s b d d ) 。 1 2 1 分子对接 当受体三维结构已知时，可以根据形状互补、性质互补的原则将配体放置 在活性部位，使之形成有利于相互作用的配体受体复合物，即所谓的对接。随 着x 射线衍射以及核磁共振等技术的发展，越来越多的生物大分子的三维结构 被测定出来，或者以同源蛋白模建方法获得，以及商用小分子数据库的不断更 新，基于受体三维结构的药物设计方法一分子对接( d o c k ) 在药物设计中取 得了巨大的成功，已经成为基于结构药物设计中最为重要的方法，下面主要介 绍分子对接方法的基本原理、方法以及应用。 1 2 1 1 分子对接的原理 分子对接的最初思想起源于1 0 0 年前f i s h e r e 胸“锁一钥匙模型”。然而， 第一章绪论 配体与受体的结合过程是一个复杂的过程，涉及到配体和受体的去溶剂化、配 体和受体( 主要是活性部位处的残基) 的构象变化以及配体与受体之间的相互 作用。配体与受体能否结合，以及配体与受体的结合强度则取决于结合过程的 自由能变化【6 8 】： g 懒= 一r t l n k f 其中k i 是药物对受体的结合常数。而结合自由能又可以表示为： g 毗嘧如t = h h z j 匿缸眭i 咤 大部分的分子对接法忽略了全部的熵效应，而在焓效应中也只考虑配体与 受体的相互作用能。配体与受体的相互作用包括静电作用( 风l e 。i o ) 、范德华 作用( e v d w ) 和氢键相互作用( e r i h d ) ，即： e 嘧b m = e 山七ee 自m s 雠+ e h 一啦 根据所采用的力场的差异，上式中的氢键作用可以显式地表达；也可以通 过调整相应原子的范德华半径来处理，或者将其包含在静电作用能中。 1 2 1 2 分子对接方法 分子对接方法根据不同的简化程度大致可以分为三类：网巾陛对接、半柔性 对接以及柔性对接。刚性对接指在对接过程中，研究体系的构象不发生变化