（法医学专业论文）fas蛋白表达与大鼠脑挫伤时间推断的研究.pdf

重庆医科大学硕士研究生学位论文 f a s 蛋白表达与大鼠脑挫伤时间推断的研究 摘要 目的：探讨f a s 蛋白在大鼠脑挫伤后不同时间的表达规律，为法 医学损伤时间推断提供帮助。 资料和方法：健康s d 大鼠9 0 只，雌雄不拘，个体质量为2 5 0 , - - 一3 0 0 9 ， 4 , - - 6 月龄。实验动物按随机分组原则分为3 组：损伤组6 5 只( 分为0 5 ， 6 ，1 2 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 ，1 2 0 ，1 6 8 ，3 3 6 h 时间段，其中做稳定性实验1 5 只) ， 假损伤对照组2 0 只，正常对照组5 只。损伤组应用改良f e e n e y 自由落体 法，建立脑挫伤动物模型；假损伤对照组钻骨暴露硬脑膜后不进行打 击操作；正常对照组大鼠不做特殊处理，直接处死。应用免疫组织化 学染色方法和图片分析软件i m a g e p r op l u s 6 o 对脑挫伤后相应时段皮 质和海马区的f a s 蛋白表达( a 0 值) 进行检测，并做f a s 表达高峰时间的 稳定性实验。实验结果所澳j j a o 值用均数标准差( x s ) 表示，统计学 组间比较采用方差分析及检验。 结果：假损伤组、正常组以及损伤组伤后0 5 小时大鼠脑组织中未 见f a s 的阳性表达，而损伤组于伤后3 0 m i n 开始表达，浓度逐渐升高， 至伤后1 2 h 表达明显增加，其后维持高水平并继续增加，至伤后4 8 h 表达 达峰值，随后逐渐下降，伤后1 4 d 表达基本消失，皮质区和海马区表达 规律相同。经统计学计算，3 0 m i n 后损伤组各时间段f a s f r 性表达与对 照组( 正常组和假损伤组) 差异具有统计学意义( p o 0 5 ) ；损伤组内各 时间段海马区表达强于皮质区( p o 0 5 ) ，证明死后5 d 内f a s 蛋白表达 稳定持久。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 结论：f a s 在大鼠脑挫伤后表达规律稳定，可以作为法医病理学脑 损伤后损伤时间推断的一项较可靠指标。 关键词：脑挫伤，f a s ，免疫组织化学，损伤时间推断 重庆医科大学硕士研究生学位论文 as t u d yo ft h ef a sp r o t e l ne x p r e s s i o ni n e s t i m a t i o no ft l m es i n c eb r a i ni n j u r yi nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n q u i r et h ee x p r e s s i o no ff a sa f t e r b r a i ni n j u r yi n r a t s ，i no r d e rt op r o v i d ee x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o re s t i m a t i o no ft i m es i n c el n j u 叫o ff o r e n s i cm e d i c i n e m e t h o d s ：9 0s dr a t s ，w h i c hw e r eh e a l t h y , w e t2 5 0 - 3 0 0 9 ，4 6m o n t h s o l da n dw e r ei g n o r e dt h e i rs e x ，w e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t ot b ig r o u p ( 6 5 r a t s ，15o ft h e6 5r a t sw e r eu s e dt os t u d yt h es t a b i l i t yo ft h ef a se x p r e s s i o na t t h ep e a k ) ，f a k eo p e r a t i o ng r o u p ( 2 0r a t s ) a n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p ( 5r a t s ) t h et b ig r o u pw a sh u r tb yf r e e l yf a l l i n gb o d yp e r c u s s i o n ，a n dw e r ek i l l e d r e s p e c t i v e l ya t0 5 ，6 ，12 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 ，12 0 ，1 6 8a n d3 3 6h o u r sa f t e r i n ju r y t h ef a k eo p e r a t i o ng r o u pw a so n l ye x p o s e dc e r e b r a ld u r am a t e rb y d r i l l ，a n dw a sn o th u r t t h en o r m a lc o n t r o lg r o u pw a se x e c u t e dd i r e c t l y w i t h o u ta n yo p e r a t i o n t h ee x p r e s s i o no ff a si nt h ec e r e b r a lc o r t e xa n d h i p p o c a m p u sw a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dt h er e s u l t sw e r e a s s e s s e db ya n a l y s i ss o f t w a r ei m a g e p mp l u s 6 0 w ea l s os t u d i e dt h e s t a b i l i t yo ft h ef a se x p r e s s i o na tt h ep e a k t h er e s u l t sw e r ee x p r e s s e da s m e a n + s d ( x 土s ) a n dt e s t e da n a l y s i so fv a r i a n c ea n dv i at - t e s t r e s u l t s ：w ed i dn o td e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no ff a sp r o t e i ni nf a k e o p e r a t i o ng r o u p ，n o r m a lc o n t r o lg r o u pa n dt b ig r o u pi nt h i r t ym i n u t e s a f t e ri n j u r y t h ef a sp r o t e i nb e g a nt oe x p r e s sa f t e rt h i r t ym i n u t e si nt b i g r o u p ，a n dt h e ni ti n c r e a s e dg r a d u a l l y , r e a c h e dp e a ki nf o r t y e i g h th o u r s a f t e ri n j u r y , t h e nd e c r e a s e dg r a d u a l l y f i n a l l y , i tr e t u r n e dt ou n d e t e c t a b l ei n f o u r t e e nd a y s t h er e g u l a r i t yo ft h ef a se x p r e s s i o nb e t w e e nt h ec e r e b r a l c o r t e xa n dh i p p o c a m p u sw a ss i m i l a r a n ds t a t i s t i c sa n a l y s i ss h o wu s ：t h e 5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 f a se x p r e s s i o no ft h et b ig r o u pa f t e rt h i r t ym i n u t e sw a ss i g n if i c a n t l y h i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ( f a k eo p e r a t i o ng r o u pa n dn o r m a lc o n t r o lg r o u p p o 0 5 ) ；t h eh i p p o c a m p u sw e r eh i g h e re x p r e s s e d t h a nt h ec e r e b r a l c o r t e x ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：t h ef a sp r o t e i nc o u l db e u s e da so n eo fr e l i a b l e i n d i c a t i o n si ne s t i m a t i o no ft i m ea f t e rb r a i ni n j u r y k e yw o r d s ：b r a i nc o n t u s i o n ，f a s ，i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ， e s t i m a t i o no ft i m es i n c ei n j u r y 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 p c d a i c d f a d d d e d d i s c h e i h c f p a c n s s e a o a o i l o d d w b c b i t s d d a b t b i d d a p o 一1 s a b c a a n k p b s 符号说明 英文名称中文名称 p r o g r a m m e dc e l ld e a t h程序性细胞死亡 a c t i v a t i o n - i n d u c e dc e l ld e a t h 激活细胞诱导死亡 f a s - a s s o c i a t i n gp r o t e i nw i t hd e a t hd o m a i n f a s 相关蛋白 d e a t he f f e c t o rd o r m a i n 死亡效应器结构域 d e a t h i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x死亡信号诱导复合体 h e m a t o x y l i ne o s i n苏木精伊红 i m m u n o h i s t o c h e m i s t n ，免疫组织化学 p a r a f o r m a i d e h y d e多聚甲醛 c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 中枢神经系统 s t a t u se p i l e p t i c u s 癫痫持续状态 a v e r a g eo p t i c a l平均光密度 a r e ao f i n t e r e s t 感兴趣区域 i n t e g r a t e do p t i c a ld e n s i t y 累计光密度 d a t i n go f w o u n d 损伤时间推断 b r a i nc o n t u s i o n 脑挫伤 b r a i ni n j u r y 脑损伤 t h et i m es i n c ed e a t h 死亡时间 d i a m i n o b e n z i d i n e 二氨基联苯胺 t r a u m a t i cb r a i ni n j u r y 脑外伤 d e a t hd o m a i n 死亡结构域 a p o p t o s i sf i r s ta n t i g e nf a s 蛋白另一名称 s t r e p t a v i d i nb i o t i nc o m p l e x链酶亲和素过氧化合物 a m i n oa c i d 氨基酸 n a t u r a lk i l l e rc e l l 自然杀伤细胞 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e磷酸盐缓冲液 重庆医科大学硕士研究生学位论文 t n f n g f s a p k m l n h d p c r i 汀 f p s d t u m o rn e c r o s i sf a c t o r n e r v eg r o w t hf a c t o r s t r e s sa c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m i n u t e h o u r d a y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s et r a n s c r i p t a s e f o r e n s i cp a t h o l o g y s t a n d a r dd e v i a t i o n 2 肿瘤坏死因子 神经生长因子 应激活化蛋白激酶 分钟 小时 天 聚合酶链反应 逆转录酶 法医病理学 标准差 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 瓤b 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文。 论文作者签名 指导教师签名 日期 带毛施 一杖 一 n厶 d bi 飞矿 f 重庆医科大学硕士研究生学位论文 f a s 蛋白表达与大鼠脑挫伤时间推断的研究 - j - 刖舌 f a s 是一种跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子( t n f ) 和神经生长因子( n g f ) 受体家 族，与其天然配体f a s l 相结合后活化，继而通过一系列病理生理过程诱导细胞凋 亡n 3 3 。既往对于f a s 系统与疾病的研究主要集中于消化道肿瘤、肝炎、心血管疾 病、血液系统疾病、生殖系统肿瘤等，而对于c n s 疾病研究较少；新近一些研究 证实h 7 1 f a s 可能参与了一些c n s 疾病的病理生理过程，如癫痫、脑缺血、颅脑外 伤等，f a s 与c n s 疾病的关系也逐渐成为研究热点之一。 脑外伤( b r a i ni n j u r y ) 在刑事伤害案件中属常见伤和多发伤，受害者因为 伤情严重，往往陷入昏迷甚至当场死亡，在侦破中无法知道案件经过，故对脑损 伤时间的准确推断对作案时间的确定和案侦工作有很大帮助。 过去在法医实际工作中脑损伤时间推断主要通过巨体和镜下形态学改变来进 行粗略估计。近年来发现不仅仅是神经元的坏死，神经元的凋亡也参与了脑外伤 后的病理生理过程阳9 3 ，这就为脑损伤时间的推断提供了全新的研究思路。脑损伤 后凋亡因子f a s 是否表达，其规律如何，参与脑损伤的病理生理机制等都是研究 f a s 蛋白表达与脑挫伤时间推断的关系需要解决的问题。本实验通过建立大鼠脑挫 伤模型，对其伤后不同时段脑组织的f a s 蛋白表达进行半定量检测，研究其表达 规律，以期为脑损伤后损伤时间的推断提供一种可靠的指标。 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 资料和方法 1 1 一般资料 1 1 1 实验对象 健康s d 大鼠8 0 只，雌雄不拘，个体质量为2 5 0 3 0 0 9 ，4 - - 6 月龄( 重庆医科 大学实验动物中心提供) 。 1 1 2 主要仪器和试剂 1 1 2 1 主要仪器 动物模型打击台 牙科钻 切片机 净化工作台 微量加样器 加样滴头 台式离心机 恒温电烤箱 冰箱 光学显微镜 c a n o n 相机 c c d 采图仪 图片分析软件i m a g e p r op l u s 6 0 1 1 2 2 主要试剂 兔抗鼠f a s 单克隆抗体 生物素化兔抗鼠抗体 s a b c 8 自制 佛山市中熙医疗器材有限公司 l e i c a ，德国 苏州苏信设备公司 g i l s o n ，法国 北方同正生物技术发展公司 北京医疗仪器维修厂 重庆实验设备厂 中国海尔公司 o l y m p u s ，日本 c a n o n ，日本 北京航空航天大学 m e d i ac y b e r n e t i c s ，美国 武汉博士德生物公司 同上 同上 重庆医科大学硕士研究生学位论文 d a b 显色试剂盒 抗原修复液 免疫组化s a b c 即用性试剂盒 1 1 2 3 主要试剂配制 同上 同上 同上 o p b s 缓冲液：自配，p h 值：7 4 n a c ll3 7 m m o l l k c l2 7m m o l l n a 2 h p 0 4 4 3n u n o l l k h 2 p 0 4 1 4m m o l l 枸橼酸盐缓冲液：自配，p h 值6 0 枸橼酸三钠3 9 枸橼酸 o 4 9 蒸馏水 1 0 0 0 m l 1 2 实验方法 1 2 1 动物模型制备 实验动物按随机分组原则分为3 组：损伤组6 5 只，其中做稳定性实验1 5 只，假 损伤对照组2 0 只，正常对照组5 只，分组方法见表1 。实验前大鼠禁食1 2 h ，分别称 重后，用3 戊巴比妥钠( 0 1 2 m l 1 0 0 9 ) 腹腔注射麻醉，俯卧固定于打击台上；手术 刀于头正中切2 c m 长创口，剥离右侧项骨骨膜，用牙科钻于右侧顶骨钻一骨窗，直 径约为6 m m ，暴露硬脑膜并使其完整；应用改良f e e n e y 自由落体法n0 i ，以直径4 m m 的圆柱体撞杆底部接触暴露的硬脑膜，采用2 0 9 砝码从2 0 c m 高处( 冲击力为4 0 0 9 e m ) 沿外周导管呈自由落体坠落撞击圆柱体顶部，通过撞杆底部撞击硬脑膜，撞击深 度小于2 m m ，记录撞击时间，骨蜡封闭骨窗，逐层消毒，缝合头皮。假损伤对照组 钻骨暴露硬脑膜后以骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，不进行打击操作。正常对照组大 鼠不做特殊处理，直接处死。 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表1 实验动物分组( 单位：只) t a b l e1g r o u po fe x p e r i m e n t a la n i m a l 1 2 2 取材和切片 实验大鼠依据分组分别于伤后不同时间行断颈处死，处死后立即取出全脑， 用4 生理盐水冲洗脑表面积血，以脑挫伤灶为中心旁2 m m 处，冠状切除脑挫伤灶 前后端的脑组织，取材置于4 多聚甲醛溶液( 4 ) 中固定2 4 h ，做标本连续切片， 切片厚度为3 微米。其中f a s 表达最强烈的时段作死后稳定性实验，即在f a s 表达高 峰时段处死模型组大鼠，置于4 冰箱冷藏，分别于第o ，1 2 ，2 4 ，4 8 ，7 2 ，1 2 0 h 取材固定切片。 1 2 3h e 染色 h e 染色步骤： ( 1 ) 二甲苯i 脱蜡1 0 分钟 ( 2 ) 二甲苯i i 脱蜡5 分钟 ( 3 ) 无水乙醇浸泡1 分钟2 次 ( 4 ) 9 5 、9 0 、8 5 乙醇各浸泡1 分钟 ( 5 ) 自来水洗2 分钟 ( 6 ) 苏木精染色1 分钟至5 分钟 ( 7 ) 自来水洗1 分钟 ( 8 ) l 盐酸酒精分化2 0 秒 ( 9 ) 自来水洗1 分钟 ( 1 0 ) 1 稀氨水反蓝3 0 秒，自来水洗1 分钟 ( 1 1 ) 伊红染色2 0 秒至3 0 秒 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ( 1 2 ) 自来水洗3 0 秒 ( 1 3 ) 8 5 乙醇脱水2 0 秒 ( 1 4 ) 9 0 乙醇3 0 秒 ( 1 5 ) 9 5 乙醇i1 分钟 ( 1 6 ) 9 5 乙醇1 l1 分钟 ( 1 7 ) 无水乙醇i2 分钟 ( 1 8 ) 无水乙醇i i2 分钟 ( 1 9 ) 二甲苯i2 分钟 ( 2 0 ) 二甲苯i i2 分钟 ( 2 1 ) 二甲苯i i l 2 分钟 ( 2 2 ) 中性树胶封片 1 2 4 免疫组织化学染色 1 2 4 1 玻片处理及切片制备 将玻片在清洗液中浸泡2 4h ，自来水冲净后，蒸馏水冲洗，置烤箱6 0 。c 烤干 后放入1 0 多聚赖氨酸溶液中，停留3 0 s 取出，捞片后置烤箱6 0 。c ，6 0 m i n 烤干， 石腊组织切片，厚3 u m ，贴与载玻片上，5 7 烘烤6 0 m i n ，备用。 1 2 4 2 免疫组织化学染色试剂及工作浓度( 见表2 ) 表2 所用一抗来源及工作浓度 t a b l e2s a u c eo ft r i m a r ya n dd i l u t e 一抗名称来源工作浓度稀释液 f a s 兔抗大鼠( 博士德生物公司) 1 ：2 0 0p b s 1 2 4 3 染色步骤 本实验采用s a b c 免疫组织化学方法。具体实验过程及操作方法如下： ( 1 ) 切片常规脱蜡至水：恒温箱取出放入二甲苯i5 m i n - - - - - 甲苯i i5m i n 一1 0 0 酒精5m i n 一1 0 0o 6 0 酒精5m i n 一9 5 酒精5m i n - * 8 0 酒精5 m i n 一7 0 酒精 5 m i n 一自来水流水冲洗一蒸馏水冲洗5m i n 。 ( 2 ) 灭活外源性过氧化物酶：3 0 h ：0 ：1 份+ 蒸馏水1 0 份混合( 即3 ) ，室温l om i n ， 重庆医科大学硕士研究生学位论文 蒸馏水洗3 次。 ( 3 ) 抗原修复：将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热使温 度保持在9 2 0 c 一9 8 0 c 之间并持续1 0m i n ，取出容器，室温冷却3 0m i n 。 ( 4 ) 滴加正常兔血清封闭液，室温2 0m i n ；甩去多余液体，不洗。 ( 5 ) 滴加一抗( f a s ) ，4 0 c 过夜；p b s 洗5m i n 3 次。 ( 6 ) 滴加二抗( 生物素化兔抗鼠i g g ) ，3 7 0 c2 0m i n ；p b s 洗5m i n 3 次。 ( 7 ) 滴加试剂s a b c ， 3 7 0 c 2 0m i n ：p b s 洗5m i n 4 次。 ( 8 ) d a b 显色：使用d a b 显色试剂盒。取l m l 蒸馏水，加试剂盒中a ，b ，c 试剂 各1 滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间；自来水充分水洗， 蒸馏水洗5 m i n 。 ( 9 ) 脱水：7 0 酒精5m i n - - , - 8 0 酒精5m i n - - 9 5 酒精5m i n 一1 0 0 酒精5m i n 。 ( 1 0 ) 二甲苯透明，中性树胶封片；显微镜观察。 阴性对照：免疫组织化学染色过程中分别平行以p b s 代替一抗的对照染色， 以除外假阳性结果。 阳性对照：免疫组织化学染色过程用武汉博士德生物技术开发公司提供的实 验用阳性对照片作为阳性对照。 1 2 5 图像分析及统计学方法 4 0 0 倍镜下采用北航真彩型c c d 采图仪分别对免疫组织化学法染色切片进行图 片采集，每张切片的海马区和皮质区各随机采集5 个视野，利用专业图像分析软件 i m a g e p r op l u s 6 0 检测每个视野范围内阳性表达神经元的平均光密度( a v e r a g e o p t i c a l ，a o ) 值，其中平均光密度= 累计光密度阳性表达面积( a o = i o d a o i ) 。运 用统计学方法计算出每组f a s 表达的a 0 的均数( 算术均数) ，数据用均数标准差 ( x s ) 表示，以s p s s i o o 软件包进行统计学处理，组间比较采用方差分析及t 检验，以p o 0 5 为差异显著性。 2 结果 2 1h e 染色光镜下形态学改变 正常组和假损伤组均无明显形态学改变。损伤组l h 后出现脑组织疏松，血管 间歇变宽，其内可见少量红细胞，变化多不明显；6 h 后部分神经细胞胞体肿胀、 胞浆呈伊红色颗粒状，弥散分布于脑实质内：有部分切片可见神经细胞胞体固缩， 1 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文 核小而深染，以损伤灶周围多见，血管间歇内红细胞增多；1 2 h 后损伤灶周围有大 量炎症细胞( 主要为多形核白细胞) 浸润，细胞水肿加剧：损伤后7 d 以上坏死区及 白质有胶质细胞和纤维细胞肥大、增生，并逐渐机化，形成胶质疤痕，其中可见 不少含铁血黄素巨噬细胞。 2 2f a s 蛋白免疫组织化学染色结果 f a s 蛋白在大鼠脑组织中的阳性表达结果为神经细胞胞膜和胞浆内有棕黄色 颗粒沉着。正常组和假损伤组均未检出阳性表达。损伤组于伤后3 0 m i n 神经元胞 膜胞浆出现微弱少量阳性表达，其后表达迅速增强，伤后1 2 h 表达已显著增强， 随后阳性表达增长速度放缓，至伤后4 8 h 表达达峰值，随后逐渐下降，至伤后1 4 d 表达基本消失( 详细半定量分析结果见表3 ，4 ) ，其中细胞膜表达较胞浆明显，胞核 无明显表达( 见附图) 。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表3 太鼠脑挫伤后不同时段脑组织中p a s 蛋白表达( 啦，i + s ) t a b l e 3 t h ee x p r e s s i o no f f a sp r o t e i n i nc o n t u s e db r a i n l i s s n e a td i f f e r e n tp e r i o da f t e ri n j n r y ( a o r 士s 1 组别皮质区海马区 对照组( 假伤组和正常组)阴性 阴性 损伤组伤后05 h 00 4 8 00 1200 43 0 0 16 伤后6 h 00 8 0 00 0 900 9 4 00 2 0 + 伤后l2 h018 4 00 1702 19 0 0 19 伤后2 4 h02 2 6 00 13023 3 00 2 2 伤后48 h 02 4 4 00 1702 6 8 00 2 0 + 伤后72 h0 2 1 9 00 2 202 5 3 00 2 1 伤后9 6 h 0i 97 00 160 2 2 8 0 0 18 伤后12 0 h0l3 4 0 0 0 6 0 i57 0 0 l3 伤后1 6 8 h00 2 1 0 0 i50 0 3 3 00 0 9 伤后3 3 6 h阴性阴性 ，( 00 5 ，组内各时间段数据两两比较：， 0 0 5 ，组内各时间段数据两两比较；事尸 0 0 5 ，与同时段皮质区比较 o 2 7 5 o 2 7 0 2 6 5 o 2 6 0 2 5 5 迥0 2 5 呈0 2 4 5 0 2 4 0 2 3 5 o 23 0 2 2 5 o 2 2 大鼠脑挫伤4 8 h 处死后稳定性比较 拶矿芦 时问( h ) 】5 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 讨论 3 1f a s 系统的结构和生物学特性 1 9 8 9 年，西德及日本的两个科研小组分别分离出能诱导细胞凋亡的新抗原， 他们分别把这种能被抗体识别的细胞表面蛋白称为a p o l ( a p o p t o s i sf i r s t a n t i g e n ) 和f a s 。后来经分子克隆出e d n a 证明a p o - 1 矛f l f a s 是一种成份。1 9 9 3 年第5 届人类白细胞分化抗原国际会议将之定为活化抗原类的c d 9 5 。通过鉴定f a s 蛋白的 结构证明它属于肿瘤坏死因子( t n f ) 和神经生长因子( n g f ) 受体家族1 。这个家族 包括两个t n f 受体( t n f r 1 ，t n f - r 2 ) 、低亲合性的n g f 受体、b 细胞受体c d 4 0 、t 细 胞抗原c d 2 7 、t 细胞相关受体o x 4 0 、4 一i b b 和c d 3 0 等，都与细胞的存活和增殖有关。 人f a s 基因定位于1 0 号染色体q 2 4 ，1 区，包含8 个内含子及9 个外显子。c d n a 全长2 5 3 4 个核苷酸，3 端非编码区含3 个p o l y ( a ) 信号a t t a a a 序列，5 侧翼序列富含g c ，并发 现有s p l 、a p - 1 、g a f 及n f - k b 等转当因子结合序列。开放阅读框长1 0 0 5 个核苷酸， 编码由3 3 5 个氨基酸( a a ) 组成的肽链，氨基端起始处为1 6 个a a 残基组成的信号区， 故其成熟受体蛋白为3 1 9 个a a ，分子量约为3 6 k d ，其糖蛋白约4 5 k d 。f a s 属i 型跨膜 糖蛋白，胞外区含1 5 7 个a a ，含2 个n 一糖基化位点( 1 0 2 与1 2 0 位) ，由此联接多糖成 分。f a s 含3 个周期性排列的富含半胱氨酸残基的亚区，半胱氨酸残基位点高度保 守。跨膜区含1 7 f a a 。胞浆区为1 4 5 个a a ，与t n f r i ( p 5 5 ) 同源性约近5 0 ，均含有 6 0 7 0 个a a 的保守序列，与细胞死亡有关，称死亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) n 2 1 引。 f a s 在体内分布广泛，特别在肝脏、心脏、肺、肾和卵巢等组织细胞表达丰富。 f a s l 最早于1 9 9 3 年由r v o u v i e r 等发现。1 9 9 4 年s u d a 等利用亲和层析技术 从鼠细胞毒t 淋巴细胞中纯化了f a s 抗原的天然配体f a s l 。经分子克隆和a a 序列 分析证明f a s l 是一种i i 型跨膜蛋白，属于t n f 配体超家族成员n 引。f a s l 基因定位 于人的1 号染色体q 2 3 ，由5 个外显子组成，c d n a 长1 6 2 3 k b ，1 0 3 2 1 0 3 4 位的核苷 酸编码终止密码，共8 4 6 b p ，编码一个2 8 1 个a a 的蛋白。f a s l 的n 一端胞内区由 7 9 个a a 构成，其中包括3 2 个疏水氨基酸残基，n 一末端缺少信号序列，接下来的 2 3 个疏水氨基酸构成跨膜区，c 一末端胞外区由1 7 9 个a a 构成，是f a s l 分子与f a s 相互作用的部位，有3 个潜在的n 一糖基化位点，分别位于第1 8 4 位，第2 5 0 位及 第2 6 0 位的天冬氨酸残基。f a s l 在正常人体分布局限，主要在激活t 细胞、自然 1 6 重庆医科大学硕士研究生学位论文 杀伤细胞( n k ) 和免疫赦免部位有表达n 5 叫7 1 。 目前研究认为f a s 相关蛋白( f a s a s s o c i a t i n gp r o t e i nw i t hd e a t hd o m a i n ， f a d d ) 与半胱天冬( c a s p a s e ) 酶系在f a s f a s l 系统介导的细胞凋亡信号传递过程中 起主要作用n 8 3 ，其主要步骤如下：( 1 ) f a s f a s l 系统活化：f a s 与f a s l 结合致 f a s 胞内的结构d d 形成三聚体的活化形式，继而与另外一种具有d d 的f a d d 结合 形成复合体；( 2 ) 凋亡酶体的形成：复合体的形成致f a d d 活化，活化的f a d d 的n 端的死亡效应器结构域( d e a t he f f e c t o rd o r m a in ，d e d ) 能与c a s p a s e 一8 酶原结合， 并使后者激活，这样由f a s f a s l f a d d c a s p a s e 一8 串联构成的复合物称为凋亡酶 体，又称死亡信号诱导复合体( d e a t h i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x ，d i s c ) ；( 3 ) 效应型c a s p a s e 激活：d i s c 可激活c a s p a s e 家族的效应因子( 如3 因子) ，继而激活 c a s p a s e 级链反应；( 4 ) 致d n a 降解酶激活，导致靶细胞p c d 。 f a s 与f a s l 结合后激活 - f a s 的d d i ：结合f a d d 士 f a d d 的d e d 结合c a s p a s e 一8 的d e d d i s c 形成形成 c a s p a s e 3 激活 激活c a s p a s i 酶系级链反应 d n a 降解酶激活 走d f a s 系统参与细胞凋亡机制示意图2 1 3 此外，近年来研究还发现一些其它机制：( 1 ) 鞘磷脂一神经酰胺机制：f a s f a s l 通过激活一系列蛋白激酶和转录因子最后激活共同信号传递通路，致p c d ，这一过 程称为神经鞘磷脂循环乜2 1 。其转换途径的特征为鞘磷脂酶激活，水解鞘磷脂，产 生神经酰胺；神经酰胺作为f a s 信号传导的重要第二信使，可下调c m y c ，活化 p p 2 a 亚族丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶，拮抗甘油二酯并活化r a s ，从而导致p c d 。 ( 2 ) d a x x( f a sd e a t hd o m a i n a s s o c i a t e dp r o t e i n ) 机制：d a x x 是用分子克隆方 重庆医科大学硕士研究生学位论文 式发现的一种蛋白，含7 3 9 个a a ，其c 一端的1 2 个a a 可与f a s 的d d 结合，使n 一 端5 0 1 6 2 5 a a 激活c j u nn 端激酶应激激活的蛋白激酶( s t r e s sa c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ，s a p k ) 的级联反应，引起p c d 。但目前该通路的某些环节尚未完 全阐明3 。 3 2f a s 与脑损伤 3 2 1f a s 参与脑损伤机制 一些研究阻9 2 0 2 4 1 证实急性脑损伤后神经细胞的损伤不仅表现为神经细胞的坏 死，还表现为神经细胞凋亡；并且通过动物实验证实f a s 介导参与了脑损伤后神经 元凋亡等退行性病变的病理生理过程，以及脑内f a s 的浓度表达与细胞凋亡程度呈 明显的正相关。f a s 参与脑损伤后致神经细胞凋亡的作用机制可能与以下因素有关 乜5 1 ：( 1 ) 脑损伤后一些即早基因的过度表达，女i c - j u n a p - 1 的过度表达而激活其靶 基因表达，使f a s 的表达过度；( 2 ) 脑损伤后机体免疫功能异常，也可引起f a s 的高 表达；( 3 ) 某些细胞因子的作用，女i t n f - r 、t n f - a 表达的增加；( 4 ) 损伤后c a s p a s e 的过度表达，使f a s 的促凋亡作用增强；( 5 ) o i uj 等发现颅脑创伤后f a s 在大鼠和 人的脑组织中表达均升高，认为f a s 参与了d i s c 的装配，f a s 可能在脑损伤后发挥 死亡受体的作用，但脑损伤后f a s 表达增高的机制并未阐明。总之，目前相关文献 报道较少，且多还停留在动物实验阶段，f a s 参与脑损伤的具体作用机制以及病理 生理过程也有待进一步研究。 3 2 2f a s 在大鼠脑损伤后表达规律及法医学意义 本研究结果显示：正常脑组织中未见f a s 的阳性表达，而损伤组于伤后3 0 m i n 开始表达，浓度逐渐升高，至伤后1 2 h 表达明显增加，其后维持高水平并继续增加， 至伤后4 8 h 表达达峰值，随后逐渐下降，伤后1 4 d 表达基本消失，皮质区和海马区表 达规律相同。经统计学计算，3 0 m i n 后损伤组各时间段f a s 肛h 性表达与对照组( 正常 组和假损伤组) 差异具有统计学意义( p o 0 5 ) ， 证明死后5 d 内f a s 蛋白表达稳定持久；另外值得一提的是，结果显示损伤后海马区 f a s 的表达强于相应时间段的皮质区表达，其差别具有统计学意义( p o 0 5 ) ，相 关内容国内外文献尚未见报道，笔者推断可能是由于海马区较皮质区范围小，呈 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 条带状，故在采图时可供采集的范围相对局限，且在海马区f a s 阳性表达细胞高度 集中，故分析计算结果强于皮质区。 从形态学的角度讲，通过h e 染色切片推断脑损伤时间虽然可行，但是其缺点 也是显而易见的：( 1 ) 需要经过较长时间才能作出判断，伤后6 h 以上才出现较为明 显的形态学改变，出现改变较晚；( 2 ) 除脑损伤外，多种颅脑疾病均可造成相似改 变，特异性差；( 3 ) 各种变化的时相相互重叠，无明确的时间分界，而且难以定量 分析，造成检测时主观随意性较大；( 4 ) 形态学改变主要集中在损伤灶周围，可供 检测部位局限。而以上缺陷正是免疫组化检沏, l j f a s 浓度用于脑损伤时间推断的优势 所在：( 1 ) 正常脑组织中无明显阳性表达，故出现表达较易确认；( 2 ) 脑损伤后f a s 的阳性表达较早( 0 5 h ) ，大大早于形态学的改变，并且能够定量，较形态学指标更 灵敏更准确；( 3 ) 通过免疫组织化学检测方法抗原抗体特异性结合，干扰小、特异 性高；( 4 ) 死后5 d 内表达稳定，使适用检测的案例量得到保证，有利于提高分析比 较的准确性；( 5 ) 对脑损伤周围组织的皮层和海马区两个部位的观测表明：脑损伤 后在损伤组织周围各个部位f a s 表达规律相似，且呈正相关，这就为今后实际运用 中的取材提供了方便。 需要指出的是，以上实验结果是在实验室理想状态下通过动物获得，在实际 工作中还受到环境气候、人为破坏、种群差异、个体差异等因素影响。故笔者认 为，在实际运用之前还需进一步做人体实验和模拟各种复杂环境条件下的实验。 将来如能够用于实际工作中，也应综合考虑多种条件，运用多项指标加以分析， 才能排除干扰，提高损伤推断的准确性。 3 2 3 本实验所采用研究方法的评价 3 2 3 1 动物模型 本实验模型采用的实验动物为s d 大鼠，对年龄、体重均进行了筛选，统一了 个体条件；实验大鼠颅骨开窗暴露硬脑膜，排除了难以标准化控制的颅骨因素的 影响；采用了外周导管和撞杆设计，使打击部位更加精确，打击力更加平均分配 到大鼠脑组织；自由落体打击主要模拟了直线运动损伤中的加速性损伤机制，该 机制为暴力性损伤的常见机制瞳引，使本实验研究成果更具针对性。总之，本实验 用到的损伤模型最大限度统一了实验标准，具有干扰小、可重复性好、操作简便 等优点，可作为脑损伤研究的常用动物模型。 1 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 2 3 2 免疫组织化学 免疫组织化学是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗 体的显色剂( 荧光素、酶、金属离子、同位素等) 显色来确定组织细胞内抗原( 多肽 和蛋白质) ，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学方法相较于形态学 方法( h e 染色) 来说具有特异性强、灵敏度高、定位准确等优势；相对于p c r 等定量 分析方法来说具有实验要求低、简便快速和成本低廉等优点。免疫组化法能够有 机地同形态、功能及代谢的研究结合起来，属于一种比较成熟的实验室方法，有利 于研究成果的实际应用及推广。 3 2 3 3 图片分析软件 本实验免疫组化切片结果定量分析所用图片分析软件i m a g e - p r op i u s 6 0 是美 国m e d i ac y b e m e t i c s 公司开发的一款专业图像处理系统，它已广泛应用于荧光成 像、质量控制、材料成像以及其它多项科研、医学、工业领域。其功能强大，操 作简便，从图像采集、处理、分析到报告、存档、输出，i m a g e p r op l u s 都能轻 松完成，国内多款图片分析软件均以其为范本编制而成，其分析处理结果的权威 性为国际公认。 3 3f a s 系统与中枢神经系统( c e n t r alnervouss y s t e m ，c n s ) 疾病 目前关于f a s 系统与c n s 疾病的关系的文献报道较少，且多研究不够深入。笔 者之所以单独将其列出，主要因为其在以下方面具有重要研究价值：( 1 ) 在某些c n s 疾病后是否存在f a s 表达，其表达规律及机制如何，能否通过抑隹j i j c n s 疾病后f a s 的 表达来阻止疾病的发生发展甚至治愈疾病；( 2 ) 从法医损伤病理学角度讲，将f a s 作为颅脑外伤后损伤时间推断的一项指标时，尚需考虑到某些c n