（植物营养学专业论文）重金属cd污染土壤毒性的复合指标的研究.pdf

重金属c d 污染土壤毒性的复合指标的研究 要 本试验选用小白菜( b 麟s 记口幽加p 琊括) 为材料，在盆栽试验条件 下，研究了外源添加不同处理c d 对土壤的植物指标、微生物指标、土 壤酶指标、土壤化学指标、发光菌指标的影响，并综合分析c d 污染土 壤的毒性大小。主要结论如下： 1 、不同浓度的c d 条件下，植物株高，生物量，根部质量，地上部 分质量，根冠比，根茎中金属c d 的含量都存在明显差异，且与添加c d 的浓度呈负相关口以植物株高，生物量，根部质量，地上部分质量为研 究对象，以减产1 0 为指标。重金属c d 毒害土壤的临界浓度分别为： 2 0 1 9 m g k g - 1 ，18 5 2 m g k g - 1 ，15 6 3 m g k g 1 ，1 9 2 9 m g k g 1 。 2 、盆栽试验中，土壤中有效态c d 和全c d 的含量与添加的c d 浓 度显著相关，相关系数分别为：闻9 9 9 4 料；间9 8 4 6 料。按照国家卫 生标准蔬菜中c d 含量o 2 0 m g 埏以为限量标准，依据土壤有效态c d 与 小白菜茎根中有效态c d 的含量回归方程，求出c d 污染土壤的临界浓 度分别为3 3 4 m g k 9 1 ，3 6 8 m g k 分1 。 3 、土壤细菌，真菌，放线菌的数量及土壤呼吸强度随着c d 浓度 的增加而降低。以细菌数量、真菌数量、放线菌数量、土壤呼吸强度的 抑制率的5 0 为准，其临界浓度分别为：5 0 8 m g k g - 1 ；2 5 9 m g k 9 1 ； 5 8 9 m g k 昏1 ；3 2 0m g k 百1 。 t 4 、高浓度的c d 对蔗糖转化酶和脲酶有较强的抑制作用，但是低浓 度的c d 却有轻微的刺激作用。按抑制率2 5 为指标，则土壤脲酶，蔗糖 转化酶的临界浓度分别为：2 8 1 l n g 埏，3 6 8 m g k g - 1 。 5 、土壤添加重金属c d 会抑制t 3 明亮发光杆菌的发光程度，且抑制率 与添加c d 的浓度呈正相关，由此计算出得出c d 的e c 。o 值为2 4 3n 培k g - 1 口 添加c a 2 + 、k _ 、m 矿后，c d 对t 3 明亮发光杆菌的毒性减弱，且k + m 9 2 + c a 2 + 。添加有机酸后，t 3 明亮发光杆菌的相对发光强度与对照相比显 著增强。说明添加有机酸减弱c d 对细菌的生物毒性，且解毒能力为酒石 酸 草酸。 6 、各指标体系对土壤c d 的敏感程度为：发光菌 土壤酶类 土壤植 物c d 的含量 土壤微生物 小白菜的农艺性状。由于发光菌，真菌和脲 酶对c d 的毒性比较敏感，且这三个指标之间相关性比较好，因此，可以 综合应用土壤中c d 的总量，发光菌指标，真菌数量指标，脲酶活性指标 作为土壤重金属c d 污染程度的评价指标，来指示土壤中c d 的污染状况。 关键词：重金属c d复合指标发光菌 i l s t u d i e so nt o x i c i 锣i n d e x e so fc a d m i u mc o n t a m i n a t i o ns o i l z h a ox u e m e i ( c o l l a g eo fa 西c u l t l l r e ，g u a l l 鲥u n i v e r s i t ) r ，n a n g i l i n g5 3 0 0 0 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t 1 1 1 i ss t u d yw a sp e r f o m l e db yu s i n gt h ec a b b a g e ( b 麟s 泐如加绷话) 嬲m a t e r i a lu n d e rt h ep o te x p e r i m e n tt oi n v e s t i g a t em ee 仃e c t so fe x t e m a l a d d i t i o no fd i 归氏玎e n tc a d m i 啪1 e v e l so nm es o i lf o m a s s ，s o i lm i c r o b i a l ， s o i le m 可m e s ，s o i lc h e m i c a la 1 1 ds o i lb i o l u m i n e s c e n c eb a c t e r i ai n d i c a 幻r s ， a n dt oc o n l p r e h e n s i v e l ya n a l y z et h eg r e a 仃1 e s so ft h et o ) 【i c i 够o fc a d m i u mm t h ec o n t 锄i n a t e ds o i l t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： l 、u n d e rt h ed i 脑e n tc o n c e n t r a t i o n so fc a d m i u m ，恤p l a n th e i 出，也e b i o m a s s ，m er 0 0 tq u a l i t y ，t 1 1 ea e r i a lp a r tq u a l i 够，t l l er o o t s h o o tr a t i oh a sa n e g a t i v ec o n e l a t i o nw i 廿l l ei n c r e a s i n go fc a d n l i u mc o n c e n t r a t i o n a st h e o 巧e c t i v eo f t h es m d y ，w i t hr e d u c e s 恤p r o d u c t i o nb yl o ；瞒t h ei n d i c a t o r s ， 田1 ec f i t i c a lc o n c e n t r a t i o n sf o r l eh e a v ym e t a lc a d i n i 啪t 0c o n t a m i n a t et h e s o i la r e2 0 1 9 m g 蚝，1 8 5 2 m g k g 1 ，1 5 6 3 m g k g - 1 ，1 9 2 9 m g k g 1 r e s p e c t i v e l y 2 、i nt i l e p o te x p e r i m e n t ，t 1 1 e s o i le f r e c t i v ec a d m i u m 锄【dm e t o t a l c 础n i u mc o n t e mh a v eas i g n i f i c a mc o r r e l a t i o nw i t ht h ei 1 1 c r e a s i n go f c a d m i u mc o n c e n t r a t i o n ，t h ec o e m c i e n t so fn l ec o r r e l a t i o n 、) i ，e r e ： 产o 9 9 9 4 橐奉；间9 8 4 6 木r e s p e c t i v e l y a c c o r d i l l gt 0n l en a t i o n a lu n i f i e d h e a l t l ls t a n d a r dv e g e t a b l e sc a d m i u mc o n t e n to 2 0 m g k 分1i sl i m i t e df o rm e s t a n d 莉，b a s i n g0 nm es o i le f f e c t i v ec a d m i u m ，m er e 孵s s i o ne q u a t i o n w i m t h ec o n t e mo fm ec a b b a g es t e ma n dr o o ti nc a d m i u m ，c o n s i d 嘶n gt h es o i l c o n t a m i n a t i o ni nc a d m i u mt h ec r i t i c a lc o n c e n t r a 矗o nw e r e3 3 4m g k 百1 ， 3 6 8 m g - k r e s p e c t i v e l y 3 、t h ea c t i v i 哆o ft h es o i lb a c t 耐a ，s o i lf h n 百 s o i la c t i l l o m y c e sa n d t h es o i l r e s p i r a t i o ni n t e n s i t ) ，d e c r e a s e dw i mt h ei l l c r e a s i n go fc a d i n i u m c o n c e n 乜a t i o n 1 ks t a n d a r ds u p p r e s sr a t eo ft h es o i lb a c t e r i a ，s o i lf h n g i ，s o i l a c t i n o m y c e sa c t i v i t y a 1 1 dm es o i lr e s p i r a t i o ni n t e i l s i 够w a s5 0 7 1 1 l e i r c r i t i c a lc o n c e n t 】m o i l s 、r e ：5 0 8m g k 分1 ，2 5 9m g k 百1 ，5 8 9m g k 分1a n d 3 2 0m g k 9 1r e s p e c t i v e l y 4 、t h eh i 曲c o n c e n 仃砒i o no fc a d m i u mh a dt h es 仃o n g 汕i b i t o 巧a c t i o no n t h es u c r a s ea n dn l eu r e a s e ，b u tl o wc o n c e n t l 眦i o no fc a d m i u mh a d l es l i g h t s t i m u l a t o 哆a u c t i o n a c c o r d i n gt 0m ei ! 1 1 1 i b i t i o n r a t e2 5 a sh l d i c a t o r t h e c r i t i c a lc o n c e n t r a t i o nf o r 廿1 ei i m i b i t i o no fs o i lu r e a s ea n ds o i ls u c r a s ew e r e ： 2 81 m g k 9 1a n d3 6 8 m g k 9 1r e s p e c t i v e l y 5 、a d d i t i o no fn l eh e a v ym e t a lc a d m i 啪i i las o i lc a ni i l l l i b i t 1 e i l l u m i i l a t i o ni n t e n s 埘o ft 3b i o l u m i n e s c e n c eb a c t e r i a ，a n d 也ei n h i b i t i o nr a ：t e h a dap o s i t i v ec o l l r e l a t i o nw i mm ec a d 】m i u ma d d e dc o n c e m a t i o n ，m u sm e e c 5 0v a l u eo fc a d m i u mi s2 4 3n 培k 9 1 a r e ra d d i t i o no ft l l ei n o 玛锄i ci o n s t 0 ) 【i c i 够o fc a d m i 啪o nt 3b i o l 啪i n e s c e n c eb a c t e r i aw e a k e n sa n dk + m 矿+ c a 2 + a f t e ra d d i t i o no fo 玛a i l i ca c i d s ，廿1 e r e l a t i v ei l l u m i n a t i o n i n t e n s i 妙o f 也e t 3b i o i u m i n e s c e n c eb a c t e i 诟c o n l p a r e dt om ec o n t r o l s i g i l i f i c a n t l yi m p r 0 v e s t h a te x p l a i n st 1 1 a ta d d i t i o no fo 唱a n i ca c i d sw e a l ( e n t h eb i 0 1 0 9 i c a lt o ) 【i c 埘o fc a d m i u m o nm eb a c t e r i aa i l dt l l ed i s i m o x i c a t i o n a b i l i t y 、糨洲ca c i d o x a l i ca c i d 6 、t h es e n s i t i v i t yo fe a c hi i l d i c a t o rs y s t e mo nt h es o i lc 础n i u mw 懿： b i o l u m i n e s c e n c eb a c t e r i a s o i le m 可m e s s o i lp l a n tb i o m a s s s o i lm i c r o b i a l ， s o i la 鲥c u l t u r a ls t a t u s a sb i o l u m i n e s c e n c eb a c t e r i a ，f 吼百a 1 1 du r e a s ew e r e c o m p a r a t i v e l ys e n s i t i v em et o x i c i t yo fc a d m i u ma i l dm er e l a t i o nb e t 、e e n t 1 1 e s et l l r e ei 1 1 d i c a t o r sw a sb e t l | e r s ob i o i u m i n e s c e n c eb a c t e r i a 证d i c a t o r ，如n 酉 m m l b e r 访d i c a t o r 切旧a s ev i t a la c t i v 时i n d i c a t o rc a nb ec o n l p r e h e n s i v e l y a p p l i e d 髂m ei i l d i c a t o rt o 嬲s e s sm et o x i c 时o f t h es o i lh e 鲫ym e t a lc a d m i u m c o n t a m i n a t i o n ，t 0m d i c a t em es i t u a t i o no fm ec o n t 锄i n a t i o no fm es o i lb y c a d m i u m k e yw o r d s ：h e a 、侈m e t a l c a d m i u mi n d i c a t o rb i o l u m i n e s c e n c eb a c t e r i a v 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究 工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：匙雩确 日期：2 0 。g 年月z 弓日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不 以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论 文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索 与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢 利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。留不保密。 学位论文全文电子版提交后： 曰同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名：丝：翌堑 日期：2 垒叁。五：奎差 导师签名： 日期： 硼占多二3 金属c d 污染土壤毒性的复合指标的研究 1 前言 随着工业生产，特别是乡镇企业的发展，农村环境迅速恶化，污水灌溉、工厂 排放的废气飘尘、化肥和农药的施用、汽车尾气中的p b 、c d 及污泥和城市垃圾等 原因造成农业生态领域的重金属污染日益严重( 刘恩玲等，2 0 0 6 ；陈怀满等，19 9 9 ) 。 据报道，目前中国受重金属污染的耕地面积占全国耕地总面积的2 0 ，约为2 0 0 0 万h l n 2 ，约占耕地总面积的1 5 ，其中工业“三废”污染1 0 0 0 万耐，农田污灌面积已 达1 3 0 多万l u n 2 。每年因土壤污染而减少的粮食产量高达1 2 0 0 万t ，直接经济损失达 2 0 0 多亿元( 韦朝阳，陈同斌2 0 0 1 年) 。某省曾对4 7 个县和郊区的2 5 9 万公顷耕地( 占 全省耕地面积的五分之二) 进行过调查。其结果表明，7 5 的县已受到不同程度的 重金属污染的潜在威胁，而且污染趋势仍在加重( 俞铮，2 0 0 4 ；陈同斌，2 0 0 3 ) 。导 致土壤污染的重金属主要包括舢、c d 、c o 、c r 、c u 、h g 、m n 、n i 、p b 、z n 等， 一般为几种重金属的复合污染( 韦朝阳，陈同斌2 0 0 1 年) 。由于土壤重金属污染具有 隐蔽性，长期性和不可逆性的特点，因此能够长期存在于土壤中。据a l l 踟，a y 的估 算，进入士壤的重金属，在没有外来继续进入，只通过植物吸收使其在土壤中消失 的时间：a s 和c d 为1 0 0 年。c u 、m n 和z n 为1 0 0 0 年；c o 、p b 、n i 为1 0 0 0 0 年( 陈 志良，2 0 0 1 ) 。进入土壤的重金属因其不可降解的性质而在土壤中累积到一定程度 会影响植物的生长和发育，进而影响农作物的产量，并通过各种途径对环境产生危 害、甚至污染食物链、危害人类健康，所以土壤的重金属污染及其控制引起了广泛 的关注。由于受重金属污染的土壤中往往伴有多种重金属元素及元素之间的交互作 用，而且，土壤与人体之间的物质平衡关系比较复杂，污染元素是通过食物链进入 人体危害健康，所以土壤重金属污染的标准难以确定。目前存在的重金属毒性检测 方法中，植物指示法虽然最能准确检测出土壤中重金属对植物体引发的毒性效应， 但植物的生长周期比较长，而且易受外界因素的干扰。动物法主要是通过将原生动 物饲养在污染的土壤中，通过其生理，生化和死亡等指标，进行污染土壤的毒性研 究，这类方法受到动物本身的影响而且费用昂贵。传统的微生物法利用细菌的生长 状况或死亡率作为测定环境中毒物的指标，但是需要较长时间。因此，发展新的快 速、准确、合理评价重金属的毒性的有效方法显得非常迫切、必要。 广西大掌硕士掌位论文 金属c d 污染土壤毒性的复合琳纠冢的研究 1 1 土壤重金属的生物有效性 在土壤环境污染物毒性评价中，重金属的生物有效毒性比重金属的总量更能反映 出重金属对环境的危害( t i 岫p 比i n e ne ta l ，2 0 0 3 ) 。重金属的生物有效性是指重金属 能对生物产生毒性效应或被生物吸收的性质由间接的毒性数据和生物体浓度数据来 评价。然而，传统的土壤毒性检测中主要是利用化学方法，即用提取剂将土壤中的重 金属消化出来然后利用化学方法或者仪器分析来检测提取液中重金属的有效量 ( a n g e l ai v 邪k ，2 0 0 4 ) 。也有些研究者利用e d l a 、醋酸来提取土壤中可溶态重金属 ( t e s s i e re ta l ，1 9 7 9 ；q u e v a u v i l l e re ta l ，1 9 9 7 ) ，认为抽提出来的这种重金属就是生物 可利用的重金属量。然而，可移动的重金属和有效生物毒性重金属完全是两个不同的 概念，它并不能正确表示重金属对生物造成的实际影响。重金属的生物有效性应该由 生物试验进行评价和表征。对于土壤中重金属的生物有效性，可采用植株中的重金属 含量、重金属的根际效应或可食部分的重金属含量来衡量，也可采用，重金属对土壤 微生物生物量，土壤代谢强度，土壤酶类活性的抑制率来表征土壤重金属污染的生物 学效应( 窦磊，彭先芝，2 0 0 7 ) 。近来，一些基于单一菌株( 例如发光菌) 的荧光性或 特异性酶活性的金属毒性测试技术( m i c r o t i d x 、m 咖l a t e 等) 被成功应用到污染物的毒 性评价中。用生态毒性剂量( e c o t o x i c o l o 西c a ld o s e ) 值定量研究污染物对微生物过程的 影响，确定影响重金属毒性的因素及对重金属污染最为敏感的土壤微生物学或生物化 学指标( m o r e 】jl e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 进入到土壤的c d ，被土壤胶体所吸附，重金属的有效性降低。土壤p h ，粘土矿 物的组成，土壤有机质和土壤中其他元素离子影响重金属的有效性。土壤溶液p h 升 高，各种重金属元素在土壤固相上的吸附量和吸附能力加强。b o e k h o l d 等( 1 9 9 9 ) 对 酸性砂土中c d 的吸附现象进行研究，发现p h 每增加o 5 个单位c d 的吸附就增加一倍； 廖敏等( 1 9 9 3 ) 的研究则表明，随p h 的升高，c d 的吸附量和吸附能力急剧上。土壤中 有机质的增加改变土壤中重金属元素的化学形态分布，增加土壤中重金属的移动性。 s i l l g l l ( 1 9 9 3 ) 利用苔藓泥炭( s p h a 印u mp e a t ) 作为有机质加入不同类型的土壤中时发 现，在沙质土壤中加入3 2 0 k g 有机质，水溶及可交换态的c d 由2 7 上升到5 4 ；而f e m n 氧化物结合态则由1 9 下降到1 3 。在其它类型的土壤中也观察到了类似的现 象。陈同斌等( 1 9 9 7 ) 研究表明，菜园土和果园土中c d 和c u ，c u 和p b 的含量呈显著 相关。由于元素之间的交互作用使得某种元素的生理效应和化学行为较之其在单体系 2 金属c d 污鞠匕壤毒性的复合巍科示的研究 中发生了很大变化。在o 3 9 8 8 9 1 0 呻l lz n 和0 0 1 0 o 3 1 6 | i m o 儿c d 的营养液中，增 加c d 的浓度可以促进莴苣嫩芽中z n 的积累。如果c d 的浓度低0 3 1 6 m o 儿，增加z n 的 浓度则莴苣和菠菜嫩芽中c d 的积累呈指数下降( 郑春荣，1 9 9 8 ) 。 1 2 植物指示法检测土壤中的重金属毒性 植物指示法是近年来发展起来的判断污染土壤重金属生物有效性的一种经济可 靠的方法，通过植物的受害症状、体内污染物含量来指示土壤重金属的生物可利用性 ( 刘俊华，薛澄泽，1 9 9 4 ) 。由于指示植物能有效吸收重金属，而且这种吸收能力取 决于土壤中重金属的生物有效性的高低，根据这种特性，人们提出依据指示植物体中 重金属元素的含量直接评价污染土壤中重金属的生物有效性。利用指示植物研究土壤 重金属污染程度，常从以下两个方面考虑：一、植物的受害症状。主要是通过肉眼观 察植物体受污染影响后发生的形态变化。生长在污染土壤中的敏感植物受污染物的影 响，会引起根、茎、叶在色泽、形状等方面的症状。当c d 进入植物体内并积累到一 定程度，会出现生长迟缓、植株矮小、退绿、产量下降等现象。例如大麦受镉污染后， 种子的萌发率、根生长速率降低。二、植物体内污染物含量。生活在重金属污染土壤 中的植物都能够不同程度地吸收一些重金属。通过分析这些植物体内重金属的含量， 可以判断污染土壤中重金属的生物可利用性，从而判断土壤受重金属污染的程度。目 前最常用的分析方法是：分析土壤中重金属有效态含量与植物吸收重金属的量的相关 性，从而求出重金属毒害的临界浓度。 利用植物指示法来检测土壤中重金属的生物有效性在国内外已经有一些研究。 n e u b 卸e r 及s c h n e i d e r 于1 9 2 3 年首先提出用黑麦幼苗法来检测土壤中营养元素的有效 性。这是一种植物短期密集吸收的方法，它使用了密集种植技术，以大量的高等植物 幼苗，在控制温度、水分、光照等条件下生长在少量土壤及纯净石英砂的混合物中， 由于黑麦幼苗根系十分发达，根与土壤充分接触，在短时间( 2 周) 内耗竭了土壤中 各元素的有效成分，所以可测定土壤中元素的生物有效性。薛澄泽( 1 9 9 5 ) 将黑麦幼 苗法应用于环境化学领域测定污染元素的生物有效性杨林书，王宏康等( 19 9 5 ) 用 小麦幼苗毒性指标表征土壤c d 染的研究。p e n u z z e l i ( 1 9 8 7 ) 也曾利用小麦幼苗法对粉 煤灰中重金属的生物有效性进行了测定。孟昭福，张增强等( 2 0 0 1 ) 利用小麦替代黑麦 幼苗测定土壤中重金属生物有效性。方学智等( 2 0 0 5 ) 研究不同浓度c d 对小白菜生 长及抗氧化系统的影响，结果表明，c d 浓度为0 o lm g l d 时促进小白菜生长：c d 浓度 广西大学蛹更士掌位沧。文 金属c d 污蔡土搠u 参性的复合指标的研究 为l om g l - l ，抑制小白菜的生长。周青，彭方睛等( 1 9 9 7 ) 研究c d 对小白菜生长的影响 与l a g l y 的防护效应，。研究表明，根施2 0 0m g l 1 的c d c l 2 能严重抑制小白菜生长。孙 光闻，朱祝军( 2 0 0 4 ) 研究不同c d 水平对白菜生长及抗氧化酶活性的影响，研究结 果表明：c d 的浓度为1 m g l - 1 对白菜生长及叶绿素含量无显著影响，当c d 的浓度为 1 0 m g l 1 显著抑制植株生长减少叶绿素含量。因此，小白菜对c d 是一种比较敏感的植 物。 1 3 土壤微生物和酶类及生化活性指示土壤中的重金属毒性 1 3 1 土壤微生物和酶类指示土壤中的重金属毒性 土壤微生物和土壤酶是农田微生态系统的重要组成部分。土壤微生物作为分解 者参与生态系统的能量流动和物质循环，是土壤生物群落中种类最多的一种。土壤 中大部分的生物化学转化过程是由微生物的活动引起的，土壤微生物在土壤物质转 化中具有多种重要功能，不仅对土壤的发生、发育、土壤肥力的形成和植物营养元 素的迁移转化起着重要作用，而且也对土壤中污染物的分解和净化、重金属和其它 有毒元素的迁移转化起着不可忽视的作用( 杨景辉，1 9 9 5 ) 。而微生物由于其在土壤 中普遍存在并对环境条件变化的敏捷反应而成为最显著类群，被认为是最有潜力的 敏感性生物指标之一。因此，对土壤微生物的影响己成为评价重金属毒性的一个重 要指标，也是生态毒理学研究的热点之一( h a 玎i u s 0e ta l ，1 9 9 7 ；朱鲁生等，2 0 0 2 ) 。e 土壤酶是由微生物、动植物活体分泌及由动植物残体、遗骸分解释放于土壤中 的一类具有催化能力的生物活性物质。和土壤微生物一样，土壤酶也是土壤的重要 组成成分之一，参与包括土壤中的生物化学过程在内的自然界物质循环。土壤酶的 酶促作用，是在土壤颗粒、植物根系和微生物细胞表面上发生的，具有与环境的统 一性( 张咏梅等，2 0 0 4 ) 。而酶作为一种蛋白质，其活力受到多种因素的影响。由于 土壤酶活性对生态环境变化的相对敏感性，所以土壤酶活性也可被作为土壤污染的 重要生物活性指标之一( 杨万勤等，2 0 0 2 ) 。 c d 对土壤的微生物活性、土壤物质的转化也有一定的影响。中科院地理研究所 主持的国家“七五 攻关项目对重金属对土壤中微生物数量、酶活性影响及其临界 毒害浓度进行了较为深入的研究( 夏增禄，1 9 8 6 ；1 9 9 1 ) ，许炼峰( 1 9 9 3 ) 报道，在土壤 中添加不同浓度的c d ，对土壤中的细菌、真菌、放线菌和固氮菌都表现出不同程度 的抑制作用，有的表现在低浓度，有的表现在高浓度。在水稻土中固氮菌和真菌对 广西大掌硕士掌位。论文 金属c d 污染土壤毒性的复合指标的研究 c d 的毒害比较敏感。c d 对土壤酶的活性有的起抑制作用，有的起激活作用。有研究 报道，水稻盆栽土壤中c d 为l m g k 9 1 时，对脲酶、磷酸酶、蔗糖酶有抑制作用( 何念祖 和孙其伟，1 9 9 3 ) 。另外有研究表明，当水溶性c d 超过1 1 0m g k 9 1 时，细菌与放线菌 数量下降，而真菌数量上升：土壤酶活性发生了变化，转化酶活性下降，而蛋白酶活 性上升( 何念祖，孙其伟，1 9 9 3 ) 。 1 3 2 土壤呼吸强度指示土壤中的重金属毒性 c d 污染对土壤生态系统具有破坏性影响，能够降低土壤微生物的数量和活性， 改变土壤微生物群落特性，影响土壤呼吸速率( 顾宗镰等，1 9 9 2 ) 。呼吸作用一般通过 测量消耗的0 2 或释放的c 0 2 来测定，土壤呼吸强度是报道最早也是报道最多的指标之 一。在大多数情况下，当重金属浓度较低时，对呼吸作用没有影响，而在高浓度下， 呼吸作用受到抑制。一些重金属和农药等污染物能强烈抑制土壤呼吸作用，然而这种 影响通常是短暂的，呼吸作用很快得到恢复，a 嘶胁( 1 9 7 1 ) 用克菌丹证实了这点。 谢晓梅( 2 0 0 2 ) 等发现，红壤加c d 培养后，土壤微生物生物量c ( c m i c ) 呈线性降低，其 中有机质含量较低的土壤微生物生物量c 的降低速率比有机质含量高的土壤更大。其 原因一方面可能是因为有机质含量丰富的高肥力土壤对c d 有较高的吸附和固定能 力，能降低土壤中c d 的有效性及对微生物生物量的负面影响：另一方面，有机质含量 丰富的土壤也能为微生物生长提供更充足的能源，促进微生物的生长和恢复。杨居荣 等( 1 9 8 2 ) 和谢晓梅( 2 0 0 2 ) 都发现，c d 还能降低土壤微生物数量，并改变微生物的种群 结构。在草甸褐土上，当添加c d 达到3 m g k 矿1 时，细菌总量开始减少。c d 对土壤微生 物基础呼吸量也产生影响，不过这种影响主要发生在c d 加入土壤后的前4 0 d 内，随着 培养时间进一步延续，微生物基础呼吸量会逐渐恢复，到最后可以接近未受c d 污染 的对照水平，原因可能是长时间c d 胁迫能激发土壤微生物的基础代谢，单位微生物 的代谢墒增大，因而土壤微生物基础呼吸量在总体上得到恢复上升( 谢晓梅，2 0 0 2 ) 。 1 3 3 发光细菌法检测土壤中的重金属毒性 发光细菌法属于生物学检测方法，它通过检测土壤一水悬浮液中发光菌的发光 强度来反映检测体系中的污染状况。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈 代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定。与传统的方法 相比，发光菌法能很好的检测出土壤中重金属的生物有效毒性，且有毒物质仅干扰 发光细菌的发光系统，具有快速、简便、灵敏、成本低、检测下限低等优点，所以 广西大掌硕士学位论文e 金属c d 污染土壤毒；性的复合指标的研究 利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质，在国内外越来越受到重视。我 国于1 9 9 5 年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法( g b r 1 5 4 4 1 一1 9 9 5 ) ( 李彦 文，2 0 0 3 ) 。 p f e i 勋( 1 9 9 2 ) 等认为地下水和地表水是土壤污染物分配的主要途径，所以土 壤污染引起的危险可以由土壤提取液的毒性估计。在试验室中将1 0 9 风干土与4 0i i l l 去离子水混合，振荡1 6h ，过滤、离心，1 5m i n 后进行生物毒性测定，根据剂量一效 应关系得出e c 5 0 为0 2i n g l 1 。s 硼a l l 撇( 1 9 9 9 ) 等用此法测定了t n t 污染土壤的 毒性，得出i c 5 0 为0 9 4m g k 分1 。我国这项研究开始于1 9 8 1 年，中国科学院南京土壤研 究所顾宗濂等对此方法进行了最早的研究。 1 3 3 1 发光细菌法的广谱性检测原理 研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，是由特异性的荧光酶 ( l e ) 、还原性的黄素( f m n h 2 ) 、八碳以上长链脂肪醛( r c h o ) 、氧分子( 0 2 ) 所参与 的复杂反应，大致历程如下： f 帆十l e f 心 2 l e十0 2 营l e f m n h 2 0 2 十 r c h o l e f 加呲0 2 r c h o l e 十f m n 十h 2o 十r c o o h 十光( 4 9 0i l i l l ) 概括的说就是，细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原 态的黄素单核苷酸( f m n h 2 ) 及长链脂肪醛氧化为f m n 及长链脂肪酸，同时释放出 最大发光强度在波长为4 5 0 4 9 0 眦处的蓝绿光。其中三步反应产生三种中间产物， 寿命极短，很难分离出来。当土壤中重金属含量增加，对细菌代谢产生阻碍时， f m n h 2 的量势必减弱，从而直接导致发光强度减弱。因而光强衰减程度与代谢阻 碍物的浓度呈负线性关系。所以，测定细菌的发光强度就能够方便地得出相应有毒 物质的浓度( 杜宗军、王祥红2 0 0 3 ) 。通常用e c 5 0 ( e 船c t i v ec 0 i l c e 劬瞰i o n5 0 ) 值 来比较各检测体系的污染状况，它表示细菌发光强度减弱至正常光强5 0 时所需 要的污染物量。e c 5 0 值越小，则说明检测物的毒性越大。 1 3 3 2 发光细菌法的特异性检测原理 特异性重金属发光检测法是为检测环境中特定重金属而设计的，利用生物传感 器的原理进行工作( l e 谢se ta l ，1 9 9 8 ) 。它包含两个相连的基因元件，个是e c e p t o r 称为生物敏感元件，令另一个是r e p o r t e r 称为报告基因。前者主要是一些可被特异 6 广西大掌硕士学位论文重金属c d 污染土壤毒性的复合指标的研究 性结合的调节单元，通常是由一个或一组基因构成，主要来源于各种抗重金属的细 菌( s i l v e r ，1 9 9 8 ，李宗义，2 0 0 5 ，李彦文，2 0 0 3 ) ，后者主要用于产生检测信号。 u l c d l i - ， z c a 图卜1 金黄色葡萄球菌c 口吠一操纵子的抗性机制( s h e t t ye ta 1 2 0 0 3 ) f i g 1t h em e c h a n i s mo ft h ec 口c 矛c 么c dr e s i s t a n c eo p e r o ni n 霈( 翠7 矗) ，肠c d c c 甜s 口“，| p “s 图1 说明了感应单元的原理，有助于了解r e c e p t o 卜r e p o r t e r 生物传感器是如何工 作的。图为金黄色葡萄球菌中与c d 相关的c 口d c 么操纵子的抗性机制( s h e 竹e ta 1 ， 2 0 0 3 ) ：在没有c d 离子存在的情况下，c 口犯编码的蛋白c 白犯结合在启动子p 剃 上，阻碍吠蛋白的表达；而当c d 离子存在，c a d c 蛋白与之结合而不再阻碍 c 口吠m 基因的正常转录翻译，从而产生幽蛋白并将相应金属离子排出体外。重 金属c d 与犯调节蛋白结合导致了启动子如d 的开启，而c d 量决定了j p 删的启 动情况。假若在尸删后面外加一个信号基因，使之在尸删的控制之下同时表达，那 么通过检测发光信号就可以方便的获知p 阳d 启动情况，从而间接了解到细胞体内 c d 量的多少。这就是r e c e p t o r - r e p o r t e r 生物传感器的基本工作原理。 在不同的生物传感器中生物敏感单元是不同的，但是对于构建每一种重金属生物 传感器来说又是独一无二和特异的，在正常条件下合成特异性蛋白质或荧光物质，进 而通过信号的强弱来检测环境中重金属的含量( s a b i n ek 6 h l e r ，2 0 0 0 ) 。利用这个原 理，通过三亲杂交的方法构建不同重金属的生物传感器。目前，已经构建了汞、砷、 7 否 e 金属c d 污染土壤毒性的复合指标的研究 c d 、铁、铜、铝等物质依赖性的基因工程发光菌，用于环境中此类物质的检测。 目前，我国在利用发光菌法检测土壤重金属的含量还处在广谱性检测阶段。由 于毒性检测法反映的信息是体系中污染物毒性的影响，它不能区分出复杂检测体系 中某一特定污染物。但是自然界实际水体和土壤环境中往往不可能只存在单一的污 染物，若要检测土壤受到那种元素的毒害，必须利用特异性的发光细菌检测法。 1 4 本研究的目的和意义 镉( c d ) 是毒性最强的重金属之一，其迁移性强，极低浓度就会对生物体产生危 害。在地壳中c d 的含量较少，地壳中各类岩石中的平均含量约为0 2m g k g 1 ( 何念祖， 孙其伟，1 9 9 3 ) ，多数土壤的c d 含量范围一般为o 0 卜2 0 0 m g 蚝d 平均值为0 3 5m g k g 。 土壤中的c d 可以通过作物吸收并在体内积累，进而进入食物链，危害人类身体健康。 6 0 年代于日本富山县爆发的“骨痛病”，其原因就是当地居民长期食用了含c d 废水污 染土壤所产生的“c d 米”所致。因此，本研究主要进行c d 污染土壤的毒性研究。， 研究表明蔬菜中重金属污染主要来自蔬菜土壤中，因此，对蔬菜地土壤重金属环 境重量进行评价研究，确定其污染水平，对防止污染，保障人体健康有十分重要的意 义广西南宁市的蔬菜生产具有得天独厚的气候条件，南宁市属于亚热带地区，四季 温和，在城郊地区大多以种菜为主，据报道，2 0 0 5 年，南宁市蔬菜种植面积1 4 2 万h m z ， 到2 0 1 0 年蔬菜种植面积发展到1 6 万h m 2 ，但随着工业、交通运输等的发展，南宁市蔬 菜地的土壤环境不同程度地受到影响，而蔬菜是人们生活中不可缺少的副食品，是重 金属进入人体重要途径之一，其重量的优劣直接关系到人们的身体健康，市民对无污 染蔬菜问题越来越关注。因此，本文以小白菜为研究对象，通过检测植物体内重金属 的含量，来表征土壤中重金属的生物有效性。 关于土壤重金属污染目前存在土壤重金属污染评价指标主要有：土壤重金属总 含量，有效含量，土壤酶活性以及动物，微生物及植物中毒临界含量等。但是，都不可 避免地都存在一些问题，传统方法在标准化和快速性方面还不能满足实际的需要，此 外，由于土壤生态系统的复杂性，土壤中重金属的毒性与土壤理化性质及生物学性质 密切相关，而目前单一的重金属的评价的指标存在着一定的局限性，因此，寻找更为 合理的指标成为重金属污染土壤评价趋势。本研究试图通过重金属c d 污染土壤的各 毒性指标来评价土壤重金属污染状况，并寻求重金属污染的复合指标来综合分析重金 属污染土壤的毒性。 3 金属c d 污染土壤毒佳的复合指标的研究 2 试验材料与方法 2 1 试验材料和仪器 菌株：t 3 明亮发光杆菌咖忍d 幻6 础幼f 姗lp 办唧办d 陀“m 夕冻干粉，购于南京土 壤研究所 植物材料：黄秧四季脆小白菜( 觚泐以加p 珊捃) ，购于南宁市农科院蔬菜种 子公司。 重金属试剂：c d c l ：5 2 h 2 0 分析纯购于广西南宁市恒因生物试剂有限公 司 土壤：供试土壤为赤红壤，采自广西大学农场北部菜园，0 2 0 c m 表层土壤， 其理化性质见表2 1 仪器：d x y 2 型生物毒性测试仪，由中国科学院南京土壤研究所研制 火焰原子吸收分光光度计( 上海，上分一惠普) 表2 1 供试土壤的主要理化性状 t a b l e2 一ln e p r 0 r t i e so f t h et e s t e ds o i l s 2 2 试验设计 通过外源添加的c d ，人为制造加不同c d 浓度的污染土壤，在盆栽试验的条件 下，通过作物的毒性指标，土壤微生物指标，土壤酶指标，发光菌指标来分析c d 对土壤的污染状况来设计的试验。 9 e 金属c d 污染土壤毒性的复合指标的研究 2 2 1 土壤盆栽试验设计 土壤盆栽试验设在广西大学植物营养学土培试验大棚内进行，采用白色塑料盆 ( 高2 0 c m ，直径1 5 c m ) 进行种植，盆底部有3 个圆形小洞，并配有1 5c m 的塑料 垫，防止漏水。每桶装土3 5 k g ，同时施用基肥，基肥施入量为n0 3g k g 一、p 2 0 5 0 2g k 分1 、k 2 00 3 9 l ( g ，并以水溶液形式将c d c l ：按照试验要求均匀喷